CN100342031C - 利用编码RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)序列对副溶血弧菌进行检测、鉴定及计数的方法 - Google Patents

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Abstract

制备用于检测、定量测定或鉴定副溶血弧菌的高性能、特异性基因扩增引物，该引物错误鉴定率低，在实际应用中具有足够高的扩增效率及扩增特异性。发明人测定了弧菌属各标准株和副溶血弧菌原种菌株(含有及不含毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列；阐明了其种系关系，并鉴定了其中的特征性核苷酸，因而能够设计包含它们且具有高度特异性的探针，及具有高度特异性和良好扩增效率的基因扩增引物。

Description

利用编码RNA聚合酶σ70因子的基因(rpoD)序列对副溶血弧菌进行检测、鉴定及计数的方法
发明详述
发明领域
本发明涉及利用基因鉴定、检验微生物和病原微生物的领域；特别地，涉及检验副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的领域。本发明涉及一种快速鉴定并检验在夏季导致食物中毒的副溶血弧菌的方法，因此本发明的领域包括食品加工、公共卫生和临床实验室检验。
背景技术
目前在食品卫生管理场所根据生化表型对副溶血弧菌进行检验。依据食品卫生检验指南，将受试样品置于TCBS琼脂基质上孵育及培养，获得形成不能降解蔗糖的略呈绿色的蓝色假定阳性菌落，在此略呈绿色的蓝色菌落上进行各种试验来鉴定其生物化学性质，对其加以验证。然而，在食品生产管理场所进行这些鉴定生物化学性质的试验存在许多问题，这是因为这些试验需要熟练的技术，且耗时耗力。为了弥补这些鉴定生物化学性质试验的不足，我们努力研发出一种利用基因准确、快速、简单地检测并鉴定副溶血弧菌的检验方法。
发明内容
到目前为止，已有下述的利用基因检验副溶血弧菌的检验方法，但是它们存在各种各样的问题。
例如，有人设计PCR引物，通过鉴定编码DNA促旋酶β亚基[日本专利公开号(Kokai)NO.09-252783，Applied and Environmentalmicrobiology，Vol.64，No.2，P.681-687]的靶gyrB基因来检测副溶血弧菌。然而，其引物的制备基于这样的假设：对各菌株gyrB基因的序列分析结果显示，副溶血弧菌株ATCC 17802和溶藻弧菌株ATCC17749间不同的序列中有部分序列是特异的。换句话说，并不是根据对以gyrB基因序列为基础的弧菌属系统发育关系的认识来制备引物，因而其特异性的范围不明确。利用靶toxR基因进行PCR的检测方法也见有报道，该基因是控制霍乱弧菌毒素基因的基因，它也存在于副溶血弧菌(Journal of Clinical Microbiology.1999 Vol.37 NO.4，p1173-1177)中。然而，与上述利用gyrB基因的检测引物类似，通过将该门(phyla)内相距较远的各株副溶血弧菌和各株霍乱弧菌株的基因序列加以比较，然后假设两株间有差异的核苷酸序列中的部分序列为副溶血弧菌特异性序列，制备这种PCR引物。因此，这些引物也不是根据对以toxR基因为基础的弧菌系统发育关系的认识来制备，其特异性的范围仍不明确。另一方面，也有检测方法注意到了副溶血弧菌毒素基因[日本专利申请公开号(Kokai)No.4-293486]。人们很久这前就认识到副溶血弧菌分为两类：一类含有在红细胞膜上钻孔导致出血(称为神奈川现象(Kanagawa phenomenon))的毒素(耐热的直接溶血素：TDH)，另一类不含有这种毒素。除了TDH，最近还发现了一种称为TRH(TDH相关溶血素：TRH)的毒素，它与TDH非常相似，不导致神奈川现象但会导致腹泻(1988：Infect Immun.Vol.56，961-965)。已经研制了PCR引物，对编码导致副溶血弧菌病原性的各毒素的tdh和trh基因进行特异性检测(日本专利申请公开号(Kokai)No.4-293486)。然而，并非所有的副溶血弧菌组分都含有这样的毒素基因。实际上环境中的大部分副溶血弧菌都没有这样的毒素基因。既然包括这些不含毒素基因的菌株在内的所有副溶血弧菌细胞计数在食品卫生控制时是重要的，食品卫生检验指南要求检验所有的副溶血弧菌，不论毒素存在与否。相应地，仅注意毒素产生能力的毒素基因检测方法不符合基于生化试验的标准方法，因而这样的检测方法不宜用作食品卫生管理中的检测和鉴定方法。综上所述，现有用于检测和鉴定副溶血弧菌的引物不够实用。
除这些检测方法外，也有报道用其它方法检测特异性存在于副溶血弧菌中的未知功能的0.76Kb DNA片段(Appl.Environ.Microbiol.61(4)：1311-1317)或溶血因子，如tlh(热不稳定的溶血素：Lett ApplMicrobiol 1999.Vol.28，66-70)和σ-VPH(FEMS Microbiol Lett 1990；55(3)：339-45)。然而，这些方法中没有一种方法被证实能可靠的检测副溶血弧菌，没有一种方法能够在评价场所得以准确的应用。
如上所述，没有一种遗传检测方法考虑到细菌“物种(species)”是一个包含遗传多样性的总体，并将假定为特定细菌群体成员的菌株的核苷酸序列用作共同序列或代表性序列来设计PCR引物。但是，考虑到分子进化中快速积累的基因突变，尤其是中性突变，最初检测到的菌株并不总是能检测到。这是因为引物区的轻微突变会降低引物的适用性，从而使扩增受到抑制。而且，还得担心可能发生错误鉴定。这是因为对密切相关物种间通过种系分析得到差别缺乏考虑，使引物设计缺少足够的扩增特异性，以至于检测到原本不是靶菌株的密切相关菌株。
因此，需要制备具有明确的特异性背景、低错误鉴定率和足够实际扩增效率和特异性的高性能、特异性基因扩增引物，对副溶血弧菌进行检测、鉴定并定量。
为了建立特异性检测细菌特定种系的基因的方法，需要收集待检测生物群体及与之种系发育密切关联的生物群体中尽可能多的核苷酸序列，并加以比较。另外，用于特异性检测的靶基因需具有足够多的差异核苷酸序列，使之可以与最邻近的亲缘种属区别开。因此，靶基因必须具有足够快的进化速度。
另外，不能使用在水平方向上高频率伸延、与种系发育相独立的基因，如副溶血弧菌的毒素基因。本发明中用作靶分子的σ70因子为rpoD基因所编码，是一种控制对数期细菌基因表达的因子，是细菌生存所必需的蛋白质。因此该因子用于种系分析是适当的，因为它几乎不沿水平方向伸延(spread horizontally)，同时具有适当的进化速率(Int.J.Syst.Bacteriol.1998；48，813-819，Int.J.Syst.Bacteriol.1999；49，87-95)。
附图简述
图1.基于rpoD基因序列的弧菌属系统树。
图2.基于rpoD基因的来源于食物的副溶血弧菌样菌落种系分析。
对通过直接测序方法得到的rpoD基因中约800bp的部分序列进行分析后，用邻位相连法(NJ)构建系统树。根据生物化学性质分析(依据食品卫生检验指南进行一级和二级鉴定试验)定为副溶血弧菌的菌株描述为V.parahaemolyticus。如图所示，副溶血弧菌所属的种系群(phyletic group)表示为V.p，弧菌属的其它种系群分成C1至C5。此处大肠杆菌株K12和霍乱弧菌的rpoD基因序列在GenBank数据库中的登录号为AE000388和AE004138。
图3.弧菌属rpoD基因的核苷酸序列在该门中的特异性信息。
本图显示了对V.p门和C1至C3(见图1)的共有序列进行测定，并进行同源性分析后的结果。上方为V.p(副溶血弧菌所属的门)，下方为C1到3门的共有序列。连续小*号指示的部分为与上方序列相同的序列。连续大·号指示的部分为副溶血弧菌特有的核苷酸。指示符号：D＝A或G或T；H＝A或C或T；V＝A或C或G；R＝A或G；Y＝C或T，K＝G或T，M＝A或C，S＝G或C，W＝A或T，及N＝A或G或T或C。
本发明的最佳实施方式
我们已研制出一种通过PCR直接测序法来测定编码RNA聚合酶σ70因子的rpoD基因核苷酸序列的简单方法[日本专利申请公开号(Kokai)NO.8-256798](表1)。
因此，利用该方法，我们测定了上述表1中所示弧菌属[购自Institute for Fermentation，Osaka(IFO)]各标准株和副溶血弧菌原种菌株(含有及不含毒素基因的菌株)的rpoD基因核苷酸序列，从而阐明了其种系关系。特别地说，表1中所示的受试菌株在补充有2％NaCl的脑/心融合基质(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)上于35℃培养生长过夜。用PUREGENE DNA分离试剂(Gentra SYSTEMS)从1ml培养溶液中提取染色体DNA。以提取出来的DNA为模板，用rpoD扩增通用引物[如日本专利申请公开号(Kokai)NO.8-256798所述的s70S：ACgACTgACCCggTACgCATgTAYATgMgNgARATgggNACNgT和s70R：ATAgAAATAACCAgACgTAAgTTNgCYTCNACCATYTCYTTYTT]，通过PCR方法扩增得到长约800bp的rpoD基因片段(位于大肠杆菌株K12的rpoD基因序列上334-1125处，对应于氨基酸序列的112-376处的区域)。扩增反应用耐热DNA聚合酶(AmpliTap Gold：Applied Biosystems)和GENE MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行。制备50μl含1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、1.5mM MgCl2、0.01％明胶、0.2mM各种dNTP，2.5U AmpliTaq和1μM各种引物的反应溶液。反应条件为AmpliTap Gold活化(95℃ 10分钟)，反应循环40次(94℃ 1分钟，56℃ 1分钟及72℃ 1分钟)，然后进行延伸反应(72℃ 10分钟)。所得PCR产物进行1％琼脂糖凝胶(Sea Plaque GTG琼脂糖：BioWhittaker Molecular Applications)电泳(0.5×TAE，100V 30分钟)，然后溴化乙锭染色10分钟。在紫外线照射下确认产物的存在，把它从胶上切下来，用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)纯化，从而制备测序反应的模板。用预先加入上述作为通用rpoD基因引物的引物的测序序列[如日本专利申请公开号(Kokai)NO.8-256798所述的s70S：ACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70R：ATAgAAATAACCAgACgTAAgTT]、ABIPRISM BigDye末端循环测序即用型反应试剂盒(Applied Biosystems)和Gene MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行测序反应。制备含20ng DNA和3.2pmol引物及8μl BigDye末端循环测序即用型反应混合物的反应溶液，使其终体积为20μl。循环测序反应包括92℃加热10分钟，然后96℃ 10秒钟、58℃或46℃(分别对应于s70S：ACgACTgACCCggTACgCATgTA和s70R：ATAgAAATAACCAgACgTAAgTT)5秒钟、60℃4分钟，共25个循环。使用ABIPRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems)进行核苷酸序列分析。利用ClustalW计算机程序对所获得的核苷酸序列进行多重对比分析，然后以PHYLIP计算机程序包和Kimura’s 2-参数模型[J.Mol.Evol，(1980)Vol.16，No.2，p.111-20]计算的遗传距离为基础，通过邻位相连法(Mol.Biol.Evol.Vol 4，No.4，406-425)构建系统树。
结果，在弧菌属的各菌株中，测定为含毒素基因(tdh或trh)的副溶血弧菌的所有菌株和一株标准株(IFO 12711T)共同组成弧菌属菌株中一个独立的单种系群(见图1)。因此，结果表明属于该门的细菌应该确定为副溶血弧菌。接下来，对于从食物样品中分离出来、在TCBS琼脂基质(NISSUI PHARMACEUTICAL Co.，Ltd)形成副溶血弧菌样略呈绿色的蓝色菌落的64株菌株，利用与标准株相似的步骤测定rpoD基因的核苷酸序列，然后进行种系分析。图2列出了分析结果。所分析的64株中有11株与上述测定为副溶血弧菌的菌株同属一门。为了核实基因分析的结果，依据食品检验指南所述一级及二级鉴定试验来进行试验，以鉴定其生物化学性质。特别地说，一级反应包括氧化酶各参数、TSI基质中的乳糖/蔗糖降解能力、葡萄糖降解时气体产生能力、硫化氢产生能力、运动能力测定、SIM基质上的吲哚产生能力、吲哚丙酮酸产生能力、运动性确认、赖氨酸脱羧酶活性、伏-波试验及盐耐受试验(0，3，7和10％的NaCl)；二级反应包括ONPG各参数、鸟氨酸脱羧酶活性、精氨酸脱水酶活性及各种糖(阿拉伯糖、麦芽糖、纤维糖、木糖、水杨苷、甘露醇、甘露糖、乳糖和蔗糖)的发酵能力。在一级鉴定试验中，副溶血弧菌具有下列性质：氧化酶，阳性；TSI基质中的乳糖/蔗糖降解能力，无降解；硫化氢，不产生；葡萄糖降解时气体产生能力，无气体产生；SIM基质上的吲哚产生能力，阳性；吲哚丙酮酸产生能力，阴性；运动性，阳性；赖氨酸脱羧酶活性，阳性；伏-波试验，阴性；盐耐受试验(0，3，7和10％的NaCl)：-，+，+和-。在二级鉴定试验中，副溶血弧菌具有下列性质：ONPG，阴性；鸟氨酸脱羧酶活性，阳性；精氨酸脱水酶活性，阴性；糖发酵能力(阿拉伯糖，阳性；麦芽糖，阳性；纤维糖，阴性；木糖，阴性；水杨苷，阴性；甘露醇，阳性；甘露糖，阳性；乳糖，阴性；蔗糖，阴性)。上述生物化学试验显示，对于来源于食物的、属于副溶血弧菌门的、依据前面的rpoD基因分析而测定为副溶血弧菌的菌株来说，只有11株测定为副溶血弧菌。因此，可通过rpoD基因分析精确地区别和鉴定副溶血弧菌种群。
为了建立能够只检测副溶血弧菌组分的遗传筛选方法，进行下列操作。首先，为了阐明密切相关物种间核苷酸序列的区别，将副溶血弧菌所属门和其邻近门的rpoD基因核苷酸序列加以比较，然后鉴定副溶血弧菌中保守但与其他属于亚弧属的细菌不同的核苷酸位置。特别地说，测定副溶血弧菌所属种系群的共有序列，并与C-1至C-3的共有序列相比，其中C-1至C-3是如图2所示亚弧菌属的其他细菌种系群，在系统树中与副溶血弧菌所属门紧邻。由此构建种系特异性信息(图3)。图中显示，序列表中SEQ ID：1的序列在33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735或798位的核苷酸在副溶血弧菌所属门中是特征性的。利用该门中包含这些特征性核苷酸的特异性序列，可以设计具高特异性的探针及具有高度特异性和极好扩增效率的基因扩增引物。
例如，利用包含15个或更多连续核苷酸、含有与密切相关物种不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，引物可以设计成总是包含与密切相关物种不同的核苷酸位置，优选20或更多个核苷酸，更优选不少于20并且不超过40个核苷酸。类似的，利用包含15个或更多连续核苷酸、含有与密切相关物种不同的核苷酸的rpoD基因核苷酸序列，探针可以设计成总是包含与密切相关物种不同的核苷酸位置，优选20或更多个核苷酸，更优选不少于20并且不超过100个核苷酸。
另外，可优选高频率包含上述与密切相关物种不同的核苷酸的区域来制备引物和探针，如包含259、261、264、267和270为核苷酸的区域，包含141、147和148位核苷酸的区域，包含192、198和204位核苷酸的区域，包含223、229和234位核苷酸的区域及包含594和597位核苷酸的区域。对于引物来说，3’端优选副溶血弧菌特异性的核苷酸。
本发明的基因扩增引物可用于检测、定量测定或鉴定副溶血弧菌。本发明包括检测、定量性测定或鉴定副溶血弧菌的试剂盒，该试剂盒包括这些引物和探针及其他试剂的组合。
表1、所用的菌株列表
弧菌属标准株 8株   副溶血弧菌      IFO 12711T溶藻弧菌        IFO 15630T溶蛋白弧菌      IFO 13287T海蛹弧菌        IFO 15637T坎氏弧菌        IFO 15631T哈氏弧菌        IFO 15634T鲨鱼弧菌        IFO 15632T塔氏弧菌        IFO 15644T
副溶血弧菌原种株 来源于人的13株来源于食物   V89-655 O3：K6  TRH：+V89-056 O4：K8  TDH：+V99-157 O1：K56 TDH：+V99-161 O4：K11 TDH：+V99-177 O4：K8  TDH：+V99-215 O3：K6  TDH：+V99-223 O4：K9  TDH：+不产生毒素的菌株：6株
  从TCBS基质分离的菌株   64株   来源于食物
  总计   85株
实施例
现以实施例的方式进一步说明本发明。但是，实施例代表本发明的实施方案，而不对本发明作任何限制。
利用表2所示检测和鉴定副溶血弧菌的引物，通过PCR方法尝试对副溶血弧菌的特异性检测。另外，权利要求10-15所述引物分别为F1、F2、F5、F6、R1和R2。以如表1所示受试菌株中提取出来的染色体DNA作为模板。表2显示了所用引物的相关细节。利用ABIPRISM BigDye末端循环测序即用型反应试剂盒(AppliedBiosystems)和Gene MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行扩增反应。制备含0.1μg DNA、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、15mMMgCl2、0.01％明胶、dNTP(各0.2mM)，2.5U AmpliTaq及引物的反应溶液，使其终体积为20μl。反应条件为用AmpliTap Gold活化(95℃ 10分钟)、94℃ 1分钟35～40个循环、退火1分钟(温度见表3)、72℃ 1分钟，然后72℃延伸反应10分钟。表3列出了引物组合及扩增反应条件。扩增后取5μl反应溶液进行2％琼脂糖凝胶(琼脂糖S：NIPPON GENE CO.，LTD)电泳(0.5×TAE，100V 30分钟)，溴化乙锭染色10分钟，在紫外线照射下确认所扩增的rpoD基因产物的存在与否。
利用4种正义引物和2种反义引物的共8种引物组合，筛选受试菌株。这样，只有属于确定为副溶血弧菌门的DNA显示阳性结果(表4)。
表2用于特异性检测副溶血弧菌的引物
  引物   序列   长度   位置a   方向
  F1F2F5F6R1R2   agarcttcgtctgactgattaagaagacctagaagatgatcagcwgcgccaaccgcgactctgarctgtctgaarctcaagttaccagtgaatagggcaattcgttaccagtgaatagg   202020201920   129-148251-270185-204215-234609-591613-594   正义正义正义正义反义反义
a.指SEQ所代表之核苷酸序列中从5’端起始的位置。
表3用于特异性检测副溶血弧菌之引物的PCR条件
正义引物 反义引物 扩增产物(bp)                   PCR条件
  退火温度(℃)   循环数   引物浓度(mM)
  F1F2F5F6F1F2F5F6   R1R1R1R1R2R2R2R2   483361427397485365431401   5856646058606056   3540403540404040   0.10.10.10.10.10.50.10.1
表4利用特异性检测副溶血弧菌的引物的PCR结果
序列号   簇 命名 菌株名 神奈川现象                                       PCR
F1&R1 F2&R1 F5&R1 F6&R1 F1&R2 F2&R2 F5&R2 F6&R2
  1   V.p   副溶血弧菌   V99-16T   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  2   V.p   副溶血弧菌   IFO12711T   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  3   V.p   副溶血弧菌   V5   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  4   V.p   副溶血弧菌   V99-10   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  5   V.p   副溶血弧菌   V73   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  6   V.p   副溶血弧菌   V99-55   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  7   V.p   副溶血弧菌   V99-78   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  8   V.p   副溶血弧菌   V20   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  9   V.p   副溶血弧菌   V17   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  10   V.p   副溶血弧菌   V47   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  11   V.p   副溶血弧菌   V99-223   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  12   V.p   副溶血弧菌   V89-655   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  13   V.p   副溶血弧菌   V48   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  14   V.p   副溶血弧菌   V99-215   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  15   V.p   副溶血弧菌   V46   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  16   V.p   副溶血弧菌   V72   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  17   V.p   副溶血弧菌   V83   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  18   V.p   副溶血弧菌   V81   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  19   V.p   副溶血弧菌   V78   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  20   V.p   副溶血弧菌   V84   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  21   V.p   副溶血弧菌   V69   -   +   +   +   +   +   +   +   +
  22   V.p   副溶血弧菌   V99-157   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  23   V.p   副溶血弧菌   V89-056   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  24   V.p   副溶血弧菌   V99-15   +   +   +   +   +   +   +   +
  25   V.p   副溶血弧菌   V99-177   +   +   +   +   +   +   +   +   +
  26   C-2   哈氏弧菌   IFO15634T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  27   C-2   水生弧菌   V33   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  28   C-2   鲨鱼弧菌   IFO15632T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  29   C-2   水生弧菌   V80   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  30   C-2   水生弧菌   V74   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  31   C-2   水生弧菌   V15   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  32   C-2   水生弧菌   V3   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  33   C-2   水生弧菌   V42   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  34   C-2   水生弧菌   V44   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  35   C-2   水生弧菌   V41   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  36   C-2   水生弧菌   V89   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  37   C-2   水生弧菌   V87   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  38   C-2   水生弧菌   V76   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  39   C-2   水生弧菌   V88   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  40   C-2   水生弧菌   V4   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表4利用特异性检测副溶血弧菌之引物的PCR结果
  序列号 簇 命名 菌株名   神奈川现象   PCR
  F1&R1   F2&R1   F5&R1   F6&R1   F1&R2   F2&R2   F5&R2   F6&R2
  41   C-2   水生弧菌   V86   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  42   C-2   坎氏弧菌   IFO15631T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  43   C-2   水生弧菌   V18   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  44   C-1   水生弧菌   V68   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  45   C-1   水生弧菌   V85   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  46   C-1   水生弧菌   V16   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  47   C-1   溶藻弧菌   IFO15630T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  48   C-3   水生弧菌   V70   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  49   C-3   水生弧菌   V71   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  50   C-5   水生弧菌   V77   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  51   C-5   水生弧菌   V82   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  52   C-4   水生弧菌   V45   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  53   C-4   水生弧菌   V8   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  54   C-4   水生弧菌   V10   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  55   C-4   水生弧菌   V13   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  56   C-4   水生弧菌   V6   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  57   C-4   水生弧菌   V9   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  58   C-4   水生弧菌   V7   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  59   C-4   水生弧菌   V14   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  60   C-4   水生弧菌   V11   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  61   C-4   水生弧菌   V12   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  62   C-4   水生弧菌   V79   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  63   C-4   水生弧菌   V43   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  64   C-4   塔氏弧菌   IFO15644T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  65   C-4   海蛹弧菌   IFO15637T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  66   C-4   水生弧菌   V64   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  67   C-4   水生弧菌   V56   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  68   C-4   水生弧菌   V55   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  69   C-4   水生弧菌   V57   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  70   C-4   水生弧菌   V63   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  71   C-4   水生弧菌   V61   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  72   C-4   水生弧菌   V65   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  73   C-4   水生弧菌   V60   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  74   C-4   水生弧菌   V67   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  75   C-4   水生弧菌   V66   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  76   C-4   水生弧菌   V59   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  77   C-4   水生弧菌   V58   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  78   C-4   水生弧菌   V62   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  79   C-4   水生弧菌   V19   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  80   C-4   溶蛋白弧菌   IFO13287T   -   -   -   -   -   -   -   -   -
表4利用特异性检测副溶血弧菌之引物的PCR结果
  序列号 簇 命名 菌株名   神奈川现象                                    PCR
  F1&R1   F2&R1   F5&R1   F6&R1   F1&R2   F2&R2   F5&R2   F6&R2
  81   希瓦菌   V51   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  82   希瓦菌   V49   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  83   希瓦菌   V53   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  84   希瓦菌   V50   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  85   希瓦菌   V52   -   -   -   -   -   -   -   -   -
工业适用性
就检测的准确性来说，本发明的rpoD基因引物和探针是优秀的。这是因为它们的设计基于对副溶血弧菌种系关系的彻底认识，通过这种认识对如何提高特异性进行了研究。因此，在细菌不从食物中分离及同属细菌物种共存的条件下，rpoD基因引物和探针用于直接检测有着巨大优势。
序列表说明
SEQ ID No.s 9～12为引物。
于2001年8月3在日本专利局提交、要求享有优先权、专利申请号为2001-235806的说明书内容，包括权利要求书和附图，在该说明书中引入作为参考。
                             序列表
<110>Nichirei Corporation
<120>副溶血弧菌的鉴定
<130>PH-1546-PCT
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>807
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>1
actcgcraag gcgaaatcga catcgcaaaa cgcattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60
tcgtctgttg ctgaataccc tggcactatt ccttacatcc tagagcaatt tgataargtt 120
caggcagaag arcttcgtct gactgattta atctctggct ttgtagatcc tgacgctgac 180
gatacagcwg cgccaaccgc gactcacatc ggttctgarc tgtctgaarc tcaattagaa 240
gaggaagacg aagaagacct agaagatgat gaagaragcg atgacgattc agatgaytcr 300
gaagaagatg taggtattga yccagagctr gcgcttgaga aattcaacca gctacgcagc 360
acataccaaa atcttcagct agcgatcaat gagtacggct acgacagccc gaaagcaacc 420
gttgctaacg aaatgatgct rgacgtattc aaagaattcc gtctaacacc aaaacagttc 480
gaccacctag tgaacgaact tcgyacwgca atggatcgcg ttcgtactca agaacgtttg 540
atcatgaagt ctgtggttga atacggcaaa atgccgaaga aatcgttyat tgccctattc 600
actggtaacg aatcaagtga tgcatggcta gacgagatcc tmgcatctga caagccatac 660
gctgagaaaa tcaaacgtaa cgaagaagag atccgtcgtt caatckckaa gttaaaaatg 720
attgaagaag agacatmtct aaacgtacar aacattaaag acatcagccg tcgcatgtct 780
atcggtgaag cgaaagcacg ccgtgcg                                     807
<210>2
<211>807
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：除溶血弧菌外的水生弧菌的共有序列
<400>2
actcgcgaag gcgaaatcga catcgcaaaa cgtattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60
tcgtctgttg ctgaataccc wggyacdaty ccrtacatyc ttgagcartt tgayaargtw 120
caagcwgaag aaytdcgtct wacwgacctw atytcwgght ttgthgaycc wgaygchgay 180
gayacvrcwg chccracrgc racrcacaty ggttctgarc tractgaatc tcagytagaa 240
gawgaagayg awgaagacgt tgatgamgac gaagawrgyg aygayrrykm wgatgahdcw 300
gargaagatg twggtatyga yccwgarytd gcgctwgaga aattcaacca rctacgcagy 360
acvtaycaaa aycttcaryt wgcaatcaac garyacggyt ayravagycc kaaagcracm 420
gtwgcwaayg arwtgatgct agacgtatty mrmgarttyc gtctracrcc waaacagtty 480
gaycacytag traaygaayt rcgyacnkcd atggatcgyg ttcgtacwca agarcgyytg 540
atcatgaark cwryngttga atacggcaaa atgccgaaga aatcrttyat ygcrctgtty 600
acwggyaayg aatcwashga wgcwtggytr gatgarrtyy twkcwtcwga yaagccatac 660
gctgaraara tyaaacgtar cgaagaagar atycgycgyt caatcrctaa rctaaaratg 720
attgarrahg aracytmtct rammgtwcar aacatyaaag acatcagccg tcgyatgtmt 780
atcggtgaag craaagmkcg ycgtgck                                     807
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>3
agarcttcgt ctgactgatt                                             20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>4
aagaagacct agaagatgat                                             20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>5
cagcwgcgcc aaccgcgact                                             20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>6
ctgarctgtc tgaarctcaa                                             20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>7
gttaccagtg aatagggca                                              19
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>副溶血弧菌
<400>8
attcgttacc agtgaatagg                                             20
<210>9
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
acgactgacc cggtacgcat gtayatgmgn garatgggna cngt                  44
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acgactgacc cggtacgcatgta                                          23
<210>11
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
atagaaataa ccagacgtaa gttngcytcn accatytcyt tytt                  44
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
atagaaataa ccagacgtaa gtt                                         23
4
5/5

Claims (17)

1.由SEQ ID NO：1中的15个或以上的连续的核苷酸组成的链，其可用于设计特异性基因扩增引物或探针，其包括为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)组群所特有的、序列表中SEQ ID NO：1所示的编码RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD中第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
2.一种基因扩增引物，它包含由SEQ ID NO：1中15个或以上连续核苷酸组成的链，或其相应的互补链，所述核苷酸包括为副溶血弧菌组群所特有的、序列表中SEQ ID NO：1所示的编码RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD中第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
3.权利要求2的基因扩增引物，其包含一条含有序列表中SEQ IDNO：1的第259、261、264、267和270位核苷酸的链，或其互补链。
4.权利要求2的基因扩增引物，其包含一条含有序列表中SEQ IDNO：1的第141、147和148位核苷酸的链，或其互补链。
5.权利要求2的基因扩增引物，其包含一条含有序列表中SEQ IDNO：1的第192、198和204位核苷酸的链，或其互补链。
6.权利要求2的基因扩增引物，其包含一条含有序列表中SEQ IDNO：1的第223、229和234位核苷酸的链，或其互补链。
7.权利要求2的基因扩增引物，其包含一条含有序列表中SEQ IDNO：1的第594和597位核苷酸的链，或其互补链。
8.权利要求2的基因扩增引物，其中3’端的核苷酸为副溶血弧菌特有的、权利要求2中列举的位置的核苷酸。
9.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-agarcttcgtctgactgatt-3’，或其相应的互补链。
10.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-aagaagacctagaagatgat-3’，或其相应的互补链。
11.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-cagcwgcgccaaccgcgact-3’，或其相应的互补链。
12.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-ctgarctgtctgaarctcaa-3’，或其相应的互补链。
13.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-gttaccagtgaatagggca-3’，或其相应的互补链。
14.权利要求2的基因扩增引物，其包括5’-attcgttaccagtgaatagg-3’，或其相应的互补链。
15.权利要求2-14中任一项的引物在制备无副溶血弧菌的食品中的用途。
16.一种试剂盒，其包含权利要求2-14中任一项的引物。
17.一种检测、定量测定或鉴定副溶血弧菌的探针，它包含由SEQ ID NO：1中15个或以上的连续核苷酸组成的链，其中，所述的链包含为副溶血弧菌组群所特有的、序列表中SEQ ID NO：1所示的编码RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD中第33、93、102、123、141、147、148、192、198、204、223、229、234、243、259、261、264、267、270、384、390、501、594、597、633、712、735和798位的任意核苷酸。
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