JP2003047474A - ＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）配列を用いた腸炎ビブリオ検出、同定、計数方法 - Google Patents

ＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）配列を用いた腸炎ビブリオ検出、同定、計数方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増
幅効率と増幅特異性を有する、高性能な腸炎ビブリオの
検出・定量・同定用特異遺伝子増幅プライマーの作製す
ること。 【解決手段】 本発明者等は、ビブリオ属標準菌株及び
腸炎ビブリオ保存株(毒素遺伝子保有株及び非保有株)の
RNAポリメラーゼσ70因子rpoD遺伝子塩基配列を決め、
その系統関係を明らかにし、腸炎ビブリオに特徴的塩基
を同定し、これを含む高特異性を有するプローブ、及び
高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅用プラ
イマーを設計することを可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本件発明は、遺伝子による微
生物、病原菌の同定・検査の分野、特に腸炎ビブリオの
検査の分野に係るものである。本発明は、夏季に食中毒
の原因となる腸炎ビブリオ菌を、迅速に同定、検査する
方法に係るもので、食品加工分野、公衆衛生分野、及び
臨床検査分野等に属するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、食品衛生の現場では、生化学的な
表現形質により腸炎ビブリオの検査を行っている。食品
衛生検査指針では、被検査試料をTCBS寒天培地に接種・
培養し、形成された白糖非分解性の緑黄色の推定陽性コ
ロニーを得、この緑黄色コロニーに対して種々の生化学
的性状確認試験を行い、判定することとなっている。し
かし、この生化学的性状の確認試験は熟練した技術と多
大な労力と時間を必要とするため、食品製造管理の現場
で実施するには多くの問題が存在する。この従来からの
生化学的性状試験の欠点を補うために、正確かつ迅速簡
便な腸炎ビブリオの検出・同定を目的として、遺伝子に
よる検査方法の開発が試みられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在までの遺伝子を用
いた腸炎ビブリオの検査方法として、以下のような方法
が開発されているが、種々の問題がある。例えば、DNA
ジャイレースβサブユニットをコードするgyrB遺伝子を
ターゲットとした腸炎ビブリオ検出用PCRプライマーが
開発されている(特開平09-252783号、Applied and Envi
ronmental Microbiology,Vol.64,No.2,P.681-687)。し
かしながら、本プライマーは、腸炎ビブリオATCC17802
株とビブリオアルジノリティカスATCC17749株それぞれ1
菌株のみのgyrB遺伝子配列を解析し、両者で配列が異な
る部分を特異的であると推測して作製した物である。従
って、gyrB遺伝子配列に基づいたビブリオ属の系統関係
を把握した上で作製されたものではないために、特異性
の範囲が明らかでない。さらに、コレラ菌毒素遺伝子を
制御する遺伝子として見いだされ、腸炎ビブリオにも存
在することが知られているtoxR遺伝子をターゲットとし
た、PCR法による検出方法も報告されている(Journal of
Clinical Microbiology.1999 Vo1,37 No,4,p,1173-117
7)。しかしながら、当該例のPCRプライマーも先のgyrB
遺伝子を用いた検出プライマーと同様に、腸炎ビブリオ
とコレラ菌という比較的隔たった系統間の、それぞれ1
菌株の遺伝子配列を比較して、2者間で異なる塩基配列
部分を腸炎ビブリオ特異的配列として推測したものであ
る。従って、当該プライマーも、やはり、toxR遺伝子配
列に基づいた系統関係を把握した上で作製されたもので
はないため、特異性の範囲が明らかでない。一方、腸炎
ビブリオが有する毒素の遺伝子に注目した検出法も存在
する(特開平4-293486)。腸炎ビブリオには、赤血球の膜
に穴をあけて溶血させる(神奈川現象と呼ばれる)毒素
(耐熱性溶血毒:Thermostable direct haemolysin:TDH)
を有するタイプと有さないタイプがあることが古くから
知られており、最近では、TDH以外にも、神奈川現象を
起こさないが、下痢を発症させる、TDHとよく似たTRH
(耐熱性溶血毒類似毒:TDH related haemolysin:TRH)と
いう毒素があることも発見されている(1988年:Infect I
mmun. Vol.56, 961-965)。これら腸炎ビブリオの病原性
の原因とされる耐熱性毒素をコードしているそれぞれの
遺伝子tdh及びtrhを特異的に検出するPCRプライマーが
開発されている(特開平4-293486)。しかしながら、全て
の腸炎ビブリオが毒素遺伝子を保有している訳ではな
い。実際、環境由来のほとんどの腸炎ビブリオは毒素遺
伝子を保有していない。他方に、食品衛生の現場では毒
素遺伝子を有さない株を含む全ての腸炎ビブリオ群の総
菌数が重要であると考えられているため、食品衛生検査
指針でも、腸炎ビブリオを毒素の有無に関わらず、検査
することを求めている。したがって、毒素産生能にのみ
注目した毒素遺伝子の検出は生化学検査に基づいた従来
法と互換性がなく、食品衛生管理の現場における検出・
同定方法としては適していない。このように、現在入手
できる腸炎ビブリオの検出・同定用プライマーの実用性
はいずれも十分なものではない。
【０００４】これらの検出法の他にも、tlh(Thermolabi
le haemolysin: Lett Appl Microbiol 1999, Vol.28, 6
6-70)、σ-VPH(FEMS Microbiol Lett 1990;55(3):339-4
5)といった溶血因子や腸炎ビブリオに特異的に存在する
0.76Kbの機能未知のDNA断片(Appl. Environ. Microbio
l. 61(4):1311-1317)を検出する方法が報告されている
が、いずれも腸炎ビブリオを確実に検出できるという証
明がなされておらず、検査現場では事実上使用できな
い。
【０００５】上記のように従来の遺伝子検査方法は、い
ずれも、細菌の「種」が遺伝的な多様性を内包する集団
であることを考慮しておらず、ある細菌集団のメンバー
と推測される菌株の塩基配列がその集団共通又は代表す
る配列としてPCRのプライマーの設計に用いられてい
る。しかしながら、分子進化特に中立的変異により速や
かに蓄積する遺伝子変異を考えると、本来検出されるべ
き菌株がプライマー領域においてわずかに変異したため
に、プライマーとしての適性が減じ、増幅が阻害されて
検出されないこともあり得る。また、系統的分析により
近縁種との差異を考慮していないため、十分な特異性を
持ったプライマーが設計できず、本来検出されるべきで
はない近縁株が検出されると言った誤判定の可能性が危
倶される。
【０００６】そこで、特異性のバックグラウンドが証明
されており、誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な
増幅効率と増幅特異性を有する、高性能な腸炎ビブリオ
の検出・同定・定量用特異遺伝子増幅プライマーの作製
が必要とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】細菌のある系統群の遺伝
子を特異的に検出する方法を作成するためには、検出し
ようとする生物群、並びにその系統的に近縁な生物群の
塩基配列をなるべく多数収集比較する必要がある。ま
た、特異検出ターゲットとする遺伝子は、最も近縁の生
物とも判別可能なように、十分に異なる塩基配列を有し
ている必要がある。この為には、標的遺伝子は、十分早
い進化速度を有していなくてはならない。
【０００８】また、高頻度で水平伝播する遺伝子、例え
ば腸炎ビブリオの毒素遺伝子のように、系統とは無関係
に存在する遺伝子は用いることができない。本発明でタ
ーゲットとして用いたrpoD遺伝子がコードするσ70因子
は、細菌の対数的増殖期の遺伝子発現を制御する因子で
あり、生存に必須の蛋白質である。この為水平伝播しが
たく、また適切な進化速度を有しているため、細菌の系
統解析に適している(Int. J. Syst. Bacteriol. 1998;
48,813-819, Int.J.Syst.Bacteriol. 1999; 49, 87-9
5.)。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明者等は、既にRNAポリメラ
ーゼσ70因子をコードするrpoD遺伝子のPCRダイレクト
シークエンス法による簡便な塩基配列の決定方法を開発
している(特開平8-256798号)。そこで、本発明者等は、
当該方法を用いて、表１に示すビブリオ属標準菌株
（（財）発酵研究所より購入）及び腸炎ビブリオ保存株
(毒素遺伝子保有株及び非保有株)のrpoD遺伝子塩基配列
を決め、その系統関係を明らかにした。即ち、下記表1
に示される供試菌株を2%NaCl添加ブレインハートインフ
ュージョン培地（日水製薬（株）製）で35℃・一晩増菌
培養した菌液1mlよりPUREGENE DNA Isolation Kit(Gent
ra SYSTEMS)を用いて染色体DNAを抽出した。抽出したDN
Aを鋳型として、rpoD増幅ユニバーサルプライマー(特開
平8-256798号に記載のs70S、s70R)を用いて約800bp(大
腸菌K-12株のrpoD遺伝子配列上のポジション334-1125:
アミノ酸配列ポジションでは、112から376に相当する領
域)のrpoD遺伝子断片をPCR法により増幅した。増幅反応
は、耐熱性DNAポリメラーゼ（AmpliTaqGold：Applied B
iosystems製）を用い、GENE MATEサーマルサイクラー(I
SC BioExpress)を使用して行った。反応液は1μg DNA、
50mM KCl、10 mM Tris-HCl pH8.3、1.5 mM MgCl2、0.01
% ゼラチン、各0.2 mMのdNTP、2.5 U のAmpliTaq Gol
d、プライマー各1μMを含む溶液を50μlに調製した。反
応条件は、AmpliTaq Goldの活性化（95℃・10分間）に
続いて、94℃・1分間、56℃・1分間、72℃・1分間の反
応を40サイクル行った後、72℃・10分間伸長反応を行っ
た。得られたPCR産物は、1%アガロースゲル(Sea Plaque
GTG agarose : BioWhittaker Molecular Applications
製)で電気泳動(0.5xTAE、100V・30分間)の後、臭化エチ
ジウムで10分間染色した。紫外線照射下でその存在を確
認し、ゲルより切り出した後、Wizard PCR Preps DNA P
urification System(Promega製)を用いて精製し、シー
ケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応は、上記rpoD
遺伝子用ユニバーサルプライマーに予め付加されている
シーケンス用配列(特開平8-256798号に記載のs70sS、s7
0sR)をプライマーとしてABI PRISM BigDye Terminat
or Cycle Sequenceing Ready Reaction Kit (Appl
ied Biosystems製)を用い、GENE MATEサーマルサイクラ
ー(ISC BioExpress)を使用して行った。反応液は、DNA2
0ng、プライマー3.2 pmol、BigDye Terminator Ready R
eaction Mix8μlを混合し、最終体積20μlに調製した。
サイクルシーケンス反応は、92℃・10分間の加熱後、96
℃・10秒、58℃又は46℃（それぞれs70sS、s70sRに対応
する）・5秒、60℃・4分を25サイクル行った。塩基配列
の解析にはABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER (AppliedB
iosystems製) を用いた。得られた塩基配列は、Clustal
Wコンピュータプログラムを用いて多重アラインメント
解析を行った後、PHYLIPコンピュータプログラムパッケ
ージを用い、木村の２パラメーターモデル(J.Mol.Evo
l、(1980) Vol.16, No.2, p.111・20)で算出した遺伝的
距離に基づいて近隣結合法(Mol.Biol.Evol.Vol.4,No,4.
406-425)により分子系統樹を作成した。
【００１０】この結果、毒素遺伝子(tdh,trh)を有し、
基準株(IF0 12711 T)を含む腸炎ビブリオと同定される
全ての菌株は、ビブリオ属菌株中で独立した単系統をな
すことが明らかとなった（図1参照）。即ち、この系統
に属する細菌群が腸炎ビブリオと判定されるべきことが
示唆された。次に、食品試料から分離したTCBS寒天培地
（日水製薬（株）製）上で腸炎ビブリオ様の緑青色のコ
ロニーを形成する64株について、標準株と同様の手順に
てrpoD遺伝子塩基配列を決定し、分子系統解析を実施し
た。この結果を図2に示した。解析した６４株中１１株
が前述の腸炎ビブリオと判断されるべき系統に属してい
た。そこで、この遺伝子解析の結果を検証する為、生化
学的性状の確認を食品検査指針に記載の1次及び2次確認
テストに準じて検査を行った。即ち、1次確認テストと
して、オキシダーゼ、TSI培地よる乳・白糖分解能、ブ
ドウ糖分解の際のガス発生能、硫化水素産生能、SIM培
地によるインドール産生能、インドールピルビン酸産生
能、運動性の確認、リシンデカルボキシラーゼ活性、Vo
ges-Proskauerテスト、および耐塩性(0,3,7,10%NaC1)に
ついて、更に2次確認テストとして、ONPG、オルニチン
デカルボキシラーゼ活性、アルギニンデヒドラーゼ活性
ならびに各種糖の発酵能(アラビノース、マルトース、
イノシット、キシロース、サリシン、マンニット、マン
ノース、乳糖、白糖)の各項目について試験を行った。
腸炎ビブリオは、1次確認テストについては、オキシダ
ーゼ：陽性、TSI培地における乳・白糖：非分解、硫化
水素：非産生、ブドウ糖分解の際のガス産生：無し、SI
M培地におけるインドール産生能：陽性、インドールピ
ルビン酸産生能：陰性、運動性：陽性、リシンデカルボ
キシラーゼ活性：陽性、Voges-Proskauerテスト：陰
性、耐塩性(0,3,7,10%NaCl)：-、+、+、-、の性状を示
す。更に2次確認テストにおいては、ONPG：陰性、オル
ニチンデカルボキシラーゼ活性：陽性、アルギニンデヒ
ドラーゼ活性：陰性、アラビノース：陽性、マルトー
ス：陽性、イノシット：陰性、キシロース：陰性、サリ
シン：陰性、マンニット：陽性、マンノース：陽性、乳
糖：陰性、白糖：陰性の性状を示す。以上の生化学検査
の結果、先のrpoD遺伝子解析により腸炎ビブリオと判断
されるべき系統に属した食品由来の１１株のみが腸炎ビ
ブリオであると判断された。これらのことから、rpoD遺
伝子の解析によって、腸炎ビブリオ群を正確に判別・同
定出来ることが示された。
【００１１】そこで、腸炎ビブリオ群のみを検出可能な
遺伝子検査法の確立の為、以下の作業を行った。まず、
近縁種間の塩基配列の差異を明らかにするために、腸炎
ビブリオが属する系統と近接する系統とのrpoD遺伝子の
塩基配列を比較し、腸炎ビブリオ群内では保存され、他
のビブリオ属細菌とは異なっている塩基の位置を同定し
た。具体的には、腸炎ビブリオが属する系統群のコンセ
ンサス配列を求めるとともに、本系統と系統学的に近縁
であることが図2により示された他のビブリオ属細菌系
統であるC-1からC-3の系統のコンセンサス配列を比較
し、系統特異的情報を作成した(図3)。この図3より、配
列表中の配列番号１の33,93,102,123,141,147,148,192,
198,204,223,229,234,243,259,261,264,267,270,384,39
0,501,594,597,633,712,735,又は798の位置の塩基が本
系統に特徴的であることが明らかとなった。これら特徴
的塩基を含む本系統に特異的な配列を用いることによ
り、高特異性を有するプローブ、及び高特異性を有しか
つ増幅効率に優れた遺伝子増幅用プライマーを設計する
ことが可能となる。
【００１２】例えば、近縁種と塩基が相違する位置を必
ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続す
る15塩基以上のrpoD遺伝子の塩基配列、好適には、20塩
基以上、更に好適には、20塩基以上で、40塩基以下の連
続するrpoD遺伝子の塩基配列を用いて、プライマーを設
計することができる。同様に近縁種と塩基が相違する位
置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む
連続する15塩基以上のrpoD遺伝子の塩基配列、好適に
は、20塩基以上、更に好適には、20塩基以上で、100塩
基以下の連続するrpoD遺伝子の塩基配列を用いて、プロ
ーブを設計することができる。
【００１３】さらに、当該プライマー及びプローブの作
製には、上記相違塩基を高頻度で含む領域、例えば、25
9,261,264,267,270を含む領域、141,147,148を含む領
域、192,198,204を含む領域、223,229,234を含む領域、
594,597を含む領域が好適に使用できる。また、プライ
マーの場合3'末端が、腸炎ビブリオに特異的塩基である
ことが望ましい。本件発明は、これらプライマー及びプ
ローブを、他の試薬と組み合わせた腸炎ビブリオの検
出、定量又は同定用のキットを包含するものである。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【実施例】〔実施例〕以下、本発明を実施例により詳細
に説明する。実施例はその1様態であり、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。表２に示した腸
炎ビブリオ検出・同定用プライマーを用いて、PCR法に
より腸炎ビブリオを特異的に検出する事を試みた。な
お、請求項10〜15に記載のプライマーは、それぞれ、Ｆ
１，Ｆ２，Ｆ５，Ｆ６，Ｒ１，Ｒ２に当たる。試料とし
て、前記表１に示した供試菌株から抽出した染色体DNA
を鋳型として用いた。使用したプライマーの詳細を表２
に示した。増幅反応は、耐熱性DNAポリメラーゼ（Ampli
Taq Gold：Applied Biosystems製）を用い、GENE MATE
サーマルサイクラー(ISC BioExpress)を使用して行っ
た。反応液はDNA0.1μg、50mM KCl、10 mM Tris-HCl pH
8.3、 1.5 mM MgCl2、0.01% ゼラチン、各0.2 mMのdN
TP、2.5 U のAmpliTaq Gold、プライマー（濃度は表３
参照）を含む溶液を最終体積20μlに調製した。反応条
件は、AmpliTaq Gold の活性化（95℃・10分間）に続い
て、94℃・1分間、アニーリング（温度は表３参照）・1
分間、72℃・1分間の反応を35〜40サイクル行った後に7
2℃・10分の伸長反応を行った。プライマーの組み合わ
せと増幅反応条件を表3に示した。増幅後の反応液5μl
を、2%アガロースゲル（アガロースＳ：（株）ニッポン
ジーン製）で電気永動後(0.5xTAE、100V・30分間)、臭
化エチジウムで10分間染色し、紫外線照射下でrpoD遺伝
子の増幅の有無を確認した。
【００１６】センスプライマー4種類、アンチセンスプ
ライマー2種類を用いて、計8通りのプライマーの組み合
わせにより供試菌株のDNAをスクリーニングした結果、
腸炎ビブリオと判定すべき系統に属するもののみが陽性
となった (表4)。
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】
【００２０】
【発明の効果】本件発明のrpoD遺伝子プライマー及びプ
ローブは、腸炎ビブリオとの系統的関係を把握した上で
設計したものであるため、特異性を向上させる検討が行
われており、検出精度という点で優れている。したがっ
て、食品から菌を単離せず、近縁細菌種が供雑している
状況で直接検出する場合に非常に有利になる。
【００２１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nichirei <120> Identification of V.parahaemolyticus <130> P00-960 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 807 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 1 actcgcraag gcgaaatcga catcgcaaaa cgcattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60 tcgtctgttg ctgaataccc tggcactatt ccttacatcc tagagcaatt tgataargtt 120 caggcagaag arcttcgtct gactgattta atctctggct ttgtagatcc tgacgctgac 180 gatacagcwg cgccaaccgc gactcacatc ggttctgarc tgtctgaarc tcaattagaa 240 gaggaagacg aagaagacct agaagatgat gaagaragcg atgacgattc agatgaytcr 300 gaagaagatg taggtattga yccagagctr gcgcttgaga aattcaacca gctacgcagc 360 acataccaaa atcttcagct agcgatcaat gagtacggct acgacagccc gaaagcaacc 420 gttgctaacg aaatgatgct rgacgtattc aaagaattcc gtctaacacc aaaacagttc 480 gaccacctag tgaacgaact tcgyacwgca atggatcgcg ttcgtactca agaacgtttg 540 atcatgaagt ctgtggttga atacggcaaa atgccgaaga aatcgttyat tgccctattc 600 actggtaacg aatcaagtga tgcatggcta gacgagatcc tmgcatctga caagccatac 660 gctgagaaaa tcaaacgtaa cgaagaagag atccgtcgtt caatckckaa gttaaaaatg 720 attgaagaag agacatmtct aaacgtacar aacattaaag acatcagccg tcgcatgtct 780 atcggtgaag cgaaagcacg ccgtgcg 807 <210> 2 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:consesus sequence among Vibiro spp.other than Vibrio haemolyticus <400> 2 actcgcgaag gcgaaatcga catcgcaaaa cgtattgaag aaggtattaa ccaagttcaa 60 tcgtctgttg ctgaataccc wggyacdaty ccrtacatyc ttgagcartt tgayaargtw 120 caagcwgaag aaytdcgtct wacwgacctw atytcwgght ttgthgaycc wgaygchgay 180 gayacvrcwg chccracrgc racrcacaty ggttctgarc tractgaatc tcagytagaa 240 gawgaagayg awgaagacgt tgatgamgac gaagawrgyg aygayrrykm wgatgahdcw 300 gargaagatg twggtatyga yccwgarytd gcgctwgaga aattcaacca rctacgcagy 360 acvtaycaaa aycttcaryt wgcaatcaac garyacggyt ayravagycc kaaagcracm 420 gtwgcwaayg arwtgatgct agacgtatty mrmgarttyc gtctracrcc waaacagtty 480 gaycacytag traaygaayt rcgyacnkcd atggatcgyg ttcgtacwca agarcgyytg 540 atcatgaark cwryngttga atacggcaaa atgccgaaga aatcrttyat ygcrctgtty 600 acwggyaayg aatcwashga wgcwtggytr gatgarrtyy twkcwtcwga yaagccatac 660 gctgaraara tyaaacgtar cgaagaagar atycgycgyt caatcrctaa rctaaaratg 720 attgarrahg aracytmtct rammgtwcar aacatyaaag acatcagccg tcgyatgtmt 780 atcggtgaag craaagmkcg ycgtgck 807 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 3 agarcttcgt ctgactgatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 4 aagaagacct agaagatgat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 5 cagcwgcgcc aaccgcgact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 6 ctgarctgtc tgaarctcaa 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 7 gttaccagtg aatagggca 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> v.parahaemolyticus <400> 8 attcgttacc agtgaatagg 20
【図面の簡単な説明】
【図１】腸炎ビブリオと他のビブリオ属近縁菌種とのrp
oD遺伝子に基づいた分子系統図
【図２】食品由来腸炎ビブリオ様コロニーのrpoD遺伝子
に基づいた分子系統図
【図３】ビブリオ属におけるrpoD遺伝子塩基配列間特異
性情報図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 武 東京都中央区日本橋箱崎町44−１ 財団法 人東京顕微鏡院 日本橋研究所内 (72)発明者 中川 弘 東京都中央区日本橋箱崎町44−１ 財団法 人東京顕微鏡院 日本橋研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA80 CA09 HA12 4B063 QA19 QQ06 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QX01

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表中の配列番号1のRNAポリメレース
    σ70因子をコードする遺伝子(rpoD)中で、腸炎ビブリオ
    菌群に特有な次の位置番号33,93,102,123,141,147,148,
    192.198,204,223,229,234,243,259,261,264,267,270,38
    4,390,501,594,597,633,712,735,又は798のいずれかの
    塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプロー
    ブの設計に用いることができる配列番号1で表される遺
    伝子の断片。
  2. 【請求項２】 配列表中の配列番号1のRNAポリメレース
    σ70因子をコードする遺伝子(rpoD)中で、腸炎ビブリオ
    菌群に特有な次の位置番号33,93,102,123,141,147,148,
    192,198,204,223,229,234,243,259,261,264,267,270,38
    4,390,501,594,597,633,712,735,又は798のいずれかの
    塩基を含む連続する15塩基以上からなる腸炎ビブリオ検
    出,定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  3. 【請求項３】 請求項2で指定された腸炎ビブリオに特
    有な位置を高頻度で含む領域を用いることを特徴とする
    請求項2記載の腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用遺伝
    子増幅プライマー。
  4. 【請求項４】 配列表中の配列番号1の位置番号259,26
    1,264,267,270の位置の塩基を含む請求項3記載の腸炎ビ
    ブリオ検出、定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  5. 【請求項５】 配列表中の配列番号1の位置番号141,14
    7,148の位置の塩基を含む請求項3記載の腸炎ビブリオ検
    出、定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  6. 【請求項６】 配列表中の配列番号1の位置番号192,19
    8,204の位置の塩基を含む請求項3記載の腸炎ビブリオ検
    出、定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  7. 【請求項７】 配列表中の配列番号1の位置番号223,22
    9,234の位置の塩基を含む請求項3記載の腸炎ビブリオ検
    出、定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  8. 【請求項８】 配列表中の配列番号1の位置番号594,597
    の位置の塩基を含む請求項3記載の腸炎ビブリオ検出、
    定量又は同定用遺伝子増幅プライマー。
  9. 【請求項９】 3'末端の塩基が該腸炎ビブリオに特有な
    請求項2で特定される位置番号の塩基であることを特徴
    とする請求項2記載の腸炎ビブリオ検出、定量又は同定
    用遺伝子増幅プライマー。
  10. 【請求項１０】 5'-agarcttcgtctgactgatt-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  11. 【請求項１１】 5'-aagaagacctagaagatgat-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  12. 【請求項１２】 5'-cagcwgcgccaaccgcgact-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  13. 【請求項１３】 5'-ctgarctgtctgaarctcaa-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  14. 【請求項１４】 5'-gttaccagtgaatagggca-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  15. 【請求項１５】 5'-attcgttaccagtgaatagg-3'及び対応
    する相補鎖からなる腸炎ビブリオ検出、定量又は同定用
    プライマー。
  16. 【請求項１６】 請求項2-15のいずれか1項に記載のプ
    ライマーを用いる腸炎ビブリオを検出、定量又は同定す
    る方法。
  17. 【請求項１７】 請求項2-16のいずれか1項に記載のプ
    ライマーを含む、腸炎ビブリオの検出、定量又は同定用
    のキット。
  18. 【請求項１８】 配列表中の配列番号1のRNAポリメレー
    スσ70因子をコードする遺伝子(rpoD)中で、腸炎ビブリ
    オ菌群に特有な次の位置番号33,93,102,123,141,147,14
    8,192,198,204,223,229,234,243,259,261,264,267,270,
    384,390,501,594,597,633,712,735,又は798のいずれか
    の塩基を含む連続する15塩基以上を含む腸炎ビブリオの
    検出、定量又は同定用プローブ。
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