JPH04293486A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは食品検査での腸炎ビブリオ
菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
　）の検出に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品ま
たは拭き取り材料の場合、腸炎ビブリオ菌と同定するま
でには、増菌培養、分離培養を経て鑑別培養に至る操作
を行わなければならない。各培養段階に要する時間は、
増菌培養で１０〜１６時間、分離培養で１８〜２４時間
、鑑別培養で１８〜２４時間かかり、総所要時間にする
と２〜４日間となり、長時間を要する。鑑別培養におけ
る試験では、ＮａＣｌ加寒天培地での発育試験、グラム
染色、オキシダーゼ試験等を行う必要があり、操作的に
も煩雑で、時間や費用もかかる。

【０００３】また、腸炎ビブリオ菌の病原因子の検出法
としては、腸炎ビブリオ菌が産生する耐熱性溶血毒（ｔ
ｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｈａｅｍｏｌ
ｙｓｉｎ；　ＴＤＨ　）に対する抗血清より得た特異免
疫グロブリンを用いた逆受身赤血球凝集反応があるが、
結果を得るまでに２０〜２４時間を要する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、従来
の方法はいずれも、腸炎ビブリオ菌と同定するまでには
非常に複雑な操作と長時間を要し、迅速性を要求される
臨床検査等に向かなかった。

【０００５】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより膜上、あるいは
他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これを
検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選択
性を得るのが難しい。

【０００６】しかも最近では、今までに報告されている
ものとは別の、新たな病原因子、耐熱性溶血毒類似毒（
ＴＤＨ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ；　Ｔ
ＲＨ　）をもつ腸炎ビブリオ菌が発見されてきており、
さらにＴＲＨをコードする遺伝子が塩基配列の違いによ
り、ｔｒｈ　１　およびｔｒｈ　２　遺伝子の２型に分
けられることが明らかになった。しかし、これらの新た
な病原因子を有する腸炎ビブリオ菌を直接に検査する方
法は確立されていなかった。

【０００７】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成
反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によ
り腸炎ビブリオ菌由来の特定遺伝子を検出するもので、
簡便、迅速かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において
提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、腸炎ビブリオ
菌の特定遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす腸炎
ビブリオ菌のみを選択的に検出することを特徴としてい
る。

【０００９】プライマ−として用いるオリゴヌクレオチ
ドは、腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒遺伝子
１型および２型（ｔｒｈ　１　およびｔｒｈ　２　遺伝
子）を検出対象とするときは、以下の配列群となるよう
に化学合成されたオリゴヌクレオチド （５’）　　ｄ−ＧＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧ
ＣＧ（３’）・・・（ａ） （５’）　　ｄ−ＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＣＴＣＡＴＡＴ
ＧＣ（３’）・・・（ｂ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。

【００１０】また、腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒素遺
伝子（ｔｄｈ　遺伝子）を検出対象とするときは、以下
の配列群となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ド（５’）　　ｄ−ＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＣ
ＣＴＧＣ（３’）・・（ｃ） （５’）　　ｄ−　ＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴ
ＴＧＧ（３’）・・・（ｄ） （５’）　　ｄ−ＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣ
ＡＴＣ（３’）・・（ｅ） （５’）　　ｄ−ＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ
ＴＧＣ（３’）・・（ｆ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。

【００１１】さらに、腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類
似溶血毒遺伝子１型（ｔｒｈ　１　遺伝子）を検出対象
とするときは、以下の配列群となるように化学合成され
たオリゴヌクレオチド （５’）　　ｄ−ＧＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧ
ＣＧＣ（３’）・・（ｇ） （５’）　　ｄ−ＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴ
ＡＣＧ（３’）・・（ｈ） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。

【００１２】ここで、遺伝子増幅は、Ｓａｉｋｉ　らが
開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ　法（以下、略してＰＣＲ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ
　２３０，１３５０（１９８５））をもとに行っている
。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発
明の場合は腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　遺伝子又はｔｄｈ
　遺伝子、ｔｒｈ　１　遺伝子）を検出する場合、その
領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識
してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレオ
チドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試
料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライ
マーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖
に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。この一連の
操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた領域
は検出できるまでにコピー数が増大してくる。

【００１３】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。

【００１４】これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。

【００１５】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。

【００１６】プライマーが規定している腸炎ビブリオ菌
の特定遺伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、
５０塩基から２，０００塩基、望ましくは、１００塩基
から１，０００塩基となればよい。

【００１７】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合
反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ
を２０から４２サイクル行って増幅させる。

【００１８】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのままｔｒｈ　遺伝子等をも
つ腸炎ビブリオ菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動や
クロマトグラフィーも有効である。

【００１９】

【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により腸
炎ビブリオ菌由来の特定遺伝子を検出するもので、簡便
、迅速かつ高感度な検出ができる。

【００２０】

【実施例】［実施例１：腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　遺伝
子の検出］ （実験例１） 検体の調製 腸炎ビブリオ菌ならびにビブリオ属菌は表１〜１５の縦
の見出しに示した総計３６２株を用いて、それぞれを適
当な増菌培地に接種し、３７℃、好気的条件下で終夜培
養を行い、その培地、１．　５ｍｌから遠心操作により
菌体を回収した。１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
．　５）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを１ｍｇ
／ｍｌとなるように溶かした液０．　５ｍｌで懸濁させ
、３７℃、１０分で溶菌させた。前記緩衝液で飽和させ
たフェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混
合比１：１）を溶菌液に加え、よく撹はんした。遠心後
、上層液を回収しエタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。その沈澱物を前記緩衝液、１ｍｌに溶かし
て、これを検体とした。

【００２１】プライマーの合成 腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　遺伝子の塩基配列（Ｎｉｓｈ
ｉｂｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．，；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．５７，２６９１−２６９７（１９８９），およ
び岸下ら，　日本細菌学会雑誌，４５，３４０（１９９
０）　）から請求項第１項に示した配列を選び、それと
同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化
学合成はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン
／　バイオリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフ
ォスホアミダイト法により行った。合成したオリゴヌク
レオチドの精製はＣ１８逆相カラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィーで行った。

【００２２】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７．５５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．　
８μｌ、プライマー（ａ）　０．７５μｌ、プライマー
（ｂ）　０．７５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ０．　１５μｌを加えて３０μｌの反応液を調製した
。この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭ
Ａ　社製）を５０μｌ加え反応液上に重層した。各添加
された液の内容を下記に示す。

【００２３】１０ｘ反応緩衝液：５００ｍＭ　ＫＣｌ，
　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），　１
５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　，０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン
ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ，　
ｄＴＴＰを混合させたもので各終濃度が１．２５ｍＭ プライマー（ａ）　および（ｂ）　：前述した化学合成
精製品の各水溶液（濃度５　ＯＤＵ／ｍｌ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（５　ｕｎｉｔ／ｍｌ；　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅ
ｒ　Ｃｅｔｕｓ　社製）反応条件は、次のとおりである
。

【００２４】熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７　分）とし、これを３５サイ
クル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ
　Ｃｅｔｕｓ社製）に上記反応条件をプログラムするこ
とにより行った。

【００２５】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。

【００２６】アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ　
）とし、臭化エチジウム（０．５　μｌ／ｍｌ）を含む
ものを用いた。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、
３０分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ等著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（
１９８２）　に記載されている技法で行った。 反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出し
た。

【００２７】結果 前述したように、腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　遺伝子は、
すでに塩基配列が決定されており、塩基配列の違いによ
り、ｔｒｈ　１　およびｔｒｈ　２　の２型が報告され
ている。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわちプライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレ
オチドの大きさは推定できる。それによると、プライマ
ー（ａ）　と（ｂ）　では、２５１塩基の長さのヌクレ
オチドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と
増幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、各プラ
イマーはｔｒｈ遺伝子の標的としている領域を正しく増
幅していると判断した。表１に腸炎ビブリオ菌２６４株
およびその他のビブリオ属細菌９８株で検討した結果を
示す。表１からわかるように、プライマーは腸炎ビブリ
オ菌のｔｒｈ　１　またはｔｒｈ２　遺伝子の両方を正
しく検出していることを示している。

【００２８】（実験例２）実験例１で得られた結果が、
ｔｒｈ　１　またはｔｒｈ　２　遺伝子をもつ腸炎ビブ
リオ菌に対し、選択的なものかどうか確かめるため、臨
床検査において腸炎ビブリオ菌以外で検査対象となる下
痢症菌等について比較検討した。

【００２９】方法は実験例１に示したものと同じである
が、表１６、１７中、１２、１３、１９、および２０の
菌株については嫌気的条件下、３７℃で一晩培養を行い
、ＰＣＲ法に適用しうる試料を調製した。検体の調製に
おいて培養した菌は、表１６、１７の縦の見出しに示し
た３９菌株である。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡは１μｇ
／ｍｌの濃度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行
わせた。結果を表１６、１７に示す。一部の菌種におい
てＰＣＲの副次的産物とみられる、増幅されたヌクレオ
チド断片が検出された。しかし、どれもｔｒｈ　１　お
よびｔｒｈ　２　遺伝子の配列から推定されるヌクレオ
チド断片の長さとは異なっていた。腸炎ビブリオ菌と同
じｔｒｈ　遺伝子をこれらの下痢症菌がもっていれば実
験例１の結果と同じ２５１塩基の長さのヌクレオチド断
片が検出されるはずである。したがって、一部の下痢症
菌でみられた増幅ヌクレオチドは腸炎ビブリオ菌のｔｒ
ｈ　遺伝子を認識して生成されたものではないことが明
らかであり、ｔｒｈ　遺伝子を有する腸炎ビブリオ菌お
よびビブリオ属細菌を他の下痢症菌から容易に区別し、
検出できることがわかる。なお、本発明の実験例の用い
ているアガロースゲル電気泳動を前述の泳動条件で行え
ば、１００塩基対以下の範囲であれば５から１０塩基対
、１００から５００塩基対の範囲であれば１０から２０
塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別することが可
能である。また、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とでヌクレオチドの長さの測定の精度を向上させれば、
選択的検出における信頼度はさらに高まるものと考えら
れる。

【００３０】［実施例２：腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ　遺
伝子の検出］ （実験例１） 検体の調整 実施例１と同様の手法で検体を調整した。

【００３１】プライマーの合成 腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ　遺伝子の塩基配列（Ｎｉｓｈ
ｉｂｕｃｈｉ，Ｍ．　ａｎｄ　Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．；
ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．４，８７−９９（１９９０
）　）から、請求項第２項に示した配列を選び、それと
同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化
学合成および合成したオリゴヌクレオチドの精製は、実
施例１と同様に行った。

【００３２】ＰＣＲ プライマ−として下記の組合せのものを使用した以外は
、実施例１と同様の手法で行った。

【００３３】 　　　　　　　　　　プライマー（１）　　　　　　　
　　　　　　　　　　プライマー（２）　　　　　　　
　　　　　　　　　　（ｃ）　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　（ｄ）　　　　　　　　
　　　　　　（ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（ｄ）　　　　　　　　　　　　
　　（ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（ｆ）　　　　　　　　検出 実施例１と同様の手法により行った。

【００３４】結果 前述したように、腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ　遺伝子は、
すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌク
レオチド、すなわちプライマーがＰＣＲにより増幅させ
てくるヌクレオチドの大きさは推定できる。それによる
と、プライマー（ｃ）と（ｄ）　、（ｅ）　と（ｄ）　
、および（ｅ）　と（ｆ）　を用いた場合には、それぞ
れ３７３、１９９、および２５１塩基の長さのヌクレオ
チドが増幅されてくるはずである。これらの推定値と増
幅されたヌクレオチドの長さが一致した場合、各プライ
マーはｔｄｈ　遺伝子の標的としている領域を正しく増
幅していると判断した。表１〜表１５に腸炎ビブリオ菌
２６４株およびその他のビブリオ属細菌９８株で検討し
た結果を示す。表１〜表１５からわかるように、各３組
のプライマーは腸炎ビブリオ菌およびビブリオ属細菌の
うち、ｔｄｈ　遺伝子をもつ菌のみを正しく検出してい
ることを示している。

【００３５】（実験例２）実験例１で得られた結果が、
ｔｄｈ　遺伝子をもつ腸炎ビブリオおよびビブリオ属細
菌に対し、選択的なものかどうか確かめるため、臨床検
査において腸炎ビブリオ菌以外で検査対象となる下痢症
菌等について実施例１と同様な手法で比較検討した。

【００３６】結果を表１６、１７に示す。一部の菌種に
おいてＰＣＲの副次的産物とみられる、増幅されたヌク
レオチド断片が検出された。

【００３７】しかし、どれもｔｄｈ　遺伝子の配列から
推定されるヌクレオチド断片の長さとは異なっている。 腸炎ビブリオ菌と同じｔｄｈ　遺伝子をこれらの下痢症
菌がもっていれば実験例１の結果と同じ３７３、１９９
、もしくは２５１塩基の長さのヌクレオチド断片が検出
されるはずである。したがって、一部の下痢症菌でみら
れた増幅ヌクレオチドは腸炎ビブリオ菌のｔｄｈ　遺伝
子を認識して生成されたものではないことが明らかであ
り、ｔｄｈ　遺伝子を有する腸炎ビブリオ菌およびビブ
リオ属細菌を他の下痢症菌から容易に区別し、検出でき
ることがわかる。

【００３８】［実施例３：腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　１
　遺伝子の検出］ （実験例１）プライマ−として請求項第３項に記載した
（ｇ）　および（ｈ）　を使用した以外は、実施例１と
同様の手法で、検体の調整、プライマ−の合成、ＰＣＲ
、検出を行った。

【００３９】本発明のプライマー（ｇ）　と（ｈ）　を
用いた場合には、２１１塩基の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。これらの推定値と増幅された
ヌクレオチドの長さが一致した場合、各プライマーはｔ
ｒｈ　１　遺伝子の標的としている領域を正しく増幅し
ていると判断した。表１〜表１５に腸炎ビブリオ菌２６
４株およびその他のビブリオ属細菌９８株で検討した結
果を示す。表１〜表１５からわかるように、各３組のプ
ライマーは腸炎ビブリオ菌およびビブリオ属細菌のうち
ｔｒｈ　１遺伝子をもつ菌のみを正しく検出しているこ
とを示している。

【００４０】（実験例２）実験例１で得られた結果が、
ｔｒｈ　１　遺伝子をもつ腸炎ビブリオおよびビブリオ
属細菌に対し、選択的なものかどうか確かめるため、臨
床検査において腸炎ビブリオ菌以外で検査対象となる下
痢症菌等について実施例１と同様な手法で比較検討した
。

【００４１】結果を表１６、１７に示す。一部の菌種に
おいてＰＣＲの副次的産物とみられる、増幅されたヌク
レオチド断片が検出された。

【００４２】しかし、どれもｔｒｈ　１　遺伝子の配列
から推定されるヌクレオチド断片の長さとは異なってい
る。腸炎ビブリオ菌と同じｔｒｈ　１　遺伝子をこれら
の下痢症菌がもっていれば実験例１の結果と同じ２１１
塩基の長さのヌクレオチド断片が検出されるはずである
。したがって、一部の下痢症菌でみられた増幅ヌクレオ
チドは腸炎ビブリオ菌のｔｒｈ　１　遺伝子を認識して
生成されたものではないことが明らかであり、　ｔｒｈ
　１遺伝子を有する腸炎ビブリオ菌およびビブリオ属細
菌を他の下痢症菌から容易に区別し、検出できることが
わかる。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】

【表７】

【００５０】

【表８】

【００５１】

【表９】

【００５２】

【表１０】

【００５３】

【表１１】

【００５４】

【表１２】

【００５５】

【表１３】

【００５６】

【表１４】

【００５７】

【表１５】

【００５８】

【表１６】

【００５９】

【表１７】

【００６０】なお、表中 ｔｒｈ　の欄　（１）：　ｔｒｈ　遺伝子１型を有する
菌同　　　　　（２）：　　　同　　　　２型を有する
菌同　　　　　（−）：　ｔｒｈ　遺伝子を有しない菌
ｔｄｈ　の欄　（＋）：　ｔｄｈ　遺伝子を有する菌同
　　　　　（−）　　　　同　　　　を有しない菌プラ
イマ−の組合せ欄（○）：増幅されたヌクレオチドの長
さが推定値と一致したもの 同　　　　　　　　　　（●）：増幅ヌクレオチドは認
められたが、その長さが推定値と異なったもの 同　　　　　　　　　　（−）：増幅ヌクレオチドが全
くみとめられなかったもの 表１〜１５における各菌株の入手先：京都大学医学部微
生物学教室 表１６、１７における各菌株の入手先：ＡＴＣＣ（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）
ＩＦＯ（発酵研究所）

【００６１】

【効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、および病
原性と最も関連の深い遺伝子を標的とするプライマーを
用いたことで、該遺伝子を有する腸炎ビブリオ菌および
ビブリオ属細菌の検出において、遺伝子増幅作用による
高い検出感度と、２つあるいは、それ以上のプライマー
で反応が規定されることによる高い選択性を得ることが
できる。

【００６２】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理が簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出が行え、しかも核酸の長
さが確認できるので結果の信頼性が高いものとなる。

【００６３】腸炎ビブリオ菌は、わが国における細菌性
食中毒原因菌の第１位を占める病原菌である。この菌に
よる健康障害のほとんどは、下痢、腹痛等を主徴とする
胃腸炎である。この胃腸炎の病原因子として最も注目さ
れているのは、耐熱性溶血毒（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌ
ｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ；　ＴＤＨ　
）である。したがって、耐熱性溶血毒をコードするｔｄ
ｈ遺伝子をプライマーの標的ヌクレオチドとすることで
食中毒原因菌としてのｔｄｈ　遺伝子保有の腸炎ビブリ
オ菌を選択的に検出することができる。

【００６４】さらに、近年ＴＤＨと類似しているが全く
異なる病原因子、耐熱性溶血毒類似毒（ＴＲＨ）が発見
され、食中毒事例におけるＴＲＨ産生性の腸炎ビブリオ
菌の病原性が重要視され始めている。そこで、ＴＲＨを
コードするｔｒｈ　遺伝子をプライマーの標的ヌクレオ
チドとすることで食中毒原因菌としてのｔｒｈ　遺伝子
保有の腸炎ビブリオ菌を選択的に検出することができる
。

【００６５】

【配列表】配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；１配
列の長さ　　　　　　　　　　１９塩基配列の型　　　
　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　
　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配
列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　
　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＧＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴ
ＡＡＧＣＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；２配
列の長さ　　　　　　　　　　１９塩基配列の型　　　
　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　
　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配
列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　
　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＣＴＣＡ
ＴＡＴＧＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；３配
列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　　　
　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　
　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配
列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　
　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴ
ＴＣＣＴＧＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；４
配列の長さ　　　　　　　　　　１９塩基配列の型　　
　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　
　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状
配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮ
Ａハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス
　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡ
ＣＴＴＧＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；５配
列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　　　
　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　
　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配
列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　
　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴ
ＧＡＣＡＴＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；６
配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　　
　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　
　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状
配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮ
Ａハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス
　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣ
ＡＴＡＴＧＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；７
配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　　
　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　
　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状
配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮ
Ａハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス
　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ配列の特徴　　　　
　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　　
　　　　　　　　　　　ＧＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴ
ＡＡＧＣＧＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）；８
配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　　
　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　
　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状
配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮ
Ａハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス
　　　　　　　　ＮＯ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中に存在する腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂ
   ｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の耐熱性
   溶血毒類似溶血毒遺伝子１型および２型（ｔｒｈ　１　
   およびｔｒｈ　２　遺伝子）をコードするヌクレオチド
   配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となる
   ように化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合
   成ヌクレオチドが以下の配列群、（５’）　　ｄ−ＧＧ
   ＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＧ（３’）・・・（
   ａ） （５’）　　ｄ−ＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＣＴＣＡＴＡＴ
   ＧＣ（３’）・・・（ｂ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】検体中に存在する腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂ
   ｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の耐熱性
   溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ　遺伝子）をコードするヌクレ
   オチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的
   となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
   て、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）　　ｄ−ＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＴＴＣＣ
   ＴＧＣ（３’）・・（ｃ） （５’）　　ｄ−ＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴ
   ＧＧ（３’）・・・（ｄ） （５’）　　ｄ−ＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣ
   ＡＴＣ（３’）・・（ｅ） （５’）　　ｄ−ＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ
   ＴＧＣ（３’）・・（ｆ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】検体中に存在する腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂ
   ｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の耐熱性
   溶血毒類似溶血毒遺伝子１型（ｔｒｈ　１　遺伝子）を
   コードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオ
   チド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌ
   クレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群
   、 （５’）　　ｄ−ＧＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＴＴＡＡＧ
   ＣＧＣ（３’）・・（ｇ） （５’）　　ｄ−ＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴ
   ＡＣＧ（３’）・・（ｈ） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】請求項第１項から第３項に記載された配列
   のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを
   鎖長反応のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチ
   ド配列を選択的に増幅させることを特徴とする方法であ
   って、（ａ）　検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド
   配列にプライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオ
   チドの重合反応により鎖長反応を行わせ、（ｂ）　得ら
   れた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に分離した場
   合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応の鋳
   型として機能し、（ｃ）　これら２種のプライマーによ
   る同時の鎖長反応、プライマー鎖長生成物の鋳型からの
   分離、そして新たなプライマーによるハイブリダイゼー
   ションを繰り返すことにより特定のヌクレオチド配列が
   増幅され、この増幅されたヌクレオチド断片を検出し、
   （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することで腸炎ビブリオ菌の検
   出を行うことを含む方法。