JPH10500011A - 直列変異反復配列オリゴタイピングによる結核菌群細菌の検出および鑑別 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増幅プライマーを用いる核酸をインビトロで増幅させる方法において，微生物M．tuberculosis 細菌群に属する微生物の直列リピート配列の部分に，直列リピートへのハイブリダイゼーションを生じついでハイブリダイズしたプライマーの伸長が起こるのに十分相補性のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマーである１対のプライマーを用い，これらのプライマーは，増幅反応における伸長が一方のプライマーでは５’方向に，他方のプライマーでは３’方向に起こるようにした方法に関する．微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の検出方法において，上述の増幅方法に続き，M．tuberculosis 細菌群に属する微生物の直列領域のスペーサーの部分にハイブリダイゼーションが起こるのに十分相同なオリゴヌクレオチドプローブを使用してそれ自体既知の方法でハイブリダイゼーション試験を行い，それ自体既知の方法でハイブリダイズした生成物を検出する方法が提供される．特定のプローブも開示されている．サンプル中の M.tuberculosis 細菌群に属する微生物のタイプを鑑別する方法において，上述の検出方法を実施し，ついで得られたハイブリダイゼーションパターンを基準と比較することからなる方法も提供される．

Description

【発明の詳細な説明】 直列変異反復配列オリゴタイピングによる 結核菌群細菌の検出および鑑別 緒言 結核は単一の感染症中では年間の死亡数が最大の感染疾患である．ＷＨＯは， 年間に，約１千万人が結核に感染し，３百万人がこの疾患で死亡していると推定 している（３７）．結核は長期間にわたり発症率が徐々に低下したのち，再び大 部分の西洋諸国において増加し始めている．さらに，Mycobacterium tuberculos is（結核菌）の多重薬物抵抗性株の出現および結核とヒト免疫不全症ウイルス感 染個体の関連で事態は劇的に悪化している（１，２，４，６，７，１０，３７） ． 結核の制御において鍵になる因子の一つは，疾患の迅速な診断と感染源の同定 である．M．tuberculosis 株のタイピングが爆発的流行の研究に極めて有用であ ることは既に証明され（６，１４，３３），多くの検査室で様々な疫学的疑問の 解決に応用されている．従来，検査室での診断は，顕微鏡検査，微生物の培養， 皮膚試験およびＸ線造影によって行われている．残念ながらこれらの方法は，多 くの場合，感度が悪く，特異性がなく，M．tuberculosis の増殖速度が遅いこと から極めて時間のかかるものである．したがって，臨床標本中の微生物を迅速に 検出するために，M．tuberculosis ＤＮＡのインビトロ増幅のような新しい技術 が開発されてきた（１４）．ＤＮＡ技術による単離M．tuberculosis の鑑別能力 は，感染源の同定ならびに伝播の主要経路および感染による結核菌の獲得の危険 因子の確立の可能性に革命をもたらすことになったのである（１，３−１０，１ ４，１６，１９−２２，２５，２６，２９−３６）．効率的な普遍的タイピング システムを使用すれば，異なる地理的領域からの株の比較ならびに個々の株の移 動の追跡が可能になるものと考えられる．このようなデータは重要な洞察を提供 し，高い感染率，強い病原性および／または多重薬物抵抗性のような，とくに問 題のある株の同定を可能にする．多数の単離体の分析により，ＢＣＧワクチンの 有効性や再発と再感染の頻度に関する長年の疑問に解答が得られる可能性もある ． M．tuberculosis 群の細菌は遺伝子的に著しく均一な細菌群であることから， 染色体ＤＮＡの遺伝子再配列に関連する反復ＤＮＡエレメントならびにトランス ポゾンが M．tuberculosisの株鑑別に利用されてきた．これらの二つが，挿入配 列であり，残りは機能または表現型は不明の短い反復ＤＮＡ配列である． 株の鑑別に最も広く用いられているエレメントは，１３５５bpの挿入配列であ るＩＳ６１１０である．これは最初に M．tuberculosisにおいて同定され（１９ ，３０），ついで，Mycobacterium bovis，Mycobacterium africanum，M．micro ttiおよびbovis ＢＣＧを含むすべての M．tuberculosis群細菌に分布すること が見出された（１１，１４，１５）．M．tuberculosis を鑑別できる可能性があ る他のエレメントには主要多型タンデムリピート（ＭＰＴＲ），多型富ＧＣ反復 配列（ＰＧＲＳ）および直列反復（ＤＲ）配列が包含される（１５，１６，２６ ）． M．tuberculosis の株鑑別を目的として報告されている大部分の方法は，サザ ンブロッティング技術で観察される，いわゆる制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ） に依存する．この技術は，培養 M．tuberculosis細菌からの染色体ＤＮＡの精製 を必要とする．さらに，ＩＳ６１１０フィンガープリンティングを行う場合には ，ＲＦＬＰでは多重ＩＳ６１１０単位の存在を必要とするので，１個のＩＳ６１ １０コピーしか含まないかまたは全くＩＳ６１１０コピーを含まない（３５）多 くの株の検出にはこの方法は適当でない．実際，すべての M．bovis ＢＣＧ株な らびにインドからの株の多数は単一のＩＳコピーしか含まない（３５）．しかし ながら，大部分の株は，３６bp直列反復配列もしくは多型富ＧＣ反復ＤＮＡエレ メントによるフィンガープリンティングで鑑別できる可能性は考えられる．主要 多型タンデムリピートおよび挿入エレメントＩＳ１０８１による判別能力は劣っ ていた．しかも，既知のフィンガープリンティング技術は，経費，技術的熟練， および成功裏に実施するためには時間が必要という要求がある（３２）．したが って，「ＤＮＡフィンガープリンティング」によるこの方法は，大部分の検査室 において定常的基盤で実施できるものではない． M．tuberculosis フィンガープリンティングの速度を上昇させるために，ポリ メラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）に基づく方法も開発されてはいるが，その方法 でも依然として培養細胞からのＤＮＡの精製および／または技術的要求の問題は 解決されていない（１２，１３，２３，２４，２７）． Groenen ら（１２）は，１回のＰＣＲで個々の M．tuberculosis株のタイピン グを可能にする，ＤＲクラスターにおけるＤＮＡ多型の性質に基づく株の鑑別方 法を記載している．記載された方法はＤＲ領域における遺伝子の多様性に基づく もので，予め確立された M．bovis ＢＣＧ Ｐ３のＤＲ領域の部分配列に基づく プライマー，ＳＰ２４−Ｒ（スペーサー領域２４に由来）およびＩＳ−Ｌ（ＩＳ コピーに由来）を使用するＰＣＲ法であった（１５）．増幅産物のサイズは約３ ００〜５５０bpの範囲である．この方法を用いて，M．bovis４２株は，分離した ＤＶＲ，すなわち，ＤＶＲ２６を欠く点において M．bovis ＢＣＤ Ｐ３とは異 なることが例示されている．M．tuberculosis 株Ｈ３７ＲａおよびＨ３７Ｒｖは ２つの分離した隣接ＤＶＲ，ＤＶＲ２５およびＤＶＲ２６を欠く点において，Ｐ ３株とは異なっていた．３つの残りの M．tuberculosis単離体１４３０ないし３ １は，ＤＶＲ２７〜ＤＶＲ２９からなるＩＳ６１１０の逆反復配列の直ぐ左側に 位置する２６２bpストレッチのＤＮＡ，ＤＶＲ２６における１５bpのユニークな スペーサー，およびＤＶＲ３０における１８bpのＤＲを欠く点で M．bovis ＢＣ Ｇ Ｐ３とは異なっていた．ＤＶＲ−ＰＣＲ法においては Jeffreys ら，１９９ １（１７）の方法が改良された．ＭＶＲ−ＰＣＲまたはデジタルタイピングと呼 ばれる Jeffreys らの方法では，２９bpのミニサテライト反復配列，ＭＳ３２中 の単一塩基対に頻繁に起こる多型を利用する．ＭＶＲ−ＰＣＲでは，それぞれＭ Ｓ３２マルチマーの増幅を可能にし，５’末端にアデニン（Ａ）またはグアニン （Ｇ）の一方をもつ２つのプライマーの対が使用される．増幅産物の電気泳動分 離により，５’末端にそれぞれＡまたはＧのいずれかを含有するＭＶＲの配列の 読み取りが可能になる．ＤＶＲ−ＰＣＲ法では，ＤＲ領域における多型，主とし て，ＭＳ３２ミニサテライトと同様に不変部（ＤＲ）および可変部（スペーサー 配列）から構成されるＤＶＲの存否が用いられる．ＭＶＲ−ＰＣＲ法は，ＤＲと の接合点でスペーサーの５’末端にＡ，Ｃ，ＧまたはＴのいずれかを含有するＤ ＶＲのマルチマーの選択的増幅が可能なように改良された．この目的では，４つ のスペーサー特異的ＰＣＲを駆動させるために，４つのプライマーの組合せが調 製 された．各組合せは逆配列プライマーＩＳ−ＬとＤＲ配列に基づく４つのプライ マーのいずれか一つを含有させた．ＤＲＡ−Ｒ，ＤＲＣ−Ｒ，ＤＲＧ−Ｒおよび ＤＲＴ−Ｒと命名されたこれらの４つのプライマーには，それぞれ保存されたＤ Ｒ配列に由来する１９残基の配列と３’末端に４つの塩基のいずれか一つを含有 させた．この方法の原理は引用文献１２の図３に示されている．４つのＤＶＲ特 異的プライマーのそれぞれが，底部から頂部へと内側に増加するＤＶＲマルチマ ーのラダーを生じる．これにより，いわゆる第一スペーサー残基配列またはＦＳ Ｒ配列が得られる． （１２）において解析された４つの株のＤＶＲ−ＰＣＲによる優れた鑑別にも かかわらず，この方法には多くの欠点がある．Jeffreysらによって記載された改 良変法におけるＤＮＡ配列決定法は技術的に極めて難しい．ラダーの読み取りが 十分に可能でないことが多く，小フラグメントの方が大フラグメントよりも増幅 されやすいので，ラダーは不完全なことが多い．しかも，試験は病院検査室のよ うな単純な検査室で定常的に実施できるものではない．すなわち，この方法は， 病院の試験実務では使用できない．さらに，配列決定上の問題のほかに，大量の 作業が含まれるサザンブロティングも必要である．サザンブロットハイブリダイ ゼーション法に伴う実用上の問題には，何日にもわたる多重工程を要するその方 法の比較的複雑な本質，ならびに主として，ＤＮＡ抽出のための液体培地中での 生物体の培養のため，生物体の単離からＤＮＡのタイピングの結果が得られるま での長期の遅れがある．ＰＣＲ増幅に基づく株のタイピングの迅速なかつ単純な 手段があれば，タイピング結果が得られるまでの遅れは回避され，多くの検査室 で実施可能な比較的単純なアッセイが提供されるものと考えられる．フィンガー プリンティングに十分なゲノムＤＮＡを得るためには，単離体の同定後にさらに ２〜４週間継代培養を行わなければならない．流行時とくに多重薬物抵抗性結核 症（ＭＤＲＴＢ）が流行している環境では，株の迅速な同定は，伝播鎖の検出お よび遮断による制御努力を高めることができるものと思われる． 引用文献２７には，Ross & Dwyerがオリゴヌクレオチドプライマーとして挿入 配列ＩＳ６１１０の末端を，ゲノム上のこのエレメントのクラスター間のＤＮＡ を増幅する試みで使用することを開示している．この試験は，挿入配列ＩＳ６１ １０がゲノム上に１〜１９コピー存在し，様々な株で異なる部位に局在するとい う仮説に基づいている．彼らは，開示されたＰＣＲ増幅法ではＩＳ６１１０をも たない２つの株では明瞭な産物を産生しないことを提示し，この方法の欠点を例 示している．さらに Ross & Dwyer は彼らの論文中で，挿入配列ＩＳ６１１０の 末端を用いるＰＣＲ増幅は様々な強度のバンドを生じることを指摘し，この試験 の結果が信頼性を欠くことを例示している． 引用文献１３には，ＩＳ６６１１０に特異的なプライマーによるポリメラーゼ チェーン反応を用いるＲＦＬＰタイピングの変法が記載されている．この変法で は，限定されたゲノムＤＮＡにライゲートしたリンカーに相補性の第二のプライ マーが用いられる．一つの鎖ではリンカーがチミジンに代えてウラシルを含有し ，ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによるこの鎖の除去によって特異的な増幅が得 られる．この方法にも前述のＰＣＲ−ＤＶＲ法の場合と同じ欠点がある． 引用文献２５には，Palittapongarnpim らが，任意プライマーを用いるＰＣＲ の使用を報告している．この論文には，株Ｈ３７ＲｖとＨ３７ＲａのＰＣＲバン ディングパターンは同一であることが提示されている．彼らは，任意プライマー を用いるＰＣＲにより M．tuberculosis株の識別が可能ではあるが，株Ｈ３７Ｒ ＶならびにＨ３７Ｒａの識別が不能なＡＰＰＣＲはさらに酷似する株に対するＡ ＰＰＣＲの限界を示すものであることを指摘している． 本発明は，M．tuberculosis 細菌群に属する微生物を，迅速かつ単純な効果的 方法によって鑑別する方法を記載する．この方法は，高度に複雑な装置を用いる ことなく検査室での実施が可能であり，精巧な分子生物学的技術の訓練を受けて いないテクニシャンでも実施できる．さらにこの方法は，M．tuberculosis 細菌 群の増殖の遅い細菌を培養する必要がなく，臨床標本中の M．tuberculosisの直 接的検出と微生物のタイピングを同時に行うのに適している．最後に，これまで 使用されてきた M．tuberculosis株の他の鑑別法に比較して，本発明は，複雑な 画像処理ソフトウエアを用いる必要のない，異なるＤＮＡタイプの簡単かつ精巧 な分類を可能にする． 発明の詳細な説明 本発明は，M．tuberculosis 群細菌に独特に存在するユニークな染色体遺伝子 座「直列リピート」（ＤＲ）領域に見出されるＤＮＡ多型に基づくものである． この遺伝子座は，結核に対するワクチンとして世界的に広く用いられている株， M．bovis ＢＣＧ中に Hermansら（１５）によって発見された．M．bovis ＢＣ ＧにおけるＤＲ領域は，それぞれ３５〜４１塩基対長の非反復ＤＮＡスペーサー によって分散されている３６塩基対の直列反復配列から構成される（１５）．M. bovis ＢＣＧにおけるＤＲ配列のコピー数は４９と測定された．M.tuberculosis 細菌群の他の株では，ＤＲエレメントの数は様々に変動することが見出された（ １５）．極めて大多数の M．tuberculosis株は，ゲノムのＤＲ含有領域に１もし くは２以上のＩＳ６１１０エレメントを含有する． 上述の最近の研究（１２）では，ＤＲ領域における遺伝子の多様性はＤＲコピ ー数の差によって発生することが示され，これは，ＤＲ配列間の相同組換えがＤ Ｒ関連ＤＮＡ多型の主要な原因である可能性を示唆している（１２）．染色体の 比較的小部分内での高度なＤＮＡ多型は，この領域をＰＣＲに基づくフィンガー プリンティング法に極めて適した領域としている． 以下に記載する本発明は，ＤＲ領域内のＤＮＡ配列のインビトロ増幅，および その増幅ＤＮＡとＤＲ領域内のユニークなスペーサーＤＮＡの配列に基づく多重 の短い合成オリゴマーＤＮＡ配列（図２）のハイブリダイゼーションによる独特 な方法を基盤とするものである．これは，両プライマーとも多重プライミング部 位を有するプライマーのセットを用い，プライマーの一つをＩＳ６１１０の部分 のような固定されたプライミング部位への結合に対立させた従来の方法と異なっ ている．M．tuberculosis 細菌群の株はこれらのスペーサー配列の存在において 異なることから，様々なスペーサーＤＮＡ配列のセットとのハイブリダイゼーシ ョンパターンの差によって鑑別することができる． M．tuberculosis の完全ＤＲ領域のＤＮＡ配列の決定 図１は，Hermans らおよび Groenenら（１２，１５）によって以前に決定され た M．bovis ＢＣＧのＤＲ領域の構造を示す．便宜上，本発明者らは，ＤＲおよ びその３’隣接スペーサー配列を「直列変異リピート」（ＤＶＲ）と命名する． すなわち，ＤＲ領域はそれぞれ，不変部分（ＤＲ）と可変部分（スペーサー）か ら構成される個別的な数のＤＶＲからなる． M．bovis ＢＣＧのＤＲ領域における配列決定された部分は黒色で印刷した． ２１のＤＶＲから構成され，その７個はＩＳ６１１０エレメントの５’側に位置 し，１４個のＤＶＲ（ＩＳ６１１０エレメントが局在する一つを含む）はＩＳ６ １１０エレメントの３’側に局在する．非配列決定部分は灰色で印刷してある． より多くのスペーサーの配列を決定するために，本発明者らは本発明において M．tuberculosisＨ３７Ｒｖの全ＤＲ領域からなる染色体領域の配列，ならびに ＤＲ領域に隣接する配列の配列決定を行った．この目的では，全ＤＲ領域を有す るコスミドＴ２１１（Pasteur Institut，PrisのCole博士より入手）を用いた． このコスミドは，M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株からの約３５kbの挿入体を含有 する．物理地図を構築し，ＤＲ領域を含むストレッチの位置をサザンブロッティ ングにより決定した．サブクローンを調製し，ＤＲクラスター中に存在するＩＳ ６１１０エレメントに隣接するＤＮＡの配列を決定した．この配列は図３に示し ，配列番号を１とした． 図１に模式的に示すように，Ｈ３７Ｒｖ株におけるＤＲの数は４１に達する． 以前に M．bovis ＢＣＧに見出されたように，この場合も各ＤＲはユニークなス ペーサー配列により分散され，サイズは２９〜４１塩基対の間で変動することが 見出された．Ｈ３７Ｒｖの１３個のＤＶＲの配列は，以前に配列決定された M.b ovis ＢＣＧの同じ染色体領域における１３個のＤＶＲの場合（１５）と同一で ある．Ｈ３７ＲｖのＤＶＲには５’末端のＤＶＲから始めて１〜４１の番号を付 す．同一のＤＶＲはスペーサー１２〜３２である． 本発明は，増幅プライマーを用い，増幅反応たとえばＰＣＲ，ＬＣＲもしくは ＮＡＳＢＡにおいてそれ自体既知の様式により核酸をインビトロで増幅させる方 法において，微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の直列リピート配列 の部分に十分に相補性のオリゴヌクレオチド配列からなる１対のプライマーを用 いて直列リピートへのハイブリダイゼーションを起こさせついでハイブリダイズ したプライマーの伸長を起こさせ，上記プライマーは増幅反応における伸長が一 方のプライマーでは５’方向に，他方のプライマーでは３’方向に起こるように する方法を意図するものである．検出すべき微生物中における直列リピートの多 重な存在により，このようなプライマーの使用はすべてのスペーサー領域が効率 的な様式で増幅されることを示唆するものである．とくに，プライマーから離れ て位置するスペーサーの増幅を達成するために極端に長い配列を調製する必要は ない．プライマー対の本発明の選択によれば，すべてスペーサー領域の核酸から なる多数の小フラグメントの不均一な産物が得られる．ついで，増幅産物の検出 は検出を所望のスペーサー領域の１または２以上に向けられたオリゴヌクレオチ ドプローブを用いることにより単純に実施できる．増幅反応における妨害を回避 するために，プライマーには，両プライマーが同じ直列リピートにハイブリダイ ズして伸長を行った場合に，それらが互いに妨害しないように，直列リピートの 非重複部分に相補性のオリゴヌクレオチド配列をもたせることができる．とくに ，一方のプライマーＤＲａが５’方向に伸長可能で，他方のプライマーＤＲｂが ３’方向に伸長可能である場合，伸長反応時の妨害を回避するため，ＤＲａは， ＤＲｂが相補性である直列リピート中の配列の５’側に位置する直列リピートの 配列に相補性になるように選択される．本発明の方法においては，使用されるプ ライマーは，特定の増幅反応の環境下に十分な増幅が起こるように直列リピート のコンセンサス配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド配列をもたなけ ればならない．増幅反応技術の熟練者であれば，良好な増幅反応が起こるために 必要な長さおよびホモロジーの程度は容易に決定できる．M．tuberculosis 群に 属する微生物の直列リピートのコンセンサス配列は配列番号２とし，図１に示す ． 本発明はまた，微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の検出方法にお いて， １）開示された実施態様のいずれかに上述した方法でサンプルからの核酸を増 幅させ，ついで， ２）それ自体既知の方法で，増幅産物を１個のオリゴヌクレオチドプローブも しくは複数個の異なるオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせるハイ ブリダイゼーション試験を実施し，この場合，各オリゴヌクレオチドプローブは M．tuberculosis 細菌群に属する微生物の直列リピートのスペーサーの部分に， 増幅前のサンプル中にこのようなスペーサー核酸が存在した場合には，増幅産物 へのハイブリダイゼーションを生じるのに十分相同であり，このハイブリダイゼ ーション工程は所望により増幅産物の電気泳動または分離を前もって行うことな く実施され，ついで ３）それ自体既知の方法で，ハイブリダイズした生成物を検出する ことからなる方法を意図するものである． 本発明の検出方法は，検出方法の対象に応じて多くの実施態様で行うことがで きる．たとえば，この方法はハイブリダイゼーション試験で少なくとも検出を所 望の微生物の総スペクトルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ数からなる数 のオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施できる．たとえば M．tuberculosis 群に属するすべての微生物に存在が知られているスペーサー領域のオリゴヌクレ オチドプローブを使用することができる．M．tuberculosis による感染の存否を 検出するためには，このようなオリゴヌクレオチドプローブの一つの使用で十分 である．M．tuberculosis 細菌群微生物の一部のタイプに特異的なオリゴヌクレ オチドプローブの組合せを使用することもできる．たとえば，M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株の１３のスペーサー領域は，M．bovis ＢＣＧと共通であることが 見出されている．しかしながら両微生物タイプからの多数のスペーサーは異なっ ている．したがって，様々な株の間の鑑別のために，特定のオリゴヌクレオチド プローブの組合せを選択することが可能である．大多数の結核感染は M．tuberc ulosis，M．bovisおよび M．africanum の群からの微生物による感染であるから ，本発明の微生物検出方法はこのような微生物の存在の検出に向けられることが 好ましい．M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖのスペーサー配列と M．bovis ＢＣＧの スペーサー配列は決定されている．M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖは４１のスペー サー配列を有し，これらの配列は本明細書においては配列番号３〜４３として示 す．M．bovis ＢＣＧのスペーサー配列については Hermansらによって（１５） に報告されている．引用された文献の図２にはM．bovis ＢＣＧの反復リピート ２４〜４３が開示され，４４はＩＳ９８７を含有する．引用文献の配列データは ，ＥＭＢＬジーンバンクおよびＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに受入番 号Ｘ５７８３５として収められている．M．tuberculosis Ｈ３７ＲｖとM．bovis ＢＣＧにおいて共通であることが見出されたスペーサー領域は M．tuberculos is Ｈ３７Ｒｖのスペーサー２０〜３２である． 上記実施態様のいずれかに開示された本発明の方法は M．tuberculosis Ｈ３ ７Ｒｖのスペーサー配列もしくは M．bovis ＢＣＧの任意のスペーサー配列に相 補性の配列または上記スペーサー配列のフラグメントもしくは誘導体に相補性の 配列であり，このようなスペーサー配列にハイブリダイズすることが可能で，こ のようなスペーサー配列に相同な少なくとも７つの連続したヌクレオチドからな りかつ／またはこのようなスペーサー配列と少なくとも６０％のホモロジー，好 ましくは少なくとも８０％のホモロジーを示し，少なくとも７ヌクレオチド長を 有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施できる．M．tuberculosis Ｈ３ ７Ｒｖまたは M．bovis ＢＣＧいずれかの存在の検出をとくに所望の場合には， 本発明の方法に適当なオリゴヌクレオチドプローブを提供するために共通のスペ ーサー配列のいずれかを使用することができる． 本発明はまた，サンプル中の M．tuberculosis細菌群に属する微生物のタイプ を鑑別する方法とくにサンプルが臨床標本である方法を意図するものである．こ の方法は，サンプルからの細胞を分析の実施のために培養する必要はなく，サン プルに対して実施できる．この方法は，上述のように本発明の検出方法を実施し ，ついで得られたハイブリダイゼーションパターンを基準で得られたハイブリダ イゼーションパターンと比較することからなる．基準は M．tuberculosis細菌群 に属する微生物の１または２以上の株についてサンプルの場合と同様の方法で得 られたハイブリダイゼーションパターンとすることができる．他の可能性として ，基準をスペーサー配列の一覧を提供する，たとえばデータバンクのような出典 による結果の調査とすることも考えられる．このようなデータバンクを予め分析 し，オリゴヌクレオチドプローブを特異的に選択することによって，鑑別を所望 の微生物株に特に適した鑑別試験を提供することが可能である．本発明を例示す る実施例では，７７の臨床サンプルを多数のオリゴヌクレオチドプローブを用い て分析し，本発明の方法で期待できるハイブリダイゼーションパターンの種類を 提供する．スペーサー領域の特異的な性質および様々な株のスペーサー領域の特 異的な組合せによって，これらのスペーサー領域はとくに鑑別試験に適している ．これが，本発明の検出方法または鑑別方法に適したオリゴヌクレオチドプロー ブを設計するための鋳型としてスペーサー配列を選ぶ理由である．したがって本 発明はまた，少なくとも７個，好ましくは１２個以上，とくに１２〜４０個のヌ クレ オチドからなるオリゴヌクレオチドプローブであり，以下のスペーサー配列：M ．bovis ＢＣＧのスペーサー配列１〜２３，M．bovis ＢＣＧのスペーサー配列 ４４〜４９および M．tuberculosisＨ３７Ｒｖのスペーサー領域１〜４３，ただ しM．bovis ＢＣＧに共通の M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ配列，すなわち M． bovis ＢＣＧの番号２０〜３２に相当するスペーサー領域を除く任意の配列に十 分相同なオリゴヌクレオチドプローブを意図するものである．とくに配列番号３ 〜２１および３５〜４３は本発明の範囲に包含される．本発明はまた，このよう なスペーサー配列にハイブリダイズできるこのようなスペーサー配列のフラグメ ントまたは誘導体であり，そのオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも７個， 好ましくは１２個以上，とくに１２〜４０個のヌクレオチドからなり，このよう なスペーサー配列に相同な少なくとも７つの連続したヌクレオチドからなりかつ ／またはこのようなスペーサー配列の相当部分と，少なくとも６０％のホモロジ ー，好ましくは少なくとも８０％のホモロジー，最も好ましくは９０％以上のホ モロジーを示すフラグメントまたは誘導体を意図する． 本発明はまた，M．tuberculosis 細菌群に属する微生物群のスペーサー領域に 特異的なオリゴヌクレオチドプローブ少なくとも１個からなるオリゴヌクレオチ ドプローブによって構成されるキャリアーを意図する．とくに上に開示した本発 明のオリゴヌクレオチドプローブからなるキャリアーを意図するものである． 本発明はまた，１対のプライマーであって，微生物 M．tuberculosis細菌群に 属する微生物の直列リピート配列の部分に，ハイブリダイゼーションを起こしつ いでハイブリダイズしたプライマーの伸長が起こるのに十分に相補性のオリゴヌ クレオチド配列からなり，上記プライマーは増幅反応における伸長が一方のプラ イマーでは５’方向に他方のプライマーでは３’方向に起こり，この場合，十分 に相補性とは直列リピート配列とくに直列リピート配列のコンセンサス配列（配 列番号２）に相同な少なくとも７つの連続したヌクレオチドからなりかつ／また は直列反復配列の相当部分と少なくとも６０％のホモロジー，好ましくは少なく とも８０％のホモロジー，最も好ましくは９０％以上のホモロジーを示し，少な くとも７オリゴヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド配列を意味するプラ イマー対を意図する．実施例に記載のプライマー対，ＤＲａおよびＤＲｂは，本 発明の実施にとくに適当なプライマー対である．５’方向への伸長が可能な一方 のプライマーＤＲａと３’方向に伸長可能な他方のプライマーＤＲｂからなり， ＤＲａは，ＤＲｂが相補性の直列リピートの配列の５”側に位置する直列リピー トの配列に相補性であり，直列リピートは M．tuberculosis細菌群に属する微生 物の直列リピートである，開示されたプライマー対は，本発明の範囲に包含され る． 増幅プライマーを用い，増幅反応たとえばＰＣＲ，ＬＣＲもしくはＮＡＳＢＡ においてそれ自体既知の様式により核酸をインビトロで増幅させる方法を実施す るためのキットにおいて，微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の直列 リピート配列の部分に，直列リピートへのハイブリダイゼーションを起こしつい でハイブリダイズしたプライマーの伸長が起こるのに十分に相補性のオリゴヌク レオチド配列からなる１対のプライマーを用い，この場合，上記プライマーは増 幅反応における伸長が一方のプライマーでは５’方向に，他方のプライマーでは ３’方向に起こるプライマーであるキットは本発明の実施態様である．このよう なキットは本発明によって開示された適当なプライマー対からなるものでなけれ ばならない．本発明のキットは上述の微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微 生物の検出方法の実施にも適応することができる．このようなキットは，増幅方 法に関して開示されたプライマー対，ならびに M．tuberculosis細菌群に属する 微生物の直列領域のスペーサー配列に十分相補性の開示されたオリゴヌクレオチ ド配列または検出および鑑別の記述において開示された実施態様におけるオリゴ ヌクレオチド配列からなるキャリアーから構成される． 実施例 M．tuberculosis の臨床単離体のおけるＤＲ含有領域のインビトロ増幅 M．tuberculosis の７４の異なる臨床単離体の染色体ＤＲ領域を，プライマー 対ＤＲａ（配列番号５０）およびＤＲｂ（配列番号５１）を用いて，ポリメラー ゼチェーン反応（ＰＣＲ）により増幅した．図４に例示するように，検討したす べての株から反応産物が得られ，増幅されたＤＮＡはサイズが不均一であった． この不均一性は，プライマーＤＲａおよびＤＲｂが，ＤＲ領域における任意のＤ ＶＲでＰＣＲを開始できることから期待されることである．したがって，各ＤＶ Ｒが増幅されたＰＣＲ産物中に存在することが期待される．プライマーとしてＩ Ｓフラグメントの核酸を用いる既知のＰＣＲ増幅反応（１５および３４）とは対 照的に，とくに直列領域の末端におけるスペーサー領域で良好な増幅が得られる ． Ｈ３７Ｒｖの個々のスペーサー配列への増幅ＤＲ領域のハイブリダイゼーショ ン 上記７４株のＰＣＲ産物を（１８）に記載のようにBiodyne Ｃペーパーに共有 結合させた４７のスペーサー配列にハイブリダイズさせた．ＰＣＲ産物はＰＣＲ 時に導入されたビオチン標識を含有するので，ハイブリダイズしたＤＮＡはスト レプトアビジン含有ペルオキシダーゼ接合体の結合および酵素アッセイによって 可視化が可能であった．結果を図５に示す．すべての株のＤＶＲ−増幅ＤＮＡが ４７のオリゴヌクレオチドの少なくとも９個とハイブリダイズした．ＰＣＲ−増 幅ＤＮＡとハイブリダイズしたスペーサーオリゴヌクレオチドの組合せによって ，M．tuberculosis の３９の異なる「ＤＶＲ型」が識別された．この実験は，こ の方法により，増幅した M．tuberculosisのＤＮＡを電気泳動で分離することな くM．tuberculosis 株のタイピングが可能であることを示している．この７４の 株は旧来の（３２）に記載されたＩＳ６１１０フィンガープリンティング法によ ってもタイピングされ，６６の異なるＩＳ６１１０型が識別された．これは，Ｉ Ｓ６１１０フィンガープリンティングを用いる株の鑑別のレベルの方が本発明に 記載の方法に比較してわずかながら高いことを指示している．本発明の方法を「 ＤＶＲオリゴタイピング」と呼ぶことにする．しかしながら，ＤＶＲオリゴタイ ピング法は M．bovis ＢＣＧならびに M．tuberculosisＨ３７ＲｖおよびＨ３７ Ｒａのような群内の多数の株の識別に十分特異的である． ＤＶＲオリゴタイピング法の特異性 増幅およびハイブリダイゼーションによる方法が M．tuberculosis細菌群に属 する細菌に特異的であるか否かを決定するために，広範囲のマイコバクテリウム 種ならびに他の細菌属に由来する４０のＤＮＡサンプルをＤＶＲオリゴタイピン グ法に付した．標的としたＤＮＡには，以下の細菌種：E．coli，Bordetella pe rtassis，Afipia felis，Rochalimea lenselae，Mycobacteriumu aviumが包含さ れた．これらの標的はいずれも，スペーサーオリゴヌクレオチドと検知可能な 陽性ハイブリダイゼーション反応を導くことはなく，本発明の方法の特異性が例 示された． 臨床標本中 M．tuberculosisのＤＶＲオリゴタイピングによる検出 上述の方法による M．tuberculosisの検出感度は，株Ｈ３７Ｒｖ，M．bovis ＢＣＧおよび２つの M．tuberculosis臨床単離体の染色体ＤＮＡの様々な量を用 いてＤＶＲオリゴタイピングを行うことによって試験した．これらの株それぞれ からのＤＮＡ検出感度は少なくともＤＮＡ６４ヘムトグラム（fg）であった．染 色体ＤＮＡ １ fgは単一の細菌中に存在する量にほぼ匹敵し，ＤＶＲオリゴタイ ピング法は単一の細菌に由来するＤＮＡの検出およびタイピングを同時に可能に するものと推定される． さらに，A．Kolk 博士(Royal Tropical Institute，Amsterdam)から入手した 臨床唾液サンプルをＤＶＲオリゴタイピング，すなわち本発明の検出および鑑別 法に付した．培養で陽性のサンプルはすべて，ＤＶＲオリゴタイピングによって も陽性で，相当する唾液サンプルからの M．tuberculosis培養液より抽出した精 製ＤＮＡによって決定されたタイプに相当するＤＶＲタイプを示した． 材料および方法 Ｈ３７ＲｖにおけるＤＲ領域のＤＮＡ配列の決定 株Ｈ３７Ｒｖの完全ＤＲ領域を有する３５kb挿入体を含有するコスミドＴ２１ １はS．Cole 博士(Institut Pasteur，Paris)から入手した．コスミドＴ２１１ の物理地図は図６に示す．このコスミドの MulI フラグメントをプラスミドｐＵ ＣＢＭ２１の MulI −切断ＤＮＡにサブクローニングして，プラスミドｐＰＧ11 ，ｐＰＧ１７およびｐＰＧ３３（図６）を得た．最後の３つのプラスミドを株Ｈ ３７Ｒｖの完全ＤＲ含有領域の配列の決定に使用した．配列決定は，Sangerら（ ２８）のジデオキシチエーンターミネーター法によって，３７３Ａ型ＤＮＡシー クエンサー(Applied Biosystems，Fosre City，Cal．USA)を用い製造業者によっ て提供されたプロトコールに従って実施した． マイコバクテリア細胞からのＤＮＡの抽出 ＤＮＡは以前の記載（３３）に従って精製した． この研究に用いた細菌株 Escherichia coli Ｋ１２株ＤＨ５α（BRL，Maryland，USA）はプラスミドｐ ＵＣＢ２１および誘導体の増殖のための宿主として使用した．M．bovis ＢＣＧ 株Ｐ３および M．tuberculosisＨ３７Ｒｖは以前に記載されている（１２，１５ ）．他の細菌株はすべてＲＩＶＭに送付された臨床単離体である． ＤＶＲオリゴタイピング ＤＮＡのインビトロ増幅 精製された M．tuberculosisのＤＮＡ１０ナノグラムを，０．５単位のSuper Tth ポリメラーゼ(HT Biotechnology，Cambridge，UK)，５μｌの１０×濃Super Rth 緩衝液，２０nmolの各ｄＮＴＰ，および２０nmolの各プライマーＤＲａお よびＤＲｂを含有する混合物に加えた．最終容量を５０μｌに調整し，この混合 物を以下のスキーム：１分９６℃，１分５５℃および３０秒７２℃を用いる増幅 ３０サイクルに付した． 逆ラインブロットハイブリダイゼーション ５’末端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドを活性化Biodyne Ｃ膜に共有結 合により連結させた（１８，３８）．Biodyne Ｃ膜（Pall Biosupport，Glen Co ve,NY，USA）は１０mlの新たに調製した１６％（w/v）１−エチル−３−（３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド中１０分間インキュベートし活性化し た．ブロットは水で濯いだのち直ちにミニブロッターシステム（Immunetics，IT K Diagnostics,Uithoon，The Netherlands）中に入れた．ミニブロッターの各ス ロットを，５００mM NaHCO₃，pH８．４中０．１２５μＭのオリゴヌクレオチド 溶液１５０μｌで満たした．室温で１分間インキュベートしたのち，オリゴヌク レオチド溶液を吸引して除去した．フィルターをミニブロッターから取出し，１ ００mM NaOH で１０分間処理して，膜を不活性化し，ＳＤＳ（０．１％）を補充 した２×ＳＳＰＥ（３６０mM NaCl,２０mM NaH₂ PO₄，２mM ＥＤＴＡ，pH７． ２）中５４℃で５分間洗浄した．フィルターを，適用したオリゴヌクレオチドの ラインパターンにスロットが垂直になるようにミニブロッターに載せた．ミニブ ロッターのスロットを１５０μｌの希釈，熱変性，ビオチン標識ＰＣＲ産物（２ ０μｌのＰＣＲ産物を１３０μｌの２×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳに希釈）で満 たし，４５℃で１０分間ハイブリダイズさせた．スロットを吸引により空にした のち，フィルターを２×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳ１５０mlによって１０分間洗 浄し，２×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳ中に１：４０００に希釈したストレプトア ビジン−ペルオキシダーゼの接合体（Boehringer，Mannheim）１０ml中，４２℃ で３０分間インキュベートした．フィルターを２×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳ１ ５０ml中４２℃で１０分間洗浄し，ついで室温で２×ＳＳＰＥ１５０mlにより軽 く濯いだ．ハイブリダイズしたＤＮＡの化学ルミネッセンスの検出にはフィルタ ーをＥＣＬ検出液（Amersham，Hertogenbosch,The Netherlands）１０ml中でイ ンキュベートしたのち，１分間，Ｘ線フィルム(Hyperfilm，Amersham)に露出し た． 図面の説明 図１：M．bovis ＢＣＧおよび M．tuberculosisＨ３７ＲｖのＤＲ領域の構造 ． 長方形は３６bpのＤＲ配列を示し，これらはサイズが２１〜４１bpと変動する ユニークなスペーサーによって分散されている．ＤＲ領域におけるＩＳ６１１０ エレメントの挿入位置を示す．M．bovis ＢＣＧのＤＲ領域の一部は以前に配列 が決定されていて（１５），この部分は黒色で表示されている．非配列決定部分 は灰色である．Ｈ３７Ｒｖの全ＤＲ領域は本発明の一部として配列決定された． Ｈ３７Ｒｖの配列におけるギャップは，M．bovis ＢＣＧには存在するＤＶＲが 欠けていることを指示する． 図２：M．tuberculosis 群細菌のＤＲ領域内ＤＮＡのインビトロ増幅の原理． ＤＲクラスター内の反復単位はＤＶＲである．各ＤＶＲは，一定の３６塩基対 配列，ＤＲと，可変部分，スペーサー（それぞれＡ，Ｂ，ＣおよびＤ）から構成 される．４つの連続するＤＶＡは，ＤＶＲ−Ａ，ＤＶＲ−Ｂ，ＤＶＲ−Ｃ，およ びＤＶＲ−Ｄとして表される．ＤＲ配列に基づく配列を有する２つのプライマー ，ＤＲａおよびＤＲｂ（矢印ａおよびｂ）のＤＮＡインビトロ増幅のための使用 はＤＶＲまたは隣接する個別的数のＤＶＲからなるストレッチの増幅を導く． 図３：M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株におけるＤＲ領域およびＤＲ領域隣接領 域のヌクレオチド配列． ＤＲ配列に相同な配列には下線を付し，アッセイにオリゴヌクレオチドとして 使用された配列はボールド体で印刷してある． 図４：プライマー，ＤＲａおよびＤＲｂを用いたＰＣＲによって増幅されたイ ンビトロ増幅 M．tuberculosisＤＮＡにゲル電気泳動． 各レーンには，様々な臨床 M．tuberculosis単離体から増幅されたＤＮＡの総 量の５分の１を負荷した．ＰＣＲの標的として用いたＤＮＡの量は１０ナノグラ ムである． 図５：７２の異なる M．tuberculosis単離体ならびに５つの異なる M．bovis ＢＣＧ単離体のインビトロ増幅ＤＶＲ産物の４１の異なるオリゴヌクレオチド とのハイブリダイゼーションパターン． 用いたオリゴヌクレオチドは材料および方法の項に記載のスペーサー配列１〜 ４１から誘導される．プライマー，ＤＲａおよびＤＲｂ（図２参照）がＤＲ領域 とともに，ＤＶＲのインビトロ増幅のドライバーとして使用された． スペーサーオリゴヌクレオチドは，平行ラインのパターンでBiodyne Ｃフィル ターに共有結合で結合させ，インビトロ増幅されたＤＶＲ ＤＮＡとのハイブリ ダイゼーションは材料および方法の項に記載したようにスペーサーオリゴヌクレ オチドパターンと直交する平行チャンネルで実施した．株１：Ｈ３７Ｒｖ；株４ １：Ｈ３７Ｒａ；株４４〜４６：異なる M．bovis ＢＣＧ単離体；株７７：M． bovisＢＣＧ Ｐ３；他の株はすべて M．tuberculosisの臨床単離体である． 図６：Ｈ３７Ｒｖの完全ＤＲ領域を含有するコスミドT２１１の挿入体の制限 地図；プラスミドｐＰＧ１７，ｐＰＧ１１およびｐＰＧ３３にサブクローニング されたMlulフラグメントの局在． ＤＶＲオリゴタイピングに用いられたオリゴヌクレオチド（配列表参照） オリゴヌクレオチド配列は，ボールド体で記載の M．bovis ＢＣＧ配列（１ ５）から誘導された配列を除き，すべて M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖ株のＤＲ 領域から誘導されたものである．スペーサーオリゴヌクレオチドの５’末端は Biodyne Ｃ膜に共有結合が可能なように，アミノ基に連結されている．すべての オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems Incorporated，PerKin Elmer B.V.， Gouda,The Netherlands から入手した．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スコウルス，レーンデルト マリヌス オランダ国 エヌエル − 3961 ジービ ー ウィユク ビユ ドゥールステデ，イ ユセンステーン 47 (72)発明者 カメルベーク，ジュディス オランダ国 エヌエル − 3524 ビーデ ィー ユトレヒト，オルダムブト，１ 【要約の続き】 られたハイブリダイゼーションパターンを基準と比較す ることからなる方法も提供される．

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．増幅プライマーを用い，増幅反応たとえばＰＣＲ，ＬＣＲもしくはＮＡＳ ＢＡにおいてそれ自体既知の様式により核酸をインビトロ増幅させる方法であっ て，微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の直列リピート配列の部分に ，直列リピートへのハイブリダイゼーションを生じついでハイブリダイズしたプ ライマーの伸長が起こるのに十分相補性のオリゴヌクレオチド配列からなるプラ イマーである１対のプライマーを使用し，この場合，上記プライマーは増幅反応 における伸長が一方のプライマーでは５’方向に，他方のプライマーでは３’方 向に起こる方法． ２．プライマーは直列リピート配列の非重複部分に相補性のオリゴヌクレオチ ド配列を有し，両プライマーが同じ直列リピートにハイブリダイズして伸長を行 う場合にも各プライマーからの伸長反応が互いに妨害されることなく起こる「請 求項１」に記載の方法． ３．一方のプライマーＤＲａが５’方向に伸長可能で，他方のプライマーＤＲ ｂが３’方向に伸長可能であり，ＤＲａはＤＲｂが相補性である直列リピートの 配列の５’側に位置する直列リピートの配列に相補性である「請求項１および２ 」のいずれかに記載の方法． ４．微生物は M．tuberculosis，M．bovisまたは M．africanum である「請求 項１〜３」のいずれかに記載の方法． ５．プライマーは，特定の増幅反応の環境下において増幅を生じるのに十分な 様式で直列リピートのコンセンサス配列（配列番号２および図１）にハイブリダ イズできるオリゴヌクレオチド配列を有する「請求項１〜４」のいずれかに記載 の方法． ６．プライマー対，ＤＲａ（配列番号５０）およびＤＲｂ（配列番号５１）を 使用する「請求項１〜５」のいずれかに記載の方法． ７．微生物 M．tuberculosis細菌群に属する微生物の検出方法において， １）「請求項１〜６」のいずれかに記載の方法によってサンプルから核酸を増 幅させ，ついで， ２）増幅産物を１個のオリゴヌクレオチドプローブもしくは複数個の異なるオ リゴヌクレオチドプローブとハイブリザイズさせるそれ自体既知の方法によるハ イブリダイゼーション試験を実施し，この場合各オリゴヌクレオチドプローブは M．tuberculosis 細菌群に属する微生物の直列リピートのスペーサーの部分に対 し，増幅前のサンプル中にこのようなスペーサー核酸が存在した場合には，増幅 産物へのハイブリダイゼーションを起こすのに十分相同であり，このハイブリダ イゼーション工程は所望により増幅産物の電気泳動または分離を前もって行うこ となく実施し，ついで ３）それ自体既知の方法で，ハイブリダイズした生成物を検出することからな る方法． ８．ハイブリダイゼーション試験は，少なくとも検出を所望の微生物の総スペ クトルに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ数からなる数だけのオリゴ ヌクレオチドプローブを用いて実施する「請求項７」に記載の方法． ９．微生物は M．tuberculosis，M．bovisおよび M．africanum の一つに属す る「請求項７または８」に記載の方法． 10．オリゴヌクレオチドプローブは，少なくとも７オチゴヌクレオチド長を有 し，M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖのスペーサー配列１〜４３および M．bovis Ｂ ＣＧのスペーサー配列１〜４９のいずれかから選択される配列に相補性の配列， または上記スペーサー配列のフラグメントもしくは誘導体に相補性の配列であり ，このオリゴヌクレオチドプローブは，上述のようなスペーサー配列にハイブリ ダイズすることができて，このようなスペーサー配列に相同な少なくとも７つの 連続したヌクレオチドからなりかつ／またはこのようなスペーサー配列たとえば 配列番号３〜４３９と少なくとも６０％のホモロジー，好ましくは少なくとも８ ０％のホモロジーを示す「請求項７〜８」のいずれかに記載の方法． 11．オリゴヌクレオチドプローブは，少なくとも７オチゴヌクレオチド長を有 し，M．tuberculosis Ｈ３７Ｒｖおよび M．bovis ＢＣＧの共通スペーサー配列 ，すなわちスペーサー配列２０〜３２もしくは配列番号２２〜３４のいずれかか ら選択される配列に相補性の配列，または上記スペーサー配列のフラグメントも しくは誘導体に相補性の配列であり，このオリゴヌクレオチドプローブは，上述 の ようなスペーサー配列にハイブリダイズすることができて，このようなスペーサ ー配列に相同な少なくとも７つの連続したヌクレオチドからなりかつ／またはこ のようなスペーサー配列と少なくとも６０％のホモロジー，好ましくは少なくと も８０％のホモロジーを示す「請求項１〜１０」のいずれかに記載の方法． 12．サンプル中の M．tuberculosis細菌群に属する微生物のタイプを鑑別する 方法において，「請求項７〜１１」のいずれかに記載の方法を実施し，ついで得 られたハイブリダイゼーションパターンを基準と比較することからなる方法． 13．「請求項１２」に記載のサンプル中の M．tuberculosis細菌群に属する微 生物のタイプを鑑別する方法において，基準は微生物 M．tuberculosis細菌群に 属する微生物の１または２以上の既知の株について同様の方法で得られたハイブ リダイゼーションパターンである方法． 14．「請求項１２」に記載のサンプル中の M．tuberculosis細菌群に属する微 生物のタイプを鑑別する方法において，基準はスペーサー配列の一覧を提供する たとえばデータバンクのような出典である方法． 15．少なくとも７個，好ましくは１２個以上，とくに１２〜４０個のヌクレオ チドからなるオリゴヌクレオチドプローブであって，以下のスペーサー配列：M. bovis ＢＣＧの配列番号１〜２３，および４４〜４９，ならびに M.tuberculosi s Ｈ３７Ｒｖの配列番号３〜２１および３５〜４３のいずれかまたはこのような スペーサー配列のフラグメントまたは誘導体に，このようなスペーサー配列にハ イブリダイズするのに十分に相同であり，このオリゴヌクレオチドプローブはこ のようなスペーサー配列に相同な少なくとも７つの連続したヌクレオチドからな りかつ／またはこのようなスペーサー配列の相当する部分たとえば配列番号３〜 ２１および３５〜４３のいずれかと少なくとも６０％のホモロジー，好ましくは 少なくとも８０％のホモロジー，最も好ましくは９０％以上のホモロジーを示す オリゴヌクレオチドプローブ． 16．M．tuberculosis 細菌群に属する微生物群のスペーサー領域に特異的なオ リゴヌクレオチドプローブ少なくとも１種からなるキャリアー. 17．「請求項１５」に記載のオリゴヌクレオチドプローブからなる「請求項１ ６」に記載のキャリアー． 18．１対のプライマーであって，両プライマーは少なくとも７オリゴヌクレオ チドのオリゴヌクレオチド配列からなり，微生物 M．tuberculosis細菌群に属す る微生物の直列リピート配列の部分に，ハイブリダイゼーションを起こしついで ハイブリダイズしたプライマーの伸長が起こるのに十分に相補性であり，上記プ ライマーは増幅反応における伸長が一方のプライマーでは５’方向に他方のプラ イマーでは３’方向に起こり，この場合十分に相補性とは上記オリゴヌクレオチ ド配列が直列リピート配列とくにそのコンセンサス配列（配列番号２）に相同な 少なくとも７つの連続したヌクレオチドからなりかつ／または直列リピート配列 の相当部分と少なくとも６０％のホモロジー，好ましくは少なくとも８０％のホ モロジー，最も好ましくは９０％以上のホモロジーを示すことを意味するプライ マー対． 19．「請求項１８」に記載のプライマー対であって５’方向に伸長可能な一方 のプライマーＤＲａと３’方向に伸長可能な他方のプライマーＤＲｂからなり， ＤＲａは，ＤＲｂが相補性の直列リピートの配列の５’側に位置する直列リピー トの配列に相補性であり，直列リピートは M．tuberculosis細菌群に属する微生 物の直列リピートに存在するするプライマー対． 20．配列番号５０のＤＲａと配列番号５１のＤＲｂである「請求項１８または １９」に記載のプライマー対． 21．「請求項１８〜２０」のいずれかに記載のプライマー対および所望により 「請求項１５」に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたは「請求項１６または １７」に記載のキャリアーからなる「請求項１〜１４」のいずれかに記載の方法 を実施するためのキット．