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[Technischer Bereich]
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Sonden, die geeignet sind zum Nachweisen
und Identifizieren von Helicobacter pylori, die ursächlichen
Bakterien der Verdauungstrakterkrankungen, einschließlich Gastritis,
Magengeschwür,
Duodenalulcus duodeni oder dgl.
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[Hintergrundtechnik]
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Seit
die Gruppe von Warren von der Existenz von Helicobacter pylori (früherer Name:
Campylobacter pylori) in der humanen Magenschleimhaut berichteten
(Warren J.R. et al., "Unidentified
curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis", Lancet 1: 1273–1275 (1983)),
wurden zahlreiche Forschungen durchgeführt im Hinblick auf die biochemischen
Eigenschaften davon, im Besonderen die Korrelation zwischen Helicobacter
pylori und Verdauungstrakterkrankungen, einschließlich Magengeschwür, Duodenalulkus
oder dgl.
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Im
Hinblick auf die Tatsachen, dass Helicobacter pylori mit hoher Ausbeute
getrennt/nachgewiesen worden sind in der humanen Magenschleimhaut
von Gastritispatienten oder Magengeschwürpatienten (z.B. wird berichtet,
dass sie in einem Ausmaß von
50 ~ 80 % im Fall von chronischer Gastritis, superfizieller Gastritis,
atropischer Gastritis, erosiver Gastritis oder dgl. nachgewiesen
wurden), und die Symptome dieser Verdauungstrakterkrankungen entsprechend
vermieden werden durch Sterilisation mittels Verabreichung von Arzneimitteln,
wurde die Korrelation zwischen Helicobacter pylori und den Verdauungstrakterkrankungen
nahegelegt.
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Helicobacter
pylori würde
keine Invasion auf Schleimhautzellen ausführen, jedoch auf der Epithelschleimhautoberfläche und/oder
dem intrazellulären
Raum verbleiben und hier wachsen (proliferieren). Schließlich wird
angenommen, dass PAS (Periodic Acid-Sciff)-reaktionspositive Schichten
in der Magenschleimhaut durch das Wachstum von Helicobacter pylori
geschwächt
werden, wobei Wirkungen von Mucin, das die Schleimhaut schützt, verschlechtert
werden, und die Potenz als Schutzfaktor der Magenschleimhaut ebenfalls
verschlechtert wird (T. Ito, "Recent
findings on Helicobacter pylori",
Medical Technology, 19 (10), S. 892–893 (September 1991)).
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Schließlich wurde
auch von dem Mechanismus berichtet, dass Helicobacter pylori im
Magenschleimhautepithel ankommen und verbleiben, dann Ammoniak erzeugt
wird durch den Abbau von Harnstoff im Magen durch Urease von Helicobacter
pylori, wobei der so erzeugte Ammoniak die Magenschleimhaut zerstört und reverse
Diffusion des Wasserstoffions hervorruft und Tumore dadurch gebildet
werden (Tsujii, M. et al., "Mechanism
of gastric mucosal damage Induced by ammonia", Gastroeneterology 107: S. 1881–1888 (1992)).
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Im
Allgemeinen umfasst die herkömmliche
Diagnose von Helicobacter pylori, die humanen Verdauungstrakterkrankungen
entspricht:
- (1) Direkten Nachweis des Vorliegens
von Helicobacter pylori in einem Teil der Schleimhaut (Abstrich,
Gewebemikroskopie, Kultivieren),
- (2) Nachweis unter Verwendung des Kennzeichens von Helicobacter
pylori, einschließlich
Ureaseaktivität und
- (3) Seroimmundiagnose (T. Shirai et al., "Diagnosis on Presence of Campylobacter
pylori", Saishin-Igaku, 44
(2), 284–288
(1989)).
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Unter
den oben genannten Verfahren ist ein Verfahren (Kultivierungsverfahren)
zum Nachweisen von Helicobacter pylori durch mikroaerobe Kultivierung
von Biopsieproben von Magenschleimhaut das verlässlichste und genauste Verfahren.
Jedoch erfordert dieses Verfahren üblicherweise ein Stunde für eine Kultivierung
des Wachstums der Bakterien, wobei eine längere Zeit erforderlich wäre, um die Testergebnisse
zu erhalten.
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Im
Hinblick auf Ureaseproduktivität
durch Helicobacter pylori sind dann Verfahren zum direkten Nachweisen
von Urease in Proben gastritischer Biopsien ebenfalls verwendet
worden (T. Ito, "Special
diagnosis for bacterial infection/4. Campylobacter pylor", Rinnshoui, 15 (Ergänzung),
S. 367–369
(1989)). Da dies jedoch Verfahren sind zum Testen der Biopsieproben
mit einem Endoskop erfordern die Verfahren die Durchführung durch
einen Fachmann und die Patienten werden unter unerträglichem
Schmerz leiden.
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Weiterhin,
da Harnstoff im Magen zu Ammoniak und 14CO2 abgebaut wird, erfolgt die Diagnose einschließlich der
Beurteilung von solchem 14CO2 durch
einen Szintillationszähler.
Dieses Verfahren erfordert jedoch ebenfalls fachmännische
Arbeit, um das Radioisotop handzuhaben.
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Eine
Vielzahl von Nukleotidsequenzen von H. pylori sind in der Technik
bekannt:
US 5,527,678 offenbart
die Sequenzen von cagB- und cagC-Genen von H. pylori und isolierten
Nukleinsäuren,
welche spezifisch an die oben genannten Gene hybridisieren.
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WO93/18150
offenbart die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des H. pylori
Cytoxins (CT), "Cytotoxin
Associated Immunodominat" (CAI)-Antigen
und des Hitzschockproteins (hsp60).
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WO91/09049
offenbart Oligonukleotidsequenzen, die spezifisch für H. pylori
sind und die geeignet sind als DNA-Sonden und Primer beim Nachweis
einer H. pylori-Infektion
im Menschen.
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Li
et al. (Journal of Clinical Microbiology, Band 31, 8, S. 2157–2162 (1993))
offenbaren eine hochspezifische und empfindliche Sonde, die von
chromosomaler DNA von H. pylori abstammt und die Tatsache, dass sie
geeignet ist zum Typisieren von H. pylori-Isolaten.
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Desai
et al. (Journal of Applied Bacteriology, Band 75, S. 574–582 (1993))
offenbaren, dass die genetische Diversität von H. pylori eingeteilt
werden kann in Bezug auf klinische Symptomatologie, unter Verwendung
von 16s rRNA und einer Spezies-spezifischen DNA-Sonde.
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[Offenbarung der Erfindung]
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Im
Hinblick auf die oben genannten Probleme in der Technik soolte die
vorliegende Erfindung zur Entwicklung einer Technologie dienen zum
einfachen, spezifischen und wirkungsvollen Nachweisen von Helicobacter
pylori ohne Einbringen eines medizinischen Instruments, wie etwa
eines Endoskops, in den Körper
eines Patienten.
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Der
Vorteil der Erfindung ist damit gerichtet auf Sonden mit spezifischen
Reaktivitäten
für DNAs
oder RNAs von Helicobacter pylori, welches das ursächliche
Bakterium von Verdauungstrakterkrankungen ist, einschließlich Gastritis,
Magengeschwür,
Duodenalulcus oder dgl. und zur Analyse von Basensequenzen in den Sonden,
die den charakteristischen Genteil von Helicobacter pylori betreffen.
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Das
heißt,
DNAs des betreffenden Bakteriums, Helicobacter pylori, können signifikant
nachgewiesen werden durch die Spezifität zwischen den Sonden der vorliegenden
Erfindung und den Bakterien-DNAs, wobei Helicobacter pylori schnell
und exakt nachgewiesen/identifiziert werden kann ohne Kultivieren/Züchten von Helicobacter
pylori.
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Dann
kann, falls Primer entwickelt werden, basierend auf der Basensequenzinformation
dieser Sonden, Helicobacter pylori identifiziert werden durch Amplifizieren
von DNAs mit PCR-Techniken, ohne Durchführen eines Hybridisierungsverfahrens.
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Wenn
nicht-radioaktive Sonden, z.B. biotinylierte Sonden zur Hybridisierung
verwendet werden, da diese Sonden nachgewiesen werden können mit
einem optischen Mikroskop in einem herkömmlichen Labor ohne Einrichtungen
zum Handhaben von Radioisotopen, kann dadurch ein Verfahren zum
Nachweis von Bakterien schnell und einfach durchgeführt werden.
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[Kurze Beschreibung der
Zeichnungen]
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1 ist
eine Ansicht, die die Beziehung zwischen der Position der Vertiefung
in der Platte mit Vertiefungen und den Proben (geblottete Stamm-DNAs)
zeigt.
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2 ist
eine Ansicht, die die Ergebnisse einer Dot-Hybridisierung von Reaktivitäten zwischen
der Sonde der vorliegenden Erfindung und DNAs aus verschiedenen
Stämmen
zeigt.
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[Bestes Verfahren zum
Durchführen
der Erfindung]
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Wenngleich
Beispiele der Sonde, die aus Helicobacter pylori gemäß der vorliegenden
Erfindung nachfolgend dargestellt sind, soll die vorliegende Erfindung
nicht aufgrund der Offenbarung der Beispiele begrenzt werden:
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Beispiel 1: Aus Helicobacter
pylori hergestellte DNA-Sonde
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(1) Herstellung einer
DNA-Sonde aus Helicobacter pylori
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Zuerst
wurde Skirrow-Medium, das die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Komponenten
enthält, hergestellt. TABELLE
1
Blucella
Nährmedium
(Difco Co.,) | 14
g |
destilliertes
Wasser | 500
ml |
Polymyxin
B | 1250
Einheiten |
Vancomycin | 5
mg |
Tripetoprim | 2,5
mg |
Pferdeserum
(Difco Co.,) | 50
ml |
Agar | 5
g |
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Dann
wurden klinisch isolierte Helicobacter pylori in dem Blucella Nährmedium
(Difco Co.,) und dem Skirrow-Medium unter micro-aerober Bedingung
(Mischgas, bestehend aus 2 % Wasserstoff, 5 % Sauerstoff, 7 % Kohlendioxid,
86 % Stickstoff (jeweils als Volumen-% ausgedrückt); relative Feuchtigkeit
90 %) bei 37 °C für fünf Tage
kultiviert, um Helicobacter pylori zu separieren und zu züchten.
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Nach
dem Kultivieren wurden die kultivierten Bakterien gesammelt. Dann
wurden sie im modifizierten Verfahren, basierend auf der Saito-Miura-Methodologie,
vergewendet ("Preparation
of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys.
Acta Band 72, S. 619–629
(1963)), unter Verwendung von Proteinase K (Merck) – 0,1 %
SDS und unter Verwendung eines Isolierungsverfahrens für Nukleinsäure, und
die genomischen DNAs davon wurden extrahiert. Extrahierte DNAs wurden
vollständig
verdaut mit dem Restriktionsenzym HindIII und wurden statistisch
in den Vektor pGEM-3Z (Promega) kloniert.
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Eine
Sonde, umfassend ein DNA-Fragment, das spezifisch reagiert mit Helicobacter
pylori wurde aus den so erhaltenen Klonen ausgewählt und wurde als Sonde HP-60
bezeichnet.
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(2) Untersuchung der Spezies-Spezifität von DNA-Sonden,
die aus Helicobacter pylori hergestellt sind
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Die
Reaktivitäten
zwischen jeder Sonde, ausgewählt
aus Beispiel 1 (1) und DNAs aus verschiedenen verursachenden Stämmen für infektiöse Erkrankungen
wurden gemäß dem folgenden
Verfahren getestet.
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Zuerst
wurden die betreffenden Stämme
für den
Test, die klinisch isolierten Stämme
und die hinterlegten Stämme,
die jeweils in Tabelle 2 aufgeführt
sind, gesammelt. In Tabelle 2 ist humane genomische DNA humane genomische
DNA, die erhalten wurden aus den humanen Leukozyten einzelner gesunder
erwachsener Männer
(30 Jahre alt), während
die Kontrolle Escherichia coli K12, Stamm JM109 mit den Plasmid pGEM-3Z
(Seikagaku Kogyo) ist.
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Abkürzungen:
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- ATCC:
- American Type Culture
Collection (Maryland, USA)
- NYSDH:
- New York State Department
of Health (Albany, New York, USA)
- CIP:
- Collection of the
Institute Pasteur (Paris, Frankreich)
- TIMM:
- Teikyo University
Institute of Medical Mycology (Tokio, Japan)
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Chromosomale
DNAs in jedem Stamm wurden gemäß des Verfahrens
von Beispiel 1 (1) isoliert für
die Spezies, die zu der Helicobacter-Gattung gehören, welche in Tabelle 2 aufgeführt ist
und entsprechend der Saito-Miura-Methodologie (supra) unter Verwendung
lytischer Enzyme (Lysostaphyn (Sigma), Lysozym (Sigma), Acetylmuramidase
SG (Seikagaku Kogyo)) für
die anderen Stämme.
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Proben
zur Dot Blot-Hybridisierung wurden erhalten durch punktuelles Auftragen
einer bestimmten Menge (z.B. 0,1 μg/5 μl) der extrahierten
DNAs auf Nylonfilter (Pauldyne) und Auswählen Alkali-denaturierter DNAs.
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Proben
humaner genomischer DNA wurden hergestellt durch Verwenden der früher erhaltenen
humanen Leukozyten entsprechend Saito-Miura-Methodologie (supra).
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Auf
der anderen Seite wurden die Kontrollen hergestellt durch Verwenden
von Escherichia coli K-12, JM109, welche das Plasmid pGEM-3Z (Promega)
aufweisen und verwendet wurden zum Klonieren der Sonden, im Herstellungsverfahren
der Plasmid-DNA, auf welche im folgenden Beispiel 2 (1) Bezug genommen wird.
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Dann
wurde mit jeder Probe gemäß dem Handbuch
von Maniatis (T. Maniatis, et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbor
Laboratory (1982)), über
Nacht Hybridisierung durchgeführt, unter
der Bedingung von 45 Formamid (Merck), 5 × SSC und 42 °C, unter
Verwendung von DNA-Sonden, welche hergestellt werden aus Helicobacter
pylori und markiert waren mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim).
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Nach
der Hybridisierung über
Nacht wurden die Proben zweimal gewaschen mit 0,1 × SSC, 0,1
% SDS für
20 Minuten bei 55 °C,
wurden dann farbentwickelt und nachgewiesen mit Anti-Dig-ALP-Konjugaten
(Boehringer Mannheim) und Hybridisierungs-Spezifitäten darauf
sind bestätigt
worden.
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Experimentelle
Ergebnisse der Reaktivitäten
zwischen jeder Sonde und den DNAs von jedem der klinisch isolierten
Stämme
sind in 2 gezeigt. Dann wurde die Positionsbeziehung
zwischen der Vertiefung in der Platte mit Vertiefungen und Proben
(geblottete Stamm-DNAs), die darauf zu blotten sind, in 1 gezeigt. Die
angegebenen Positionszahlen in der schematischen Ansicht der Platte
mit Vertiefungen (well-plate), die in 1 gezeigt
sind, entsprechen nämlich
den Proben (Stamm)-Zahlen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind.
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Wie
aus den Reaktionsergebnissen, die in 2 gezeigt
sind, ersichtlich ist, reagierten alle getesteten Sonden nur mit
DNAs von Helicobacter pylori (Stämme
Nr. 1 und 2), reagierten demgemäß jedoch
nicht (hybridisierten nicht) mit DNA aus Stämmen, die zur Helicobacter-Gattung
gehörten,
ausgenommen Helicobacter pylori, wodurch ihre Spezifitäten bestätigt worden
sind.
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Beispiel 2: Analyse der
Basensequenz
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Die
Basensequenz der DNA-Sonde, deren Spezies-Spezifitäten in Beispiel
1 bestätigt
worden sind, wurde entsprechend dem folgenden Verfahren sequenziert.
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(1) Herstellung von Plasmid-DNA
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Escherichia
coli K-12, JM109, umfassend pGEM-3Z (Promega), darin eingebaut subklonierte
Insertionsfragmente (die zu sequenzieren sind), wurde in 5 ml Luria-Bactani Medium (Bacto-trypton,
10 g/1 I; Bacto-Hefeextrakt, 5 g/1 I; NaCl, 10 g/1 I; pH-Wert 7,0,
eingestellt mit 5N NaOH) inokuliert und wurde über Nacht kultiviert.
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Kulturflüssigkeit
wurde zentrifugiert (5000 UpM, 5 min.) und die Bakterien wurden
gesammelt. 100 μl Lösung von
50 mM Glucose/25 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0)/10 mM EDTA, enthaltend
2,5 mg/ml Lysozym (Sigma) wurden zugegeben zu den Präzipitaten
und sie wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten belassen. 0,2 M
NaOH-Lösung,
enthaltend 1 % Natriumdodecylsulfat (Sigma) wurden zu der so erhaltenen
Suspension gegeben und sie wurden gemischt. 150 μl 5M Kaliumacetatlösung (pH-Wert
4,8) wurde weiterhin hierzu zugegeben, dann wurden sie gemischt
und wurden mit Eis für
15 Minuten gekühlt.
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Eine
Gemischlösung
aus Wasser und Phenol/Choroform (CHCl3)
(Volumenverhältnis
von Wasser: Phenol/Chloroform = 1:1) wurde zugegeben bis zu einem äquivalenten
Volumen Überstand,
erhalten durch Zentrifugation (15.000 UpM, 15 min.) der gekühlten Lösung, und
es wurde gemischt. Das doppelte Volumen Ethanol wurde zu dem Überstand,
der aus einer solchen gemischten Lösung erhalten wurde, zugegeben,
dann wurden sie gemischt und Präzipitate
wurden erhalten durch weitere Zentrifugation (12.000 UpM, 5 min.).
Diese Präzipitate
wurden in 100 μl
Lösung
von 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, dann wurden weiterhin 10
mg/ml RNaseA (Sigma)-Lösung
hierzu zugegeben und sie wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten
belassen.
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300 μl 0,1 M Natriumacetatlösung (pH-Wert
4,8) wurden zu einem solchen Präparat
gegeben, dann wurde das äquivalente
Volumen der Gemischlösung,
bestehend aus Wasser und Phenol/Chloroform (CHCl3) (Volumenverhältnis von
Wasser: Phenol/Chloroform = 1:1) hierzu zugegeben und sie wurden
gemischt. Das doppelte Volumen Ethanol wurde weiterhin zu dem Überstand
zugegeben, der aus einer solchen gemischten Lösung erhalten wurde, und Präzipitate
wurden erhalten. DNA-Proben wurden hergestellt durch Trocknen dieser
Präzipitate
und ihr Lösen
in 10 μl
destilliertem Wasser.
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(2) Vorbehandlung zum
Sequenzieren
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Die
Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit dem AutoReadTM-Sequenzierungskit
(Pharmasia) durchgeführt.
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Die
Konzentration von DNA für
ein Templat wurde eingestellt auf 5–10 μg in 32 μl Lösung. 32 μl Templat-DNA-Lösung wurden
in 1,5 ml Miniröhrchen
(Eppendorf) übergeführt, dann
wurden 8 μl
2M NaOH-Lösung hierzu
zugegeben und sie wurden vorsichtig gemischt. Nach leichter Zentrifugation
wurden sie für
10 Minuten bei Raumtemperatur belassen.
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7 μl 3M Natriumacetat
(pH-Wert 4,8) und 4 μl
destilliertes Wasser wurden hierzu zugegeben, dann wurden weiterhin
120 μl Ethanol
zugegeben und sie wurden gemischt und wurden für 15 Minuten auf Trockeneis belassen.
DNAs, die durch 15-minütige
Zentrifugation präzipitierten,
wurden gesammelt und Überstände wurden
vorsichtig entfernt. Die so erhaltenen Präzipitate wurden mit 70 % Ethanol
gewaschen und wurden für
10 Minuten zentrifugiert. Dann wurden die Überstände vorsichtig erneut entfernt
und die Präzipitate
wurden unter dem verringerten Druck getrocknet.
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Präzipitate
wurden gelöst
in 10 μl
destilliertem Wasser, dann 2 μl
Fluoreszenzprimer (Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
(SEQ ID NO.: 1)]-3' (1,6 pmol/μl; 0,42 A260 Einheit/ml); M13-Reverser Primer, 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC
(SEQ ID NO.: 2)]-3' (2,1
pmol/μl;
0,42 A260 Einheit/ml)] (0,42 A260 Einheit/ml,
4 ~ 6 pmol) und 2 μl
Annealingpuffer wurden hierzu zugegeben und sie wurden vorsichtig
gemischt.
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Nach
leichter Zentrifugation wurden sie bei 65 °C für 5 Minuten erhitzt, dann wurden
sie rasch auf eine Temperatur von 37 °C gebracht und wurden bei der
Temperatur für
10 Minuten gehalten. Hiernach wurden sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten
oder mehr belassen und wurden leicht zentrifugiert. Dann wurden
die Proben hergestellt indem hierzu 1 μl Elongationspuffer und 3 μl Dimethylsulfoxid
gegeben wurden.
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Vier
Probenkleingefäße (Mini-Tubes)
sind gekennzeichnet worden mit den Einzelsymbolen "A", "C", "G" oder "T" und
entsprechend des aufgeschriebenen Symbols wurden 2,5 μl von Gemisch
A (ddATP, gelöst zusammen
mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP), Gemisch C (ddCTP, gelöst zusammen
mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP), Gemisch G (ddGTP, gelöst zusammen
mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP) oder Gemisch T (ddTTP, gelöst zusammen
mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in jedes Röhrchen gegossen. Jede Lösung wurde
auf Eis gehalten bis zur Verwendung und die Lösung wurde bei 37 °C für 1 Minute
oder mehr erhitzt, wenn sie tatsächlich
verwendet wurde.
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2 μl verdünnte T7DNA-Polymerase
(Pharmacia; 6–8
Einheiten/2 μl)
wurden zu jeder DNA-Probe gegeben und es wurde vollständig gemischt,
indem pipettiert wurde oder vorsichtig gemischt wurde. Unmittelbar nach
Abschluss des Mischens wurden jeweils 4 μl von jeder dieser Gemischlösungen in
die jeweilige dieser vier vorgewärmten
Mischlösungen
gegeben. Zum Zeitpunkt des Zugebens dieser Gemischlösungen wurden frische
Spitzen verwendet.
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Die
Lösung
wurde für
5 Minuten bei 37 °C
erwärmt,
dann wurden 5 μl
Terminierungslösung,
gebunden an den zuvor angegebenen AutoReadTM Sequenzierungskit
(Pharmasia), in jede Reaktionslösung
gegeben. Frische Spitzen wurden ebenfalls für dieses Zugabeverfahren verwendet.
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Die
Lösung
wurde für
zwei bis drei Minuten bei 90 °C
erwärmt
und wurde unmittelbar auf Eis abgekühlt. 4–6 μl/Bande der Lösung wurden
für die
Elektrophorese verwendet.
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(3) Sequenzieren der Basensequenz
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Die
Basensequenzen der Sonden, die in Beispiel 1 offenbart sind, die
spezifisch für
Helicobacter pylori sind, wurden mit dem A.L.F.-DNA-Sequencer-System
(Pharmacia) unter einer Elektrophoresebedingung von 45 °C für 6 Stunden
sequenziert.
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Als
ein Ergebnis davon wurde die Basensequenz der Sonde HP-60 (SEQ ID
NR. 8) aufgeklärt.
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(Industrielle Anwendbarkeit)
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Entsprechend
den Sonden der vorliegenden Erfindung kann Helicobacter pylori direkt
nachgewiesen werden und kann rasch/exakt identifiziert werden ohne
Verwendung eines invasiven medizinischen Instruments und Züchten von
Bakterien. Das heißt,
entsprechend der Diagnose, unter Verwendung der vorliegenden Sonden,
würde die
Nachweisrate deutlich verbessert werden und die Bakterien können identifiziert
werden mit einzelnen Probekörpern,
wobei die Zeit, die erforderlich ist zur Diagnose, auf etwa ein
bis zwei Tage verringert werden wird. Daher wird eine effektive
Therapie planbar sein in dem frühen
Stadium der Erkrankung und kann unmittelbar beginnen.
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Da
die Basensequenzen der vorliegenden Sonden, die spezifisch für DNAs von
Helicobacter pylori sind, das eng verbunden mit humanen Erkrankungen
des Verdauungstraktes ist, aufgeklärt worden sind, können diese
Sonden künstlich
hergestellt werden. Weiterhin können
verursachende Bakterien-DNAs in dem klinischen Probekörper mit
PCR-Techniken amplifizieren, unter Verwendung von Primern, die hergestellt
werden unter Verwendung eines Teils der analysierten Basensequenzen,
wobei als ein Ergebnis davon Helicobacter pylori schnell nachgewiesen
wird und die vorliegenden Sonden können daher praktisch in der
Diagnose verwendet werden.
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Weiterhin
werden durch Vergleichen der Basensequenzen von Genom-DNAs in der
klinischen Probe mit denjenigen, die durch die vorliegende Erfindung
analysiert werden, die verursachenden Bakterienspezies von Erkrankungen
des Verdauungstraktes rasch identifiziert werden.
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Wie
oben angegeben, werden gemäß der vorliegenden
Erfindung Proben, die als spezifisch für Helicobacter pylori erachtet
werden, bereitgestellt und ausgezeichnete Anwendbarkeiten davon
werden ebenfalls als ein Leitfaktor zum Herstellen von PCR-Primern
und als eine Standardsequenz, die geeignet ist zum Vergleich mit
genomischen DNAs in den klinischen Proben, erwartet. Die vorliegende
Erfindung kann weiterhin einen Effekt zur Bereitstellung wertvoller
Hinweise zum Herstellen und Entwickeln der anderen geeigneten Sonden
bieten, die spezifisch für
DNAs von Helicobacter pylori sind, das das verursachende esBakterium
der Verdauungstrakterkrankungen ist. Dann werden, da die Basenquenzen,
die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, erhalten wurden
durch statistisches Klonieren der genomischen DNAs von klinisch
isolierten Stämmen,
die Verwendbarkeiten der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung
auf komplementäre
Stränge
davon ausgedehnt.
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Es
versteht sich natürlich,
dass DNAs der Wildstämme
den mutierten Teil enthalten. Jedoch, was aus der Offenbarung der
veranschaulichenden Beispiele oben ersichtlich ist, würden solche
mutierte Teile nicht die Spezifität der vorliegenden Sonden als
auch die Nützlichkeit
für die
klinische Anwendbarkeit davon beeinträchtigen (siehe z.B. die Verwendung
hiervon zur Entwicklung von PCR-Primern).
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