WO1996010647A1 - Sonde pour diagnostic des maladies infectieuses - Google Patents

Sonde pour diagnostic des maladies infectieuses Download PDF

Info

Publication number
WO1996010647A1
WO1996010647A1 PCT/JP1995/002036 JP9502036W WO9610647A1 WO 1996010647 A1 WO1996010647 A1 WO 1996010647A1 JP 9502036 W JP9502036 W JP 9502036W WO 9610647 A1 WO9610647 A1 WO 9610647A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
probe
bacteria
streptococcus
clinical
Prior art date
Application number
PCT/JP1995/002036
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Keshi
Soji Eda
Hirotsugu Uehara
Hiroshi Ueyama
Akio Matsuhisa
Original Assignee
Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. filed Critical Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
Priority to CA002199938A priority Critical patent/CA2199938C/en
Priority to DE69529758T priority patent/DE69529758T2/de
Priority to AT95933618T priority patent/ATE233326T1/de
Priority to DK95933618T priority patent/DK0785277T3/da
Priority to AU36189/95A priority patent/AU689325B2/en
Priority to EP95933618A priority patent/EP0785277B1/en
Priority to KR1019960706982A priority patent/KR100238337B1/ko
Priority to US08/809,254 priority patent/US6660852B1/en
Publication of WO1996010647A1 publication Critical patent/WO1996010647A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention relates to a probe useful for detecting and identifying a causative bacterium of an infectious disease, in particular, a bacterium Streptococcus pneumoniae, which is a typical causative bacterium of bacterial pneumonia. (Background technology)
  • infection refers to the invasion of a pathogenic microorganism (hereinafter referred to as the "bacteria”) into the organism, establishing a foothold for growth. However, it depends on the interaction between the resistance of the host and the virulence of the fungus.
  • bacteria pathogenic microorganism
  • bacterial pneumonia includes Streptococcus newmonies (Strep tococcus pneumon iae) bacteria, Staphylococcus' Aureus (bacterium Staphylococcus aureus) bacteria, etc.
  • bacterial phagocytosis is a phenomenon in which the phagocytic activity of cells does not reach the virulence of bacteria, and bacteria such as Streptococcus pneumoniae colonize the tissues of the lung lobe and bronchi and cause inflammation. Defined as pneumonia.
  • bacteria such as Streptococcus pneumoniae colonize the tissues of the lung lobe and bronchi and cause inflammation.
  • pneumonia In the conventional diagnosis of bacterial pneumonia, (1) clinical symptoms, (2) specimen culture, (3) Gram staining of bacteria contained in the specimen, and (4) confirmation of shock state Is essential, and a treatment policy is determined only after these items are confirmed.
  • it is estimated by the above-mentioned clinical symptoms, chest X-ray findings, and an increase in acute phase reactive substances such as neutrophilia and CRP (C-reactive protein).
  • methods for searching for pathogenic bacteria in patients with suspected bacterial pneumonia include using sputum, upper respiratory secretions, pleural effusion, focal lesions, or samples collected from blood as samples. First of all, it is judged by a smear test whether or not it is suitable as a test material by observing inflammatory cells, etc., and then subjected to Gram staining to determine whether it is positive, negative, cocci or bacilli.
  • a common procedure is to identify the causative agent by culturing the bacteria using a selective medium:
  • the cultivation of the bacteria takes a long time, If inevitable contamination with indigenous bacteria is inevitable and a large amount of antibiotics are administered at the time of suspected bacterial pneumonia, even if the specimen contains bacteria, the enrichment will occur. In many cases, they cannot grow, and in fact, the success rate of culturing bacteria from these specimens is extremely low.
  • a method as a subroutine includes a method for instrumental analysis of bacterial components and metabolites of bacteria (Yoshimi Benno, “Fast identification of bacteria by gas chromatography”, Clinical Laboratory, Vol. 29, No. 12, 16) See pages 18 to 1623, January 1985, Medical Research Institute, a method using specific antibodies (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-224068), and a hybridization method using DNA specificity. Methods (Japanese Translation of PCT International Publication No. 61-502376), all of which require bacterial isolation and enrichment culture.
  • At least one or two are required for selective separation of bacteria from the specimen, at least one day for enrichment, one or more for fixation, and a total of three to four for the pretreatment operation.
  • this culture is actually continued until the bacteria grow, so that the pre-treatment operation often requires one week or more. May also be indistinguishable.
  • the present invention has been completed in view of the above-mentioned problems in the technical field.
  • the gist of the present invention is that Streptococcus, which is a typical causative bacterium of infectious disease-causing bacteria, in particular, bacterial pneumonia.
  • the purpose of the present invention is to elucidate the nucleotide sequence of the gene portion inherently possessed by Streptococcus newmonie.
  • the probe of the present invention can significantly detect, for example, the DNA of a bacterium that is still maintained in a bacterium that is being taken up and destroyed by phagocytic cells based on its specificity.
  • the bacterium is cultivated.
  • the causative organism of infectious disease can be detected quickly and reliably without multiplication.
  • primers are designed with reference to the nucleotide sequence information of these probes, the infectious disease-causing bacteria can be identified by amplification of the DNA by PCR, without the need for hybridization.
  • the probe used for hybridization is non-radioactive, for example, if a probe with a biotin is used, it can be detected using an optical microscope even in a general laboratory without a facility using radioisotopes. Detection work can be done quickly and easily. [Brief description of drawings]
  • Figure 1 shows the restriction enzymes SP-22, SP-23, and SP-25 for detection of Streptococcus' newmonies (Streptococcus j /? Ei /; j7o / j / ae) bacteria. Map;
  • Fig. 2 shows probes for detection of Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pflei / iwoTn'ae) bacteria SP-26, SP5-15, SP5-34, and
  • probes derived from infectious diseases in particular, Streptococcus pneumoniae, which is a pneumonia-causing bacterium, are shown below.
  • Example 1 DNA probe derived from Streptococcus pneumoniae ⁇ (Preparation of DNA probe from jj Streptococcus pneumon iae
  • the clinical strain Streptococcus pneumoniae was isolated from BHI (Brain Heart
  • the extracted DNA is completely digested with the restriction enzyme Pstl, and the vector pGEM-
  • Streptococcus pneumoniae-specific that is, natural
  • Streptococcus pneumoniae bacterium Seven kinds of probes containing a DNA fragment showing specific reactivity with DNA possessed were selected.
  • SP-23 Named SP-23, probe SP-25, probe SP-26, probe SP-5-15, probe SP-5-34, and probe SP-6-6. This is shown in FIG.
  • Table 1 Bacteria Nn cells HSI cells-rA to ⁇
  • Example 1 the DNA contained in each strain was extracted from each clinical strain, and a fixed amount (for example, 51) of the extracted DNA was converted to nylon phyllo.
  • the sample spotted on the filter and denatured by alkali was used as a sample for the dot blot 'hybridization section'.
  • the human genomic DNA sample was prepared by applying the previously obtained leukocyte to the Saito-Miura method described above.
  • the control sample was prepared by transforming Escherichia coli K-12, JM109 containing the plasmid pGem-32 obtained previously in the method for preparing plasmid DNA described in Example 2 (1) described later. It was prepared by applying the body. Then
  • Digoxigenin-ll-dUTP (manufactured by BRL) was used to insert the Streptococcus pneumoniae ⁇ DNA probe into the Mania manual.
  • the ten sign indicates that a hybridized signal was detected.
  • the nucleotide sequence of the DNA probes (total of 7 probes) whose species specificity was confirmed in Example 1 was determined according to the following method.
  • the subcloned insert (to be sequenced) was transformed with pGem-3Z (Promega containing Escherichia coli K-12, JM109 transformant) and 5 ml of Luria-Bactani Medium (bacterium Puton, 10 g / lL; noct-yeast extract extract, 5 g / lL; NaCK10g / lL; adjusted to pH 7.0 with 5N NaOH) and cultured overnight.
  • pGem-3Z Promega containing Escherichia coli K-12, JM109 transformant
  • Luria-Bactani Medium bacteria Puton, 10 g / lL; noct-yeast extract extract, 5 g / lL; NaCK10g / lL; adjusted to pH 7.0 with 5N NaOH
  • the culture was collected by centrifugation (5,000 rpm, 5 minutes). 100 1 of a 50 mM glucose / 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / lOmM EDTA solution containing lysozyme (Sigma) at a concentration of 2.5 mg / ml was added to the sediment, and left at room temperature for 5 minutes. To the obtained suspension, a 0.2 M sodium hydroxide aqueous solution containing sodium dodecyl sulfate (Sigma) at a concentration of 1% was added and mixed. Further, a 5 M aqueous solution of potassium acetate (PH4.8) 1501 was added, mixed, and cooled on ice for 15 minutes.
  • PH4.8 potassium acetate
  • Type III DNA 32AI1 was transferred to a 1.5 ml minitube (Eppendorf), and 81 of a 2 M aqueous sodium hydroxide solution was added thereto and mixed gently. After light centrifugation, the mixture was left at room temperature for 10 minutes.
  • Diluted T7 DNA polymerase (Pharmacia; 6-8 units / 21) 21 was added to the DNA sample and mixed thoroughly by pipetting or gentle mixing. Immediately after mixing, the mixture was dispensed into four solutions kept 4.5 1 each. A new tip was used for dispensing.
  • probe SP-22 SEQ ID NO: 1
  • probe SP-23 SEQ ID NO: 2
  • probe SP-25 SEQ ID NO: 3
  • probe SP-26 SEQ ID NO: 4
  • probe SP-5-15 SEQ ID NO: 5
  • Probe SP-5-34 SEQ ID NO: 6
  • Probe SP-6-6 SEQ ID NO: 7
  • an infectious disease causing bacterium incorporated into a phagocytic cell can be directly detected without growing, and the bacterium can be quickly and accurately identified. That is, in the diagnosis using the probe of the present invention, bacteria can be identified in one sample, and the time required for diagnosis is about 1 to 2 days, which is 3 to 4 days (the detection rate is low) of the conventional method. It can be shortened dramatically, and the detection rate is extremely high. Therefore, in addition to providing technological guidelines for the treatment of bacterial pneumonia, it is expected that patients with infectious diseases can be treated quickly and effectively, and that mortality will be reduced.
  • the Strep tococcus ⁇ / ⁇ / ⁇ aell force which is deeply associated with the development of pneumonia
  • the nucleotide sequence of a probe that specifically responds to the DNA The results revealed that these probes could be artificially prepared, and that a clinical trial was performed using primers that were created using part of the analyzed base sequence information.
  • the DNA of the causative organism of the infectious disease contained in the specimen can be amplified by the PCR method, which can be used for quick diagnosis of the causative organism.
  • the present invention not only provides a probe for diagnosing infectious diseases, which was the intended purpose, but also serves as a guideline for preparing primers for PCR, and as a guide for genomic DNA contained in clinical samples. Is expected to have excellent utility as a reference sequence suitable for comparison with DNA, and further explore probes that specifically react with DNA carried by infectious disease-causing bacteria (Pneumoniae-causing bacteria) ⁇ It has excellent effects such as providing valuable clues in development.
  • the nucleotide sequence disclosed in the present application is a genomics of a clinical isolate.
  • the nucleotide sequence of the present invention extends to its complementary strand.
  • the DNA possessed by the wild-type strain has a mutated portion.
  • the specificity of the probe of the present invention when the DNA mutant portion is used in a hybridization for diagnosis of infectious disease or as apparent from the disclosure of the present application.
  • the present invention has no effect on the usefulness of the present invention, for example, it can be used for designing a primer of a PCR method for the purpose of rapid diagnosis of infectious disease using the nucleotide sequence information disclosed in the above.
  • Sequence type nucleic acid
  • CTGCAGCTTT CAAGGAACCT GTCAAGAGAG CCAGTTTCAA ATTGGGAAAA AGGTTCTGTA 60 AACTCTCAAA GTGTTGCTCT GCGAGGATTT CTGTTGGTAC CATTAGGGCA GCCTGATAAC 120 CTGCTGTCAC TGCCGCAAAC ATGGCCAAGC CAGCGACTAC CGTTTTTTCC ACTCCCCACA 180 TCCCCTTGTA GGAGACGATT CATGTGGTGG TCGGACTTCA TATCAGTTAA AATTTCCTGC 240 AAACTCTTTT CCTGAGCTTG GGTCAGGGCA AAAGGAAGAC TTACTTTAAC TGCTGTCACT 300 TTCCTGAG ACCAATTCAG AACCAGACCA CTTCCCTGAA CTCTATTTTC AGACTTGAGC 360 ATCTGCAG 368 SEQ ID NO: 2
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Streptococcus pneumoniae
  • TTCACCATTC TTCCATACCA TTATCGCTGG TTTTGACCTT GCCATGGAAG AAAAAGATGG 1080
  • Sequence type nucleic acid
  • Organisms: 3 ⁇ 4 Streptococcus pneumoniae
  • CTGCAGGTTT TGTCCTCAAC CTCCCAATCA AAGAAAATAT GAGAAATCTG CGAGTTAAGA 60 TTGAGAAAAA GACGGGCCTA CTATGGAATA GATGGCAAAC AATCTATGAA AACAGACCAA 120 TTTTAGCTCA ACCCCACCGT AAAATTACCC ATTGGGGTAC GACATTGAAT TCCAAGGTGA 180 GTGACGATGA TGTCTTGTAA TCTGATGGTA GAATGACAGT TAGTTTGTCT AGTTTATAAG 240 AAAGTACTAC CTGAGCTTGA ATAGAACTCA GGTAGCTCTCTC TATGAAAGAA CAAAATTAAT 300 ACTCAATGAA AATCAAAGAG CAAACTAGGA AACTAGCCGC AGTTTGCTCA AAGCACTGCT 360 TTGAGGTTGT AGATAAGACT GACGAAGTCG TCACCATATA TAATCCAAGG CGACGTTGAC 420 GTGGATTGAA GAGATTTTAG AAGAGTATAA ACAG
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • TTTGTGCTA CGTAGG ATTA AGGATCTAGGG TAATTTTACTAATAGTCC ATCTTTC GTT CTTTCA AGAT3 ⁇ 4GA GCCCTC CAA CGTGACTTTAGATTGGTGTTCGAA CGT TT
  • GTGTAGCCAC CGTAGGTCAA GTCAGCTGCC CAGTGATGGA AGGTAGAGTC GTACTCACCA 2460
  • GGATTGTTCA TAATGCTACG ATAAGCAATG GCACCATCCT GCCAATCGAC TTTCTTGTCT 3120
  • CAGAACCAGC CATCCTTGTC ATAACCGACA AAAACATTAT TCTTGGTATC TTTAAATTTC 4260
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name 'Stref' toco 'y cas pneumoniae (Streptococcus pneumoniae)
  • EJ3V3D13V S, VD 313
  • VV3VD1C V3D1 ⁇ 1DV1 L1 901- vvi3 V3011VV 3 33V9V1V31V s 3vilVVV 0V1
  • VV1V1S1s 3V V03 v 31v11313

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

明 細 書 感染症診断用プローブ 〔技術分野〕
本発明は、 感染症疾患の原因菌、 特に、 細菌性肺炎の代表的起炎 菌である ス ト レブ ト コ ッ カス · ニューモニエ S trep tococcus pneumon iae) 菌の検出および同定に有用なプローブに関する。 〔背景技術〕
病理学的に、 感染とは病原性の微生物 （以下、 「菌」 と称する） が生体内に侵入し、 増殖の足がかりを確立することを指し、 生体内 での菌の増殖に起因する発症は、 宿主の抵抗力と菌の毒力との相互 関係に依存するものである。
感染症の中でも、 ス ト レプ ト コ ッカ ス · ニュ ーモニエ菌 （肺炎球 菌） などの細菌を原因とする肺葉および気管支の炎症、 すなわち、 細菌性肺炎の治療体系の改善が、 当該技術分野では急務とされてい た。 すなわち、 細菌性肺炎は、 ス ト レプ ト コ ッカ ス · ニ ュ ー モニ ェ Strep tococcus pneumon iae) 菌、 ス タ フ イ ロ コ ッ カ ス ' ァ ウ レ ウ ス Staphyl ococcus a ureus) 菌などの細菌が、 肺胞腔を主な炎症 の場として発症することに端を発するものであり、 臨床的には、 通 常、 上気道炎症状に引き続き、 突然に悪寒戦慄をもって発症し、 40 °C前後の高熱が弛張し、 激しい咳嗽、 胸痛、 喀痰が出現する- また、 全身倦怠感、 食欲不振、 頭痛といった全身症状も強く、 呼 吸困難、 チアノ一ゼを呈し、 また、 合併症として菌血症、 髄膜炎、 関節炎を併発することもあり、 時に致死的経過をとる重篤かつ緊急 な感染症である。
このよ う に、 細菌性肺炎については、 特に、 的確な早期診断のも とに、 適切な早期治療を実施することが必要であることから、 迅速 な治療方法の改善が待望されている。
さ らに、 肺炎を含めた感染症に羅病すると、 生体組織内では第一 義的には好中球、 単球及びマク ロ フ ァージ系の食細胞がその防御機 能を果たし、 また、 優勢になった菌が食細胞組織から血液中に侵出 したことによ り、 血液中に菌が出現するものと考えられている。
一般には、 細胞の食菌力が菌の毒力に及ばず、 ス ト レプ ト コ ッカ ス . ニュ ーモニエ菌などの細菌が、 肺葉および気管支の組織に定着 して炎症を引き起こす現象が細菌性肺炎と定義されている。 そし て、 従来の細菌性肺炎の診断においては、 （1 ) 臨床症状、 （2 ) 検体 の培養、 （3 ) 検体に含まれる菌のグラム染色、 および（4) シ ョ ッ ク 伏態の確認が必須であ り、 これらの項目が確認されて初めて治療方 針が決定される。 典型例では、 前述の臨床症状、 胸部 X線所見、 および好中球増加、 C R P ( C - Reac t i ve P rot e i n： C反応性蛋白質） など急性相反応性物質の増加を認めるこ とによって推定はできるも のの、 確定診断のためには、 喀痰、 胸水あるいは血液などの検体か ら起炎菌を検索 · 確定した上で、 菌の種類に応じた適切な抗生物質 を使用し、 治療しなければならない： 従って、 臨床現場において は、 迅速かつ確実な原因菌の同定が望まれている。
また、 近年は、 レジオネラ肺炎、 カ リ ニ肺炎などの新しい型の肺 炎も確認されており、 さ らには、 M R S A (メ シチ リ ン耐性黄色ブ ドウ球菌） といった耐性株の出現もみられ、 起炎菌検索の重要性は さ らに増大してきている。
しかしながら、 実際には、 起炎菌の確定は困難を伴うのが通常で あ り、 特に、 市中肺炎の場合、 30〜50 %程度は起炎菌不明のま ま治 療が開始されている と言われている。 すなわち、 細菌性肺炎が疑 われた患者の起炎菌の検索方法としては、 喀痰、 上気道分泌物、 胸 水、 病巣局所、 あるいは血液からの採取試料を検体として使用し、 まず、 これを塗沫検査により炎症細胞などの観察により検査材料と しての適否を判断し、 次いでグラム染色を行って、 陽性 . 陰性の別. 球菌 · 桿菌の別を決定する。 そして、 選択培地を用いて菌を培養 することで、 起炎菌種の同定が行われるのが一般的な手順である： ところが、 この方法によると、 菌の培養に長時間を要する上に、 常在菌の混入が避けられず、 また、 細菌性肺炎を疑われた時点で、 大量に抗生物質を投与されている場合には、 たとえ検体中に菌が含 まれていても、 増菌 ' 増殖できない場合が多く、 実際には、 これら 検体からの菌の培養の成功率は極めて低いものとなっている。
さ らに、 サブルーチンとしての方法に、 菌体成分ゃ菌の代謝産物 の機器分析法 （辨野義己、 「ガスクロマ ト グラフィ一による細菌同 定の迅速化」 、 臨床検査、 29巻、 12号、 16 18 ~ 1623頁、 1 985年 1 1月、 医学書院参照） 、 特異抗体を利用した方法 （特開昭 60 - 224068号参 照） 、 さらには、 D N Aの特異性を利用したハイブリ ダィゼ一シ ョ ンによる方法 （特表昭 61— 502376号） 等があるが、 いずれも、 菌の 分離及び増菌培養が必須とされている c
—方、 感染症における食細胞の機能に着目したものと して、 血液 試料中の白血球成分が集中しているパフィ ーコ一 ト （B u f f y co a t ) の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。 一般にパフィーコ一 ト標 本で菌が検出される頻度は、 成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に 30 %程度にとどまるが、 新生児の場合、 10例中 7例 （70 % ) で菌を 検出している報告もあり、 塗抹標本の検鏡によ り末梢血中菌の有無 に関する情報は治療における大きな指針となっている：
上記従来技術においては、 その前処理操作として、 少なく とも検 体からの菌の選択的分離に 1〜 2 曰、 増菌に 1 日、 固定操作に 1 曰 以上、 合計で 3〜 4 曰は十分かかり、 現実にはこの培養を菌が発育 するまで続けることになるので、 前処理操作に一週間以上要する場 合が多く、 さらに、 菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌が混入して も区別できない場合もある。
そして重要なことは、 前述した事情から、 培養すべき検体中の多 く の菌は食細胞に取り込まれ、 抗生物質投与のため死んでいるか静 止状態にあるため、 培養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、 臨 床検体を用いた培養による実際の菌の検出率は 10 %前後と、 非常に 低い。 換言すれば、 臨床的に肺炎の可能性が疑われた患者の血液 をさらに一昼夜以上培養して検査しても結局、 その 90%は菌の存在 すら判明しないのが現状である。
このような状況から、 現在は起炎菌の確定と、 それに即した抗生 物質の選択が要求されているにもかかわらず、 臨床的に細菌性肺炎 の可能性が疑われた段階で、 検出結果が出るのを待たずに治療、 す なわち、 起炎菌不明のまま、 最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物 質を投与し、 1、 2 日間様子を見て、 効果が現れないと別の抗生物 質に切換えるという試行錯誤的な方法に頼っているのである- また、 検体中の菌を染色によ り検出する方法では、 生体成分も菌 と同様に染色されるため、 検鏡して認められる形態によってのみ迅 速に菌を判別するのは、 熟練が必要であり、 判定が困難な場合もあ る。
このよ う に、 迅速 · 確実な診断が求められる疾患であるにもかか わらず、 従来の診断方法では十分対応できていなかったのが実情で ある。
〔発明の開示〕
本発明は上記当該技術分野が抱えている課題に鑑みて完成された ものであり、 その要旨とするところは、 感染症原因菌、 特に、 細菌 性肺炎の代表的起炎菌であるス ト レブ ト コ ッカ ス · ニュ ー モニエ { S trep tococcus pneumon ia e) 菌が保有する D N Aまたは R N Aと 特異的な反応性を有するプローブ、 および、 当該プローブに含まれ るス ト レプ ト コ ッカ ス · ニ ュ ーモニエ菌が本質的に保有している遺 伝子部分の塩基配列を解明するこ とにある。
すなわち、 本発明のプローブにより、 例えば、 食細胞に取り込ま れて破壊されつつある菌においてなお維持されている菌の D N Aを, そ.の特異性に基づいて有為に検出でき、 これによ り、 菌を培養 . 増 殖せずに、 感染症疾患の原因菌が迅速かつ確実に検出できる。 ま た、 これらのプローブの塩基配列情報を参照してプライマ一をデザ イ ンすれば、 ハイブリ ダィゼー シ ヨ ンを行わなく とも、 P C R法に よる D N Aの増幅によ り、 感染症原因菌を同定することができる： また、 ハイブリ ダィゼー シ ヨ ンに用いるプローブを非放射性のも の、 例えば、 ピオチ ン化したプローブを用いれば、 放射性同位元素 使用施設のない一般検査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、 検出 作業が迅速、 簡便に行える。 〔図面の簡単な説明〕
第 1 図は、 ス ト レプ ト コ ッカ ス ' ニ ュ ーモニエ Streptococcus j/?ei/;j7o/j/ae)菌検出用プローブ SP-22、 SP-23、 および SP-25の制 限酵素地図であり ；
第 2図は、 ス ト レブ ト コ ッ カ ス ' ニ ュ ーモニエ Streptococcus pflei/iwoTn'ae)菌検出用プローブ SP-26、 SP5-15、 SP5-34、 および
SP6-6の制限酵素地図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下に、 感染症疾患、 特に、 肺炎起炎菌であるス ト レプ ト コ ッカ ス · ニュ ーモニエ Streptococcus pneumoniae 菌に由来するプロ —ブの実施例を示す。
実施例 1 ： ス ト レプ ト コ ッカ ス · ニ ュ ーモニエ Streptococcus pneumoniae} 菌由来 D N Aプロ一ブ (jj Streptococcus pneumon iae 由来 D NAプローブの調製
臨床菌株 Streptococcus pneumoniae を BHI (Brain Heart
Infusion)培地で一晩培養し、 培養菌体を集菌して、 N-Acetyl- muramidase SG 加えた上で、 Sai to-Miura法 ("Preparation of transforming deoxyribonucleicacid by phenol treatment" ,
Biochim. Biophys. Acta 72巻、 619〜 629頁（1963) )に従って、 ゲノ ミ ッ ク D N Aを抽出した。
抽出した D NAを、 制限酵素 Pstlで完全消化し、 ベク タ ー pGEM-
3Z にラ ンダム ク ロ ーニ ングし、 得られたク ロ ー ンから
Streptococcus pneumoniae 菌特有の、 すなわち、 天然の
Streptococcus pneumoniae 菌カゝ *保有する D N Aとの特異的反応性 を示した D NA断片を含む 7種のプローブを選抜した。
そして選抜された各プローブを、 プローブ SP-22 、 プローブ
SP-23 、 プローブ SP- 25 、 プローブ SP-26 、 プローブ SP- 5-15 、 プ ローブ SP-5- 34 、 およびプローブ SP-6-6と命名し、 その制限酵素地 図を第 1図ならびに第 2図に示した。
(2) Streptococcus pneumoniae^由来 D NAプロ一ブの種特異性の s、J
各プローブと各種感染症原因菌株の D NAとの反応性を、 以下の 方法によ り検討した。
まず、 検討対象菌株として、 下記表 1 に列挙した臨床単離株およ び寄託菌株を準備した = なお、 表 1 中の、 ヒ ト ' ゲノ ミ ッ ク D N Aおよび対照試料の入手源と して、 4名の健康な成人男子から採取 した白血球、 ならびにプラス ミ ド pGem-32を含んだ Escherichia coli K-12, JM109形質転換体をそれぞれ準備した。 表 1 細菌 Nn 細細 菌 HSI タ - rA to术
1丄 C /■ ) c wvcnH np-9
2
4 I Γ Π 00/
ej M ΓΙPしT 1fし 007/007/
しひ/ Λ iしし
7 L/ ry c / / c Πし 1し Οϋτ
8 i «J i WPTf 7171
9 StrpDtoroc u^ ΪΆΡΟΆ lis ΑΤΓΓ
10 StfGD tococcus isi t is ATCC 9811
11 t GQtocnccu^ !Borh i 11 nrum ATCC 27824
12 Ji DHI S8
13 t n t n nmi ^Άπειι is ΑΤΓΓ lOSRfi
]4 / Α ρ 7Π7
1 ひしひしし cU / Α\Τ丄ΓしΡし 3^0390 丄 0 / Wo 1しし 丄
17 Aiしし
Q
A J 60S 161 l μΠΘΙΙΙΠθΏ t 6
1 1 Q rb^UUUniUndb del uginO a Α1ΤΓΓ
丄しし )ΰι3
20 Enterococcus agglomerans 臨床分離株
21 Haemophil is influenzae 臨床分離株
22 Candida albicans IFM 40083- Α型
23 Aspergi 1 lus fumigatus MTU 06001
24 Cryptococcus neofor ans MTU 13001
25 Mucor spinosus TI M 1322
26 ヒト ·ゲノミック DMA
27 対照
凡例： NYSDH New York State Department of Health
(Al any, New York, U.S.A.)
NCTC National Col lection of Type Cul tures
(London, England)
DHI Dairen Hygienic Institute
IFM 千葉大学真核微生物研究セン夕ー
MTU 東京大学医学部
TIMM 帝京大学医真菌研究センター そして、 各臨床菌株を実施例 1 (1) に記載の方法に従って、 各菌 株が保有する DNAを抽出し、 この抽出した D NAの一定量 （例え ば、 5 1)をナイ ロ ン フ ィ ル タ にスポ ッ ト し、 アルカ リ変性したも のを ド ッ ト · ブロ ッ ト ' ハイ ブ リ ダィゼー シ ヨ ンの試料と した。
なお、 ヒ ト · ゲノ ミ ッ ク D N A試料は、 前出の Saito-Miura 法に. 先に入手した白血球を適用することで調製した。 一方、 対照試料 は、 後述する実施例 2 (1) に記載のプラス ミ ド D NAの調製方法に, 先に入手したプラス ミ ド pGem-32を含んだ Escherichia col i K-12, JM109 形質転換体を適用するこ とで調製した。 次いで、
Digoxigenin-ll-dUTP (BRL社製） でラ ベ しナこ Streptococcus pneumoniae ^^ D NAプローブを、 マニアテ イ スのマニュアル
( T. Maniatis.et al . , "Molecular Cloning (A Laboratory
Manual) '\ Cold Spring Harbour Laboratory ( 1982) )【こ従 ヽ、 45% ホルムア ミ ド、 5 X SSC、 42°Cの条件下で、 終夜ハイプリ ダイゼー シ ヨ ンを実施した。
終夜ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンを終えた試料を、 55°Cにて 0.1 X SSC、 0.1¾SDSによる 20分間の洗浄を 2回行った後に、 Anti-Dig- ALP conjugates(BRL社製） で検出 ' 発色させ、 ハイ ブリ ダィゼー シ ョ ンの状況を確認した。
各プローブと各臨床菌株の D N Aとの反応性に関する実験結果を、 以下の表 2 に示した。
表 2 細加苗 プローブ 〔記号 ： SP- 〕
No. 名 (出所 ·由来） 22 23 25 26 5- 15 5-34 6-6
1 Streptococcus pneumoniae (NYSDH DP-2) + + + + + + +
2 Streptococcus pneumoniae (臨床分離株） + + + + + + +
3 Streptococcus pneumoniae (臨床分離株） + + + + + + +
4 Streptococcus agalactiae ( IFM 58/59)
5 Streptococcus anginosus (NCTC 8787)
6 Streptococcus conste! la tus (ATCC 27823)
7 Streptococcus equisimi I is (NCTC 8543)
8 Streptococcus faecium (NCTC 7171)
9 Streptococcus faecal is (ATCC 19433)
10 Streptococcus mi t is (ATCC 9811)
11 Streptococcus morbi l loruw (ATCC 27824)
12 Streptococcus pyogenes (DHI S8)
13 Streptococcus sanguis (ATCC 10556)
14 Streptococcus sa l i varius (ATCC 7073)
15 Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
16 Staphylococcus epiderai is (ATCC 12228)
17 Escherichia col i (ATCC 25922)
18 Kiebsiel ia pneumoniae (臨床分離株）
19 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27583)
20 Enterococcus agglomerans (臨床分離株）
21 Hae卿 hi 1 is influenzae (臨床分離株）
22 Candida a lbicans ( I FM 40083- A型)
23 Aspergi l lus fumiga tus (MTU 06001)
24 Cryptococcus neofor ans (MTU 13001 )
25 Mucor spinosus (T1MM 1322)
26 ヒト ·ゲノミック DNA
27 対照 + + + + + + + 注： 表中において；
十の符号は、 ハイプリダイズのシグナルが検出されたことを、
一の符号は、 ハイブリダィズのシグナルが検出されなかったことを、 それぞれ示す c 上記表 2から明らかなよう に、 いずれのプローブも
Streptococcus pneumoniae^に由来する D N Aに対してのみ反応性 を示し、 1SίΓep ococci/s属以外の菌種由来のD N Aはもちろん、 Sirep ococciis属の他の菌種由来の D NAに対しても反応性 （ハイ ブ リ ツ ドの形成） が認められず、 その種特異性が確認された。
実施例 2 ： 塩基配列の解析
実施例 1 にて種特異性が確認された D N Aプローブ （計 7本） の 塩基配列を下記の方法に従って決定した。
(1) プラス ミ ド D N Aの調製
サブク ロー ンされた （塩基配列を決定すべき） 挿入断片を pGem -3Z (Promega こ含んだ Escherichia col i K-12, JM109形質転換体 を、 5 mlの Luria-Bactani Medium (バク ト 一 ト リ プ ト ン、 10g/lL ； ノくク ト 一イ ース トエキス ト ラ ク ト、 5g/lL; NaCK lOg/lL; 5 N NaOH で pH 7.0に調整） に植菌し、 一晩培養した。
培養液を遠心分離（5，000rpm、 5分） して集菌した。 沈瀬物に 2.5mg/mlの濩度で リ ゾチーム（Sigma) を含む 50mM グルコース/ 50mM Tris-HCl (pH8.0) /lOmM EDTA 溶液を 100 1 加え、 室温で 5 分間放置した。 得られた懸濁液に 1 %の濃度で ドデシル硫酸ナ ト リ ゥム（Sigma) を含む 0.2M水酸化ナ ト リ ゥム水溶液を加えて混合 した。 5 M酢酸カ リ ウム水溶液（PH4.8) 150 1 をさ らに加えて 混合し、 15分間氷冷した。
そして、 遠心分離 （ 15，000rpm、 15分）して得た上清を、 フ ヱ ノ ー ル /CHC13処理し、 上清に 2倍量のエタ ノ ールを加え、 さ らに遠心分 難（12,000rpm、 5分） して沈澱を得た。 この沈瀬物を、 10mM Tris-HCl (pH7.5)/0. lmM EDTA溶液 100〃 1 に溶解し、 lOmg/ml RNaseA ( Sigma)溶液を加え、 室温で 15分間放置した。
この調製物に 0.1M 酢酸ナ ト リ ゥム水溶液（PH4.8) を 300 1 加 え、 フヱノ ール/ CHC13処理し、 上清にエタ ノールを加えて沈瀕を得 た。 この沈澱物を乾燥し、 10 l の蒸留水に溶解したものを D N A試料とした。
(2) 塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理を AutoRead (登録商標） Sequencing Kit (Pharmasia)を用いて行った。
すなわち、 錶型となる D NAが 32tt l 溶液中に 5〜10/ig の濃度 になるように調整した。 1.5m 1の ミ ニチューブ （エ ツ ペ ン ドル フ） に、 錶型 DNA 32AI 1 を移し、 2 M水酸化ナ ト リ ウム水溶液を 8 1 加えて穏やかに混合した。 そして、 軽く遠心した後、 室温で 10 分間放置した。
3 M酢酸ナ ト リ ゥム （pH4.8) 7 u 1 と蒸留水 4 1 を加え、 さら にエタノールを 120 / l 加えて混合し、 ドライアイス上で 15分間放 置した。 そして、 15分間遠心分離して沈澱した D N Aを集め、 注 意しながら上清を除去した。 得られた沈瀕物を 70%エ タ ノ ールで 洗浄し、 10分間遠心分離した。 そして、 注意しながら再度上清を 除去し、 減圧条件下で沈淞物を乾燥した。
沈澱物を蒸留水 10 1 に溶解し、 螢光性のプライマー
L Fl uorescent Primer JI13 Universal Primer; 5' -Fluorescei n- d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3' (1.6pmol/ 1； 0.42 A260 unit/ ml)； M13 Reverse Primer, 5' -Fluoresce in-d[CAGGAAACAGCTATGAC] -3' (2. lpmol/^t 1； 0.42 A26。 un / ml) 〕 2 j 1 (0.42 A26。 un /ml , 4〜 6 pmol) とアニー リ ン グ用緩衝液 2 〃 1 を加え穏やかに 混合した。
そして、 軽く遠心した後、 65'Cで 5分間熱処理を行い、 素早く 37'C条件下に置き、 そこで 10分間保温した。 保温後 10分以上室温 で放置し、 軽く遠心した。
そして、 延長用緩衝液 とジメチルスルホキシ ド 3 1 を加え たものを試料とした。 4本のミ ニチューブに A、 C、 Gおよび Tと記入し、 それぞれの チューブに AMix (ddATPを dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶 解したもの） 、 C Mix (ddCTP を dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと 共に溶解したもの） 、 G Mix (ddGTP を dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解したもの） および T Mix(ddTTPを dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解したもの） を 2.5AI 1 ずつ分注した： なお、 それぞれの溶液は使用時までは氷中で保存し、 使用時には 37'Cで 1分間以上保温してから使用した。
希釈した T7DNA ポ リ メラ一ゼ （Pharmacia; 6〜 8 un i ts/ 2 1 ) 2 1 を D NA試料に加え、 ピペ ッティ ングもレ く は穏やかな混合 によ り、 完全に混合した。 混合後すぐに、 この混合液を 4.5 1 ずつ保温しておいた 4種の溶液に分注した。 なお、 分注に際して は新しいチップを用いた。
37°Cで 5分間保温し、 停止溶液を 5 /i l ずつそれぞれの反応液に 加えた。 この分注においても、 新しいチップを用いた。 90'Cで 2〜 3分間保温し、 すぐに氷中で冷却した。 電気泳動には 1 レー ンあたり 4〜 6 1 を泳動した c
(3) 塩基配列の決定
実施例 1 および 2に開示した、 Streptococcus pneumon i aeWtが 有する D NAに対して特異性を有するプローブそれぞれの塩基配列 の决定を、 泳動温度 45°C、 泳動時間 6時間として、 A.L.F.DNA Sequencer システム（Pharmacia) を用いて行った。
その結果、 プローブ SP-22(配列番号 1 ) 、 プローブ SP-23(配列番 号 2) 、 ブローブ SP- 25(配列番号 3 ) 、 プローブ SP-26(配列番号 4 )、 プローブ SP-5-15(配列番号 5 ) 、 プローブ SP- 5-34(配列番号 6 ) 、 およびプローブ SP-6-6 (配列番号 7 ) それぞれの塩基配列の全容が 明らかとなつた- 〔産業上の利用可能性〕
本発明のプローブを用いれば、 例えば、 食細胞に取り込まれた感 染症原因菌を増殖することなく直接検出し、 かつ菌を迅速にしかも 正確に同定できる。 すなわち、 本発明のプローブを用いた診断で は、 1回分の検体で菌の同定まで行え、 診断に要する時間も従来法 の 3 ~ 4日 （検出される率は低い） から、 約 1〜2 日と飛躍的に短 縮でき、 しかもその検出率は格段と高い。 それ故、 細菌性肺炎の 治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、 感染症患者に早 期の内に有効な治療が実施でき、 ひいては死亡率の低減も期待され る。
また、 感染症疾患起炎菌の中でも、 特に、 肺炎の発症に深く 関連 3 る、 S trep tococcus Ρ εί/Λ/θ aell力、'保有する D N Aに特異的に反 応するプローブの塩基配列を明らかにしたことによ り、 これらプロ —ブを人工的に調製することを可能とした さ らに、 解析した塩 基配列の情報の一部を利用して作製したプライマ ーを用いて、 臨床 検体に含まれる感染症原因菌の D N Aを、 P C R法によ って増幅し て、 原因菌の迅速な診断に役立てることができる。
さ らに、 臨床検体に含まれるゲノ ミ ッ ク D N Aの塩基配列と本発 明によって解析された塩基配列とを比較参照するこ とによ り、 肺炎 起炎菌種の迅速な同定が行える。
上記したように、 本発明は、 所期の目的であった感染症診断用プ ローブを提供するのみならず、 P C R用プライマ ー作製の指針とし て、 また臨床検体に含まれるゲノ ミ ッ ク D N Aとの比較参照用に適 した標準配列として優れた有用性が期待され、 さらには感染症疾患 起炎菌 （肺炎起炎菌） が保有する D N Aに特異的に反応するプロ一 ブの今後の探究 · 開発における貴重な手がかりをもたらすなどの優 れた効果を奏するものである。
また、 本願出願にて開示した塩基配列は、 臨床分離株のゲノ ミ ツ ク D N Aをランダムにクローニングして得られたものであり、 それ 故、 本発明の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである さらに、 野性株が保有する D N Aに変異部分が存在することは当 然考えられるが、 上記実施例の開示から明らかなように、 当該 D N A変異部分が、 感染症診断のためのハイブリ ダィゼーシ ヨ ンへ利用 する際の本発明プローブの特異性、 あるいは本願出願にて開示した 塩基配列情報を感染症の迅速診断を目的とした P C R法のプライマ 一をデザイ ンするために利用できる等の、 本発明が奏する有用性に は何ら影 Sを与えるものではない。
配 列 表 配列番号： 1
配列の長さ ： 368
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖伏
配列の種類： Genomi c DNA
起源
： ストレフ'トコッカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分離株 SP-22
E列
CTGCAGCTTT CAAGGAACCT GTCAAGAGAG CCAGTTTCAA ATTGGGAAAA AGGTTCTGTA 60 AACTCTCAAA GTGTTGCTCT GCGAGGATTT CTGTTGGTAC CATTAGGGCA GCCTGATAAC 120 CTGCTGTCAC TGCCGCAAAC ATGGCCAAGC CAGCGACTAC CGTTTTTTCC ACTCCCCACA 180 TCCCCTTGTA GGAGACGATT CATGTGGTGG TCGGACTTCA TATCAGTTAA AATTTCCTGC 240 AAACTCTTTT CCTGAGCTTG GGTCAGGGCA AAAGGAAGAC TTACTTTAAC TGCTGTCACT 300 TTTTCCTGAG ACCAATTCAG AACCAGACCA CTTCCCTGAA CTCTATTTTC AGACTTGAGC 360 ATCTGCAG 368 配列番号： 2
配列の長さ ： 1978
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
E源
生物名：ストレフ'トコッカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分離株 SP-23 配列
CTGCAGGTTC CCCTGTATTT GCTGGTTTCA TTACTGGTTT AATCATGGGA GATGTGACTA 60 CTGGTTTACT TATCGGTGGT AACTTGCAAC TGTTCGTTCT TGGGGTTGGT ACCTTCGGTG 120 GTGCTTCTCG TATCGACGCA ACTTCTGGTG CGGTTCTTGC GACAGCCTTC TCTGTTTCAC 180
AAGGAATTGA TGCACCGCTT GCCATTACTA CAATCGCTGT ACCAGTAGCA GCTCTCTTGA 240
CTTACTTCGA CGTTCTTGGT CGTATGACTA CTACCTTCTT？ GCTCACCGT GTGGATGCTG 300
CAATCGAACG CTTTGACTAT AAGGTATTGA ACGCAACTAC TTGCTTGGTG CGATTCGTGG 360
GCTCTATCTC GTGCCCTTCC AGTCTTCTTT GCCCTTGCTT TTGGTGGTGC CTTTGTACAA 420
TCAGTAGTAG ACTTCGTTGA AGCCTACAAA TGGGTTGCAT ATGGCTTGAC ACTTGCAGGA 480
CGTATGCTTC CAGGTCTTGG ATTTGCAATC TTGCTTCGTT ACCTTCCAGT' TAAACGTAAC 540
CTTCACTACC TTGCTATGGG ATTTGGTTTG ACAGCTATGT TGACTGTTCT TTACTCATAT 600
GTAACAGGTC TTGGTGGCGC TGTTGCTGGT ATCGTAGGTA CTCTTCCTGC TGAAGTTGCT 660
GAAAAAATTG GTTTCGTGAA CAACTTCAAA GGTTTGTCTA TGATTGGTAT TTCTATCGTA 720
GGTATTTTCC TTGCAGTGCT TCACTTCAAA AATAGCCAAA AAGTAGCTGT AGCAGCACCT 780
TCTACACCAT CAGAAAGTGG GGAAATCGAA GATGACGAAT TCTAATTACA AACTTACAAA 840
AGAAGATTTT AATCAAATCA ACAAACGTAG CTTGTTTACT TTCCAATTAG GTTGGAACTA 900
CGAACGTATG CAAGCTTCTG GTTACCTTTA CATGATCTTG CCTCAGTTGC GTAAAATGTA 960
TGGTGATGGA ACTCCTGAAT TGAAAGAAAT GATGAAAGTT CATACTCAAT TCTTCAATAC 1020
TTCACCATTC TTCCATACCA TTATCGCTGG TTTTGACCTT GCCATGGAAG AAAAAGATGG 1080
TGTAGGTTCA AAAGACGCCG TTAACGGTAT CAAGACAGGT TTGATGGGAC CATTCGCTCC 1140
TCTTGGGGAT ACAATCTTTG CTTCACTTGT ACCTGCTATC ATGGGGTCAG TCGCAGCAAC 1200
TATGGCTATC GCTGGCCAAC CTTGGGGGAT CTTCCTTTGG ATTGCAGTTG CAGTAGCGTA 1260
TGACATCTTC CGTTGGAAAC AGTTGGAATT TGCTTACAAA GAAGGGGTTA ACCTTATCAA 1320
CAACATGCAA AGTACCTTGA CAGCTTTGAT TGACGCTGCA TCTGTACTTG GTGTCTTCAT 1380
GATGGGTGCT CTTGTAGCAA CAGTGATTAA CTTTGAAATT TCTTACAAGT TGCCAATCGG 1440
TGAAAAGATG ATTGATTTCC AAGACATCTT GAATCAAATC TTCCCACGTT TGCTTCCAGC 1500
AATCTTTACT GCCTTTATCT TCTGGTTGCT TGGTAAGAAA GGTATGAACT CTACTAAAGC 1560
TATCGGTATT ATTATCGTAC TTGCTTTGGC TCTTTCTGCC CTTGGTCACT TTGCACTTGG 1620
AATGTAATTC CTTATGACTA AATCATTAAT TTTGTGAGCC ATGGTCGCTT CTGTGAGGAG 1680 CTTAGAGGTA GCACAGAAAT GATTATGGGC CCACAAGACA ACATTTACAC AGTAGCTCTT 1740
CTTCCAGAAG ATGGCCCAGA AGAATTTACT GCTAAATTTG AAGCTGTTAT TGGAGGATTG 1800
GATGATTTCC TAGTCTTTGC GGATCTTCTC GGTGGGACAC CTTGTAATGT GGTGAGTCGC 1860
TTGATCATGG AAGGTCGTGA TATTGACCTT TACGCAGGGA TGAATCTTCC AATGGTGATT 1920
GAATTTATCA ATGCGAGCCT TACAGGCGCA GATGCGGACT ACAAGAGCCG TGCTGCAG 1978 配列番号： 3
配列の長さ ： 1124
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖伏
配列の種類： Genomi c DNA
起源
生物: ¾：ストレフ'トコッカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分離株 SP-25
配列
CTGCAGGTTT TGTCCTCAAC CTCCCAATCA AAGAAAATAT GAGAAATCTG CGAGTTAAGA 60 TTGAGAAAAA GACGGGCCTA CTATGGAATA GATGGCAAAC AATCTATGAA AACAGACCAA 120 TTTTAGCTCA ACCCCACCGT AAAATTACCC ATTGGGGTAC GACATTGAAT TCCAAGGTGA 180 GTGACGATGA TGTCTTGTAA TCTGATGGTA GAATGACAGT TAGTTTGTCT AGTTTATAAG 240 AAAGTACTAC CTGAGCTTGA ATAGAACTCA GGTAGCTCTC TATGAAAGAA CAAAATTAAT 300 ACTCAATGAA AATCAAAGAG CAAACTAGGA AACTAGCCGC AGTTTGCTCA AAGCACTGCT 360 TTGAGGTTGT AGATAAGACT GACGAAGTCG TCACCATATA TAATCCAAGG CGACGTTGAC 420 GTGGATTGAA GAGATTTTAG AAGAGTATAA ACAGAAAGGT AGAGCGCGTG TTCTAATTTG 480 AACACGAGTA GAAAACTTTT CTAAAAGCAA AAACGAAAGG ATGGGTAAAC TGTATTCGCT 540 GAACTGAATA CGGGCGACTC TCCTCTAAAT CAAAATTAAG AAAGGAATTG ACCCCACCCT 600 AAAAGTAGTG GGAAAAAGAT AGTTGGTCTA GCGAGCATCG CTCACTGCGC CCAACTCCTA 660 TTTTCCCTTC GCTTTTTGAT GGGTTTGGTA TCTTTCTCAA TATAAAATAT AAATAAGAAG 720 ATAGAGCGTG TGTTTTGATT TGAACACGAG CGGAAAACTC GGAAAATAGA TAATCTGACT 780
Figure imgf000020_0001
μい,
CO 03 o oo
Figure imgf000020_0002
CZ3 O CD
9459 ：
CGTAGACTATGTA AAATC GGAAGTTGTCGTGG TTGGGAAC GCAG
ATCTGCAAATA TGA 【TTAATTTG GGCGGGGGATGCTATGC ACTATTCG ATTTT
TTGTTTAATGTTAC GAAC3TGCGT ACAT¾TTT ¾CACGTGG TACAT AACAAGGCTGGCTT
TCTTCTCCGGG GATCCTCT GTGCAA¾ ATGAT2OTTTTATTACCTTGG TGCGGG AATTT
ATCATAAATT AGTCTATC ATAGC ATAAAATCTTCTTTGCCATTGCTGT TGCAGGG GAAAT
GAAAATTACAGTTTCTC CAGTCGTTGT GAGGTCTATTTCCTTCT CCCTT ATCAC3T GTTTT OAVXdis6dr/D€ 13VISV131 V11V3D313
LL313VV
VVV11130
1 VV3VV3VV3
31V19311D
DD VDVD91VV V11 VVVVV3V
1V9111 VS3
3JI {SV31V1
Figure imgf000021_0001
U11 OV33V
33ili lvvvv
Figure imgf000021_0002
V1D151VV3
1V03 VVVVVV
JJ1iV J0Vl3 3131：VV3V
loil ivfsvl
vjJIEJ vO
3V31V 0VVV1 9SZ96、I
o o o CD o ◦ Z5 o o
CN3 ∞ o oo o O CM O
O oo o
CM CO CD O oo
1IE31113V33LL133V1 VDViiVIVV11110 0VVVV313VVV 1VV39V 31 CO CO CO CO CO CO CO CO CO CQ CO O
3113 V31V131131¾VV3111VV13D31V113133VVV1VV33V1 V01V VVV 082 V5 f— ：
31 Jiulv S11V13 ：V1VVV11vvsvJVVVV133J 315vovo 3VV 1V3VD1 0021,
09
EJ, V331i313150V：1 3V1V0VV3v3 V33VV9VVVV
Figure imgf000022_0001
01U913VDV01 V3Di3V1V VOlDliVDO1V1 3 30 VVD 0V33 DILSVVVV
1 JSVi VV133SV033ELlviV130 3E 1VVV3GOVvvV3 V33V 33VV1οοεVV ο
lE v 10131V1 11一 13V13V1001131131V 33V31VV11一 In 1V0VVVV ，
1U1V E3V1V331V3V3311311VE 1311131loV1V31VVVDVV Ivsvv V3V
：
3 V11313 V3V1111311UJ,3133V 30V1VVVVVVV33V3V VVEV311VV31V1 101V
E— 1slo IIVEVSO VVJSV3VVV V3V91V1VV li:〕fvV 09εε
J)
GliJJ1sjvv VVVVVVsV
51 331V13DVJJ3331丄丄丄 V 0VLI3VV 1VVV V133IVVVV ，
l 51Eし E J J3vlvvvll1VD1」J_Jl111vl09EV1 11VV VVV v3v SV
E 111 3V0V313DV13 V1V303V 1XVVVVV
Figure imgf000022_0002
11 11313VV31V3V VV91V911191330V1130
3〕 013
31v ν11113〕33391〕l 0E iDVvvV3VV1VS191 08ε V3V2- l誠v ，
0L333VS1L 0VJ0311 DfJvu 3ViGull jvsolvv LGSDVll
313VV01391VV39V； 33 lfVV13311301 U9V 0V
DJE VV1V 131111V011sols vovv1V193 V0VVV D13391JL10DVVVV3 vssfv 3 JVvl39313913VVV1131Vl103iVVV3i3 313V11一 VVVV 1310 SVV3VV 331Sv:sli331VVVV0：3VV 3{fv 33v 3VVV SV311ju3010331DiiVOV010D Vlvja V1 IVD
I1IJJ3JVVLVV3 VJJJ EVJV3 VVVDV
iJJJVVV3VV3 VJJi933V1DV,L13,V 3DVDVJ VVVV 3V UMV13Sol131DilVVllVV VV3V3333VV1V slll D0VV3V IVVDVV OV3VVv 9130V VVV11D135V313 VVV3VVV3VV3313VVVVVVV i
8 06
oiv DSVDvlvJVOO V31VE13L5V3VVvOV隱 0
Figure imgf000023_0001
1 I0V1V3Dl 1ESlvgv 3VVVoVVVVV3V ：vvv V f
1 D3 31333V3V31V331：v VVVV33333311vvgv V
E11111V 33330iJ-V1 VDV：V33VDVV 1V3I1 giv:s 0VVVV90VV3vo
139i31 mm3vv3V33DV 13VV30i3 0V9VV
1U33V3V 33 b3 Ig301vv33 VOV讀 vv10V33DJJVVVV is V1V3V
Figure imgf000023_0002
DOVV OVVOVlDllJ 0§VJJDd 3313V3JXVV31V9V1V09V3 3VVV1VVV1333V11V01 VVV3V13 VV0 111V339VVVV VVVV0V騰V 013153VVV301313V EJVV13VVV0
隱
1VV 3V0DVV 3VVU3V3V33V3O VVV3V3 VVVMIVOV1111ν 0VVVVVVV3039ν iiOlV0VV91VOVVVlV VV0V VVDi31V VVV3V31D313V DV3VV3V 3 TTTCTGCAG 5949 配列番号： 5
配列の長さ ： 3568
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
源
生 ¾名： ストレ 7·トコッカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分難株 SP-5- 15
配列
CTGCAGGATA TTTCTGCCTT GTATTGCCAG TGGTTTAGCG CCACAGCCAC ATATCTTTTA 60 CGGTTTTTTA CCGAGAAAAT CAGGTCAGCA GAAGCAATTT TTTTGGCTTG AAAAAAGATT 120 ATCCTGAAAC ACAGATTTTT TATGAATCAC CTCATCGTGT AGCAGACACG TTGGAAAATA 180 TGTTAGAAGT CTACGGTGAC CGCTCCGTTG TCTCTGGTCA GGGAATTGAC CAAAATCTAT 240 GAAGAATACC AACGAGGTAC TATCTCTGAG TTATTAGAAA GCATTGCTGA AACGCCACTC 300 AAGGGCGAAT GTCTTCTCAT TGTTGAGGGT GCCAGTCAGG GTGTGGAGGA AAAGGACGAG 360 GAAGACTTGT TCGTAGAAAT TCAAACCCGC ATCCAGCAAG GTGTGAAGAA AAACCAAGCT 420 ATCAAGGGAA GTCGCTAAGA TTTACCAGTG GAATAAAAGT CAGCTCTACG CTGCCTACCA 480 CGACTGGGGA GAAAAACAAT AAAGGGAGAC AGGATGTAAT AATTCTGTCT GTTTCTGTTT 540 AACTTAATTA GTGATGATAA TATAAAGATG TATCACTTGG TATAGAAGCT TTGGTATTAA 600 GTTTTTTATT AAGCCCATAC GGAATACCGA TGGTTGGAGC AGCAGTTATA GCGTTCTTAG 660 AAGGTATAAA TAGAAAAATA AGGTCATTTT AAATCAAAGG ATTGATAAAT CAGAAAGAAG 720 GTGATTTTTT GCGAACATAC GAAAATAAAG AAGAACTAAA AGCTGAGATA GAGAAAACAT 780 TTGAGAAATA TATTTTAGAA TTTGATAATA TTCCAGAAAA TTTAAAAGAT AAGAGAGCTG 840 ATGAAGTTGA CAGAACTCCA GCAGAAAACC TTGCTTATCA GGTTGGTTGG ACCAACTTGG 900 TTCTTAAATG GGAAGAAGAT GAAAGAAAGG GGCTTCAAGT AAAAACACCA TCGGATAAAT 960 TTAAATGGAA TCAACTTGGT GAATTATATC AGTGGTTCAC AGATACCTAC GCTCATTTAT 1020
- - .i一 /96 OAV 9§ V31DVDILD9V31313iDISD 1311V13 VV11VlvlvvVVV9 fvV.VVVV Dvv 0801
3313V0111V95i¾uV0VVJV133MSIVD 130OVVV 3V313033vvf VVV 0
30V3UJgolJ3VV11V 103V1VV IflVV1V-0 vvVV JE3Vlv謹
0lJVE3i llljiviovov voavvvIVVVVVvvJEllvlvwvvvvvv D2 VV 091
1V3E VVVE3 E31V 13VV0VV 3V1330V33V11JS VVVVVVVJJ1DVVVV V
Figure imgf000025_0001
iJ, VDj-iojv G誠 3v 0
U031V113E3E3 11VJIV30VO3V09V3VV VV 3V3V0 I
ov¾1MV1VVDVV eilvulv iJlEvlo VDVDVD9 VV3VDVV 13V IluvivV 0SD9I
i¾ 13V11VVVJV19U Vvvvv3V33VV；3VVVJJ VSVV 3VVV
191vau〕 V0V3vvvv V9113ν13031DVV0 vv:5V一V 089 31
U13VEV 1DD1VE3 SVJiJ VVVV0VVVV931VVV
113ivll 3VES13VV vvvvsvaivo vvijvo31 VVVVVV9V：VvvvvvvV081 v 0 lolvvv
Figure imgf000025_0002
3313 EDDlvl9!3il3V13V01V VV1VVV3VVD VVV
1 313il3113VV V013V9V13VV0V
Dil3E1EV3VV VVllO V1V1 V 1 0 JJV3v 。
ii il301 53vV3V30V 313V33VV IVDlisDV
11 SD1目：。 33V
:1 V∑0SVV3111331311V3Vf3VV3VV
V193E31VVVV V3192 301V333VV3： 5V11DVV 089
3V0V1V3 9VVi o
LL93V13 LDVVIGI 11DVV0 OE 0VVV ilgvv VV3VV33V VJ05vv33EX3V3139 vVVV113V1E1 03 VVV TCGTGCATCA GTTAGTTGTT TACTTGCTTC ATCATTCATA GAACTACTAT ACCATATTTT 2820
GTTTCGCAGG AAGTCTATTG GAAAGTAAGA AATATTGAAG CTGAGGCTAT TAGAAGAAAT 2880
TGTGAGCGTG GTGCTATTTT TTCAGGTAAA ATAAAATATC ACGAAGATTC ACAGTTTAAA 2940
GGAGATCACT ATGTTGAATG TTATGCTGTT TTAGATAATA CGGTTATAGC AAGAGATAGA 3000
ATAACAGTCC CTATCGATCC GTTATGTGGA AAAGATTTTA TAGAGTAGCA TATAATTGAT 3060
TCTTAACTGG AATACTCACT ATCTCTTTAC ATCAAGAAAA TGACTAAACA GGGAAGTTTG 3120
CCTTCTTCCC TTTTTTTGTT ATACTAGTAG AAGAAAAAAT AGAAAGATTT GTGGGAGTGA 3180
AAAGTCCTGT GGACTTTTTC AGCCTGAGCC AAGAAACTCG AAAGCTCGTA AGTCTGATTG 3240
GCTTTTTCAA TGTGAATCTT AACTTCATAC TCCCAAAGAG GTATTAGTGT CGTGTCTCAA 3300
TCTTATATCA ATGTTATCGG TGCTGGTTTG GCAGGTTCTG AAGCAGCCTA CCCAAAATCG 3360
CAGAGCGTGG GTATTCCAGT TAAACTTTAT GAAATGCGTG GTGTCAAGTC AACACCTCAG 3420
CACAAAACAG ACAATTTTGC TGAGTTGGTT TGTTCCAATT CCTTGCGTGG AGATGATTTG 3480
ACAAATGCTG TTGGCCTCCT TAAGGAAGAA ATGCGTCGCT TGGGTTCTGT GATTTTGGAA 3540
TCTGCTGAGG CTACACGTGT TCCTGCAG 3568 配列番号： 6
配列の長さ ： 4528
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomi c DNA 生物名：ストレフ ·トコッカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分薩株 SP- 5-34
配列
CTGCAGATTG GTATTTATCG CCACCATCTC CGTAAGTCTT AGTACCTGTA AGGACAATTT 60 TCTTAGCCTT AATTGTCTTA CCAAAATCAA TGTCTTTTGG CTTATTGTTA TCTGGCCAAT 120 CAGTTGCAGT AAAGGTATGC TCCTTGCCAG ACTCATCTGT CACAACAAGT TTCACATCAC 180 GCAAGTTACC ATTTGAACCT GATCCACGTG GAACATAACG AAGTCCAGTG ATTTCAGTTG 240 ATATAA AATTTCT TCGGGTAC CATTTGCAT CCATCCGTTAAAAGTGAACC AGGAGCG T
GCTTGAAGGCCAAG CG GTTTT GTGCACGG CTGGCCCTA GATCTTTCTAAGTAGTC ATC CTCC TCTT CTTA GG TCAGA ； TTATTGCTGTCT TTGCCAA
TTTGTGCTA CGTAGG ATTA AGGATCTAGGG TAATTTTACTAATAGTCC ATCTTTC GTT CTTTCA AGAT¾GA GCCCTC CAA CGTGACTTTAGATTGGTGTTCGAA CGT TT
ATGAAAAGAAGCTC GCCTGTC TAA T G CACGGTATACTGGTCACC ACTTA CTG- TCTAATACATTTGTTC TGG AGCAATC¾ TGCCTTCTT C TTCCTT AATTGA ATGCCGGC
-3
GAACATA CTTGTTTTA CAAC AACGGT GGTTCAGCAGTTAA CTTTTTTTT CTGAGTT- AT ATTTACA TTTCACCGGTG AGCCGC TGATT ACACCGAATTTCTGCACT ACGGTCT GCTTTACATGGATAG TAG TTGAGGCGA GAGACT ¾CACTTT GCGTATTTATAAGTACT GG
GTTGAAG CAGAGGTAGTGTACATT TGTAA CTGTATCGTACTTAGTTTACG CTTT CTC AGT
C2 TATAAAGAGAG ACTCAATGC AAGAACATT iTC CAGTT GAGAGCTTCCTGTGTCC C一
TCATACGGATGTTAA GA GCTCACATCT TATT TCAAGGTC, CAC CGTT
-9
A ATA TGCTTGTCTCACAC ATTTTCAAG T CTGAGGTGCC ACCTGTAC CCTGGACTTTT AAGAG CAACCAT GGGATCGGAT GCGGTTTCT T CACTTGCAC CACTACAA ACAATGCCC TGTTTTAGAATTCT CACTGTTATGATCG TTC TAACTCATC GCTTAGGT AG
5*
TGCAA TTTCCTCGAA 2AGACCAT CATTTTCTATGACGAAACCA7CGG CTCT GG GT O CO CX) OO Ol CJ1 CO ro AAAC GGTGTTT LAGTTTTG ¾CTTACC CTTCAATAAGGTA ATTCAAGG TCCG
oo t cr> O CO OO - O to CD 05 σ>
OO C z5 en ^ CO CO
Q O O D O t n ^ oo t 03 o ^ oo t σ¾ o ο ο οCGTTGA AAGATTGAA CTCCTATTCCT CACTACCTGCTACTGGA TCCTA CG 「 ο ο σ ο ο ο ο ο ο CAAAGA CCAGCGCCAA¾TGCA TATGCATTT CCATTGTGTTGAGTTTC ATTGATCC TC CG
ATCTTGAATTCTGTGGAAGTTGCT T AAGTATCCCC TGTTCA CCGTCACA GGTGC CTTCTG T ATACC.AATATGCATTGA¾AGATTCCACCAATCCC CGAGTTC TTCC AGTT CTA i
AAPAAAACA CGGAATCGATT AATATCCA TCTGGCTTATAC GGGTTTTGAGTT G ACCTGTTAAGATACTC TTCGCATGCAA TGTCTCA GCTTC TGTCAA TATGAC CGTGGATTT TGAG GGATGAAAACTTA AAGCATCGTTTTTT CCTGCTGAG GTTAGCC GCTCTCCAT AACC ATCAGACGCTCGTA TCTCGCAGCTC ATCTTGGC ATCTCTGCC GTTC CACACTA TAGTAAT GACAGCAC AAACTTTTTAAGT TCAAATC TCTCTACCA ACGTTTTTCTGAC CGACGGAG CT AGCAAATTAAGCATGCAAGTACC TGGGG ATAACAGA TAAGTTCC TCAGT TACC TCTTGGA ACTGACTTACATCCA GATGTGCC CTTCTTTCAA GACAGTT GCGGTGC CTCC TCCGCCTTC CATCTTGGAT GACACGTCCG TTGAGAGTTA CTGTACGTTC GCGATATTGT GGACTATTGA 2040
CATCATTTGA CTTACGAGTT ACAACTACTT TATTATTGTC AGCATCTACC AATTCCACTC 2100
GCATTTCTGG AGTCCATTTA TAGGTGCTAC CGTTATCGGT CATAGTCCAC CGGTGTACCA 2160
TTTTCCCATT TACTTACAGT GAAGTGTTGG AAGTACTTGG TCATGACGTC ATGGGCAAAT 2220
AAGTTAGTTA CATAGCCATT GTAGTCACTT CTTCCTTGCC AGCCTTCAAA GTCTTTCATG 2280
CTGTAGCCAC CTAGCAGTGG ATAGTTGGCT GCACCACCAT AACTTCTGTA GTCCCCTACC 2340
CAAGCATCTT TTTGGTGGTT ACGTATAAAG CGGGTGATGG CACTGTTGAT ACCTTTATTG 2400
GTGTAGCCAC CGTAGGTCAA GTCAGCTGCC CAGTGATGGA AGGTAGAGTC GTACTCACCA 2460
CCATGGCCCC ACTCGATCGC AAAGCGCCAG CCTTGTTTGT TAATTTCTTT AGCAAGAACG 2520
TGGGTAGCCC AGGCACCGTT ATCACCTGAT TGACCATTAC CCCAAACGTC CACATAGATA 2580
AAGTCGAGAC CGTCACCAAG TTTTTTCTTC AAATCTTCCC AACGTGCCAA ACGACCATGA 2640
GCTAGGTCAT AGGCAGCATC AATGTTGATA CCTTGATCTA GCCAGTTCCA ACCATAGCTA 2700
TAGCTTCCAT CTGGATTCTT ACGGAGAATT TTTTCATTGA AGTATTTAGA CTCAGGATAA 2760
GTTTCTGAAG CGTTAACGTG GATACCTAGA TGAGCTCCAT ATTTCTTAGC CTTCTCAATT 2820
AGGGTCTTGA AGTCTTCGAC ACCACCGATA CGCTTACCAA TATCAGCATA GTTCAAGTGA 2880
CCAGAGTCAT GGCCTTCGCT ACCATATCCT TTAAGGAGAA CACCTTGCCC AAGACCATCT 2940
GTGTGGAGAT TGATTTTCTT GATACCATCC AAGGTCATAA GGAATGGGTT TTGTGCTTGA 3000
GAACCAAAGT TCATCGCGAT ACGGTAAGCT GTGATATCCT TAACTTTTTT CCAACCTTGA 3060
GGATTGTTCA TAATGCTACG ATAAGCAATG GCACCATCCT GCCAATCGAC TTTCTTGTCT 3120
GCATTGGCAT CTTCAGTGAT AACAACCTTA GCACTTGGAA GTTCCTTCGT GTATTCTGGG 3180
AAAACAATGC CCTTATAAGC TTTTTCCCAT TGCCATTCAG AGCTGTGGAT TCCTACATAG 3240
TTGGCATTTC CGACTGTTTC TTTATAGGCT GTCAAACGAG TCCAGTCATT CGAACCACCA 3300
CCATAGCTGT TTTGAGAGTT ACTCCAAACA CCAGCAGCAA GCTTATCTGT AGAAACAAAT 3360
CCATACATGT AACCCTTGGC TAGATCTTTC ATTGGATTGG TTACATCGAT ATGATCATCT 3420
CCGCTGACAT GCGTATTGTT TGACATGGTT GCCCCATCAA ACTTAGCACC AGTTTGATCA 3480
CTAGAAACAG AGACTAAAGC ATTGCCGAGG AAACTAATAG AAGAAAGTAG TTTTCTTTCG 3540
TCATCAATCT TTTGACCTGG AGTGACTTGA TTGTGGTTGA CAATCTTGGT CACATCAAAG 3600
TGCAATTGAT TGTCCACAAC TTGCAAGCGT ACTGTCATTT CCGCATTGAT TAAGTGAGCA 3660
TCATCGCGAA GCTTCATCAA GTACTCTGCT GTTGTCTCAT TGATTTTCTT ATAAGTGACT 3720 TCAGGGGTGA TTCGGTGGTT ATTGATAAAG ACTTGGTTGA ACTGTTGAAC CTGTCCTGGC 3780
AAAGTATGTC CATTCAAGCT GTATTCCTTG ACACGAGGGA AGGCTTGGTC AATCACTGCT 3840
TTGAGAACCT TAGACTGAAT CGTGTCATAA GTCACCTTGC TATCATCAAC TTCAGGACCT 3900
GTTTCTTTTT CAGCAGGGGT ATCCTCTGTT TTTACCCCCT CTTGGTTATC CGTTTTAACG 3960
CTAACAACTG TTCGCTCATC GTCATAAGAG CCCGCCTTGA GAAGAATCTT CTTCTCATTT 4020
TTAAGATGGT CATTGACCGC AGCTGGTAGA GTCACTGTGT CAAAGAGATT GACATCGTTA 4080
TTGCTGGCAT TTAGCTGACC GTCTGACTTG AGAGTGATAG AGAGACGGTT TGTGATCTGT 4140
TTCAGAGCAG CAACACGACT ACCTCTATAC CAAGTGCTAG TTGTTGGAGA TTTATACTCC 4200
CAGAACCAGC CATCCTTGTC ATAACCGACA AAAACATTAT TCTTGGTATC TTTAAATTTC 4260
AAGAAGACAC CAAAGCGTGA TTTGCCCTTT TCAGAATCAT CTTTGAAGGT TAAATCAACA 4320
GTTGCATTTC CATTGGCATC AACGGTCAAG CCCTTCTTTT CAAACAGGGC TGGTTTACCT 4380
GCGTTATCAT TTTGAGCAGT TGAGGATAAT TGGTTGTAGC GGACACCTTT TTCTTCTCGG 4440
ATAGTGACTG TTCCCTGTTG TTCTTTTTTC TCTACCGTTT GCCATTCAGG GGTTACCGTC 4500
TTAGGTGTTT CAGGTTTAGC AGCTGCAG 4528
配列番号： 7
配列の長さ ： 5579
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
源
生物名 '· ストレフ'トコ' yカス ニューモニエ Streptococcus pneumoniae)
株名：臨床分薩株 SP-6- 6
配列
CTGCAGGCTT CCCTTTAGCA GTTACAGCCT GTTTCTTACG GTCTTTTTCA CTCCGGCCAA 60 TCGGCGCTTC AATTACACCA CGATCATTAG GCAGATTTCC ATGAACAATC GCCCAATATT 120 TGCGGAGAGA CTTTTTATCT TTGAGTTCTT GGGCAAGTAC TAGATGCGCA TCATCGTTTT 180
- 2 1 - 1133V 3VV3VV3
S：3VV OiViDDlOVVD
SJU 13vfJVl：V31:S13V
1001V3131100VV33013
V33V{i 33O33VVVV31
SJ1VV1311VVV3 VDV1V
131331E11 VEV33 333DVV 1V3V
3 vovvVVV;
VvVV vv
EJ3V3D13V:S,VD 313
sjjlvov
jL3V 3v3:sDl
i311393VV0
Figure imgf000030_0001
91V31 3VVVV
131VVVVV1
_>
113131130VVVVV VDV,
191ν3331VVV13933ν13
1VJS SD01VV VVVlvVV Eil133vvvDl V313V03
1190DVVVVD313SDVV0V
11LE3V1 Ivvvfsov3vv
souallU13vv 33VV31 10V33V 301:SS1 13V13 VDV3V0VVV 6d/6€is9 ο :一 - EUJU 3JLV 30JLIL1030 ¾3νν333 V1VV330 13113VV3333VVVJ 9VVVν3V 0861
¾iLLUVVVVVVD3V VVVVE fVE.L33vlvlv UIJtlV3315VSV謹 9IVVV3V0H3VJ3fV VVVVVVOD 11SVVV VV931V10 V33V33 V3VVV
IIU3Jialv0V〕 ii3VV13VVVLU V3V03VVg33v VVVVVV33 VvV
Figure imgf000031_0001
Slviv JJVV
1331; V33 V一
VD3 VV
13¾13DVV V
VV 33fwvV 1vsvv
v SJJiVV v
§3
1JV1EVVJVV
1VV33V
Figure imgf000031_0002
llE ,iv3ivvvvvl1111111IVVOViv 5:3 V
ιι 1V1iJJνV
D 93V V31V13V3D11i 1313vvVV VVVVDJsv, SV
1J Dvvv VVV13VV11315VVVV31151V 1351VV0V slisiii vvv 1131vlvoi33J3VV3 vvv
VD1 V1V33VUV V3V313U33JJV3V313DVV3V33V 13 3 VV3V3 093V3VJi9VV OlUOiVVDV9εlVJVl 9fV33 V131 VV01V3913VD139V3l3V11 uvovvo DVDJiooLvG
IDLL ,11V33VVV03 V011i1J3V31V0DVD1VVV
1331V1 V0V3V3V3V VV13031D31V1V VVV1V11 VV31VV3330
lgolvl
Figure imgf000032_0001
E1 9V VUVVVDVVOV
3V0 ollosol VVVSVVvv visvuvilvj ΰslso Μ 5Εl JiiDvvvsl VSVIV9ν3313 oiVDvV
D
D9 VVVV,
Ή 30VV0VV VVVVVV1V111VlVVO3 IVVVi一
1301VOVOVIVV 31VVV VVVE1E OVVV1 V1VV30
51JDVVS01V 3JVEV 31V
E—
■a:
1313VlDlOL VV5VV1V31311VOIOVDO ViV3333111V331 VVVV il 1 ovvj31911139svlov13311V3VV9Vvvi:v 00 3113VD1V0V13 VV, V9V
3 1 VV3VD1C V3D1§1DV1 L1 901- vvi3 V3011VV 3 33V9V1V31V s 3vilVVV 0V1
Figure imgf000032_0002
謹
svl v91vv 31V933D ν11133311VVVJS
v ol ,vv11333U 1033VV13VDVVV
31113 91V3333V §v1 119lvlv 139133
11ilE 01S3VVV DvlV3311V3sllV vovviv
V3JS1VV91013VVUuVV331vv¾ 311V1D11 V3v9
uii livofsv VV3V313UV3S1V93Vi3J- D91iiG lv3VV3v
VV1V1S1s 3V V03:v 31v11313
3D11DD1V V9131V3 VVD11 V39:svlls IVSDllD IUVJS11V1
1VJS1311 1V3V VV000011 OEVJV1Uv3i 11V3313 LL1313i 9S/S XDdS-A! O一 - 3V111OV S3 VV VOD 103VVV333V39 iOlJJVM 3V1311V0VVVE3DV 09s- 誠。0SS O
Figure imgf000033_0001

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 感染症疾患起炎菌であるス ト レプ ト コ ッ カス · ニ ュ ーモニ ェ (Streptococcus pneumoniae) 菌が保有する D NAを、 制限酵素 尸 silで処理して得られる D NA断片を含み、 およびス ト レブ ト コ ッ カ ス · ニ ュ ーモニエ菌が保有する D NAと特異的に反応するこ とを 特徴とする感染症診断用プローブ。
2 . 前記感染症診断用プローブが、 配列番号 1乃至 7 に記載の 少な く とも一つの塩基配列を含む請求の範囲第 1 項に記載の感染症 診断用プローブ =
PCT/JP1995/002036 1994-09-30 1995-10-02 Sonde pour diagnostic des maladies infectieuses WO1996010647A1 (fr)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002199938A CA2199938C (en) 1994-09-30 1995-10-02 Probe for diagnosing infectious diseases
DE69529758T DE69529758T2 (de) 1994-09-30 1995-10-02 Sonde für die diagnose von infektiösen erkrankungen
AT95933618T ATE233326T1 (de) 1994-09-30 1995-10-02 Sonde für die diagnose von infektiösen erkrankungen
DK95933618T DK0785277T3 (da) 1994-09-30 1995-10-02 Probe til diagnose af infektionssygdomme
AU36189/95A AU689325B2 (en) 1994-09-30 1995-10-02 Probe for diagnosing infectious diseases
EP95933618A EP0785277B1 (en) 1994-09-30 1995-10-02 Probe for diagnosing infectious diseases
KR1019960706982A KR100238337B1 (ko) 1994-09-30 1995-10-02 감염증 진단용 프로브
US08/809,254 US6660852B1 (en) 1994-09-30 1995-10-02 Probe for diagnosing infectious diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP23634894A JP3571378B2 (ja) 1994-09-30 1994-09-30 感染症診断用プローブ
JP6/236348 1994-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1996010647A1 true WO1996010647A1 (fr) 1996-04-11

Family

ID=16999484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1995/002036 WO1996010647A1 (fr) 1994-09-30 1995-10-02 Sonde pour diagnostic des maladies infectieuses

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6660852B1 (ja)
EP (1) EP0785277B1 (ja)
JP (1) JP3571378B2 (ja)
KR (1) KR100238337B1 (ja)
AT (1) ATE233326T1 (ja)
AU (1) AU689325B2 (ja)
CA (1) CA2199938C (ja)
DE (1) DE69529758T2 (ja)
DK (1) DK0785277T3 (ja)
WO (1) WO1996010647A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037026A1 (en) * 1996-04-02 1997-10-09 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
WO1998026072A1 (en) * 1996-12-13 1998-06-18 Eli Lilly And Company Streptococcus pneumoniae dna sequences
EP0890641A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-13 Smithkline Beecham Corporation Novel IspA
US6348328B1 (en) * 1997-05-14 2002-02-19 Smithkline Beecham Corporation Compounds
EP0889132A3 (en) * 1997-07-01 2002-03-20 Smithkline Beecham Corporation Streptococcus pneumoniae gidA2 polynucleotides and polypeptides

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002230275A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-12 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Environmentally regulated genes, involved in the virulence ofstreptococcus suis
EP1446140A4 (en) * 2001-10-15 2007-03-07 Novartis Vaccines & Diagnostic TREATMENT OF HEAVY PNEUMONIA BY ADMINISTRATION OF TFPI (TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR)
KR20030056628A (ko) * 2001-12-28 2003-07-04 학교법인 성균관대학 폐렴구균 알코올 탈수소효소를 이용한 폐렴구균의 동정방법
AU2003300356A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Disposable hand-held device for collection of exhaled breath condensate
US7828741B2 (en) * 2002-12-20 2010-11-09 The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Utilizing lipopolysaccharide in exhaled breath condensate to diagnose gram negative pneumonia
AU2005244249A1 (en) * 2004-03-17 2005-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Treatment of severe community-acquired pneumonia by admistration of tissue factor pathway inhibitor (TFPI)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01137976A (ja) * 1987-11-20 1989-05-30 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規ｄｎａフラグメント
WO1993003186A1 (en) * 1991-07-31 1993-02-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid
US5212297A (en) * 1989-05-16 1993-05-18 University Of Kansas cDNA clones encoding chicken egg white cystatin
WO1994001583A1 (en) * 1992-07-07 1994-01-20 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Probe for diagnosing infectious disease

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2687168B1 (fr) * 1992-02-10 1994-03-25 Bio Merieux Fragment de l'adn genomique de streptococcus pneumoniae, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, reactif et procede de detection de streptococcus pneumoniae.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01137976A (ja) * 1987-11-20 1989-05-30 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規ｄｎａフラグメント
US5212297A (en) * 1989-05-16 1993-05-18 University Of Kansas cDNA clones encoding chicken egg white cystatin
WO1993003186A1 (en) * 1991-07-31 1993-02-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid
WO1994001583A1 (en) * 1992-07-07 1994-01-20 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Probe for diagnosing infectious disease

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997037026A1 (en) * 1996-04-02 1997-10-09 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
WO1998026072A1 (en) * 1996-12-13 1998-06-18 Eli Lilly And Company Streptococcus pneumoniae dna sequences
US6348328B1 (en) * 1997-05-14 2002-02-19 Smithkline Beecham Corporation Compounds
EP0889132A3 (en) * 1997-07-01 2002-03-20 Smithkline Beecham Corporation Streptococcus pneumoniae gidA2 polynucleotides and polypeptides
EP0890641A1 (en) * 1997-07-10 1999-01-13 Smithkline Beecham Corporation Novel IspA

Also Published As

Publication number Publication date
DK0785277T3 (da) 2003-06-10
JP3571378B2 (ja) 2004-09-29
AU689325B2 (en) 1998-03-26
ATE233326T1 (de) 2003-03-15
AU3618995A (en) 1996-04-26
EP0785277B1 (en) 2003-02-26
EP0785277A4 (en) 1997-09-10
KR100238337B1 (ko) 2000-03-02
EP0785277A1 (en) 1997-07-23
CA2199938A1 (en) 1996-04-11
US6660852B1 (en) 2003-12-09
JPH0889295A (ja) 1996-04-09
DE69529758D1 (de) 2003-04-03
KR970703431A (ko) 1997-07-03
DE69529758T2 (de) 2003-11-27
CA2199938C (en) 2002-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5763188A (en) Probe for diagnosing Escherichia coli, Klebsiella pneumonieae or Enterobacter cloacae
WO1996010647A1 (fr) Sonde pour diagnostic des maladies infectieuses
JPH06133798A (ja) 感染症診断用プローブ
CA2284555C (en) Probes for the diagnosis of infections caused by streptococcus pyogenes
JP3914914B2 (ja) ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ
JP3914916B2 (ja) ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ
JP3914915B2 (ja) ストレプトコッカス・ピオゲネス菌に起因する感染症の診断用プローブ
EP0972833B1 (en) Probes for the diagnosis of infections caused by klebsiella pneumoniae
AU716843B2 (en) Probes for the diagnosis of infections caused by (bacteroides fragilis)
RU2455363C1 (ru) Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления streptococcus thermophilus в заквасочных культурах при производстве твердых сыров

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2199938

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2199938

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1995933618

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 08809254

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1995933618

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1995933618

Country of ref document: EP