KR100238337B1 - 감염증 진단용 프로브 - Google Patents

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도다 미키오
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Abstract

스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)균이 보유하는 DNA를 제한효소 PstI으로 완전소화하고, 적당한 벡터에 클로닝하여, 스트렙토 뉴모니에균이 본질적으로 보유하는 DNA단편을 포함하는, 폐렴 원인균의 검출 및 동정에 유용한 폐렴 기염균 유래의 프로브를 제공한다.

Description

감염증 진단용 프로브
병리학적으로 감염이란, 병원성 미생물(이하, 「균」이라 함)이 생체내에 침입하여 증식의 발판을 확립하는 것을 가리키며, 생체 내에서의 균의 증식에 기인하는 발증(發症)은, 숙주의 저항력과 균의 독성과의 상호관계에 의존하는 것이다.
감염증 중에서도, 스트렙토코커스 뉴모니에균(폐렴구균) 등의 세균을 원인으로 하는 폐엽(肺葉) 및 기관지의 염증, 즉 세균성 폐렴의 치료체계의 개선이 당해 기술분야에서는 급선무로 되고 있었다. 즉, 세균성 폐렴은, 스트렙토코커스 뉴모니에균, 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)균 등의 세균이 폐포강을 주된 염증의 장으로 하여 발증하는 것에서 시작하는 것으로, 임상적으로는 통상 상기도 염증 증상으로 이어져서 갑자기 오한 전율로써 발증하고, 40℃전후의 고열이 오르내리고, 심한 기침, 가슴통증, 객담(喀痰)이 출현한다.
또, 전신권태감, 식욕부진, 두통과 같은 전신증상도 강하게 나타나고, 호흡곤란, 치아노제를 보이며, 또 합병증으로서 균혈증(菌血症), 수막염(髓膜炎), 관절염을 일으킬 수도 있으며, 때로는 치사적 경과를 가져오는 위중하고도 긴급한 감염증이다.
이와 같이, 세균성 폐렴에 관해서는, 특히 적확한 조기진단하에 적절한 조기치료를 실시하는 것이 필요하므로, 신속한 치료방법의 개선이 기대되고 있다.
또한, 폐렴을 포함한 감염증이 발병하면, 생체조직내에서는 제일의적으로는 호중구(好中球), 단구(單球) 및 마크로파지(macrophage)계의 식세포가 그 방어기능을 하며, 또한 우세해진 균이 식세포조직으로부터 혈액 중에 침투함으로써 혈액 중에 균이 출현하는 것으로 생각되고 있다.
일반적으로는, 세포의 식균력이 균의 독성에 미치지 않으며 스트렙토코커스 뉴모니에균 등의 세균이 폐엽 및 기관지의 조직에 정착하여 염증을 일으키는 현상이, 세균성 폐렴이라고 정의되어 있다. 그리고 종래의 세균성 폐렴의 진단에 있어서는, (1)임상 증상, (2)검체의 배양, (3)검체에 포함되는 균의 그램염색(Gram stain), 및 (4)쇼크상태의 확인이 필수이며, 이들 항목이 확인되고나서 비로소 치료방침이 결정된다. 전형예에서는, 상술한 임상 증상, 흉부X선 소견 및 호중구 증가, CRP(C-Reactive Protein:C반응성 단백질) 등 급성 상반응성 물질의 증가를 확인함으로써 추정은 할 수 있으나, 확정진단을 위해서는, 객담, 흉수 혹은 혈액 등의 검체로부터 기염균을 검색, 확정한 다음에 균의 종류에 따른 적절한 항생물질을 사용하여 치료해야 한다. 따라서, 임상 현장에 있어서는, 신속하고도 확실한 원인균의 동정이 요망되고 있다.
또, 최근 레지오네라 폐렴, 카리니 폐렴 등의 새로운 형태의 폐렴도 확인되고 있으며, 또한 MRSA(메시치린 내성 황색 포도구균)과 같은 내성주(耐性株)의 출현도 보이며, 기염균 검색의 중요성은 더욱 증대되어 가고 있다.
그러나, 실제로는 기염균의 확정은 곤란한 것이 통상이며, 특히 시중 폐렴의 경우, 30∼50%정도는 기염균이 불명인 채 치료가 개시되고 있다고 한다. 즉, 세균성 폐렴이 의심된 환자의 기염균의 검색방법으로서는 객담, 상기도 분비물, 흉수, 병소국소, 혹은 혈액으로부터의 채취시료를 검체로서 사용하며, 먼저 이것을 도말검사에 의해 염증 세포 등의 관찰에 의하여 검사재료로서의 적부를 판단하고, 이어서 그램염색을 행하여 양성, 음성의 구별, 구균, 간균(桿菌)의 구별을 결정한다. 그리고 선택배지를 이용하여 균을 배양함으로써, 기염균종의 동정이 행해지는 것이 일반적인 순서이다.
그런데, 이 방법에 의하면, 균의 배양에 장시간을 요하는데다가 상재균(常在菌)의 혼입을 피할 수 없으며, 또한 세균성 폐렴이 의심된 시점에서 대량으로 항생물질이 투여되고 있는 경우에는, 설령 검체중에 균이 포함되어 있더라도 증균, 증식할 수 없는 경우가 많으며, 실제로는 이들 검체로부터의 균의 배양의 성공률은 매우 낮은 것으로 되어 있다.
또한, 서브루틴(subroutine)으로서의 방법에, 균체성분이나 균의 대사산물의 기기분석법(辨野義己, 「가스크로마토그래피에 의한 세균동정의 신속화」, 임상검사, 29권, 12호, 1618∼1623페이지, 1985년 11월, 의학서원 참조), 특이항체를 이용한 방법(일본국 특허공개 소60-224068호 참조), 또한 DNA의 특이성을 이용한 하이브리다이제이션(hybridization)에 의한 방법(일본국 특허공고 소61-502376호) 등이 있는데, 모두 균의 분리 및 증균배양이 필수로 되어 있다.
한편, 감염증에 있어서의 식세포의 기능에 착안한 것으로서, 혈액시료 중의 백혈구성분이 집중되어 있는 바피 코트(Buffy coat)의 도말 염색 표본을 검경(檢鏡)하는 방법이 있다. 일반적으로 바피 코트 표본에서 균이 검출되는 빈도는, 성인 균혈증에서는 이타혈(耳朶血)의 빈도와 마찬가지로 30%정도에 그치지만, 신생아의 경우 10개의 예 중에서 7개의 예(70%)에서 균을 검출하고 있다는 보고도 있으며, 도말 표본의 검경에 의하여 말초혈중균의 유무에 관한 정보는 치료에 있어서 커다란 지침이 되고 있다.
상기 종래 기술에 있어서는, 그 전처리 조작으로서 적어도 검체로부터의 균의 선택적 분리에 1∼2일, 증균에 1일, 고정조작에 1일이상, 합계하여 3∼4일은 충분히 걸리며, 실제로는 이 배양을 균이 발육할 때까지 계속하게 되므로, 전처리 조작에 1주일 이상을 요하는 경우가 많으며, 게다가 균의 배양시에 질환의 원인균 이외의 균이 혼입되더라도 구별할 수 없는 경우도 있다.
그리고 중요한 것은 상술한 사정으로부터, 배양해야 할 검체 중의 많은 균은 식세포에 잡아먹히고, 항생물질 투여를 위해 죽어 있거나 정지상태에 있기 때문에, 배양조건하에서도 증식할 수 있는 균의 수는 적으며, 임상검체를 이용한 배양에 의한 실제의 균의 검출율은 10%전후로 매우 낮다. 환언하면, 임상적으로 폐렴의 가능성이 의심된 환자의 혈액을 다시 하루 낮밤 이상 배양하여 검사하더라고 결국 그 90%는 균의 존재마저 판명되지 않는 것이 현상황이다.
이와 같은 상황으로부터, 현재는 기염균의 확정과 그것에 입각한 항생물질의 선택이 요구되고 있음에도 불구하고, 임상적으로 세균성 폐렴의 가능성이 의심된 단계에서, 검출결과가 나오는 것을 기다리지 않고 치료, 즉 기염균이 불명인 채 가장 광범위한 종류의 균에 유효한 항생물질을 투여하고, 1, 2일간 경과를 지켜보아서, 효과가 드러나지 않으면 다른 항생물질로 바꾼다고 하는 시행착오적인 방법에 의존하고 있는 것이다.
또, 검체중의 균을 염색에 의하여 검출하는 방법에서는, 생체성분도 균과 마찬가지로 염색되기 때문에, 검경하여 확인되는 형태에 의해서만 신속하게 균을 판별하는 것은, 숙련이 필요하며 판정이 곤란한 경우도 있다.
이와 같이, 신속하고 확실한 진단이 요구되는 질환임에도 불구하고, 종래의 진단방법으로서는 충분히 대응할 수 없었던 것이 실정이다.
본 발명은 감염증 질환의 원인균, 특히 세균성 폐렴의 대표적 기염균(起炎菌)인 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)균의 검출 및 동정에 유용한 프로브에 관한 것이다.
제 1 도는 스트렙토코커스 뉴모니에균 검출용 프로브 SP-22, SP-23 및 SP-25의 제한효소 지도이고,
제 2 도는 스트렙토코커스 뉴모니에균 검출용 프로브 SP-26, SP5-15, SP5-34 및 SP6-6의 제한효소 지도이다.
본 발명은 상기 당해 기술분야가 내포하고 있는 문제를 감안하여 완성된 것이며, 그 요지로 하는 바는, 감염증 원인균, 특히 세균성 폐렴의 대표적 기염균인 스트렙토코커스 뉴모니에균이 보유하는 DNA 또는 RNA와 특이적인 반응성을 갖는 프로브, 및 당해 프로브에 포함되는 스트렙토코커스 뉴모니에균이 본질적으로 보유하고 있는 유전자부분의 염기배열을 해명하는 것에 있다.
즉, 본 발명의 프로브에 의하여, 예를 들면 식세포에 잡아먹히어 파괴되고 있는 균에 있어서 아직 유지되고 있는 균의 DNA를, 그 특이성에 의거하여 유용하게 검출할 수 있으며, 이에 따라 균을 배양, 증식하지 않고 감염증 질환의 원인균을 신속하고 확실하게 검출할 수 있다. 또한 이들 프로브의 염기배열정보를 참조하여 프라이머를 디자인하면, 하이브리다이제이션을 행하지 않더라도 PCR법에 의한 DNA의 증폭에 의해 감염증 원인균을 동정할 수가 있다.
또, 하이브리다이제이션에 이용하는 프로브를 비방사성의 것, 예를 들면 비오틴화한 프로브를 이용하면, 방사성 동위원소 사용시설이 없는 일반검사실에서도 광학현미경을 이용하여 검출할 수 있으며 검출작업을 신속하고 간편하게 행할 수 있다.
이하, 감염증 질환, 특히 폐렴의 기염균인 스트렙토코커스 뉴모니에균에 유래하는 프로브의 실시예를 나타낸다.
실시예 1:스트렙토코커스 뉴모니에균 유래 DNA 프로브
(1)스트렙토코커스 뉴모니에균 유래 DNA 프로브의 조제
임상균주인 스트렙토코커스 뉴모니에를 BHI(Brain Heart Infusion)배지에서 하루밤 배양하고, 배양균체를 집균(集菌)하여 N-아세틸-무라미다아제 SG를 가한 다음, 사이토-미우라(Saito-Miura)법("Preparation of transforming deoxyribonucleicacid by phenol treatment", Biochim. Biophys. Acta 72권, 619∼629페이지(1963))에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다.
추출한 DNA를 제한효소 PstI로 완전소화하고, 벡터 pGEM-3Z에 랜덤 클로닝하고, 얻어진 클론으로부터 스트렙토코커스 뉴모니에균 특유의, 즉 천연의 스트렙토코커스 뉴모니에균이 보유하는 DNA와의 특이적 반응성을 보이는 DNA단편을 포함하는 7종의 프로브를 선발하였다.
그리고 선발된 각 프로브를 프로브 SP-22, 프로브 SP-23, 프로브 SP-25, 프로브 SP-26, 프로브 SP-5-15, 프로브 SP-5-34 및 프로브 SP-6-6이라 명명하고, 그 제한효소 지도를 제 1 도 및 제 2 도에 나타내었다.
(2)스트렙토코커스 뉴모니에균 유래 DNA 프로브의 종특이성의 검토
각 프로브와 각종 감염증 원인 균주의 DNA와의 반응성을 이하의 방법에 의하여 검토하였다.
먼저, 검토대상 균주로서, 하기 표 1에 열거한 임상단리주 및 기탁균주를 준비하였다. 또한, 표 1 중의 인간 게놈 DNA 및 대조시료의 입수원으로서, 4명의 건강한 성인남녀로부터 채취한 백혈구, 및 플라스미드 pGem-32를 포함한 이스취리시아 콜리 K-12(Escherichia coli K-12), JM109 형질전환체를 각각 준비하였다.
세균 No. 세균명 출소·유래
1 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) NYSDH DP-2
2 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 임상분리주
3 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 임상분리주
4 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae) IFM 58/59
5 스트렙토코커스 안지노서스(Streptococcus anginosus) NCTC 8787
6 스트렙토코커스 콘스텔라터스(Streptococcus constellatus) ATCC 27823
7 스트렙토코커스 이퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis) NCTC 8543
8 스트렙토코커스 패시움(Streptococcus faecium) NCTC 7171
9 스트렙토코커스 패깔리스(Streptococcus faecalis) ATCC 19433
10 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis) ATCC 9811
11 스트렙토코커스 모르빌로럼(Streptococcus morbillorum) ATCC 27824
12 스트렙토코커스 파이어쥐닌(Streptococcus pyogenes) DHI S8
13 스트렙토코커스 산귀스(Streptococcus sanguis) ATCC 10556
14 스트렙토코커스 살리바리어스(Streptococcus salivarius) ATCC 7073
15 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 25923
16 스타피로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228
17 이스취리시아 콜리(Escherichia coli) ATCC 25922
18 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 임상분리주
19 쉐도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27583
20 엔터로코커스 아글로메란(Enterococcus agglomerans) 임상분리주
21 헤모필리스 인플루엔제(Haemophilis influenzae) 임상분리주
22 캔디다 알비칸(Candida albicans) IFM 40083-A형
23 아스페르길러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus) MTU 06001
24 크립토코커스 네오포르만(Cryptococcus neoformans) MTU 13001
25 무코르 스피노서스(Mucor spinosus) TIMM 1322
26 인간 게놈 DNA
27 대조
범례 : NSYDH ; New York State Department of Health(Albany, New York, U.S.A.)
NCTC ; National Collection of Type Cultures(London, England)
DHI ; Dairen Hygienic Institute
IFM ; 치바대학 진핵미생물 연구센터
MTU ; 도쿄대학 의학부
TIMM ; 데이쿄대학 진균 연구센터
그리고 각 임상균주를 실시예1의 (1)에 기재한 방법을 따라서, 각 균주가 보유하는 DNA를 추출하고, 이 추출한 DNA의 일정량(예를 들면 5μl)을 나일론필터에 스폿하고, 알칼리변성된 것을 도트 브롯트 하이브리다이제이션(dot brot hybridization)의 시료로 하였다.
또한, 인간 게놈 DNA시료는, 상술한 사이토-미우라법에, 앞서 입수한 백혈구를 적용함으로써 조제하였다. 한편, 대조시료는, 후술하는 실시예2의 (1)에 기재된 플라스미드 DNA의 조제방법에, 앞서 입수한 플라스미드 pGem-32를 포함한 이스취리시아 콜리 K-12, JM109 형질전환체를 적용함으로써 조제하였다. 이어서, 디고시게닌 -11-dUTP(BRL사제)로 라벨한 스트렙토코커스 뉴모니에균 유래의 DNA프로브를, 마니아티스의 매뉴얼(T. Maniatis, et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbour Laboratory(1982))을 따라서 45%포름아미드, 5×SSC, 42℃의 조건하에서, 철야 하이브리다이제이션을 실시하였다.
철야 하이브리다이제이션을 마친 시료를, 55℃에서 0.1×SSC, 0.1%SDS에 의한 20분간의 세정을 2회 행한 후에, Anti-Dig-ALP 컨쥬게이트(Anti-Dig-ALP conjugates)(BRL사제)로 검출, 발색시키고, 하이브리다이제이션의 상황을 확인하였다.
각 프로브와 각 임상균주의 DNA와의 반응성에 관한 실험결과를 이하의 표 2에 나타내었다.
세균No. 세균명 출소·유래 프로브〔기호:SP-〕
22 23 25 26 5-15 5-34 6-6
1 스트렙토코커스 뉴모니에 NYSDH DP-2 + + + + + + +
2 스트렙토코커스 뉴모니에 임상분리주 + + + + + + +
3 스트렙토코커스 뉴모니에 임상분리주 + + + + + + +
4 스트렙토코커스 아갈락티에 IFM 58/59 - - - - - - -
5 스트렙토코커스 안지노서스 NCTC 8787 - - - - - - -
6 스트렙토코커스 콘스텔라터스 ATCC 27823 - - - - - - -
7 스트렙토코커스 이퀴시밀리스 NCTC 8543 - - - - - - -
8 스트렙토코커스 패시움 NCTC 7171 - - - - - - -
9 스트렙토코커스 패깔리스 ATCC 19433 - - - - - - -
10 스트렙토코커스 미티스 ATCC 9811 - - - - - - -
11 스트렙토코커스 모르빌로럼 ATCC 27824 - - - - - - -
12 스트렙토코커스 파이어쥐닌 DHI S8 - - - - - - -
13 스트렙토코커스 산귀스 ATCC 10556 - - - - - - -
14 스트렙토코커스 살리바리어스 ATCC 7073 - - - - - - -
15 스타피로코커스 아우레우스 ATCC 25923 - - - - - - -
16 스타피로코커스 에피데르미디스 ATCC 12228 - - - - - - -
17 이스취리시아 콜리 ATCC 25922 - - - - - - -
18 클레브시엘라 뉴모니에 임상분리주 - - - - - - -
19 쉐도모나스 아에루지노사 ATCC 27583 - - - - - - -
20 엔터로코커스 아글로메란 임상분리주 - - - - - - -
21 헤모필리스 인플루엔제 임상분리주 - - - - - - -
22 캔디다 알비칸 IFM 40083-A형 - - - - - - -
23 아스페르길러스 푸미가터스 MTU 06001 - - - - - - -
24 크립토코커스 네오포르만 MTU 13001 - - - - - - -
25 무코르 스피노서스 TIMM 1322 - - - - - - -
26 인간 게놈 DNA - - - - - - -
27 대조 + + + + + + +
주 : 표 중에 있어서 ;
+의 부호는 하이브리드의 시그널이 검출된 것을 나타내며
-의 부호는 하이브리드의 시그널이 검출되지 않은 것을 나타낸다.
상기 표 2로부터 확실한 바와 같이, 어느 프로브도 스트렙토코커스 뉴모니에균에 유래하는 DNA에 대해서만 반응성을 보이며, 스트렙토코커스속 이외의 균종 유래의 DNA는 물론, 스트렙토코커스속의 다른 균종 유래의 DNA에 대해서도 반응성(하이브리드의 형성)이 확인되지 않으며, 그 종특이성이 확인되었다.
실시예 2:염기배열의 해석
실시예 1에서 종특이성이 확인된 DNA 프로브(모두 7개)의 염기배열을 하기의 방법을 따라서 결정하였다.
(1) 플라스미드 DNA의 조제
서브 클론된(염기배열을 결정해야 하는) 삽입단편을 pGem-3Z(Promega)에 포함된 이스취리시아 콜리 K-12, JM109 형질전환체를, 5ml의 루리아-박타니-미디엄(Luria-Bactani Medium)(박토-트립톤, 10g/1L; 박토-이스트 엑스트랙트, 5g/1L; NaCl, 10g/1L;5N NaOH로 pH7.0으로 조절)에 식균(植菌)하고, 하룻밤 배양하였다.
배양액을 원심분리(5,000rpm, 5분)하여 집균하였다. 침전물에 2.5mg/ml의 농도로 리조치임(Sigma)을 포함한 50mM 글루코오스/50mM Tris-HCI(pH8.0)/10mM EDTA 용액을 100μl 가하고, 실온에서 5분간 방치하였다. 얻어진 현탁액에 1%의 농도로 도데실황산나트륨(Sigma)을 포함한 0.2M 수산화나트륨수용액을 가하여 혼합하였다. 5M초산칼륨수용액(pH4.8) 150μl를 더 가하여 혼합하고, 15분간 빙냉(氷冷)하였다.
그리고 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 얻은 상청을, 페놀/CHCl3처리하고, 상청에 2배량의 에탄올을 첨가하고, 다시 원심분리(12,000rpm, 5분)하여 침전을 얻었다. 이 침전물을 10mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1mM EDTA용액 100μl에 용해하고, 10mg/ml RNaseA(Sigma)용액을 가하고, 실온에서 15분간 방치하였다.
이 조제물에 0.1M 초산나트륨수용액(pH4.8)을 300μl 가하고, 페놀/CHCl3처리하고, 상청에 에탄올을 첨가하여 침전을 얻었다. 이 침전물을 건조하고, 10μl의 증류수에 용해한 것을 DNA 시료로 하였다.
(2)염기배열 결정의 전처리
염기배열 결정의 전처리를 오토리드(AutoRead)(등록상표) 시퀸싱 키트(Sequencing Kit)(Pharamasia)를 이용하여 행하였다.
즉, 주형이 되는 DNA가 32μl용액 중에 5∼10μg의 농도가 되도록 조정하였다. 1.5ml의 미니튜브(엣펜돌프)에, 주형 DNA 32μl를 옮기고, 2M수산화나트륨수용액을 8μl 가하여 조용히 혼합하였다. 그리고 가볍게 원심한 후, 실온에서 10분간 방치하였다.
3M초산나트륨(pH4.8) 7μl과 증류수 4μl을 가하고, 다시 에탄올을 120μl 가하여 혼합하고, 드라이아이스 상에서 15분간 방치하였다. 그리고 15분간 원심분리하여 침전된 DNA를 모으고, 주의하면서 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 70%에탄올로 세정하고, 10분간 원심분리하였다. 그리고 주의하면서 다시 상청을 제거하고, 감압조건하에서 침전물을 건조하였다.
침전물을 증류수 10μl에 용해하고, 형광성의 프라이머〔Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3'(1.6pmol/μl; 0.42 A260unit/ml); M13 Reverse Primer, 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC]-3'(2.1pmol/μl; 0.42 A260unit/ml)〕2μl(0.42 A260unit/ml, 4∼6pmol)과 어닐링용 완충액 2μl을 가하여 조용히 혼합하였다.
그리고 가볍게 원심한 후, 65℃에서 5분간 열처리를 행하고, 재빨리 37℃조건하에 두고, 그곳에서 10분간 보온하였다. 보온후 10분이상 실온에서 방치하고, 가볍게 원심하였다.
그리고, 연장용 완충액 1μl와 디메틸술폭시드 3μl를 가한 것을 시료로 하였다.
4개의 미니 튜브에 A, C, G, 및 T라고 기입하고, 각각의 튜브에 AMix(ddATP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것), C Mix(ddCTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것), G Mix(ddGTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것) 및 T Mix(ddTTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해한 것)을 2.5μl씩 나누어 부었다.
또한, 각각의 용액은 사용할 때까지는 얼음 중에서 보존하고, 사용할 때에는 37℃에서 1분이상 보온하고 나서 사용하였다.
희석한 T7DNA 폴리메라제(Pharmacia; 6∼8units/2μl)2μl를 DNA시료에 첨가하고, 피페팅(pippetting) 혹은 조용한 혼합에 의하여 완전히 혼합하였다. 혼합 후 바로, 이 혼합액을 4.5μl씩 보온하여 둔 4종의 용액에 나누어 부었다. 또한 나누어 부을 때에는 새로운 칩을 사용하였다.
37℃에서 5분간 보온하고, 정지용액을 5μl씩 각각의 반응액에 첨가하였다. 이와 같이 나누어 부을 때에도 새로운 칩을 사용하였다. 90℃에서 2∼3분간 보온하고, 바로 얼음 중에서 냉각하였다. 전기영동에는 1레인당 4∼6μl를 영동하였다.
(3)염기배열의 결정
실시예 1 및 2에 개시한 스트렙토코커스 뉴모니에균이 보유하는 DNA에 대하여 특이성을 갖는 프로브 각각의 염기배열의 결정을, 영동온도 45℃, 영동시간 6시간으로 하여, A.L.F.DNA Sequencer 시스템(Pharmacia)을 이용하여 행하였다.
그 결과, 프로브 SP-22(배열번호 1), 프로브 SP-23(배열번호 2), 프로브 SP-25(배열번호 3), 프로브 SP-26(배열번호 4), 프로브 SP-5-15(배열번호 5), 프로브 SP-5-34(배열번호 6) 및 프로브 SP-6-6(배열번호 7) 각각의 염기배열의 전모가 확실해졌다.
본 발명의 프로브를 사용하면, 예를 들면 식세포에 잡아먹힌 감염증 원인균을 증식하는 일 없이 직접 검출하고, 또한 균을 신속하고도 정확하게 동정할 수 있다. 즉, 본 발명의 프로브를 사용한 진단에서는, 1회분의 검체로 동정까지 행할 수 있으며, 진단에 요하는 시간도 종래법의 3∼4일(검출되는 비율은 낮다)로부터 약 1∼2일로 비약적으로 단축할 수 있으며, 게다가 그 검출율은 아주 높다. 이로 인해, 세균성 폐렴의 치료에 대하여 획기적인 지침을 줄 수 있을 뿐만 아니라, 감염증 환자에게 조기에 유효한 치료를 실시할 수 있으며, 나아가서는 사망율의 저감도 기대된다.
또한, 감염증 질환 기염균 중에서도, 특히 폐렴의 발증에 깊은 관련이 있는 스트렙토코커스 뉴모니에균이 보유하는 DNA에 특이적으로 반응하는 프로브의 염기배열을 확실하게 함으로써, 이들 프로브를 인공적으로 조제하는 것을 가능하게 하였다. 또한, 해석한 염기배열의 정보의 일부를 이용하여 제작한 프라이머를 이용하여 임상검체에 포함되는 감염증 원인균의 DNA를 PCR법에 의하여 증폭하여 원인균의 신속한 진단에 도움을 줄 수 있다.
또한, 임상검체에 포함되는 게놈 DNA의 염기배열과 본 발명에 의하여 해석된 염기배열을 비교참조함으로써, 폐렴 기염균종의 신속한 동정을 행할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 소기의 목적이었던 감염증 진단용 프로브를 제공하는 것 뿐만 아니라, PCR용 프라이머 제작의 지침으로서, 또 임상검체에 포함되는 게놈 DNA와의 비교참조용에 적합한 표준배열로서 우수한 유용성이 기대되며, 또한 감염증 질환 기염균(폐렴 기염균)이 보유하는 DNA에 특이적으로 반응하는 프로브의 금후의 연구, 개발에 있어서의 귀중한 단서를 가져오는 등의 우수한 효과를 발휘하는 것이다.
또, 본원 출원에서 개시한 염기배열은, 임상분리주의 게놈 DNA를 랜덤으로 클로닝하여 얻어진 것이며, 이 때문에 본 발명의 염기배열의 유용성은 그 상보쇄에 까지 미치는 것이다.
또한, 야성주(野性株)가 보유하는 DNA에 변이부분이 존재하는 것은 당연히 생각할 수 있으나, 상기 실시예의 개시로부터 확실한 바와 같이, 당해 DNA 변이부분은, 감염증 진단을 위한 하이브리다이제이션에 이용할 때의 본 발명 프로브의 특이성, 혹은 본원 출원에 개시한 염기배열 정보를 감염증의 신속진단을 목적으로 한 PCR법의 프라이머를 디자인하기 위하여 이용할 수 있는 등의 본 발명이 갖는 유용성에는 아무런 영향을 주지 않는다.
배열표
배열번호 : 1
배열의 길이 : 368
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-22
배열
배열번호 : 2
배열의 길이 : 1978
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-23
배열
배열번호 : 3
배열의 길이 : 1124
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-25
배열
배열번호 : 4
배열의 길이 : 5949
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-26
배열
배열번호 : 5
배열의 길이 : 3568
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-5-15
배열
배열번호 : 6
배열의 길이 : 4528
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-5-34
배열
배열번호 : 7
배열의 길이 : 5579
배열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2
토폴로지 : 직쇄형상
배열의 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)
주명 : 임상분리주 SP-6-6
배열

Claims (2)

  1. 감염증 질환 기염균인 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)균이 보유하는 DNA를 제한효소 PstI로 처리하여 얻어지는 DNA단편을 포함하며, 또한 스트렙토코커스 뉴모니에균이 보유하는 DNA와 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 감염증 진단용 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 감염증 진단용 프로브가 배열번호 1 내지 7에 기재된 적어도 하나의 염기배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염증 진단용 프로브.
KR1019960706982A 1994-09-30 1995-10-02 감염증 진단용 프로브 KR100238337B1 (ko)

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