JP2004057009A - アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの染色体上の新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の核酸配列、該挿入配列を利用した迅速かつ簡便な細菌検出方法を提供する。
【解決手段】２種類の特定の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有する新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域、該配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドである核酸増幅プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片を増幅する方法および試薬。ならびに該ＤＮＡ増幅方法で得られた増幅ＤＮＡ断片を確認する細菌の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】２種類の特定の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有する新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域、該配列のうち少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドである核酸増幅プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片を増幅する方法および試薬。ならびに該ＤＮＡ増幅方法で得られた増幅ＤＮＡ断片を確認する細菌の検出方法。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子および該遺伝子を特異的に増幅するための試薬および該増幅方法ならびにアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は嫌気性細菌で、近年歯周病の起因菌（歯周病菌）として注目されている。歯周病は歯を支える組織（歯肉）に炎症を起こす病気であり、歯周病菌が引き起こす感染症である。最近の研究により、歯周病菌は歯だけでなく全身の病気と関連している可能性が示唆されており、感染に対する早期診断および早期治療が極めて重要であることから該細菌の迅速な検出方法が望まれている。
【０００３】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出および同定する方法としては、市販の細菌同定キットを利用する手段が知られている。該キットは複数の生化学試験の結果から得られるプロファイルより細菌を同定する方法であが、歯周病菌の生育速度が遅いために、結果の判明までに数日から数週間を要する。そこで現在、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて増幅する方法が注目されている。
【０００４】
しかし口腔内に存在する細菌の種類が多い、すなわちアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスと類似した遺伝子を保有する近縁の細菌が多く存在するため、ＰＣＲ法によりアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの遺伝子を特異的に増幅することは困難である。そこで、菌体の培養法を伴う検査法すなわち形態学的検索や生化学試験と、ＰＣＲ法に代表される遺伝子検査が合わせて行われている（足本ら、Ｄｅｎｔａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ誌・９４巻・５１６−５２０頁・１９９９年）。しかしアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出に迅速性および簡便性が要求されていることを考慮すると、時間を要する培養を伴わないＰＣＲ法のみを用いて該細菌を特異的に増幅することが非常に効果的であると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスに特異的な遺伝子領域を使用して、試料中の該遺伝子を特異的に増幅し、該細菌を迅速に検出するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するためにアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスおよび他の歯周病関連細菌の遺伝子に関して種々鋭意検討した結果、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列（１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域）が該菌株に特異的であることを見出し、それを用いた遺伝子増幅法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスには複数の１６Ｓリボソーム遺伝子および２３Ｓリボソーム遺伝子が存在するため、該細菌には１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域も複数箇所存在する。本発明者らは、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスには２種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域が存在することを発見した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域。
［２］配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［４］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［５］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［６］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［７］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［８］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［９］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［１０］試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
［１１］試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系にて３５サイクルの遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列を解析して得たものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１または２）から選択されたＤＮＡ断片であって、少なくとも連続した１５塩基、好ましくは２０〜３５塩基よりなる核酸配列を含有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な２種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１または２）の間で配列が共通する部分からそれぞれ選択され、配列番号３および４に示される核酸配列（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用されるが、特に、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅用のプライマーとして使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しようとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択される。
また、本発明のオリゴヌクレオチドはシークエンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され得る。さらには、検出用プローブとしても使用可能である。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３および４に示される塩基配列またはそれらの相補配列の全域を使用する必要はない。配列表の塩基配列およびその相補配列に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反応条件などに合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算することにより決定され得る。しかし、ＰＣＲの場合、プライマーに十分な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した１５塩基、さらに望ましくは、２０塩基の長さが必要である。プライマーが短いと、それに応じてアニール温度を下げることになるので特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。逆にプライマーが長すぎるとプライマー同士の非特異的な反応によりターゲットの増幅量が落ち、さらに余計なアニーリングにより特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。したがって、２５〜３０塩基程度が増幅量の面で有利だと考えられる。
【００１２】
プライマーが十分な特異性を有するためには、３’末端の塩基は配列表の核酸配列に示される３’末端の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置換を行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を及ぼさない程度に、１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の塩基配列に従って、プライマーの５’末端側をさらに延長して使用してもよい。
本発明では、上記少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを増幅用プライマーとして使用し、一方のプライマーの伸長生成物は、その相補体から分離された場合、他方のプライマーの鋳型となるように配列を選択する必要がある。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、生物の細胞内で行われる核酸合成反応を利用した方法またはデオキシリボヌクレオチドを化学的に反応させる方法などにより製造することが出来る。
【００１４】
本発明のＤＮＡ増幅方法に用いるプライマーとしては、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域、好ましくは配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、あるいは、さらに好ましくは配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチドなど、上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ法が用いられる。
【００１５】
本発明のＤＮＡ増幅方法において、上述したように、各種試料に存在するアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から、１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するには、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いられ得る。そして、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増幅されたＤＮＡを、さらに配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することによって、より高感度の増幅が可能となることが予想される。このとき使用する外側のプライマーは、該１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に特異的であることが望ましいが、特異性の低いプライマーも使用し得る。
【００１６】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からの１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅において、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることが必要である。このことは、増幅反応における特異性には、使用する２つのオリゴヌクレオチドの相乗効果が重要であることによる。また、さらに特異性を高めるためには、増幅に使用するプライマーの濃度をできるだけ低く抑えることも重要である。
【００１７】
本発明のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅用試薬は、具体的には、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマーを含むか、より好ましくは少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等を含む。
【００１８】
本発明の増幅用試薬において、上記プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量を含む。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。
【００１９】
さらに、本発明の試薬には、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を単離するための工程に適した緩衝液および当該ＤＮＡ断片を増幅するに適した緩衝液を併せて含めてもよい。さらに増幅したＤＮＡ断片を検出するための試薬も、検出法に併せて各種組み合わせておくこともできる。
【００２０】
本発明の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に必要なマグネシウム塩を併せて含むことができ、好ましくは０．５ｍＭ〜４ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの濃度範囲で添加できる。また、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に好ましい条件として、増幅反応中のｐＨを６．５〜９．０好ましくは７．０〜８．０に設定することが好ましい。
【００２１】
本発明において、増幅する遺伝子は、患者から採取した組織片や唾液、食品など、あらゆる材料中に存在する細菌由来の遺伝子であるが、単離培養された菌体の遺伝子を増幅することも含まれる。また、本発明における試料には、上記の各種材料や培養菌体の他、これらより単離および精製された核酸なども含まれる。
すなわち、本発明における試料としては、上記の各種材料を直接、用いる場合の他に、上記の各種材料の培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から単離された寒天培地上の菌体またはその培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸なども試料として用いられ得る。
【００２２】
本発明の細菌検出方法は、上記ＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。或いは、上記ＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。
【００２３】
本発明の細菌検出方法は、試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片を得ることができる。
このとき、測定系中にはさらに、プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことができるが、反応阻害物を含ませることは好ましくない。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。最適な組合せの１つとしては、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系が挙げられる。
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのＣＦＵは、該菌を生育に適した条件で平板培養した場合に生じる該菌のコロニー数により定義される。アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスは、例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。ＡＴＣＣから分与された菌株にはＰｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔが添付されており、生育に適した条件とは、例えば、ＡＴＣＣが発行したＰｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔに記載された培養方法をいう。
遺伝子増幅反応サイクルは、３５サイクルが増幅ＤＮＡ断片の収量の点で好ましいが、該増幅ＤＮＡ断片を検出し得る条件であれば特に制限はない。
なお、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られているか否かは、増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行うことにより確認できる。一般に、電気泳動でのエチジウムブロマイド染色による検出限界は１０ｎｇよりやや少なめであると言われていることから、検出が可能であれば増幅ＤＮＡ断片は１０ｎｇ以上あると判断する。
【実施例】
以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。
【００２４】
実施例１
（１）オリゴヌクレオチドの合成
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列から選択し、その配列は、配列番号３および４にそれぞれ示される。プライマー１：配列番号３のうち、１〜２６番目、プライマー２：配列番号４のうち、１〜３０番目
該オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成することにより得た。手法はＡＢＩ社のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃にて一夜実施した。精製はＨＰＬＣ（ベックマン製）を用い、逆相クロマトカラム（ナカライテスク製）にて実施した。
【００２５】
（２）試料の調製
歯周病関連細菌６株の菌体コロニーをそれぞれ直接、ＰＣＲの試料として使用した（表１参照）。寒天培地上の菌体コロニー１００，０００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を水１００μｌに懸濁し、そのうちの１μｌをＰＣＲに使用した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
（３）ＰＣＲ
配列番号３および４に示されるオリゴヌクレオチド（プライマー１および２）を、それぞれＰＣＲのプライマーとして用いた。反応液組成は、プライマー１および２をそれぞれ０．２μＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｄａｓｈ：東洋紡製）２５単位／ｍｌ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡製）である。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液（菌体コロニー懸濁液）１μｌを添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
熱変性： ９４℃、２０秒
アニーリング： ６０℃、５秒
伸長反応： ７４℃、３０秒
上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて行った。
【００２８】
（４）検出
増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
【００２９】
（５）結果
増幅ＤＮＡ断片の検出に用いたアガロースゲル電気泳動を図１に示す。
図１から明らかなように、上記増幅方法により、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（レーン１）についてのみ増幅ＤＮＡ断片が得られた。一般に、電気泳動でのエチジウムブロマイド染色による検出限界は１０ｎｇよりやや少なめであると言われていることから、増幅ＤＮＡ断片は１０ｎｇ以上あると推定される。すなわち、本発明の方法により、迅速かつ簡便なアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出が可能であることを示している。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、あらゆる材料中から簡便、迅速、かつ特異的にアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子を増幅し、該細菌を迅速に検出することができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】歯周病関連細菌の菌体コロニー中の遺伝子から、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅したＤＮＡ断片を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子および該遺伝子を特異的に増幅するための試薬および該増幅方法ならびにアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は嫌気性細菌で、近年歯周病の起因菌（歯周病菌）として注目されている。歯周病は歯を支える組織（歯肉）に炎症を起こす病気であり、歯周病菌が引き起こす感染症である。最近の研究により、歯周病菌は歯だけでなく全身の病気と関連している可能性が示唆されており、感染に対する早期診断および早期治療が極めて重要であることから該細菌の迅速な検出方法が望まれている。
【０００３】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出および同定する方法としては、市販の細菌同定キットを利用する手段が知られている。該キットは複数の生化学試験の結果から得られるプロファイルより細菌を同定する方法であが、歯周病菌の生育速度が遅いために、結果の判明までに数日から数週間を要する。そこで現在、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて増幅する方法が注目されている。
【０００４】
しかし口腔内に存在する細菌の種類が多い、すなわちアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスと類似した遺伝子を保有する近縁の細菌が多く存在するため、ＰＣＲ法によりアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの遺伝子を特異的に増幅することは困難である。そこで、菌体の培養法を伴う検査法すなわち形態学的検索や生化学試験と、ＰＣＲ法に代表される遺伝子検査が合わせて行われている（足本ら、Ｄｅｎｔａｌ Ｏｕｔｌｏｏｋ誌・９４巻・５１６−５２０頁・１９９９年）。しかしアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出に迅速性および簡便性が要求されていることを考慮すると、時間を要する培養を伴わないＰＣＲ法のみを用いて該細菌を特異的に増幅することが非常に効果的であると考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスに特異的な遺伝子領域を使用して、試料中の該遺伝子を特異的に増幅し、該細菌を迅速に検出するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するためにアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスおよび他の歯周病関連細菌の遺伝子に関して種々鋭意検討した結果、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列（１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域）が該菌株に特異的であることを見出し、それを用いた遺伝子増幅法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスには複数の１６Ｓリボソーム遺伝子および２３Ｓリボソーム遺伝子が存在するため、該細菌には１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域も複数箇所存在する。本発明者らは、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスには２種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域が存在することを発見した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域。
［２］配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［４］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［５］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
［６］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［７］細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
［８］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［９］請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
［１０］試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
［１１］試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系にて３５サイクルの遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓリボソーム遺伝子と２３Ｓリボソーム遺伝子の間に存在する核酸配列を解析して得たものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１または２）から選択されたＤＮＡ断片であって、少なくとも連続した１５塩基、好ましくは２０〜３５塩基よりなる核酸配列を含有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、新規な２種類の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域（配列番号１または２）の間で配列が共通する部分からそれぞれ選択され、配列番号３および４に示される核酸配列（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）の少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用されるが、特に、ＰＣＲ法などによる遺伝子増幅用のプライマーとして使用され得る。その際、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが使用され、２種のプライマーは増幅しようとする核酸配列の両端を規定し、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるように、その塩基配列が選択される。
また、本発明のオリゴヌクレオチドはシークエンス解析を行う場合のプライマーとしても使用され得る。さらには、検出用プローブとしても使用可能である。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３および４に示される塩基配列またはそれらの相補配列の全域を使用する必要はない。配列表の塩基配列およびその相補配列に由来する適度な長さの配列が、ＰＣＲ反応条件などに合わせて、解離温度（Ｔｍ値）などを計算することにより決定され得る。しかし、ＰＣＲの場合、プライマーに十分な特異性を持たせるためには、少なくとも連続した１５塩基、さらに望ましくは、２０塩基の長さが必要である。プライマーが短いと、それに応じてアニール温度を下げることになるので特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。逆にプライマーが長すぎるとプライマー同士の非特異的な反応によりターゲットの増幅量が落ち、さらに余計なアニーリングにより特異性が落ちる傾向が出ると考えられる。したがって、２５〜３０塩基程度が増幅量の面で有利だと考えられる。
【００１２】
プライマーが十分な特異性を有するためには、３’末端の塩基は配列表の核酸配列に示される３’末端の塩基を用いることが望ましい。使用する条件、目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中にある程度の置換を行ってもよい。また、プライマーの特異性に影響を及ぼさない程度に、１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の塩基配列に従って、プライマーの５’末端側をさらに延長して使用してもよい。
本発明では、上記少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを増幅用プライマーとして使用し、一方のプライマーの伸長生成物は、その相補体から分離された場合、他方のプライマーの鋳型となるように配列を選択する必要がある。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、生物の細胞内で行われる核酸合成反応を利用した方法またはデオキシリボヌクレオチドを化学的に反応させる方法などにより製造することが出来る。
【００１４】
本発明のＤＮＡ増幅方法に用いるプライマーとしては、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域、好ましくは配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、あるいは、さらに好ましくは配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチドなど、上述のすべてのオリゴヌクレオチドが挙げられる。この遺伝子増幅には、一般的にＰＣＲ法が用いられる。
【００１５】
本発明のＤＮＡ増幅方法において、上述したように、各種試料に存在するアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から、１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するには、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせが好適に用いられ得る。そして、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドよりも外側のプライマーにより増幅されたＤＮＡを、さらに配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドを用いて再増幅することによって、より高感度の増幅が可能となることが予想される。このとき使用する外側のプライマーは、該１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に特異的であることが望ましいが、特異性の低いプライマーも使用し得る。
【００１６】
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からの１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅において、配列番号３および４にそれぞれ示されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いることが必要である。このことは、増幅反応における特異性には、使用する２つのオリゴヌクレオチドの相乗効果が重要であることによる。また、さらに特異性を高めるためには、増幅に使用するプライマーの濃度をできるだけ低く抑えることも重要である。
【００１７】
本発明のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片の増幅用試薬は、具体的には、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマーを含むか、より好ましくは少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有する、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等を含む。
【００１８】
本発明の増幅用試薬において、上記プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰは当該増幅工程を十分に行い得る量を含む。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。
【００１９】
さらに、本発明の試薬には、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片からランダムに選択された１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を単離するための工程に適した緩衝液および当該ＤＮＡ断片を増幅するに適した緩衝液を併せて含めてもよい。さらに増幅したＤＮＡ断片を検出するための試薬も、検出法に併せて各種組み合わせておくこともできる。
【００２０】
本発明の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に必要なマグネシウム塩を併せて含むことができ、好ましくは０．５ｍＭ〜４ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの濃度範囲で添加できる。また、ＤＮＡポリメラーゼの活性発現に好ましい条件として、増幅反応中のｐＨを６．５〜９．０好ましくは７．０〜８．０に設定することが好ましい。
【００２１】
本発明において、増幅する遺伝子は、患者から採取した組織片や唾液、食品など、あらゆる材料中に存在する細菌由来の遺伝子であるが、単離培養された菌体の遺伝子を増幅することも含まれる。また、本発明における試料には、上記の各種材料や培養菌体の他、これらより単離および精製された核酸なども含まれる。
すなわち、本発明における試料としては、上記の各種材料を直接、用いる場合の他に、上記の各種材料の培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸などが用いられ得る。さらに、上記の各種材料から単離された寒天培地上の菌体またはその培養液、またはそこから粗抽出または精製された核酸なども試料として用いられ得る。
【００２２】
本発明の細菌検出方法は、上記ＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。或いは、上記ＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより行うことができる。
【００２３】
本発明の細菌検出方法は、試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片を得ることができる。
このとき、測定系中にはさらに、プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことができるが、反応阻害物を含ませることは好ましくない。
プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好適であり、２００ｎＭ程度がさらに好適である。ＤＮＡポリメラーゼは１〜２００Ｕ／ｍｌ程度を含む。２０〜１００Ｕ／ｍｌ程度がより好適であり、５０Ｕ／ｍｌ程度がさらに好適である。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、大腸菌など種々の起源のものが用いられ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性のものがより好ましい。中でもＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。ｄＮＴＰは５０〜５００μＭ程度を含む。１００〜３５０μＭ程度がより好適であり、２００μＭ程度がさらに好適である。最適な組合せの１つとしては、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系が挙げられる。
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのＣＦＵは、該菌を生育に適した条件で平板培養した場合に生じる該菌のコロニー数により定義される。アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスは、例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手することができる。ＡＴＣＣから分与された菌株にはＰｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔが添付されており、生育に適した条件とは、例えば、ＡＴＣＣが発行したＰｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔに記載された培養方法をいう。
遺伝子増幅反応サイクルは、３５サイクルが増幅ＤＮＡ断片の収量の点で好ましいが、該増幅ＤＮＡ断片を検出し得る条件であれば特に制限はない。
なお、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られているか否かは、増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色を行うことにより確認できる。一般に、電気泳動でのエチジウムブロマイド染色による検出限界は１０ｎｇよりやや少なめであると言われていることから、検出が可能であれば増幅ＤＮＡ断片は１０ｎｇ以上あると判断する。
【実施例】
以下に、本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。
【００２４】
実施例１
（１）オリゴヌクレオチドの合成
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上の該ＤＮＡ断片を増幅するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列から選択し、その配列は、配列番号３および４にそれぞれ示される。プライマー１：配列番号３のうち、１〜２６番目、プライマー２：配列番号４のうち、１〜３０番目
該オリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて合成することにより得た。手法はＡＢＩ社のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃にて一夜実施した。精製はＨＰＬＣ（ベックマン製）を用い、逆相クロマトカラム（ナカライテスク製）にて実施した。
【００２５】
（２）試料の調製
歯周病関連細菌６株の菌体コロニーをそれぞれ直接、ＰＣＲの試料として使用した（表１参照）。寒天培地上の菌体コロニー１００，０００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）を水１００μｌに懸濁し、そのうちの１μｌをＰＣＲに使用した。
【００２６】
【表１】
（３）ＰＣＲ
配列番号３および４に示されるオリゴヌクレオチド（プライマー１および２）を、それぞれＰＣＲのプライマーとして用いた。反応液組成は、プライマー１および２をそれぞれ０．２μＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｄａｓｈ：東洋紡製）２５単位／ｍｌ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡製）である。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液（菌体コロニー懸濁液）１μｌを添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
熱変性： ９４℃、２０秒
アニーリング： ６０℃、５秒
伸長反応： ７４℃、３０秒
上記熱変性、アニーリングおよび伸長反応を３０回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ２４００）を用いて行った。
【００２８】
（４）検出
増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
【００２９】
（５）結果
増幅ＤＮＡ断片の検出に用いたアガロースゲル電気泳動を図１に示す。
図１から明らかなように、上記増幅方法により、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（レーン１）についてのみ増幅ＤＮＡ断片が得られた。一般に、電気泳動でのエチジウムブロマイド染色による検出限界は１０ｎｇよりやや少なめであると言われていることから、増幅ＤＮＡ断片は１０ｎｇ以上あると推定される。すなわち、本発明の方法により、迅速かつ簡便なアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出が可能であることを示している。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、あらゆる材料中から簡便、迅速、かつ特異的にアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域の遺伝子を増幅し、該細菌を迅速に検出することができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】歯周病関連細菌の菌体コロニー中の遺伝子から、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅したＤＮＡ断片を示す図面に代わる電気泳動写真である。
Claims (11)
- 配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を有することを特徴とする、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域。
- 配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
- 細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための試薬であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅用試薬。
- 細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号１または２のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
- 細菌の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域のＤＮＡ断片から１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片を増幅するための方法であって、少なくとも２種のプライマーが、配列番号３および４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドであり、一方のプライマーの伸長生成物が、その相補体から分離された場合に、他方のプライマーの鋳型となることを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
- 請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られた１つまたはそれ以上の増幅ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
- 請求項６または７記載のＤＮＡ増幅方法で得られたＤＮＡ断片を制限酵素で消化し、該ＤＮＡ断片の鎖長を比較することを特徴とする細菌の検出方法。
- 試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを含む系にて遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
- 試料中のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスを検出するための方法であって、１，０００ＣＦＵのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、２００ｎＭのプライマー、５０Ｕ／ｍｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰおよび緩衝液を含み、反応阻害物を含まない系にて３５サイクルの遺伝子増幅反応を行った場合に、少なくとも１０ｎｇの増幅ＤＮＡ断片が得られることを特徴とする細菌検出方法。
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| JP2002215540A JP2004057009A (ja) | 2002-07-24 | 2002-07-24 | アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスの検出方法 |
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Family Applications (1)
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2002
- 2002-07-24 JP JP2002215540A patent/JP2004057009A/ja active Pending
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