JPH11285383A - 新規な挿入配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】大腸菌の染色体上の新規な挿入配列の核酸配
列、該挿入配列を利用した迅速かつ簡便な細菌型別方法
を提供する 【解決手段】配列番号１に示される核酸配列または該配
列に相補的な核酸配列を有する新規な挿入配列、該配列
のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列
を含有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレ
オチドである核酸増幅プライマー、熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む細菌の染色体上
に複数のコピーが存在する挿入配列に挟まれた複数の領
域のＤＮＡ断片からＤＮＡ断片を増幅する方法および試
薬。ならびに該ＤＮＡ増幅方法で得られた増幅ＤＮＡ断
片の鎖長を比較する細菌の型別方法。上記挿入配列をベ
ロ毒素遺伝子に挿入することにより、ベロ毒素産生性大
腸菌のベロ毒素産生能を消失させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細菌の染色体上の
新規な挿入配列および該挿入配列に挟まれた複数の領域
のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増
幅するための試薬および該増幅方法ならびに細菌を型別
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】転移因子とは、染色体上で転移し得るＤ
ＮＡ断片で、原核生物から真核生物までの広い範囲の生
物に存在することが知られている。細菌の転移因子は、
挿入配列（ＩＳ）とトランスポゾンに分類される。ＩＳ
は通常、大きさが７６０〜２，０００ｂｐ程度のＤＮＡ
断片であり、その両端に８〜２５ｂｐ程度の逆向きの繰
り返し構造（インバーテッドリピート）を有し、内部に
は転移に必要な酵素であるトランスポゼースをコードす
る配列がみられる。

【０００３】一方、トランスポゾンはインバーテッドリ
ピートおよびトランスポゼースをコードする配列に加え
て、転移には直接関与しない薬剤耐性遺伝子などを併せ
持つ転移因子であり、２つのＩＳの間に薬剤耐性遺伝子
が挟まれた構造のものと、ＩＳ内に薬剤耐性遺伝子が挿
入された構造のものが存在する。

【０００４】また、大腸菌においては染色体上に数種類
のＩＳがあり、それぞれのＩＳについて複数個のコピー
が存在することも知られている。

【０００５】ＩＳをはじめとする転移因子は、その転移
により広く染色体の再編成（挿入、切断、逆位、欠失な
ど）に関与し、細菌の染色体における各種遺伝子群の配
置を変化させる。したがって、細菌の染色体におけるＩ
Ｓの配置は該菌株の特徴を示すものであり、その解析に
よる細菌の型別は特定の細菌の分布あるいは伝搬経路な
どを探る目的で行われる疫学調査にも十分に適用し得
る。特に、近年頻発している病原性大腸菌（Ｏ１５７な
ど）への集団感染においては、食品あるいは食材料に関
する疫学調査の結果、感染の原因と判断し得る食材が同
定された事例もみられた。

【０００６】現在、疫学調査における細菌の型別には、
染色体ＤＮＡの制限酵素切断パターンをパルスフィール
ドゲル電気泳動によって調べる方法が、最も一般的に行
われている。しかし、パルスフィールドゲル電気泳動は
信頼性が高い反面、正確な結果を得るためには技術的に
熟練を要する操作を伴い、さらには結果が判明するまで
に２４時間以上を必要とする問題も指摘されてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、大腸
菌の染色体上の新規なＩＳの核酸配列、ならびに該ＩＳ
に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ
以上の該ＤＮＡ断片を増幅し、該増幅ＤＮＡ断片の鎖長
を比較することにより、迅速かつ簡便に細菌を型別する
方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々鋭意検討したところ、ベロ毒素産
生性大腸菌の産生するベロ毒素２型（ＶＴ２）をコード
する遺伝子およびＶＴ２遺伝子に挿入されることにより
ＶＴ２遺伝子を不活性化するＩＳとして、新規なＩＳを
見出した。

【０００９】すなわち、本発明は配列番号１に示される
核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有すること
を特徴とする新規な挿入配列である。

【００１０】また、本発明は、配列番号１に示される核
酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なく
とも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有すること
を特徴とするオリゴヌクレオチドである。

【００１１】さらに、本発明は配列番号２または３に示
される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のう
ち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含
有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。

【００１２】本発明は、細菌の染色体上に複数のコピー
が存在する挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片
から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための
試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番
号２および３に示される核酸配列または該配列に相補的
な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりな
る核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方
のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離され
た場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を
含むことを特徴とするＤＮＡ断片の増幅用試薬である。

【００１３】また、本発明は細菌の染色体上に複数のコ
ピーが存在する挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ
断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するた
めの試薬であって、プライマーが、配列番号２および３
に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列の
うち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を
含有するオリゴヌクレオチドであり、該プライマーの伸
長生成物が、その相補体から分離された場合に、同じプ
ライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とす
るＤＮＡ増幅用試薬である。

【００１４】また、本発明は、細菌の染色体上に複数の
コピーが存在する挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮ
Ａ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅す
る方法であって、少なくとも２種のプライマーとして、
配列番号２および３に示される核酸配列または該配列に
相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用
し、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から
分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となること
を特徴とするＤＮＡ断片の増幅方法である。

【００１５】さらに、本発明は細菌の染色体上に複数の
コピーが存在する挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮ
Ａ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅す
る方法であって、プライマーとして、配列番号２および
３に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列
のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列
を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、該プライマー
の伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、同
じプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅
方法である。

【００１６】本発明は、上記ＤＮＡ増幅方法で得られた
１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較する
ことを特徴とする細菌の型別方法である。

【００１７】また、本発明は上記ＤＮＡ増幅方法で得ら
れたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖
長を比較することを特徴とする細菌の型別方法である。

【００１８】さらに、本発明は配列番号１に記載される
核酸配列または該配列に相補的な核酸配列をベロ毒素遺
伝子に挿入することにより、ベロ毒素産生性大腸菌のベ
ロ毒素産生能を消失させることを特徴とするベロ毒素産
生性大腸菌のベロ毒素産生能を消失させる方法である。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明の新規なＩＳは、本発明者
らがベロ毒素遺伝子に生じた外来ＤＮＡ断片の挿入を検
出するために、種々鋭意検討している中で、特定の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド（特願平10-47677号)
をプライマーとして、ベロ毒素遺伝子をＰＣＲにより増
幅した際に、分子量の大きなＤＮＡ断片を得たことか
ら、その塩基配列を解析して得たものである。

【００２０】本発明の新規なＩＳ（配列番号１）は、ベ
ロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素２型（ＶＴ２）
をコードする遺伝子に挿入されることにより、ＶＴ２遺
伝子を不活性化するＩＳである。また、ＶＴ１遺伝子を
不活性化できる可能性も有する。該ＩＳは１，３１０ｂ
ｐのＤＮＡ断片であり、その両端にＩＳの特徴である２
５ｂｐからなるインバーテッドリピートを有し、内部に
はトランスポゼースをコードする配列が見られる。

【００２１】通常、細菌の染色体上には１種類のＩＳに
ついて、複数個のコピーが存在する。本発明のＩＳ（配
列番号１）はベロ毒素をコードする遺伝子とは無関係
に、染色体上に複数存在し得る。したがって、該ＩＳの
存在はベロ毒素産生性大腸菌のみに限定されるものでは
ない。

【００２２】また、該ＩＳを発見した際、該ＩＳがベロ
毒素遺伝子に挿入されることにより該遺伝子が不活性
化、すなわちベロ毒素の産生能が消失していた。したが
って、該ＩＳを人為的にベロ毒素遺伝子に挿入すること
により、ベロ毒素産生性大腸菌のベロ毒素産生能を消失
させることが可能である。

【００２３】本発明のオリゴヌクレオチドは、新規なＩ
Ｓ（配列番号１）から選択された、ＤＮＡ断片であっ
て、少なくとも連続した１５塩基、好ましくは２０〜３
５塩基よりなる核酸配列を含有する。該オリゴヌクレオ
チドは、細菌の染色体上に複数存在する該ＩＳに挟まれ
た複数の領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該
ＤＮＡ断片を増幅する。複数の領域のＤＮＡ断片はラン
ダムに選択される。

【００２４】本発明のオリゴヌクレオチドは、新規なＩ
Ｓ（配列番号１）の両端のインバーテッドリピートから
それぞれ選択され、配列番号２および３に示される核酸
配列（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の少なくとも連
続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する。該オリゴ
ヌクレオチドは、細菌の染色体上に複数のコピーが存在
するＩＳに挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片、すなわ
ち、あるＩＳと他のＩＳの間に存在するＤＮＡ断片から
ランダムに選択された１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片
を増幅する。

【００２５】本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマ
ーとして使用されるが、特に遺伝子増幅用のプライマー
として使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴ
ヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しよ
うとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの
伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択
される。

【００２６】また、本発明のオリゴヌクレオチドはシー
クエンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され
得る。さらには、検出用プローブとしても使用可能であ
る。

【００２７】本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号
２および３に示される塩基配列またはそれらの相補配列
の全域を使用する必要はない。配列表の塩基配列および
その相補配列に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反
応条件などに合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算
することにより決定され得る。しかし、プライマーに十
分な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した１
５塩基、さらに望ましくは、２０塩基の長さが必要であ
る。

【００２８】プライマーが十分な特異性を有するために
は、３’末端の塩基は配列表の核酸配列に示される３’
末端の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目
的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置
換を行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を
及ぼさない程度に、ＩＳの塩基配列に従って、プライマ
ーの５’末端側をさらに延長して使用してもよい。

【００２９】本発明では、上記少なくとも２種のオリゴ
ヌクレオチドを増幅用プライマーとして使用し、一方の
プライマーの伸長生成物は、その相補体から分離された
場合、他方のプライマーの鋳型となるように配列を選択
する必要がある。

【００３０】遺伝子増幅に用いるプライマーとしては、
上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この
遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ（polymerase chain r
eaction)法が用いられる。

【００３１】上述したように、各種試料からの細菌の染
色体上に複数のコピーが存在するＩＳに挟まれた複数の
領域のＤＮＡ断片から、１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ
断片を増幅するには、配列番号２および３にそれぞれ示
されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いら
れ得る。しかし、配列番号２および３にそれぞれ示され
るオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増
幅されたＤＮＡを、さらに配列番号２および３にそれぞ
れ示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅すること
によって、より高感度の増幅が可能となることが予想さ
れる。このとき使用する外側のプライマーは、該ＩＳに
特異的であることが望ましいが、特異性の低いプライマ
ーも使用し得る。

【００３２】細菌の染色体上に複数のコピーが存在する
ＩＳに挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つまたは
それ以上の該ＤＮＡ断片の増幅において、配列番号２お
よび３にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合
わせを用いることが必要である。このことは、増幅反応
における特異性には、使用する２つのオリゴヌクレオチ
ドの相乗効果が重要であることによる。また、さらに特
異性を高めるためには、増幅に使用するプライマーの濃
度をできるだけ低く抑えることも重要である。

【００３３】本発明では、プライマーとして、配列番号
２および３に示される核酸配列または該配列に相補的な
核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる
核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、該プラ
イマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合
に、同じプライマーの鋳型となるプライマー１種を使用
することも可能である。

【００３４】本発明の細菌の染色体上に複数コピー存在
するＩＳに挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つま
たはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅用試薬は、具体的に
は、少なくとも２種のプライマーが、配列番号２および
３に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列
のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列
を含有する、細菌の染色体上に複数コピー存在するＩＳ
に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片からランダムに選択
された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するた
めのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの
伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方
のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む。

【００３５】本発明の増幅用試薬は、上記少なくとも２
種のプライマーに代えて、配列番号２および３に示され
る核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少
なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する
オリゴヌクレオチドであり、該プライマーの伸長生成物
が、その相補体から分離された場合に、同じプライマー
の鋳型となるプライマー１種を使用してもよい。

【００３６】上記プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量が含
まれるが、例えばＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／
ｍｌ、ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ、プライマーは１〜
１０００ｎＭ程度が含められる。

【００３７】さらに、本発明の試薬には、細菌の染色体
上に複数コピー存在するＩＳに挟まれた複数の領域のＤ
ＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上
の該ＤＮＡ断片を単離するための工程に適した緩衝液お
よび当該ＤＮＡ断片を増幅するに適した緩衝液を併せて
含めてもよい。さらに増幅したＤＮＡ断片を検出するた
めの試薬も、検出法に併せて各種組み合わせておくこと
もできる。

【００３８】さらには、本発明では上記増幅方法で得ら
れた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較
することにより、細菌の型別が可能となる。具体的に
は、本発明の細菌を型別する方法は、上記増幅方法で得
られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片を電気泳動
などにより検出し、該増幅ＤＮＡ断片の鎖長を複数の試
料間で比較することを特徴とする。

【００３９】上述のように、細菌の染色体上には１種類
のＩＳについて複数個のコピーが存在する。また、ＩＳ
をはじめとする転移因子の転移などにより細菌の染色体
における各種遺伝子群の配置は様々に変化していること
から、細菌の染色体におけるＩＳの配置は該菌株の特徴
となり得る。細菌の染色体上に複数コピー存在するＩＳ
に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片の鎖長は、それぞれ
に対応するＩＳ間の距離を示し得ることから、該ＤＮＡ
断片をランダムに増幅し、該増幅ＤＮＡ断片長のパター
ンを複数の試料間で比較することにより、迅速かつ簡便
な細菌の型別が可能となる。

【００４０】本発明において、増幅する遺伝子はあらゆ
る材料または環境中に存在する細菌由来の遺伝子である
が、単離培養された菌体の遺伝子を増幅することも含ま
れる。また、本発明における試料には、上記の各種材料
や培養菌体の他、これらより単離および精製された核酸
なども含まれる。

【００４１】すなわち、本発明における試料としては、
上記の各種材料を直接、用いる場合の他に、上記の各種
材料の培養液、またはそこから祖抽出または精製された
核酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から
単離された寒天培地上の菌体またはその培養液、または
そこから粗抽出または精製された核酸なども試料として
用いられ得る。

【００４２】本発明の挿入遺伝子は、ベロ毒素１型（Ｖ
Ｔ１）および２型（ＶＴ２）の両遺伝子を保有するにも
かかわらず、ベロ毒素１型（ＶＴ１））を産生するが、
ベロ毒素２型（ＶＴ２）を産生しないベロ毒素産生性大
腸菌（ＶＴＥＣ菌株）から見出された遺伝子であり、Ｖ
Ｔ２遺伝子に挿入されたことにより、該菌株のＶＴ２産
生能が消失、すなわちＶＴ２遺伝子が不活性化されるこ
とが確認されているから、該挿入遺伝子をベロ毒素遺伝
子に挿入することにより、ベロ毒素産生性大腸菌のベロ
毒素産生能を消失させることが可能であると考える。

【００４３】

【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に
説明する。 実施例１ （１）オリゴヌクレオチドの合成 細菌の染色体上に複数のコピーが存在するＩＳに挟まれ
た複数の領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該
ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、配
列番号１に示される核酸配列から選択し、その配列は、
配列番号２および３にそれぞれ示される。プライマー
１：配列番号２のうち、１〜２３番目、プライマー２：
配列番号３のうち、１〜２３番目 該オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザ
ー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成する
ことにより得た。手法はＡＢＩ社のマニュアルに従い、
各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５
℃にて一夜実施した。精製はＨＰＬＣ（ベックマン製）
を用い、逆相クロマトカラム（ナカライテスク製）にて
実施した。

【００４４】（２）試料の調製 由来の異なるベロ毒素産生性大腸菌６株の菌体コロニー
をそれぞれ直接、ＰＣＲの試料として使用した（表１参
照）。寒天培地上の菌体コロニー（１白金耳）を水１０
０μｌに懸濁し、そのうちの１μｌをＰＣＲに使用し
た。

【００４５】

【表１】

【００４６】（３）ＰＣＲ 配列番号２および３に示されるオリゴヌクレオチド（プ
ライマー１および２）を、それぞれＰＣＲのプライマー
として用いた。反応液組成は、プライマー１および２を
それぞれ０．２μＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄ
ＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．３５ｍＭ、熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｄａｓｈ：東洋紡製）２５単
位／ｍｌ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡製）
である。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液
（菌体コロニー懸濁液）１μｌを添加し、反応液量を１
００μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下
の通りである： 熱変性： ９４℃、３０秒 アニーリングおよび伸長反応： ７０℃、８分 上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り
返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサ
ーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて
行った。

【００４７】（４）検出 増幅反応後の反応液１０μｌを１％アガロースゲルにて
電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線
照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧
１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の
条件は、マニアティス（Maniatis）らのモレキュラー・
クローニング（Molecular Cloning ）（1982年）に記載
の技法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に
泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参
考とした。

【００４８】（５）結果 増幅ＤＮＡ断片の検出に用いたアガロースゲル電気泳動
を図１に示す。

【００４９】図１から明らかなように、上記増幅方法に
より、由来の異なるベロ毒素産生性大腸菌（レーン１〜
６）について、明らかにパターンの異なる増幅ＤＮＡ断
片が得られた。すなわち、本発明により、迅速かつ簡便
な細菌の型別が可能であることを示している。

【００５０】

【発明の効果】本発明により、技術的な熟練および長時
間を要するパルスフィールドゲル電気泳動などを行うこ
となく、迅速かつ簡便に細菌を型別できる。したがっ
て、本発明は疫学調査などにも応用できる。また、本発
明で開示されたＩＳを発見した際、該ＩＳがベロ毒素遺
伝子に挿入されることにより該遺伝子が不活性化、すな
わちベロ毒素の産生能が消失していた。したがって、該
ＩＳを人為的にベロ毒素遺伝子に挿入することにより、
ベロ毒素産生性大腸菌のベロ毒素産生能を消失させるこ
とが可能である。

【００５１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1310 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列の特徴 起源：Verotoxin-producing Escherichia coli 配列 TGAACCGCCC CGGAAATCCT GGAGACTAAA CTCCCTGAGA AAGAGGTAAA CAGGATGACT 60 AAAAATACTC GTTTTTCCCC CGAAGTCCGT CAGCGGGCGA TTCGTATGGT TCTGGAAAGT 120 CAGGATGAAT ATGACTCACA GTGGGCGGCA ATTTGTTCCA TTGCCCCAAA GATTGGCTGT 180 ACGCCGGAGA CTCTGCGTGT CTGGGTTCGC CAGCATGAGC GGGATACCGG GGGCGGTGAT 240 GGTGGGCTCA CCAGCGCTGA ACGTCAGCGT CTGAAAGAGC TGGAACGTGA AAATCGTGAA 300 CTGCGCCGCA GTAACGATAT CCTTCGCCAG GCTTCCGCTT ATTTTGCGAA GGCGGAGTTC 360 GACCGCCTCT GGAAAAAATG ATGCCACTGC TGGATAAGCT GCGTGAGCAG TACGGGGTCG 420 GACCGGTATG CAGCGAACTG CATATTGCCC CGTCAACGTA TTACCATTGT CAGCAACAGC 480 GACATCATCC GGATAAACGC AGTGCCCGTG CGCAGCACGA CGACTGGCTG AAGAGAGAGA 540 TACAGCGCGT ATACGATGAA AATCATCAGG TGTACGGTGT GCGTAAAGTC TGGCGTCAGT 600 TGTTACGGGA AGGAATCAGG GTGGCCAGAT GTACAGTGGC ACGTCTCATG GCGGTTATGG 660 GACTTGCCGG TGTTCTCCGG GGTAAAAAGG TCCGTACGAC CATCAGCCGG AAAGCCGTTG 720 CCGCAGGCGA CCGCGTAAAC CGTCAGTTCG TGGCAGAACG ACCTGACCAG CTGTGGGTGG 780 CTGATTTTAC TTACGTCAGC ACATGGCAGG GCTTCGTCTA TGTGGCGTTT ATCATTGATG 840 TGTTTGCCGG ATACATCGTG GGGTGGCGGG TCTCATCGTC TATGGAAACG ACATTCGTGC 900 TGGATGCGCT GGAGCAGGCG TTGTGGGCCC GTCGTCCGTC TGGCACCATC CATCACAGCG 960 ATAAAGGCTC TCAGTATGTG TCACTGGCCT ATACGGAGCG ACTAAAAGAA GCCGGATTAC 1020 TGGCATCAAC AGGGAGTACA GGCGACTCGT ATGACAACGC GATGGCTGAG AGCATCAATG 1080 GTCTTTACAA AGCGGAGGTA ATACACCGTA AGAGCTGGAA AAACCGTGCA GAAGTGGAAC 1140 TGGCCACACT AACGTGGGTG GACTGGTATA ACAATCGACG ATTGCTGGGA AGGCTGGGCC 1200 ATACTCCTCC GGCAGAAGCA GAAAAAGCTT ATTATGCTTC CATCGGAAAC GATGATCTGG 1260 CAGCCTGAGT TCACAGATAA AACACTCTCC AGGAAACCCG GGGCGGTTCA 1310

【００５２】 配列番号：２ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２３ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：新規なＩＳのインバーテッドリピートと相補的な配列を有する。 配列 CTCCAGGAAA CCCGGGGCGG TTC 23

【００５３】配列番号：３ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：１．．２３ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：新規なＩＳのインバーテッドリピートと相補
的な配列を有する。 配列 CTCCAGGATT TCCGGGGCGG TTC 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 由来の異なるベロ毒素産生性大腸菌の菌体コ
ロニー中の遺伝子から、本発明のオリゴヌクレチドをプ
ライマーとして使用して増幅したＤＮＡ断片を示す図面
に代わる電気泳動写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示される核酸配列または該
   配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする新規
   な挿入配列。
2. 【請求項２】 配列番号１に示される核酸配列または該
   配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１
   ５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号２または３に示される核酸配列
   または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連
   続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴
   とするオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 細菌の染色体上に複数のコピーが存在す
   る挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つ
   またはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であ
   って、少なくとも２種のプライマーが、配列番号２およ
   び３に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配
   列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配
   列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライ
   マーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合
   に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定
   性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むこ
   とを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
5. 【請求項５】 細菌の染色体上に複数のコピーが存在す
   る挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つ
   またはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であ
   って、プライマーが、配列番号２および３に示される核
   酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なく
   とも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリ
   ゴヌクレオチドであり、該プライマーの伸長生成物が、
   その相補体から分離された場合に、同じプライマーの鋳
   型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄ
   ＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅
   用試薬。
6. 【請求項６】 細菌の染色体上に複数のコピーが存在す
   る挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つ
   またはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅する方法であっ
   て、少なくとも２種のプライマーとして、配列番号２お
   よび３に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸
   配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸
   配列を含有するオリゴヌクレオチドを使用し、一方のプ
   ライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場
   合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とする
   ＤＮＡ増幅方法。
7. 【請求項７】 細菌の染色体上に複数のコピーが存在す
   る挿入配列に挟まれた複数の領域のＤＮＡ断片から１つ
   またはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅する方法であっ
   て、プライマーとして、配列番号２および３に示される
   核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少な
   くとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオ
   リゴヌクレオチドを使用し、該プライマーの伸長生成物
   が、その相補体から分離された場合に、同じプライマー
   の鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
8. 【請求項８】 請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法
   で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長
   を比較することを特徴とする細菌の型別方法。
9. 【請求項９】 請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法
   で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断
   片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の型別方法。
10. 【請求項１０】 配列番号１に記載される核酸配列また
    は該配列に相補的な核酸配列をベロ毒素遺伝子に挿入す
    ることにより、ベロ毒素産生性大腸菌のベロ毒素産生能
    を消失させることを特徴とするベロ毒素産生性大腸菌の
    ベロ毒素産生能を消失させる方法。