KR100361965B1

KR100361965B1 - 헬리코박터 파이로리균의 검출 및 동정을 위한 프로브

Info

Publication number: KR100361965B1
Application number: KR1019997000561A
Authority: KR
Inventors: 게시히로유키; 에다쇼지; 우에하라히로츠구; 니시다게이고; 마츠히사아키오
Original assignee: 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2002-11-23
Also published as: DE69735593D1; KR20000068006A; EP0965646A1; CA2261576C; EP1369495B1; WO1998003681A1; AU3634197A; JPH1033179A; EP1369495A1; US6172215B1; ATE321881T1; EP0965646B1; EP1375677B1; EP0965646A4; CA2261576A1; DE69735562T2; AU721358B2; DE69735561T2; DE69735593T2; EP1375677A1

Abstract

본 발명에는, 소화기계 질환의 기염균인 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균을 특이적으로 검출 및 동정하는 프로브가 개시되어 있다. 이 프로브는, 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA를 제한 효소 Hind Ⅲ로 완전히 소화한 단편을 포함한다. 이들 프로브의 염기 배열 정보는, 헬리코박터 파이로리균에 특이적인 프로브를 PCR로 조제할 때에 사용하는 프라이머의 구조 지표로서, 또한 임상 검체에 포함되는 게놈 DNA와의 비교에 적합한 표준 배열로서 유용하다.

Description

헬리코박터 파이로리균의 검출 및 동정을 위한 프로브{Probes for Detecting and Identifying Helicobacter pylori}

헬리코박터 파이로리〔구명: 캄파이로박터 파이로리〕균이 사람의 위점막에존재한다는 것이 워렌(Warren) 등에 의하여 보고되어온 이래(Warren J. R. et al., "Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis", Lancet 1: 1273-1275(1983)), 그 생화학적 성질, 특히 위 및 십이지장 궤양 등의 소화기계 질환과, 헬리코박터 파이로리균과의 연관성에 대하여 여러가지 연구가 진행되고 있다.

헬리코박터 파이로리균은, 위염 및 위궤양 환자의 위점막으로부터 높은 빈도로 분리 및 검출되며〔예를 들면, 만성 위염, 표층성 위염, 위축성(萎縮性) 위염, 미란성(靡爛性) 위염 등의 증상례에서는, 50∼80%의 비율로 검출되었다는 보고도 있다〕, 또한 약제 투여에 의하여 제균 처리함으로써 소화기계 질환의 증상이 개선되기 때문에, 헬리코박터 파이로리균과 소화기계 질환과의 연관성이 시사되어 있었다.

헬리코박터 파이로리균은, 점막 세포내로 침입하는 성질은 없고, 상피 점막면 및 세포 틈새에 정착하여 증식한다. 또한, 헬리코박터 파이로리균의 증식에 따른 위점막의 PAS(Periodic Acid Sciff) 반응 양성층의 비박화(菲薄化)에 의하여, 점막을 보호하고 있는 뮤신(mucin)의 효과가 저하하고, 위점막의 방어 인자가 감퇴한다고 생각되고 있다(이토우 다케시, 「Helicobacter pylori에 관한 최근의 발견」, Medical Technology, 19(10), pp.892-893 (1991년 9월)).

그리고, 헬리코박터 파이로리균이, 위점막 상피에 접하여 생식하며, 위내의 요소(尿素)가 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 우레아제(urease)에 의하여 분해되어 생성된 암모니아에 의하여, 위점막 장해, 수소이온의 역확산 등을 발생시키고, 나아가서는 종양의 형성에 이른다고 하는 메카니즘도 보고되어 있다(Tsujii, M. et al., "Mechanism of gastric mucosal damage Induced by ammonia", Gastroenterology 107: pp. 1881-1888(1992)).

사람의 소화기계 질환과의 관련이 지적되고 있는 헬리코박터 파이로리균의 진단 방법으로서는, 일반적으로 (1)점막 국소에 있어서의 헬리코박터 파이로리균의 직접적인 존재 증명〔도말법(塗抹法), 조직경검법(組織鏡檢法), 배양법〕, (2)우레아제 활성 등의 헬리코박터 파이로리균의 특성을 이용한 검출 방법, 및 (3)혈청 면역 진단법이 있다(시로이 다카유키 등, 「Campylobacter pylori의 존재 진단」, 최신 의학, 44(2), 284-288(1989)).

이 가운데, 위점막의 생검 재료의 미호기(微好氣) 배양으로부터 헬리코박터파이로리균을 검출하는 방법(배양법)이, 가장 정밀도가 높고 확실한 방법이다. 그러나, 이 방법에서는, 균의 증식을 위한 배양 시간으로서, 통상 약 1주간의 시간을 필요로 하기 때문에, 검사 결과를 얻기까지에는 장시간을 요하게 된다.

또한, 헬리코박터 파이로리균의 우레아제 생산 능력을 감안하여, 위 생검 재료로부터 직접 우레아제를 검출하는 방법 등도 이용되고 있다(이토우 다케시, 「특수한 세균 감염증의 진단법/4.Campylobacter pylori」, 임상의(臨床醫), 15(증간호), pp.367-369(1989)). 그러나, 이들 방법은 모두 내시경 검사에 의한 생검 재료를 대상으로 한 검사법이며, 검사를 실시함에 있어서는 시술자의 숙련을 요할 뿐만 아니라, 환자에게 적지않은 고통을 강요하는 것이었다.

게다가, 헬리코박터 파이로리균에 의하여 위내의 요소가, 암모니아와 14CO2로 분해된다는 것에 주목하고, 이 14CO2를 신틸레이션 카운터(scintillation counter)에 의하여 측정하는 진단법도 있다. 그런데, 이 방법에 의하더라도, 방사성 동위 원소의 취급이라는 번잡하고 숙련을 요하는 검사 처치를 거쳐야만 한다고 하는 문제점이 있다.

본 발명은 위염, 위궤양 및 십이지장 궤양 등의 소화기계 질환의 기염균인 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균의 검출 및 동정에 유용한 프로브에 관한 것이다.

도 1은, 웰의 위치와 피검 시료(블롯팅된 균주 DNA)의 대응 관계를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 프로브와 각종 균주 유래의 DNA와의 반응성을 나타낸 도트 하이브리다이제이션의 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 상기한 기술 배경을 감안하여, 헬리코박터 파이로리균을, 내시경 등의 의료기구를 환자 체내에 도입하지 않고, 보다 간편하게 그리고 보다 특이적이고 효율성 좋게 검출할 수 있는 기술을 확립하는 것을 지향하여 완성된 것이다.

그리고, 그 요지로 하는 바는, 위염, 위궤양, 십이지장 궤양 등의 소화기계 질환의 기염균/원인균인 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA 또는 RNA와 특이적인 반응성을 갖는 프로브와, 이 프로브에 포함되는 헬리코박터 파이로리균이 본질적으로 보유하고 있는 유전자 부분의 염기 배열을 해명하는데 있다.

즉, 검출 대상인 헬리코박터 파이로리균에 있어서 유지되고 있는 DNA를, 본 발명의 프로브와 그 DNA간의 특이성에 의거하여 유위하게 검출할 수 있으며, 이에 따라서, 헬리코박터 파이로리균을 배양 및 증식하지 않고, 신속하고 확실하게 헬리코박터 파이로리균을 검출 및 동정할 수가 있는 것이다.

또한, 이들 프로브의 염기 배열 정보에 의거하여 프라이머를 디자인하면, PCR법에 의한 DNA의 증폭의 유무를 검출 및 확인함으로써, 하이브리다이제이션을 하지 않더라도, 헬리코박터 파이로리균을 동정할 수가 있다.

게다가, 하이브리다이제이션에 사용하는 프로브를 비방사성의 것, 예를 들면, 비오틴화한 프로브로 함으로써, 방사성 동위 원소 사용 시설이 없는 일반 검사실에서도 균의 검출이 가능하며, 이에 따라서 균의 동정 검출 작업을 신속하고 간단하게 행할 수 있는 것이다.

이하에, 본 발명의 헬리코박터 파이로리균에 유래하는 프로브의 실시예를 나타내겠으나, 이들 실시예의 개시에 의하여 본원 발명이 한정적으로 해석되어져서는 안되는다는 것은 물론이다.

실시예 1: 헬리코박터 파이로리균 유래의 DNA 프로브

(1)헬리코박터 파이로리균 유래의 DNA 프로브의 조제

먼저, 하기 표 1에 기재된 조성을 갖는 스키로(Skirrow) 배지를 조제하였다.

블루셀라 브로스(디프코사 제품)(Blucella broth: Difco Co.,)	14g
증류수	500ml
폴리믹신(polymyxin) B	1250단위
반코마이신(vancomycin)	5mg
트리페트푸림	2.5mg
말 혈청(디프코사 제품)	50ml
한천	5g

이어서, 임상 분리된 헬리코박터 파이로리균을, 블루셀라 한천 배지(디프코사 제품) 및 상기 스키로 배지에서, 미호기적 조건〔2% 수소, 5%산소, 7%이산화탄소, 86% 질소(모두 체적%)의 혼합 가스; 상대 습도 90%〕하에서, 37℃에서 5일간 배양하여 헬리코박터 파이로리균을 분리 및 증식하였다.

배양 종료후에, 배양 균체를 집균하였다. 그리고, 모은 균체에 대하여, 프로티나아제 K(멜크사 제품) -0.1%SDS를 사용한, 핵산의 단리법을 이용한 Saito-Miura법("Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta vol. 72, pp.619-629(1963))의 변법을 적용하여, 그 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를, 제한 효소 HindⅢ로 완전 소화하고, 벡터 pGEM-3Z(프로메가 제품)에 랜덤 클로닝하였다.

얻어진 클론으로부터 헬리코박터 파이로리균과 특이적으로 반응하는 DNA 단편을 포함하는 8종의 프로브를 선발하고, 얻어진 각 프로브를, 프로브 HP-32, 프로브 HP-34, 프로브 HP-49, 프로브 HP-55(down), 프로브 HP-55(up), 프로브 HP-60, 프로브 HP-64 및 프로브 HP-66이라고 각각 명명하였다.

(2)헬리코박터 파이로리균 유래의 DNA 프로브의 세균 종 특이성의 검토

실시예 1(1)에서 선발한 각 프로브와 각종 감염증 원인 균주의 DNA와의 반응성을, 이하의 방법에 의하여 검토하였다.

먼저, 검토 대상 균주로서, 하기 표 2에 열거한 임상 단리주 및 기탁 균주를 준비하였다. 게다가, 표 2에 있어서, 사람의 게놈 DNA란 한 명의 건강한 성인 남자(30세)로부터 채취한 백혈구 유래의 사람의 게놈 DNA를, 그리고 대조 시료로서 플라스미드 pGEM-3Z(세이가가쿠 고교 제품)을 포함한 Escherichia coli K-12, JM109주를 각각 준비하였다.

세균 번호	세 균 명	출소 및 유래
1	Helicobacter pylori	ATCC 43629
2	Helicobacter pylori	임상 분리주
3	Helicobacter cineadi	ATCC 35683
4	Helicobacter fennelliae	ATCC 35684
5	Helicobacter mustelae	ATCC 43772
6	Campylobacter jejuni	CIP 702
7	Campylobacter coli	CIP 7080
8	Campylobacter fetus	CIP 5396
9	Streptococcus aureus	ATCC 25923
10	Streptococcus epidermidis	임상 분리주
11	Escherichia coli	ATCC 25922
12	Klebsiella pneumoniae	임상 분리주
13	Streptococcus pneumoniae	NYSDH DP-2
14	Pseudomonas aeruginosa	임상 분리주
15	Enterobacter cloacae	임상 분리주
16	Haemophilis influenzae	임상 분리주
17	Candida albicans	ATCC 48130
18	Aspergillus fumigatus	TIMM 0063
19	Cryptococcus neoformans	TIMM 0354
20	Mucor spinosus	TIMM 1322
21	Absidia corymbifera	TIMM 2435
22	사람의 게놈 DNA
24	대조(Escherichia coli K-12, JM109(pGEM-3Z))

상기 표 2에 있어서, ATCC는 미국 전형 표준 보존 시설(American Type Culture Collection; 메리랜드주, 미국)을 나타내며, NYSDH; 뉴욕주 보건국(New York State Department of Health; 아루바니, 뉴욕주, 미국), CIP; 파스퇴르 연구소 보존 시설(Collection of the Institute Pasteur; 파리, 프랑스), TIMM; 테이쿄 대학 진균 연구 센터(도쿄, 일본)를 각각 나타낸다.

그리고, 표 2중의 헬리코박터속에 속하는 세균은 실시예 1(1)에 기재된 방법, 또한 그 외의 세균에 대해서는, 각종 용균 효소〔리조스타핀(시그마 제품), 리조치임(lysozyme)(시그마 제품), 아세틸무라미다아제 SG(세이가가쿠 고교 제품)〕을 이용한 상술한 Saito-Miura법에 의하여, 각 균주가 보유하는 염색체 DNA를 추출하였다.

추출한 DNA의 일정량(예를 들면 0.1μg/5μl)을 나일론 필터(폴다인 제품)에 스폿하고, 알칼리 변성한 것을 도트 블롯 하이브리다이제이션의 시료로 하였다.

게다가, 사람의 게놈 DNA시료는, 앞서 입수한 백혈구를 상술한 Saito-Miura법에 적용함으로써 조제하였다.

한편, 대조 시료는 후술하는 실시예 2(1)에 기재된 플라스미드 DNA의 조제 방법을, 앞서 프로브의 클로닝을 위하여 사용한 플라스미드 pGEM-3Z(플로메가사 제품)을 포함한, Escherichia coli K-12, JM109주에 적용함으로써 조제하였다.

이어서, 각 시료에 대하여, Digoxigenin-11-dUTP(베링거 만하임사 제품)로 라벨한 헬리코박터 파이로리균 유래의 DNA 프로브를, 마니아티스의 매뉴얼(T. Maniatis, et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbour Laboratory(1982))에 따라서, 45% 포름아미드(멜크사 제품), 5×SSC, 42℃의 조건하에서 종액(終液) 하이브리다이제이션을 실시하였다.

종액 하이브리다이제이션을 마친 시료를, 55℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에 의한 20분간의 세정을 2회 행한 후에, Anti-Dig-ALP conjugates(베링거 만하임사 제품)으로 검출 및 발색시키고, 하이브리다이제이션에 관한 특이성을 확인하였다.

각 프로브와 각 임상 균주의 DNA와의 반응성에 관한 실험 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 웰의 위치와 피검 시료(블롯팅된 균주 DNA)의 대응 관계를 도 1에 나타내었다. 즉, 도 1에 나타낸 웰 플레이트의 모식도에 붙인 웰의 위치 번호는, 표 2에 열거한 시료(균주)에 붙인 번호와 부합되는 관계에 있다.

도 2의 반응 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험한 어떠한 프로브도 헬리코박터 파이로리균(세균 번호 1 및 2)에 유래하는 DNA에 대해서만 반응성을 나타내고, 헬리코박터속에 속하지 않는 균종에 유래하는 DNA는 물론, 헬리코박터 파이로리균 이외의 헬리코박터속에 속하는 다른 균종 유래의 DNA에 대해서도 반응성(하이브리드의 형성)이 보이지 않고, 본원 발명의 프로브에 의한 종 특이성이 확인되었다.

실시예 2: 염기 배열의 해석

실시예 1에서 종 특이성이 확인된 DNA 프로브(합계 8개)의 염기 배열을 하기의 방법에 따라서 결정하였다.

(1)플라스미드 DNA의 조제

서브 클로닝된(염기 배열을 결정해야 할) 삽입 단편을 넣은 pGEM-3Z(프로메가사 제품)을 포함한 Escherichia coli K-12, JM109주를, 5ml의 Luria-Bactani Medium(bacto-tryptone, 10g/1L; bacto-yeast extract, 5g/1L; NaCl, 10g/1L; 5N NaOH에서 pH 7.0으로 조정)에 식균하고, 하룻밤 배양하였다.

배양액을, 원심 분리(5,000rpm, 5분)하여 집균하였다. 그리고, 침전물에 2.5mg/ml의 리조치임(시그마 제품)을 포함한, 50mM글루코오스/25mM Tris-HCl(pH 8.0)/10mM EDTA 용액을 100μl 첨가하고, 실온에서 5분간 방치하였다. 얻어진 현탁액에, 1%의 도데실 황산 나트륨(시그마 제품)을 포함한 0.2M 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 혼합하였다. 이어서, 5M 초산 칼륨 수용액(pH 4.8) 150μl를 더 첨가하여 혼합하고, 15분간 얼음중에서 냉각하였다.

그리고 원심 분리(15,000rpm, 15분)하여 얻은 상청에, 이 상청과 동등한 양의, 물과 페놀/클로로포름(CHCl3)으로 이루어지는 혼합액(물: 페놀/클로로포름=1:1의 체적비)을 첨가하고, 이어서 혼합하였다. 그리고, 얻어진 상청에 대하여, 이 상청의 2배량(체적비)의 에탄올을 첨가하고, 다시 원심분리(12,000rpm, 5분)하여 침전을 얻었다. 이 침전물을, 10mM Tris-HCl(pH 7.5)/0.1mM EDTA 용액 100μl에 용해하고, 여기에 10mg/ml RNaseA(시그마 제품) 용액을 첨가하고, 실온에서 15분간 방치하였다.

이 조제물에, 0.1M 초산 나트륨 수용액(pH 4.8)을 300μl 첨가하고, 다시 이 용액과 동등한 양의, 물과 페놀/클로로포름(CHCl3)로 이루어지는 혼합액(물: 페놀/클로로포름 = 1:1의 체적비)을 첨가하고, 이어서 혼합하였다. 그리고, 얻어진 상청에 대하여, 이 상청의 2배량(체적비)의 에탄올을 첨가하여 침전을 얻었다. 이 침전물을 건조하고, 10μl의 증류수에 용해한 것을 DNA시료로 하였다.

(2)염기 배열 결정의 전처리

염기 배열 결정의 전처리를, AutoRead(등록 상표) Sequencing Kit(팔마시아 제품)을 이용하여 행하였다.

먼저, 주형이 되는 DNA를, 32μl 용액 중에 5∼10μg의 농도가 되도록 조정하였다. 그리고, 1.5ml의 미니 튜브(에펜돌프)에, 주형 DNA의 용액 32μl을 옮기고, 2M 수산화 나트륨 수용액을 8μl 첨가하여 조용히 혼합하였다. 그리고, 가볍게 원심한 후, 실온에서 10분간 방치하였다.

3M 초산 나트륨(pH 4.8) 7μl와 증류수 4μl를 첨가하고, 다시 에탄올을 120μl 첨가하여 혼합하고, 드라이 아이스 위에서 15분간 방치하였다. 그리고, 15분간의 원심 분리로 침전된 DNA를 모으고, 주의하면서 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 70% 에탄올로 세정하고, 10분간 원심분리하였다. 그리고 주의하면서 다시 상청을 제거하고, 감압 조건하에서 침전물을 건조하였다.

침전물을 증류수 10μl에 용해하고, 형광성의 프라이머〔Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; 5'-Fluorescein-d〔CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(배열 번호 1)〕-3'(1.6pmol/μl; 0.42 A260 unit/ml); M13 Reverse Primer, 5'-Fluorescein-d〔CAGGAAACAGCTATGAC(배열 번호 2)〕-3'(2.1pmol/μl; 0.42 A260 unit/ml)〕2μl(0.42 A260 unit/ml, 4∼6pmol)과 어닐링용 완충액 2μl를 첨가하여 조용히 혼합하였다.

그리고, 가볍게 원심한 후, 65℃에서 5분간 열처리를 행하고, 재빨리 37℃의 온도 조건하에 두고, 그곳에서 10분간 보온하였다. 보온후 10분 이상, 실온에서 방치하고, 이어서 가볍게 원심하였다.

그리고, 연장용 완충액 1μl와 디메틸술폭시드 3μl를 더 첨가한 것을 시료로 하였다.

4개의 미니 튜브에 A, C, G 및 T라고 기입하고, 각각의 튜브에, A Mix(ddATP를 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것), C Mix(ddCTP를 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것), G Mix(ddGTP를 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것) 및 T Mix(ddTTP를 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것)을 2.5μl씩 분주하였다. 게다가, 각각의 용액은 사용시까지는 얼음중에서 보존하고, 사용시에는 37℃에서 1분 이상 보온하고 나서 사용하였다.

희석한 T7DNA 폴리머라제(팔마시아 제품; 6∼8units/2μl)2μl를 각 DNA 시료에 첨가하고, 피페팅 혹은 조용한 혼합에 의하여 완전히 혼합하였다. 혼합후에 바로, 이 혼합액을 4.5μl씩, 별도로 보온해 둔 4종의 Mix 용액에 분주하였다. 게다가, 분주시에 있어서는 새로운 팁을 사용하였다.

37℃에서 5분간 보온하고, 상술한 AutoRead(등록상표) Sequencing Kit에 첨부되어 있던 반응 정지 용액을 5μl씩 각각의 반응액에 첨가하였다. 이 분주에 있어서도, 새로운 팁을 사용하였다.

90℃에서 2∼3분간 보온하고, 바로 얼음중에서 냉각하였다. 전기 영동은 1레인당 4∼6μl를 영동하였다.

(3)염기 배열의 결정

실시예 1에 기재된 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA에 대하여 특이성을 갖는 각 프로브의 염기 배열을, 영동 온도 45℃, 영동 시간 6시간으로 하여, A.L.F. DNA Sequencer 시스템(팔마시아 제품)을 이용하여 결정하였다.

그 결과, 프로브 HP-32(배열 번호 3), 프로브 HP-34(배열 번호 4), 프로브 HP-49(배열 번호 5), 프로브 HP-55(down)(배열 번호 6), 프로브 HP-55(up)(배열 번호 7), 프로브 HP-60(배열 번호 8), 프로브 HP-64(배열 번호 9) 및 프로브 SP-66(배열 번호 10) 각각의 염기 배열이 확실해졌다.

본 발명의 프로브는, 내시경 등의 의료 기구를 사용하지 않고, 또한 헬리코박터 파이로리균의 증식 및 배양을 거치지 않고, 신속, 정확하게 직접적으로 헬리코박터 파이로리균을 검출 및 동정할 수 있다. 즉, 본 발명의 프로브를 이용한 진단에서는, 검출율이 비약적으로 향상할 뿐만 아니라, 1회분의 검체로 균의 동정까지 행할 수 있으며, 진단에 요하는 시간도 약 1∼2일 정도로 짧아진다. 따라서, 조기에 유효한 치료 방침을 제시할 수 있으며, 즉시 치료를 실시하는 것이 가능해진다.

또한, 사람의 소화기계 질환에 깊이 관련된, 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA에 특이적인 프로브의 염기 배열을 확실하게 함으로써, 이들 프로브가 인공적으로 조제가능하게 된다. 게다가, 해석한 염기 배열의 정보의 일부를 이용하여 제작한 프라이머를 사용함으로써, 임상 검체에 포함되는 원인균의 DNA를, PCR법에 의하여 증폭할 수 있으며, 그 결과 헬리코박터 파이로리균을 신속히 특정할 수 있으며, 진단에 도움이 될 수 있다.

게다가, 임상 검체에 포함되는 게놈 DNA의 염기 배열과 본 발명에 의하여 해석된 염기 배열을 비교 참조함으로써, 소화기계 질환 원인균의 균종의 신속한 동정에 기여한다.

이와 같이, 본 발명에 의하면, 소망의 목적이었던 헬리코박터 파이로리균에 특이적인 프로브를 제공할 뿐만 아니라, PCR용 프라이머 제작의 지침으로서, 또한 임상 검체에 포함되는 게놈 DNA와의 비교 참조용에 적합한 표준 배열로서 우수한 유용성이 기대되는 것이다. 게다가, 소화기계 질환의 원인균인 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA에 특이적인 프로브의, 금후의 연구, 개발에 있어서의 귀중한 단서를 가져오는 등의 우수한 효과를 갖는 것이다. 또한, 본 발명에서 개시한 염기배열은, 임상 분리주의 게놈 DNA를 랜덤으로 클로닝하여 얻어진 것이며, 따라서, 본 발명의 염기 배열의 유용성은 그 상보쇄에까지 미치는 것이다.

더우기, 야성주(野性株)가 보유하는 DNA에 변이 부분이 존재한다는 것은 당연히 생각할 수 있다. 그러나, 상기 실시예의 개시로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 DNA의 변이 부분은, 본 발명의 프로브의 특이성, 및 그 임상 현장에서의 용도(예를 들면, PCR용 프라이머의 디자인을 위한 사용 등)에서의 유용성에 아무런 영향도 주지 않는다.

Claims

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균이 보유하는 DNA를 제한 효소 Hind Ⅲ로 소화하여 얻어지는 DNA 단편을 포함하며, 또한 헬리코박터 파이로리균이 보유하는 DNA와 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 프로브.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 단편이 배열 번호 3 내지 10에 기재된 적어도 하나의 염기 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.