JPH05245000A - 結核菌の特異的検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 結核菌の特異的、高感度、迅速な検出法を提
供する。 【構成】 結核菌群の特異的検出方法であって、該結核
菌群を含むと思われる試料から該結核菌群の１６S rＲ
ＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を抽出し、１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ塩基配列中の該結核菌群に特異的な
配列に相補的なプライマーであって、センスストランド
用オリゴヌクレオチドプライマーおよびアンチセンスス
トランド用オリゴヌクレオチドプライマーからなる組合
せ、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡ
合成酵素を該抽出したＤＮＡ溶液に適用して、該両プラ
イマーのヌクレオチド配列を両端に有するＤＮＡ断片を
増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素によって
処理し、制限酵素処理した後の該ＤＮＡ増幅断片を電気
泳動にかけ、核酸結合膜に固定し、ついで該ＤＮＡ増幅
断片の一部分に相補的な標識プローブをハイブリダイズ
させ、該標識プローブの標識を検出することによって該
結核菌群の存在を検出することを特徴とする方法；およ
び該方法に用いるプライマーおよびプローブ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、結核菌群の特異的かつ
迅速、高感度の検出法、および該方法に使用するプライ
マーおよびプローブに関する。

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】結核
菌(Mycobacterium tuberculosis)を起炎菌とする結核菌
感染症は、新しい化学療法の発達や生活環境の改善など
により年々減少してきてはいるものの、発展途上諸国に
おいては、年間９００万人の結核患者が発生し、３００
万人が結核によって死亡しており、いまだに患者を死に
至らしめる重篤な感染症であることには間違いない。ま
た、わが国においてもその減少は、１９７７年をさかい
に鈍化の傾向を示しており、１９８８年の１年間には５
４３５７人の新規患者が登録されているのが現状であ
る。結核感染症の診断・治療には、早期に結核菌を検出
することが必要であり、そのための迅速で高感度な検出
方法が望まれている。

【０００２】結核菌を検出する方法としては、チール・
ネールゼン(Ziehl-Neelsen)染色による検鏡法、コール
ド式抗酸菌染色による鏡検法、培地を用いた培養法など
が知られている。新しく開発された培養法としては、¹⁴
Ｃで標識した基質を含む選択複合抗菌剤ＰＡＮＴＡを添
加したミドルブルック７Ｈ１２Ｂ培地に検体を接種、培
養し、接種菌の増殖に伴って培地中の¹⁴Ｃ標識基質をカ
ルボキシル化する時に発生する¹⁴ＣＯ₂をラジオメトリ
ックに測定することによって菌増殖の有無を知る Bacte
c ４６０ ＴＢ システムがある。また、マイコバクテリ
ウム属(Mycobacterium)の菌体構成物質の１つであるツ
ベクロステアリン酸(ＴＢＳＡ)をガスクロマトグラフィ
ー／マススペクトル(ＧＣ／ＭＳ)によって定量するＴＢ
ＳＡ検出法が開発されている。さらに、ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションを利用したＤＮＡプローブ法も知られて
いる。

【０００３】しかしながら、上記従来方法は、種々の欠
点を有する。すなわち、鏡検法は染色の如何にかかわら
ず、その染色結果から結核菌の特定を行うことはできな
い。培養法は、結果を得るまでに４週間〜８週間の長期
間を要する。Bactec ４６０ＴＢ システムを用いた培養
では、結果を得るまでの時間を１週間〜２週間に短縮す
ることが可能であるが、¹⁴Ｃを使用するためＲＩ施設を
必要とする。また、ＴＢＳＡ検出法は、高価な設備機器
を必要とすること、多検体を同時に処理できないことな
ど問題が多い。ＤＮＡプローブ法は、微量の菌体を検出
する際に培養の過程が避けられず、培養法と同様、長期
間の時間を要する。加えて、ラジオアイソトープを使用
するためＲＩ施設が必要である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、結核菌に特異
的な塩基配列に相補的な１組のプライマーを用いて該特
異的配列を増幅させたうえで、制限酵素で処理し、得ら
れた断片から結核菌に特異的な断片のみを相補的標識プ
ローブを用いて検出することにより、結核菌を迅速、高
感度に検出し得ることを見いだし、本発明を完成するに
至った。

【０００５】すなわち、本発明は、結核菌群(Mycobacte
rium tuberculosis complex)の特異的検出方法であっ
て、該結核菌群を含むと思われる試料から該結核菌群の
１６SrＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡ塩基配列を抽出し、１
６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ塩基配列中の該結核菌群に
特異的な配列に相補的なプライマーであって、センスス
トランド用オリゴヌクレオチドプライマーおよびアンチ
センスストランド用オリゴヌクレオチドプライマーから
なる組合せ、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸およ
びＤＮＡ合成酵素を該抽出したＤＮＡ溶液に適用して、
該両プライマーのヌクレオチド配列を両端に有するＤＮ
Ａ断片を増幅させ、該増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素
によって処理し、制限酵素処理した後の該ＤＮＡ増幅断
片を電気泳動にかけ、核酸結合膜に固定し、ついで該Ｄ
ＮＡ増幅断片の一部分に相補的な標識プローブをハイブ
リダイズさせ、該標識プローブの標識を検出することに
よって該結核菌群の存在を検出することを特徴とする方
法に関する。本発明の結核菌の検出法は、従来法に比べ
て簡便であり、高感度かつ迅速である。

【０００６】本発明はさらに、上記検出法に用いるプラ
イマーおよびプローブにも関する。上記「結核菌群」と
は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacte
rium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ボビス(Myc
obacterium bovis)、マイコバクテリウム・アフリカヌ
ム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・
ミクロチ(Mycobacterium microti)の４菌種を指すが、
今枝(InternationalJournal of Systematic Bacteriolo
gy３５、１４７〜１５０(１９８０))およびアイゼナッ
ハ(Eisenach)(American Review of Respiratory Diseas
e１３３、１０６５〜１０６８(１９８６))によれば、こ
れら結核菌群を構成する４種の菌株は同一菌種単位に匹
敵すると報告されている。すなわち、これら４種の菌株
からなる結核菌群は、ヒト結核患者において通常認めら
れる結核菌を総称したものであり、いずれの菌種もほぼ
同等の同定特性を有するものである。従って、本明細書
において「結核菌群」なる語と「結核菌」なる語とは、ヒト
結核患者で認められる病原菌としての結核菌を総称する
ものとして、ほぼ同等の意味で用いられている。

【０００７】１６Ｓ rＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列中
には、結核菌に特異的な配列が含まれている。たとえ
ば、７５番目の塩基から９７番目の塩基の間の配列、お
よび４５３番目の塩基から４７５番目の塩基の間の配列
は、細菌種特異的に保存されている配列である[スズキ
(Suzuki,Y.)、ナガタ(Nagata,A.)、オノ(Ono,Y.)、ヤマ
ダ(Yamada,T.)のJournal of Bacteriology１７０、２８
８６−２８８９(１９８８年)]。このような結核菌に特
異的な配列を選択することは本発明の方法において非常
に重要であり、たとえば、上記特定の塩基よりもそれぞ
れ数塩基上流側または下流側にずらした位置でプライマ
ーを作成した場合、該プライマー間のＤＮＡ配列を結核
菌に特異的に増幅させることができず、結核菌以外にも
数多くの細菌種について同様のＤＮＡ断片が増幅される
結果を招く。

【０００８】本発明の方法に用いる上記相補的プライマ
ーとは、上記特異的配列に相補的な一重鎖ＤＮＡからな
るオリゴヌクレオチドであり、下記配列： センスストランド用プライマー： ５′−ＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴ−３′ アンチセンスストランド用プライマー： ５′−ＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡ−３′ を有するプライマー、又はこれらと同等の相補性を有す
るプライマーが好ましい。ここで同等の相補性を有する
プライマーとは、相補性を妨げない程度で上記塩基配列
中のヌクレオチドの欠失、挿入、置換等を含むプライマ
ーを意味し、このようなプライマーも本発明のプライマ
ーに含まれる。

【０００９】結核菌を含むと思われる試料から目的ＤＮ
Ａを抽出するには、結核菌感染が疑われる動物個体より
得られた排出物中に存在する細胞から、界面活性剤やタ
ンパク質分解酵素を用いる方法あるいは凍結融解を繰り
返す方法などの通常の方法によってＤＮＡを抽出すれば
よく、これをフェノール、クロロホルム、エタノール等
を使用して精製して溶液とする。

【００１０】本発明の方法においては目的結核菌の検出
のために該結核菌に特異的な塩基配列を上記プライマー
対を用いて増幅させる。その際、たとえば、サイキ(Sai
ki,R.K.)らによって報告されたＰＣＲ法(Science２３
９、４８７−４９１(１９８８年)、特開昭６１−２７４
６９７)、その変法およびその改良法(以下「ＰＣＲ法
等」という)を用いるのが好ましい。これらのＰＣＲ法
等により、少量の試料から特定のＤＮＡ断片を飛躍的に
増幅させることができる。以下、そのＰＣＲ法等の手順
を簡単に説明する。

【００１１】まず、増幅すべきＤＮＡ配列を変性して２
本の一重鎖ＤＮＡ配列とする。つぎに、増幅すべきＤＮ
Ａ配列の一方の鎖の一方の端部に相補的な一重鎖オリゴ
ヌクレオチドである第一プライマーおよび他方の鎖のも
う一方の端部に相補的な一重鎖オリゴヌクレオチドであ
る第二プライマーを用意する。増幅系は、増幅すべきＤ
ＮＡ配列(鋳型として働く)、４種のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰもしくはｄＵＴＰ)およびＤＮＡポリメラーゼから
なる。この増幅系に上記２種類のプライマーの組合せを
過剰に加え、増幅すべきＤＮＡ配列を有する鋳型ＤＮＡ
と上記２種のプライマーをそれぞれアニールさせ、つい
でＤＮＡポリメラーゼと４種のデオキシヌクレオシド三
リン酸とから各鋳型上に相補鎖を合成させる。つぎに、
生成した二重鎖を熱変性によって一重鎖としたうえで、
それぞれの鎖を鋳型として上記と同じアニール、相補鎖
の合成の手順を繰り返せば、プライマーに挟まれた部分
のみを指数関数的に増やすことができるのである。

【００１２】以上のように、理論上、プライマーに挟ま
れた部分のＤＮＡ配列は、上記一連の操作をＮサイクル
行うことにより２^N倍に増幅され、ＤＮＡポリメラーゼ
は１分間に数百から数千塩基の合成が行えるので１サイ
クルを５〜７分で行うことができる。従って、たとえば
２５サイクルの増幅が３時間程度で終了し、各サイクル
の効率が９０％であるとすれば、(１＋０.９)²⁵すなわ
ち約１００万倍に増幅できることになる。なお、ＰＣＲ
法等において用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮ
Ａの開裂温度において耐熱性であるポリメラーゼ、たと
えばＴａｑ、Ｔｔｈポリメラーゼなどを用いると、各サ
イクルの熱変性の手順のたびに該酵素の補充をする必要
がほとんどなくなるのでＰＣＲ法等をより簡便、迅速な
方法となし得る。

【００１３】上記増幅されたＤＮＡ断片は、結核菌が保
有する１６S rＲＮＡ遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片
である。そのＤＮＡ断片の大きさは、ＰＣＲ法等におい
てはプライマーに挟まれる部分のＤＮＡ配列が増幅され
るため、用いるプライマーの種類に依存する。本発明の
場合は、７５の位置番号から始まるセンスストランド用
プライマーと４７５の位置番号で終わるアンチセンスス
トランド用プライマーとをＰＣＲ法等にて用いるので、
増幅されるＤＮＡ断片は、塩基配列番号の７５から４７
５までの部分となり、その大きさは４０１塩基対であ
る。

【００１４】つぎに、上記で増幅されたＤＮＡ断片を制
限酵素を用いて断片化する。ここで制限酵素とは、ＤＮ
Ａ鎖の特定の塩基配列を特異的に認識し、その配列の部
分、あるいは少し離れた部分を切断する酵素である。従
って、プライマーの選択に際して、増幅されたＤＮＡ断
片中に結核菌に特異的な制限酵素認識部位(作用部位)が
存在するようにしておけば、その後に該増幅ＤＮＡ断片
に制限酵素を作用させることにより、特異的な長さを有
するＤＮＡ断片が得られることになる。本発明は、その
ような特異的な制限酵素認識部位が得られるように上記
２種のプライマーを選択したものである。

【００１５】すなわち、本発明の制限酵素は、５'−Ｇ
ＣＧＣ−３'なる塩基配列を認識する制限酵素であり、
結核菌群が保有する１６S rＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列において塩基配列番号の２０８から２１１と３７６
から３７９の二箇所に存在する上記塩基配列を認識し切
断することにより、１６８塩基対、１３６塩基対、およ
び９７塩基対の３つの特異的ＤＮＡ断片が得られる。し
かしながら、他のマイコバクテリウム属においては、結
核菌群の１６S rＲＮＡ遺伝子の塩基配列番号の２０８
から２１１に相当する位置の制限酵素認識塩基配列は存
在しないため、そのような断片は得られない。結核菌群
以外の一部のマイコバクテリウム属には、結核菌群の１
６S rＲＮＡ遺伝子の塩基配列番号の１８４から１９０
に相当する位置に制限酵素認識塩基配列が存在するもの
があるが、下記に述べる本発明のプローブは、その塩基
配列番号の１８２から１９７の位置に該制限酵素認識配
列を包含している。すなわち、そのような１８４から１
９０に相当する位置に制限酵素認識塩基配列を有する細
菌では、増幅ＤＮＡ配列の制限酵素による処理の結果、
該制限酵素認識塩基配列において開裂して断片を生じ、
そのため本発明のプローブとはハイブリダイズすること
ができないから、結核菌群のみが本発明の特異的プロー
ブにより検出することができるのである。

【００１６】つぎに、上記で断片化したＤＮＡ配列を電
気泳動に供し、アルカリ変性して一重鎖にした後、核酸
結合膜に固定させる。すなわち、上記増幅されたＤＮＡ
断片を制限酵素で処理した後の特異的ＤＮＡ断片を、ド
ットブロット法やサザンブロット法あるいはエレクトロ
ンブロット法等によってニトロセルロース膜やナイロン
膜などの核酸結合膜に移し、加熱や紫外線照射により膜
に結合させる。つぎに、上記膜に固定化されたＤＮＡ断
片を標識プローブを用いて検出する。この標識プローブ
は化学修飾されており、プローブ、すなわち上記増幅さ
れたＤＮＡ断片や制限酵素処理後の特異的ＤＮＡ断片ま
たは１６S rＲＮＡ遺伝子の一部分の塩基配列と相補的
なオリゴヌクレオチドを、ハプテン、ビオチン、蛍光色
素、放射性同位元素などによって標識したものである。
この標識プローブを用いて、上記増幅されたＤＮＡ断片
や制限酵素処理後のＤＮＡ断片または１６S rＲＮＡ遺
伝子を検出することができる。

【００１７】本発明のプローブは、結核菌群の１６S r
ＲＮＡ遺伝子の塩基配列番号１８２から１９７に相当す
る下記配列： ５′−ＡＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３′ を有するもの、またはこれらと同等の相補性を有するプ
ローブを標識したものである。ここで同等の相補性を有
するプローブとは、相補性を妨げない程度で上記塩基配
列中のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を有する
ものを意味し、そのようなプローブも上記プローブに含
まれる。

【００１８】なお、本発明においては、上記ＰＣＲ等の
増幅法において、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
の１つとしてｄＵＴＰを使用しているが、それは上記増
幅ＤＮＡ断片がウラシルＤＮＡとなるようにするためで
ある。従って、ｄＵＴＰの代わりにｄＵＴＰの一部をｄ
ＴＴＰに置き換えても同様の結果が得られるのである
が、最初の増幅反応を実施する直前にウラシルＤＮＡ分
解酵素を作用させて反応溶液中に誤って混入した汚染増
幅ＤＮＡ断片を分解しておき、その後に増幅反応を行う
ことによって偽陽性を防止することが可能となり、検出
の精度が向上する。

【００１９】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ 結核菌の１６S rＲＮＡ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片
のＰＣＲ法による増幅、増幅ＤＮＡ断片の制限酵素処理
および制限酵素処理ＤＮＡ断片(特異的ＤＮＡ断片)の検
出： Ａ．１６S rＲＮＡ遺伝子を含む結核菌ＤＮＡの調製：

【００２０】結核菌(Mycobacterium tuberclosis)Ｈ３
７ＲＶ株を、１％小川培地(極東製薬工業株式会社製)を
用いて３７℃にて４週間純培養を行い、得られたコロニ
ーを白金耳でマイクロチューブに集めた。得られた菌体
にＴＥ緩衝液(１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)；２００μｌ)を加えて懸濁後、
２０％ＳＤＳ(１０μｌ)を加えて撹拌し、凍結融解を５
回繰り返した後、７５℃で１０分間加温し菌体を破壊し
た。これに０.１％ ８−ヒドロキシキノリンを含むフェ
ノールで飽和した１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)
(以下「フェノール」という)(２００μｌ)を加えて混和
後、４℃にて５分間、１１０００ｒｐｍで遠心分離し、
その上層を別のマイクロチューブに移し、フェノール
(１００μｌ)およびクロロホルム／イソアミルアルコー
ル(２４：１)(以下「クロロホルム」という)(１００μ
ｌ)を加えて混和後、４℃にて５分間、１１０００ｒｐ
ｍで遠心分離し上層を得た。フェノール／クロロホルム
(１：１)(２００μｌ)による抽出操作を２回繰り返し
た。上層を別のマイクロチューブに移し、クロロホルム
(２００μｌ)を加えて混和後、４℃にて５分間、１１０
００ｒｐｍで遠心分離しＤＮＤ溶液を得た。

【００２１】この得られたＤＮＡ溶液にその１／１０量
の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ５.９）および２.５倍量の
エタノールを加え、−７０℃に１時間静置した。その
後、４℃にて１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離す
ることにより得られたＤＮＡの沈澱を７０％冷エタノー
ルで洗浄後、再度４℃にて１０分間、１４０００ｒｐｍ
で遠心分離して得られたＤＮＡの沈澱を減圧下に乾燥し
た後、ＴＥ緩衝液(１００μｌ)にて溶解し、ＤＮＡ試料
溶液として凍結保存した。

【００２２】Ｂ．オリゴヌクレオチドプライマーおよび
オリゴヌクレオチドプローブの選択および合成：ウシ型
結核菌の１６S rＲＮＡ遺伝子の塩基配列[スズキ(Suzuk
i,Y.)、ナガタ(Nagata,A.)、オノ(Ono,Y.)、ヤマダ(Yam
ada,T.)、Journal of Bacteriology１７０、２８８６−
２８８９(１９８８)]、エルナ・ダムス(Erna Dams)らの
文献(Nucleic Acids Research １６巻特集号 ｒ８７−
１７３(１９８８))およびティル・ロガル(Till Rogall)
らの文献(International Journal of Systematic Bactr
iology４０、３２３−３３０(１９９０))に記載の塩基配
列をもとに、各種細菌種間に共通な配列およびＧＣ含量
の多い領域を含まず、プライマーダイマーを形成せず、
かつＴｍ値がほぼ同じである一組のプライマーを選択し
た。

【００２３】すなわちセンスストランド用プライマーと
して下記配列： ５′−ＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴ−３′ を有するもの、およびアンチセンスストランド用プライ
マーとして下記配列： ５′−ＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡ−３′ を有するものを選択した。プローブの選択も同様に上記
文献に記載の塩基配列をもとに、細菌種間に共通な配列
およびＧＣ含量の多い領域を含まない下記配列： ５′−ＡＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３′ を有するものを選択した。上記プライマーおよびプロー
ブの化学合成は、常法に従って行った。

【００２４】Ｃ．結核菌の１６S rＲＮＡ遺伝子の一部
を含むＤＮＡ断片の増幅：上記工程Ａで調製したＤＮＡ
を上記ＰＣＲ法を用いて増幅させた。上記工程Ｂで合成
したプライマーをＰＣＲ法において使用した。表１に示
した組成の反応液をミネラルオイルで覆いサーマル・リ
アクター（英国、ＨＹＢＡＩＤ社製）にセットした。ウ
ラシルＤＮＡ分解酵素を３７℃にて１０分間作用させて
偽陽性の原因となり得る汚染増幅ＤＮＡ断片を分解した
後、９４℃で１０分間加熱してウラシルＤＮＡ分解酵素
を失活させた。ここで、上記汚染増幅ＤＮＡ断片とは、
過去に工程Ｂ記載のプライマーを使用して増幅された残
留ＤＮＡ断片を意味する。そのような残留ＤＮＡ断片
は、その５′および３′側の２３塩基対が上記プライマ
ーと相補性を有するため、誤って上記反応液中に混入し
た場合、偽陽性の原因となる可能性がある。以上の前処
理を行った後、熱変性(９２℃にて１分間)、アニーリン
グ(６２℃にて２分間)、伸張反応(７２℃にて２分間)か
らなるサイクルを４０サイクル行った。

【００２５】

【表１】 表１ 成分 容量(μｌ) １０倍濃度の反応用緩衝液 ５.００ ｄＮＴＰｓ １.３０ プライマー １.００ ＤＮＡ溶液 適量 Ｔａｑポリメラーゼ(５単位/μｌ) ０.２５ ウラシルＤＮＡ分解酵素(１単位/μｌ) ０.５０ 蒸留水 適量 合計 ５０.００

【００２６】上記表１において、１０倍濃度の反応用緩
衝液は、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０.
１％ゼラチンを含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
(ｐＨ８.３)からなるものであり、ｄＮＴＰｓは各１０
ナノモル(ｄＵＴＰに関しては２０ナノモル)の４種のデ
オキシヌクレオシド三リン酸(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、およびｄＵＴＰ)を含有するものであり、プラ
イマーは、それぞれ１２.５ピコモルのセンスストラン
ド用プライマーおよびアンチセンスストランド用プライ
マーを含有するものであり、ＤＮＡ溶液は上記工程Ａで
調製したＤＮＡ試料溶液であり、０.５μgのＤＮＡを含
有している。ＴａｑポリメラーゼおよびウラシルＤＮＡ
分解酵素はともにパーキン・エルマー・シータス(Perki
n ElmerCetus)社製のものを使用した。

【００２７】Ｄ．増幅ＤＮＡ断片の制限酵素処理：増幅
反応後、反応溶液を全て別チューブに移し替え、フェノ
ール(２５μｌ)およびクロロホルム(２５μｌ)を加えて
撹拌後、４℃にて５分間、１１０００rpmで遠心分離し
た。上層を再び別チューブに移し替え、３Ｍ酢酸ナトリ
ウム(ｐＨ５.９、５μｌ)および２.５倍量のエタノール
を加え、−７０℃にて１時間静置した。その後、４℃に
て１０分間、１４０００rpmで遠心分離し、得られたＤ
ＮＡの沈澱を減圧下で乾燥後、蒸留水(１７.５μｌ)中
に再溶解した。１０倍濃度の反応緩衝液(２μｌ)および
制限酵素(０.５μｌ)を加えてミネラルオイルで覆った
後、３７℃で２〜３時間酵素反応を行った。

【００２８】上記で用いた１０倍濃度の反応緩衝液に
は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１００
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトール、５００
ｍＭＮａＣｌが含まれていた。また、上記制限酵素とし
てはＨｈａＩ(１０単位／μｌ)を用いた。 Ｅ．制限酵素処理後のＤＮＡ断片の臭化エチジウム染色
による検出：上記工程Ｄで制限酵素処理により得られた
特異的ＤＮＡ断片を含む反応液(１０μｌ)をＤＮＡサイ
ズマーカーとともに２.５％アガロースゲルにて電気泳
動を行った後、臭化エチジウムで染色した。その結果を
図１に示す。図１に示すように、１６８塩基対、１３６
塩基対、９７塩基対の各特異的ＤＮＡ断片が認められ
た。

【００２９】Ｆ．特異的ＤＮＡ断片のプローブによる検
出：上記工程Ｅで得られた染色ゲルをアルカリ変性液
(０.２Ｎ ＮａＯＨ、０.６ＭＮａＣｌ；１５０ｍｌ)中
に浸し、３０分間ゆっくり振盪し、アルカリ変性させ
た。ついで、ゲルを脱イオン水で軽く洗い、中和反応液
(０.２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、０.６Ｍ Ｎａ
Ｃｌ；１５０ｍｌ)中にて１時間ゆっくり振盪し、中和
させた。途中１回、中和反応液を交換した。ゲルと同じ
大きさに切ったナイロン膜を蒸留水に浮かして湿らせた
後、１０×ＳＳＣ(１×ＳＳＣは ０.１５Ｍ ＮａＣｌ、
０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ７.０)中に１０分
間浸した。このナイロン膜へ上記中和反応の終わったゲ
ル中の特異的ＤＮＡ断片をサザーン(Southern)の方法(J
ournal of Molecular Biology ９８、５０３−５１７(１
９７５))に準じて転写し、ナイロン膜を風乾後、２５４
ｎｍの紫外線を３分間照射し固定した。

【００３０】あらかじめ本発明の上記プローブを、ベー
リンガー−マンハイム社製の標識キット(DIG Oligonucl
eotide 3'-End Labeling Kit、製品番号１３６２３７
２）にてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識してお
き、この標識プローブをナイロン膜に固定した上記ＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズさせ、ベーリンガー−マンハイ
ム社製の核酸検出キット(Nucleic Acid Detection Ki
t、製品番号１１７５０４１)を用い、説明書に準じて特
異的ＤＮＡ断片の検出を行った。特異的ＤＮＡ断片の検
出操作中、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリ
ダイゼーションは３７℃にてそれぞれ１時間および５時
間行った。また、ハイブリダイゼーション後のナイロン
膜の洗浄は、０.１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ用い、室
温下にて５分間、２回洗浄後、４８℃にて１５分間、２
回行った他は説明書に準じて行った。プローブの標識を
常法に従って酵素反応させて発色させた。その結果を図
２に示す。図２に示すように、本発明の上記プローブ
は、上記工程Ｅで認められた３つのＤＮＡ断片のうち１
６８塩基対のＤＮＡ断片と特異的にハイブリダイズし
た。

【００３１】実施例２ 交叉性の検定：実施例１と同様の手順に従い、マイコバ
クテリウム属に属する細菌の内、動物個体に感染の可能
性があるもの１４菌種およびヒト細胞について交叉性の
検定を行った。その結果を図３および図４に示す。

【００３２】交叉性の検定に用いたマイコバクテリウム
属の１３菌種(ヒト結核菌を除く)を下記表２に示す。表２ マイコバクテリウム・スクロフラセウム(Mycobacterium
scrofulaceum) マイコバクテリウム・フォルチツム(Mycobacterium for
titum) マイコバクテリウム・カンサイイ(Mycobacterium kansa
sii) マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis) マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium) マイコバクテリウム・スズルガイ(Mycobacterium szulg
ai) マイコバクテリウム・ゴルドナエ(Mycobacterium gordo
nae)

【００３３】マイコバクテリウム・シェロナエ(Mycobac
terium chelonae) マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacterium
intracellulare) マイコバクテリウム・シミアエ(Mycobacterium simiae) マイコバクテリウム・クセノピ(Mycobacterium xenopi) マイコバクテリウム・ノンクロマゲニクム(Mycobacteri
um nonchromagenicum) マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ(Mycobacterium bov
is BCG)実施例３ 検出感度の検定：本発明による検出方法により目的結核
菌の検出を行った場合の検出感度を以下のようにして検
定した。

【００３４】Ａ．結核菌の菌希釈系列の作成およびその
培養：実施例１と同じ結核菌株(Mycobacterium tubercl
osis Ｈ３７ＲＶ）を使用した。この結核菌をデュボス
培地(栄研化学株式会社製)(５ｍｌ)に一白金耳植菌し、
３７℃で４週間培養した。この培養液の一部を用いて５
２０ｎｍの吸光度を測定し、同波長での吸光度が０.１
となるようにデュボス培地を用いて菌液を調製した。こ
の菌液を原液としデュボス培地を用いて１０ⁿ(ｎ＝０〜
９)の希釈系列を作成し、その１００μｌを３％小川培
地に植菌し、３７℃で８週間培養を行った。５２０ｎｍ
における吸光度が０.１の場合の菌濃度は１０⁶〜１０⁷
個／ｍｌといわれており、各１００μｌの上記希釈液系
列を１％小川培地に植菌した場合、希釈系列の１０⁵個
または１０⁶個の菌希釈液の場合まで、培養した培地中
に結核菌が存在すると仮定した。培養の結果、１０⁴個
の希釈倍数まで菌の存在が確認できた。上記仮定と培養
結果が異なる原因として、培養操作および培養過程にお
ける菌の死滅が考えられる。培養結果を表３に示す。

【００３５】Ｂ．１６S rＲＮＡ遺伝子を含む結核菌Ｄ
ＮＡの調製：上記工程Ａで作成した菌希釈系列(各１０
０μｌ)を１.５ｍｌ容のマイクロチューブにとり、４℃
にて５分間、１１０００rpmで遠心分離した後、上澄み
液を除去した。ＴＥ緩衝液(１００μｌ)および２０％Ｓ
ＤＳ(１０μｌ)を添加し、実施例１工程Ａに記載の方法
により結核菌ＤＮＡの調製を行った。 Ｃ．ＰＣＲ法による結核菌１６S rＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ
断片の増幅：上記工程Ｂで得たＤＮＡ試料溶液を用い、
実施例１工程Ｃに記載の方法に従ってＰＣＲ法を行い、
結核菌１６S rＲＮＡ遺伝子ＤＮＡ断片の増幅を行っ
た。ＰＣＲ法に用いた反応液の組成は、ＤＮＡ溶液とし
て上記ＤＮＡ溶液(５μｌ)を用い、蒸留水は反応液が全
体として５０μｌとなるまで加えた他は表１に示した反
応液組成と同じであった。

【００３６】Ｄ．結核菌１６S rＲＮＡ遺伝子増幅ＤＮ
Ａ断片の制限酵素処理：実施例１工程Ｄに記載の方法に
従い、上記工程Ｂで得られたＤＮＡ断片を制限酵素によ
り処理した。 Ｅ．制限酵素処理断片の臭化エチジウム染色による検
出：実施例１工程Ｅに記載の方法に従い、上記工程Ｄで
制限酵素処理により得られた制限酵素処理特異断片を含
む反応液(１０μｌ)についてアガロースゲル電気泳動を
行った。その結果、１６８塩基対、１３６塩基対、９７
塩基対の各ＤＮＡ断片が１０⁴の希釈倍数まで確認でき
た。その結果を表３に示す。

【００３７】Ｆ．特異的ＤＮＡ断片のプローブによる検
出：実施例１工程Ｆに記載の方法に従い、上記工程Ｅで
得られた臭化エチジウム染色後の２.５％アガロースゲ
ルについて、１６８塩基対の特異的ＤＮＡ断片のプロー
ブによる検出を行った。その結果を表３に示す。表３の
結果から明らかなように、上記工程Ａにおいて仮定した
結果と一致した(すなわち、１０⁵の希釈倍数まで検出さ
れた)。

【００３８】

【表３】 表３ 希釈倍数 培養結果 臭化エチジウム フローブによる (コロニー数) 染色による検出 検出 １０⁰ 多数 ＋ ＋ １０¹ 多数 ＋ ＋ １０² 多数 ＋ ＋ １０³ ３０ ＋ ＋ １０⁴ ５ ＋ ＋ １０⁵ ０ − ＋ １０⁶ ０ − − １０⁷ ０ − − １０⁸ ０ − − １０⁹ ０ − −

【００３９】実施例４ 動物排泄物中の結核菌の検出：ヒトより排泄された１１
５の喀痰試料を用いて結核菌を検出した。最も汎用され
ているチール・ネールゼン染色を用いた染色標本検査法
および小川培地を用いた分離培養法を行い、本発明の方
法と比較した。 Ａ．チール・ネールゼン染色を用いた染色標本検査法に
よる抗酸菌の検出：結核菌をはじめとするマイコバクテ
リウム属の細菌はチール・ネールゼン染色により、その
染色性の特異性(抗酸性)により赤く染まり、他の細菌と
判別が可能である。厚生省監修「結核菌検査指針」(財
団法人日本公衆衛生協会、染色標本検査法の項、１５−
２０頁、１９７９年)の記載に従い、上記各喀痰試料の
一部について塗抹標本を作製し、チール・ネールゼン染
色を施し、顕微鏡下にて赤色に染色された菌の存在が確
認された場合、抗酸菌陽性とした。

【００４０】Ｂ．培養法による抗酸菌の検出および結核
菌の同定：厚生省監修「結核菌検査指針」(財団法人日
本公衆衛生協会、分離培養法の項、２１−３０頁、１９
７９年)の記載に従い、上記工程Ａで使用した各喀痰の
残りについて４％ＮａＯＨをその５倍量加え、３％小川
培地(極東製薬工業株式会社製)を用いて抗酸菌の分離培
養を行った。菌発育の判定は植菌４週後および８週後に
行い、培地に発育した菌については上記工程Ａに記載の
方法に従ってチール・ネールゼン染色を施し、抗酸菌で
あることを確認した。また、発育コロニーの少ないもの
については、そのコロニーの一部を１％小川培地を用い
て再度培養し、増菌を行った。

【００４１】充分な菌体が得られた培地について、極東
Ｎ.Ｔ.ペーパー(極東製薬工業株式会社製)を用いてナイ
アシン試験を説明書に従って行った。ナイアシンテスト
陽性のものを結核菌とした。このテストは、結核菌は多
量のニコチン酸(ナイアシン)を産性するが他の抗酸菌は
一部を除いて極めて少量しか産性しないという性質を利
用したものであり、産性されたニコチン酸を検出するこ
とによって結核菌の同定が可能である。ニコチン酸を多
量に産性する菌としては、結核菌群、すなわちマイコバ
クテリウム・ツベルクローシス・コンプレックス(Mycob
acterium tubercuiosis complex、マイコバクテリウム
・ボビスを除く)の他にマイコバクテリウム・シミアエ
(Mycobacterium simiae)が知られているが、実施例２の
交叉検定試験の結果に示すように、結核菌群とマイコバ
クテリウム・シミアエとは交叉性を示さない。

【００４２】Ｃ．本発明の方法による喀痰中の結核菌の
検出：上記工程Ｂにおいて４％ ＮａＯＨを加え培養に
供した後の残りの喀痰を１０ｍｌ容の先細スピッツに入
れ、３０００rpmにて１５分間遠心分離を行った。上澄
み液を除去後、沈渣をＴＥ緩衝液(１ｍｌ)中に懸濁さ
せ、全量を１.５ｍｌ容のマイクロチューブに移し、４
℃にて１１０００rpmで５分間遠心をした。上澄み液を
除去後、再度ＴＥ緩衝液(２００μｌ)および２０％ＳＤ
Ｓ(１０μｌ)を加えて懸濁後、実施例１工程Ａ、工程
Ｂ、工程Ｃ、工程Ｄ、工程Ｅおよび工程Ｆに記載の各方
法に従い、喀痰中の結核菌の検出を行った。上記工程
Ａ、工程Ｂおよび工程Ｃの各結果を４表に示す。表４
中、ナイアシンテストの欄で「過去陽性」とあるのは、
喀痰の排泄者において過去に抗酸菌が検出され、検出さ
れた抗酸菌についてナイアシンテストを行った際の結果
である。

【００４３】

【表４】

【発明の効果】本発明の検出法は、従来法に比べて特異
的かつ高感度、迅速に結核菌を検出することができる。
従って、微量の試料からでも検出することが可能であ
る。また、ＲＩ法を用いていないため、特別な施設も必
要としない。また、本発明の検出法において増幅ＤＮＡ
断片の大きさが４０１塩基対であるため、増幅を効率よ
く行うことができる。さらに、増幅ＤＮＡ断片を制限酵
素で断片化して結核菌群に特異的な３つのＤＮＡ断片が
得られるため、特異的な結核菌の検出が可能となる。加
えて、ウラシルＤＮＡ分解酵素で前処理した後にｄＵＴ
Ｐを用いて増幅させるので、汚染増幅ＤＮＡ断片による
偽陽性を防ぎ、検出精度を上げることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の方法により、増幅したＤＮＡ断片を
制限酵素処理して得られた特異的ＤＮＡ断片をＤＮＡサ
イズマーカーとともにアガロース電気泳動にかけ臭化エ
チジウム染色した結果を示す模式図。

【図２】 本発明の方法によって得られた酵素処理ＤＮ
Ａ断片に本発明のプローブをハイブリダイズさせた後、
酵素反応によって発色させた結果を示す模式図。

【図３】 マイコバクテリウム属に属する各種細菌およ
びヒトより得たＤＮＡ試料を本発明の方法により増幅、
制限酵素処理して得られた各ＤＮＡ断片をＤＮＡサイズ
マーカーとともにアガロース電気泳動にかけ臭化エチジ
ウム染色した結果を示す模式図。

【図４】 マイコバクテリウム属に属する各種細菌およ
びヒトより得たＤＮＡ試料を本発明の方法により増幅、
制限酵素処理して得られた各ＤＮＡ断片をＤＮＡサイズ
マーカーとともにアガロース電気泳動にかけ臭化エチジ
ウム染色した後、さらに本発明のプローブを作用させて
酵素反応によって発色させた結果を示す模式図。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 結核菌群(Mycobacterium tuberculosis
   complex)の特異的検出方法であって、該結核菌群を含む
   と思われる試料から該結核菌群の１６S rＲＮＡ遺伝子
   を含むＤＮＡ塩基配列を抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝
   子ＤＮＡ塩基配列中の該結核菌群に特異的な配列に相補
   的なプライマーであって、センスストランド用オリゴヌ
   クレオチドプライマーおよびアンチセンスストランド用
   オリゴヌクレオチドプライマーからなる組合せ、４種の
   デオキシヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡ合成酵素を
   該抽出したＤＮＡ溶液に適用して、該両プライマーのヌ
   クレオチド配列を両端に有するＤＮＡ断片を増幅させ、
   該増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素によって処理し、制
   限酵素処理した後の該ＤＮＡ増幅断片を電気泳動にか
   け、核酸結合膜に固定し、ついで該ＤＮＡ増幅断片の一
   部分に相補的な標識プローブをハイブリダイズさせ、該
   標識プローブの標識を検出することによって該結核菌群
   の存在を検出することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 制限酵素処理する前の増幅ＤＮＡ断片の
   大きさが４０１塩基対である請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 制限酵素処理した後の増幅ＤＮＡ断片の
   大きさがそれぞれ１６８塩基対、１３６塩基対、９７塩
   基対である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 該４種のデオキシヌクレオシド三リン酸
   として、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰを用
   いる請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 ＤＮＡ断片を増幅する前に、ウラシルＤ
   ＮＡ分解酵素を用いて汚染増幅ＤＮＡ断片を分解するこ
   とにより偽陽性を防ぐ請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 該センスストランド用オリゴヌクレオチ
   ドプライマーが下記塩基配列： ５′−ＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴ−３′ を有するプライマーであるか、または該配列と同等の相
   補性を有するプライマーであり、該アンチセンスストラ
   ンド用オリゴヌクレオチドプライマーが下記塩基配列： ５′−ＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡ−３′ を有するプライマーであるか、または同等の相補性を有
   するプライマーである請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 該標識プローブが、下記塩基配列： ５′−ＡＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３′ を有するプローブ、または同等の相補性を有するプロー
   ブを標識したものである請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 (ｉ)下記塩基配列： ５′−ＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴ−３′ を有するセンスストランド用オリゴヌクレオチドプライ
   マー、または該配列と同等の相補性を有するプライマー
   と、(ｉｉ)下記塩基配列： ５′−ＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡ−３′ を有するアンチセンスストランド用オリゴヌクレオチド
   プライマー、または同等の相補性を有するプライマーと
   からなる、試料から結核菌群を検出するのに使用するた
   めのプライマー組成物。
9. 【請求項９】 (ｉ)下記塩基配列： ５′−ＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴ−３′ を有するセンスストランド用オリゴヌクレオチドプライ
   マー、または該配列と同等の相補性を有するプライマ
   ー、(ｉｉ)下記塩基配列： ５′−ＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡ−３′ を有するアンチセンスストランド用オリゴヌクレオチド
   プライマー、または同等の相補性を有するプライマー、
   および(ｉｉｉ)下記塩基配列： ５′−ＡＣＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３′ を有するプローブ、または同等の相補性を有するプロー
   ブを標識した標識プローブからなる、試料から結核菌群
   を検出するのに使用するための組成物。