KR100343106B1 - 박테로이데스 프라질리스균에 기인하는 감염증의 진단용 프로브 - Google Patents

박테로이데스 프라질리스균에 기인하는 감염증의 진단용 프로브 Download PDF

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Abstract

박테로이데스 프라질리스( Bacteroides fragilis )균이 보유하는 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 제한효소 HindⅢ로 완전 소화하고, 적당한 벡터에 클로닝하여, 박테로이데스 프라질리스균이 본질적으로 보유하는 DNA 단편을 포함하는 프로브를 선발하여, 그 프로브의 염기 배열을 해명한다.

Description

박테로이데스 프라질리스균에 기인하는 감염증의 진단용 프로브{Probes for the diagnosis of infections caused by Bacteroides fragilis}
병원미생물의 감염에 의해 일어나는 질환을 총칭하여 감염증이라 하는데, 병리학적으로, 감염이란 병원성 미생물(이하, 「균」이라 칭한다)이 생체내에 침입하여 증식의 발판을 확립하는 것을 지칭하며, 생체내에서의 균의 증식에 기인하는 발증(發症)은, 숙주의 저항력과 균의 독성과의 상호관계에 의존하는 것이다.
그런데, 각종 감염증에서 분리되는 모든 균주 중 약 20%는 혐기성균이 차지하고 있다. 그 중에서도 혐기성 그람음성간균은 모든 혐기성균의 30∼50%에 달하는데, 그 중에서 가장 검출 빈도가 높은 균은, 박테로이데스 프라질리스( Bacteroides fragilis )균임이 알려져 있다.
박테로이데스 프라질리스균은, 세균 분류학적으로는 무포아(無胞芽) 혐기성 그람음성간균에 속하며, 사람의 하부 소화관이나 외음부, 질(膣), 요도내 등에 상재하고 있다. 특히, 대장내에서는 대변 1g당 109∼1011개나 존재하며, 그 수는 대장균보다도 많은 정도이다.
박테로이데스 프라질리스균에 의한 감염은 내인성(內因性) 감염이며, 그 병원적 역할은 기회주의적이다. 임상적으로는 복강내 감염증, 부인 성기 감염증, 욕창, 당뇨병성 궤양, 골수염, 균혈증, 허리에서 하부의 연부 조직 감염증 및 고름(pus)에서 높은 비율로 검출된다(Chemothrapy, 제 37 권, 1229∼1244페이지, 1989년; 임상과학, 제 22권, 322∼333페이지, 1986년). 또한, 장관(腸管), 특히 대장의 외상, 수술, 궤양, 암, 게실염(diverticulitis)이나 충수염(appendicitis) 등에서 천공(穿孔;perforation)이 일어나면 본 균이 관여하는 복강내 농양(膿瘍)이 야기된다. 골반내 농양에서는 90%의 증상 예에서 혐기성균이 검출되는데, 그 약 반수는 본 균에 의한 것이다. 더욱이 균혈증 원인균의 5∼10%는 혐기성균이지만, 여기에도 본 균의 관여가 크다고 알려져 있다.
일반적으로 박테로이데스 프라질리스균과 같은 무포아성 혐기성균은 아미노글리코시드계 및 폴리믹싱(polymyxin)계 항생물질에 내성을 나타내지만, 특히 본 균은 β-락타마아제(β-lactamase)를 생산하기 때문에, 페니실린 및 세펨(cepham)계 등의 다수의 β-락탐제에 내성이다. 또한, 다른 혐기성균에 비해 상용 항균약에 대한 내성화가 현저하고, 세파마이싱(cephamycin)계 항생물질 및 이미페넴(imipenem)계 약제에 대한 내성주(耐性株)도 검출되고 있다(화학요법의 영역, 제 6 권, 제 9 호, 1915∼1925페이지, 1990년). 따라서, 일단 본 균에 의한 감염이 성립되면 치료가 매우 곤란해진다. 특히 패혈증에 이른 증상 예에서는 사망율이 높다고 보고되고 있다. 또한 항생물질의 수술전 투여 등에서는 균교대증(菌交代症)으로서 오히려 본 균의 감염을 초래하는 일도 있다.
이와 같이, 박테로이데스 프라질리스 감염증에 대해서는, 정확한 초기진단을 바탕으로, 적절한 약제 선택을 실시할 필요가 있기 때문에, 신속한 진단방법의 확립이 요구되고 있다.
혐기성균 감염증은 국소 파염에 의해 상재균이 조직내로 침입함으로써 시작된다.
그리고, 종래의 진단에서는, (1) 임상증상, (2) 검체의 배양, (3) 검체에 포함되는 균의 그람염색 등의 확인이 필수이며, 이들 항목이 확인되어야 비로소 치료방침이 결정된다. 구체적으로는 ① 직접 그람염색 표본에서 그람음성간균이 확인됨, ② 검체가 악취를 냄, ③ 횡격막보다 하부의 감염증, ④ 페니실린계, 세파로스포린(cephalosporin)계 약제가 효과 없는 감염증, ⑤ 당뇨병성 궤양, 욕창 및 균혈증 환자라면 일단, 박테로이데스 프라질리스 감염증이 의심되지만, 정확을 기하기 위해서는, 검체로부터 기인균을 검색 확정한 후에, 균의 종류에 따른 적절한 항생물질을 사용하여 치료하여야 한다. 따라서, 임상현장에서는 신속하고 확실한 원인균의 동정이 요구된다.
또한, 최근에는 내성주의 출현도 보여지고 있어, 기인균 검색의 중요성은 더욱 증대되어 오고 있다.
하지만, 실제로는, 기인균의 확정은 곤란한 것이 통상이다. 특히 혐기성균의경우, 상재균의 혼입, 공기에의 노출 및 건조를 피하지 않으면 안된다. 즉, 혐기성균 감염증이 의심되는 환자의 기인균의 검색 방법으로서는, 혈액, 수액(髓液), 흉수(胸水), 복수(腹水), 농양(膿瘍) 등의 천자액(穿刺液;puncture fluid), 또는 고름, 분비물 등으로부터의 채취 시료를 검체로서 사용하지만, 본 균은 사람의 하부 소화관 및 질 내의 상재균이기 때문에, 이들 부위의 감염증에서는 상재균의 혼입을 가능한 한 피해서 채취해야 한다. 채취된 검체는 건조를 방지하고, 즉시 산소와의 접촉을 피할 수 있는 혐기성균 검사용 용기에 보존하여, 육안 관찰 및 악취의 유무를 확인한 후, 직접 도말(塗抹) 표본의 그람염색을 행한다. 계속해서, 선택 배지를 이용하여 혐기성 조건하에서 48시간 배양함으로써, 기인균의 동정이 행해지는 것이 일반적인 순서이다. 그런데 이 방법에 따르면, 균의 배양에 장시간이 걸리는데다가, 약제 감수성 성적의 결과를 얻기까지는 3∼4일의 배양이 더 필요하고, 또한 본 균은 단독으로 검출되는 경우가 비교적 적고, 본 균 검출예의 약 70∼80%는, 다른 호기성균 등과의 복합균 감염예라 불리고 있으며, 호기성균 검출을 위해, 호기조건에서 검체를 처리하여 본 균의 존재를 간과할 우려도 있다. 더욱이, 감염증이 의심된 시점에서, 대량으로 항생물질을 투여받고 있는 경우에는, 설령 검체중에 균이 포함되어 있더라도, 증균·증식이 억제되고 있는 경우가 있고, 실제로는, 이들 검체로부터의 균의 배양이 매우 낮은 것이 되어 있다.
더욱이, 서브루틴(subroutine)으로서의 방법으로, 균체 성분 및 균의 대사산물의 기기 분석법(벤노 요시미, 「가스크로마토그래피에 의한 세균 동정의 신속화」, 임상검사, vol.29, No.12, pp.1618-1623, 1985년 11월, 의학서원 참조), 특이항체를 이용한 방법(일본국 특허공개 60-224068호 참조), 또한 DNA의 특이성을 이용한 하이브리디제이션(hybridization)에 의한 방법(일본국 특허공개 61-502376호) 등이 있는데, 모두 균의 분리 및 증균 배양이 필수로 되어 있다.
한편, 감염증에서의 식세포의 기능에 주목한 것으로서, 혈액시료중의 백혈구 성분이 집중되어 있는 버피코트(Buffy coat)의 도말 염색 표본을 검경(檢鏡)하는 방법이 있다. 일반적으로 버피코트 표본에서 균이 검출되는 빈도는, 성인 균혈증에서는 이타혈(耳朶血)의 빈도와 마찬가지로 30% 정도에 그치지만, 신생아의 경우, 10개의 예중 7개의 예(70%)에서 균이 검출되는 것으로 보고되고 있으며, 도말 표본의 검경에 의해 말초혈중균의 유무에 관한 정보는 치료시의 큰 지침이 되고 있다.
상기 종래 기술에서는, 그 전처리(前處理) 조작으로서, 적어도 검체로부터 균을 선택적으로 분리하는데에 1∼2일, 균을 증식하는데에 1일, 고정조작에 1일 이상이 소요되어, 합계 3∼4일은 족히 소요되며, 현실적으로는 이 배양을 균이 발육할때까지 계속하게 되므로, 전처리 조작에 1주일 이상이 소요되는 경우가 많고, 더욱이 균의 배양시에 질환의 원인균 이외의 균이 혼입되어도 이를 구별하지 못하는 경우도 있다.
그리고 중요한 것은, 상술한 사정으로 말미암아, 배양할 검체중의 많은 균은 식세포에 잡아먹히고, 항생물질의 투여에 의해 죽어 있거나 활동이 정지해 있는 상태가 되어, 배양조건하에서도 증식할 수 있는 균의 수는 적으며, 임상검체를 사용한 배양에 의한 실제 균의 검출율은 10% 전후로 매우 낮다. 바꾸어 말하면, 임상적으로 감염증의 가능성이 의심되는 환자의 혈액을 다시 하루 밤낮 이상 배양하여 검사하여도, 결국 그 90%는 균의 존재조차 판명해내지 못하고 있는 실정이다.
이와 같은 상황에서, 현재로는 기인균의 확정과, 그에 입각한 항생물질의 선택이 요구되고 있는데도 불구하고, 임상적으로 감염증의 가능성이 의심되는 단계에서 검출 결과가 나오는 것을 기다리지 않고 치료, 즉 기인균이 불명인채로, 가장 광범위한 종류의 균에 효과가 있는 항생물질을 투여하고, 1∼2일간 상태를 보아, 효과가 나타나지 않으면 다른 항생물질로 바꾸는 시행착오적인 방법에 의존하고 있는 것이다. 또한 이러한 치료방법에서는, 균교대증에 의해, 오히려 본 균의 감염을 초래하고 말 우려도 있다.
또한 검체중의 균을 염색에 의해 검출하는 방법에서는, 생체성분도 균과 마찬가지로 염색되기 때문에, 검경하여 확인되는 형태에 의해서만 신속하게 균을 판별하는 것은 숙련이 필요하고, 판정이 곤란한 경우도 있다.
이와 같이, 박테로이데스 프라질리스균에 의한 감염증은, 신속하고 정확한 진단이 요구되는 질환임에도 불구하고, 종래의 진단방법에서는 충분히 대응하지 못하고 있는 실정이다.
본 발명은 감염증 질환의 원인균, 특히, 복강내 감염이나 부인 성기 감염, 패혈증 등의 기인균인 박테로이데스 프라질리스( Bacteroides fragilis )균의 검출 및 동정(同定)에 유용한 프로브(probe)에 관한 것이다.
도 1(a)는 도트 블롯 하이브리디제이션(dot blot hybridization)의 각 필터의 DNA 균주의 배치를 나타내고, 도 1(b)는 각 프로브를 이용하여 하이브리디제이션을 행하고 발색시킨 후의 결과를 나타낸다.
본 발명은 상기한 해당 기술분야가 안고 있는 과제에 감안하여 완성된 것으로, 그 요지로 하는 바는, 감염증 원인균, 특히 박테로이데스 프라질리스균이 보유하는 DNA 또는 RNA와 특이한 반응성을 갖는 프로브, 및 그 프로브에 포함되는 박테로이데스 프라질리스균이 본질적으로 보유하고 있는 유전자 부분의 염기 배열을 해명하는데 있다.
즉 본 발명의 프로브에 의해, 예를 들면, 식세포에 잡아먹혀서 파괴되고 있는 균에서 아직 유지되고 있는 균의 DNA를, 하이브리디제이션법을 이용하여, 그 특이성에 근거하여 우연히 검출할 수 있고, 이에 의해 균을 배양·증식시키지 않고, 감염증 질환의 원인균을 신속하고 확실하게 검출할 수 있다. 또한, 이들 프로브의 염기배열 정보를 참조하여 프라이머(primer)를 디자인한다면, 하이브리디제이션을 행하지 않아도, PCR법에 따른 DNA의 증폭에 의해, 감염증 원인균을 동정할 수 있다.
또한, 하이브리디제이션에 이용되는 프로브를 비방사성인 것, 예를 들면 비오틴화한 프로브를 이용하면, 방사성 동위원소의 사용 시설이 없는 일반 검사실에서도 광학현미경을 이용하여 검출할 수 있고, 검출 작업을 신속, 간편하게 할 수 있다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위해, 감염증 질환 기인균인 박테로이데스 프라질리스균에 유래하는 프로브의 실시예를 나타낸다.
실시예 1 :박테로이데스 프라질리스균 유래 DNA 프로브
(1) 박테로이데스 프라질리스균 유래 DNA 프로브의 조제
임상균주인 박테로이데스 프라질리스균을 BHI(Brain Heart Infusion) 배지에서 혐기성 조건하(5% CO2)에서 하룻밤 배양하고, 배양균체를 집균(集菌)하여, 용균(溶菌) 단계에서 N-아세틸무라미다아제(N-Acetylmuramidase) SG를 첨가한 사이토-미우라(Saito-Miura)변법("Preparation of transforming deoxyribonucleicacid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta vol.72, pp.619-629(1963))에 준하여, 게놈 DNA(Genomic DNA)를 추출하였다.
추출한 DNA를 제한효소 HindⅢ으로 완전 소화하고, 벡터 pGEM-3Z로 무작위 클로닝하고, 얻어진 클론(clone)으로부터 박테로이데스 프라질리스균 특유의, 즉 천연 박테로이데스 프라질리스균이 보유하는 DNA와의 특이 반응성을 나타낸 DNA 단편을 포함하는 6종의 프로브를 선발하였다.
그리고 선발된 각 프로브를, 프로브 BF-7, 프로브 BF-17, 프로브 BF-21, 프로브 BF-28, 프로브 BF-34 및 프로브 BF-35라 명명하였다.
(2) 박테로이데스 프라질리스균 유래 DNA 프로브의 종 특이성의 검토
각 프로브와 각종 감염증 원인 균주의 DNA와의 반응성을 이하의 방법에 의해 검토하였다.
먼저, 검토 대상 균주로서, 하기 표 1에 열거한 임상 단리주 및 기탁 균주를 준비하였다. 또한, 표 1 중의 인간 게놈 DNA 및 대조 시료의 입수원으로서, 4명의 건강한 성인 남자로부터 채취한 백혈구, 및 플라스미드(plasmid) pGEM-3Z를 포함한 대장균(Escherichia coli)K-12, JM109 형질 전환체를 각각 준비하였다.
균No. 명칭 균명 출처 유래
1 BF 박테로이데스 프라질리스 (Bacteroides fragilis) 임상분리주
2 BT 박테로이데스 세오타이오타오미크론(Bacteroides theotaiotaomicron) 임상분리주
3 BV 박테로이데스 불구터스(Bacteroides vulgutus) 임상분리주
4 SA 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) ATCC 25923
5 SE 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228
6 EC 대장균(Escherichia coli) ATCC 25922
7 KP 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 임상분리주
8 EBC 엔테로박터 클로카에(Enterobacter cloacae) 임상분리주
9 EF 엔테로콕쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 임상분리주
10 PA 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27583
11 HI 헤모필리스 인플루엔제(Haemophills influenzae) 임상분리주
12 HPA 헤모필리스 파라인플루엔제(Haemophills parainfluenzae) 임상분리주
13 SP 화농상연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 임상분리주
14 SAG 스트렙토콕쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae) 임상분리주
15 SPN 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) NYSDH DP-2
16 HUM U937 인간 게놈 DNA
[범례]NYSDH : New York State Department of Health (Albany, New York, USA
그리고 각 임상균주를 실시예 1의 (1)에 기재된 방법에 따라, 각 균주가 보유하는 DNA를 추출하고, 이 추출한 DNA의 일정량(예를 들면 10∼100ng)을 나일론 필터에 스폿(spot)하고, 알칼리 변성한 것을 도트 블롯 하이브리디제이션의 시료로 삼았다. 또한 인간 게놈 DNA 시료는, 상술한 사이토-미우라 변법에, 먼저 입수한 백혈구를 적용함으로써 조제하였다. 한편, 대조시료는 후술하는 실시예 2의 (1)에 기재된 플라스미드 DNA의 조제방법에, 앞서 입수한 플라스미드 pGEM-3Z를 포함한 대장균(Escherichia coli) K-12, JM109 형질 전환체를 적용하는 것으로 조제하였다. 계속해서, 디곡시게닌-11-dUTP(Digoxigenin-11-dUTP ; BRL사 제품)로 라벨한 박테로이데스 프라질리스균 유래의 DNA 프로브로, 마니아티스의 매뉴얼(T. Maniatis,et al., "Molecular Cloning(A Laboratory Manual Second Edition)", Cold Spring Harbour Laboratory(1989))에 따라, 45% 포름아미드, 5×SSC, 42℃의 조건하에서, 철야 하이브리디제이션을 실시하였다.
철야 하이브리디제이션을 끝낸 시료를, 매뉴얼에 따라, 55℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에 의한 20분간의 세정을 2회 실시한 후, Anti-Dig-ALP 컨쥬게이트(Anti-Dig-ALP conjugates ; BRL社 제품)로 검출 발색시키고, 하이브리디제이션의 상항을 확인하였다. 얻어진 결과는, 도 1에 나타내는 바와 같다. 도 1(a)는 도트 블롯 하이브리디제이션을 행한 각 필터에 스폿해 두었던 DNA 균주의 배치를 나타내고, 도 1(b)는 상기 각각의 프로브 BF-7, BF-17, BF-21, BF-28, BF-34 및 프로브 BF-35를 이용하여 하이브리디제이션을 행하고 발색시킨 후의 결과를 나타낸다.
각 프로브와, 각 임상균주의 DNA와의 반응성에 관한 실험 결과를, 하기 표 2에 나타낸다.
균No. 약칭 균명 7 17 21 28 34 35
1 BF 박테로이데스 프라질리스 + + + + + +
2 BT 박테로이데스 세오타이오타오미크론 - - - - - -
3 BV 박테로이데스 불구터스 - - - - - -
4 SA 황색포도상구균 - - - - - -
5 SE 표피포도상구균 - - - - - -
6 EC 대장균 - - - - - -
7 KP 폐렴간균 - - - - - -
8 EBC 엔테로박터 클로카에 - - - - - -
9 EF 엔테로콕쿠스 패칼리스 - - - - - -
10 PA 녹농균 - - - - - -
11 HI 헤모필리스 인플루엔제 - - - - - -
12 HPA 헤모필리스 파라인플루엔제 - - - - - -
13 SP 화농상연쇄상구균 - - - - - -
14 SAG 스트렙토콕쿠스 아갈락티에 - - - - - -
15 SPN 폐렴연쇄상구균 - - - - - -
16 HUM U937 인간 게놈 DNA - - - - - -
[범례]+ : 하이브리다이즈의 신호가 검출됨- : 하이브리디이즈의 신호가 검출되지 않음
상기 도 1 및 표 2에서 알 수 있듯이, 양쪽의 프로브 모두 박테로이데스 프라질리스균에 유래하는 DNA에 대해서만 반응성을 나타내며, 박테로이데스속 이외의 균종 유래의 DNA는 물론, 박테로이데스속의 다른 균종 유래의 DNA에 대해서도 반응성(하이브리드의 형성)이 인지되지 않고, 그 종 특이성이 확인되었다.
실시예 2 : 염기배열의 해석
실시예 1에서 종 특이성이 확인된 DNA 프로브(합계 6개)의 염기배열을 하기의 방법에 따라 결정하였다.
(1) 플라스미드 DNA의 조제
서브클론화된(염기 배열을 결정해야 할) 삽입 단편을 pGEM-3Z(Promega)에 포함한 대장균(Escherichia coli)K-12, JM109 형질 전환체를, 5㎖의 루리아-백타니 미디움(Luria-Bactani Medium)(bacto-tryptone, 10g/1L; bacto-yeast extract, 5g/1L; NaCl, 10g/1L; 5N NaOH에서 pH 7.0으로 조정)에 식균(植菌)하여, 하룻밤 배양하였다.
배양액을 원심분리(5,000rpm, 5min.)하여 집균하였다. 침전물에 2.5㎎/㎖의 농도로 리소자임(Lysozyme ; Sigma)을 함유하는 50mM 글루코스/50mM 트리스(tris)-HCl(pH8.0)/10mM의 EDTA용액을 100㎕ 첨가하여 실온에서 5분간 방치하였다. 얻어진 현탁액에 1%의 농도로 도데실황산나트륨(Sigma)을 함유하는 0.2M의 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 혼합하였다. 5M 초산칼륨 수용액(pH4.8) 150㎕를 더 첨가하여 혼합하고, 15분간 빙냉(氷冷)하였다.
그리고, 원심분리(15,000rpm, 15min.)하여 얻은 상청(上淸)을, 페놀/CHCl3처리하여, 상청에 2배량의 에탄올을 첨가하고, 다시 원심분리(12,000rpm, 5min.)하여 침전을 얻었다. 이 침전물을, 10mM의 트리스-HCl(pH7.5)/0.1mM의 EDTA용액 100㎕에 용해하고, 10mg/㎖의 RNaseA(Sigma) 용액을 첨가하여, 실온에서 15분간 방치하였다.
이 조제물에 0.1M 초산나트륨 수용액(pH4.8)을 300㎕ 첨가하여, 페놀/CHCl3처리하고, 상청에 에탄올을 첨가하여 침전을 얻었다. 이 침전물을 건조시켜 10㎕의 증류수에 용해시킨 것을 DNA 시료로 삼았다.
(2) 염기배열 결정의 전처리(前處理)
염기배열 결정의 전처리를 오토리드(AutoRead ; 등록상표) 시퀀싱 키트(Sequencing Kit) (Pharmacia)를 이용하여 실시하였다.
즉, 주형(鑄型)이 되는 DNA가 32㎕의 용액중에 5∼10㎍의 농도가 되도록 조정하였다. 1.5㎖의 미니튜브(엡펜돌프 ; Eppendolf)에, 주형 DNA 32㎖를 옮기고, 2M의 수산화나트륨 수용액을 8㎖ 첨가하여 차분히 혼합하였다. 그리고 가볍게 원심한 후, 실온에서 10분간 방치하였다.
3M의 초산나트륨(pH4.8) 7㎕와 증류수 4㎕를 첨가하고, 다시 에탄올을 120㎕ 첨가하여 혼합하고, 에탄올 드라이아이스 위에서 15분간 방치하였다. 그리고 15분간 원심분리하여 침전시킨 DNA를 모으고, 주의하면서 상청을 제거하였다. 얻어진 침전물을 70%의 에탄올로 세정하고, 10분간 원심분리하였다. 그리고 다시 주의하면서 상청을 제거하고, 감압 조건하에서 침전물을 건조시켰다.
침전물을 증류수 10㎕에 용해하여, 형광성 프라이머〔Fluorescent Primer, Universal Primer; 5'-플루오레스세인(Fluorescein)-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(배열번호:7)]-3'(1.6pmol/㎕;0.42A260unit/㎖); 역프라이머(Reverse Primer), 5'-플루오레스세인(Fluorescein)-d[CAGGAAACAGCTATGAC(배열번호:8)]-3'(2.1pmol/㎕;0.42A260unit/㎖)〕2㎕(0.42A260unit/㎖, 4∼6pmol)와 어닐링(annealing)용 완충액 2㎕를 가하여 차분히 혼합하였다.
그리고, 가볍게 원심한 후, 65℃에서 5분간 열처리를 행하여, 재빠르게 37℃ 조건하에 두고, 거기서 10분간 보온하였다. 보온 후 10분 이상 실온에서 방치하고, 가볍게 원심하였다.
그리고, 연장용(延長用) 완충액 1㎕와 디메틸설폭시드 3㎕를 첨가하여 시료로 삼았다.
4개의 미니튜브에 A, C, G 및 T를 기입하고, 각각의 튜브에 A 믹스(ddATP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해시킨 것), C 믹스(ddCTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해시킨 것), G 믹스(ddGTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해시킨 것) 및 T 믹스(ddTTP를 dATP, dCTP, c7dGTP 및 dTTP와 함께 용해시킨 것)를 2.5㎕씩 나누어 부었다. 또한 각각의 용액은, 사용시까지는 얼음속에서 보존하고, 사용시에는 37℃에서 1분간 이상 보온한 후 사용하였다.
희석한 T7DNA 폴리머라제(polymerase)(Pharmacia ; 6∼8units/2㎕) 2㎕를DNA 시료에 첨가하고, 피펫팅(pipetting) 또는 부드러운 혼합에 의해 완전혼합시켰다.
혼합 후 바로, 이 혼합액을 4.5㎕씩 보온시켜 둔 4종의 용액에 나누어 부었다. 또한 나누어 부을 때에는 새로운 팁(tips)을 사용하였다.
37℃에서 5분간 보온하고, 정지 용액을 5㎕씩 각각의 반응액에 첨가하였다.
이번에 나누어 부을 때에도, 새로운 팁을 사용하였다. 90℃에서 2∼3분간 보온시키고, 바로 얼음속에서 냉각하였다. 전기영동(電氣泳動)에는 1레인당 4∼6㎕를 영동하였다.
(3) 염기배열의 결정
실시예 1 및 실시예 2에 개시한 박테로이데스 프라질리스균이 보유하는 DNA에 대해 특이성을 갖는 프로브 각각의 염기배열의 결정을, 영동온도 45℃, 영동시간 6시간으로 하여, A.L.F.DNA 시퀀서 시스템(Sequencer system)(Pharmacia)을 사용하여 행하였다. 각 상류와 하류에서 밝혀진 배열로부터 차례로 플라이머를 디자인하고, 상기 조작을 반복하였다.
그 결과, 프로브 BF-7(배열번호:1), 프로브BF-17(배열번호:2), 프로브BF-21(배열번호:3), 프로브BF-28(배열번호:4), 프로브BF-34(배열번호:5) 및 프로브BF-35(배열번호:6) 각각의 염기배열의 전용(全容)이 명확해졌다.
본 발명의 프로브를 사용하면, 예를 들면, 식세포에 잡아먹힌 감염증 원인균을 하이브리디제이션법을 이용하여, 증식하지 않고 직접 검출할 수 있고, 아울러균을 신속하게 그리고 정확하게 동정할 수 있다. 즉, 본 발명의 프로브를 사용한 진단에서는, 1회분의 검체로 균의 동정까지 행할 수 있으며, 진단에 소요되는 시간도 종래법의 경우 3∼4일(검출율은 낮다) 소요되는데 비하여, 약 1∼2일로 비약적으로 단축시킬 수 있으며, 더욱이 그 검출율은 매우 높다. 그러므로, 감염증의 치료에 대해 획기적인 지침을 줄 뿐만 아니라, 감염증 환자에게 조기에 효과있는 치료를 실시할 수 있고, 나아가서는 사망율의 저감도 기대된다.
또한, 감염증 질환 기인균 중에서도, 박테로이데스 프라질리스균이 보유하는 DNA에 특이적으로 반응하는 프로브의 염기배열을 밝힘으로써, 이들 프로브를 인공적으로 조제할 수 있게 하였다. 게다가 해석(解析)한 염기배열의 정보의 일부를 이용하여 제작한 프라이머를 사용하고, 임상검체에 포함되는 감염증 원인균의 DNA를 PCR법에 의해 증폭하여, 원인균의 신속한 진단에 유용하게 쓰일 수 있다.
더욱이, 임상검체에 내포한 게놈 DNA(Genomic DNA)의 염기배열과 본 발명에 의해 해석된 염기배열을 비교, 참조함으로써, 감염증 기인균종의 신속한 동정을 실시할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 소기의 목적이었던 감염증 진단용 프로브를 제공할 뿐만 아니라, PCR용 프라이머 제작의 지침으로서, 또한 임상검체에 포함되는 Genomic DNA와의 비교, 참조용에 적합한 표준 배열로서 우수한 유용성이 기대되고, 더욱이 감염증 질환 기인균이 보유하는 DNA에 특이적으로 반응하는 프로브의 앞으로의 탐구 개발에 귀중한 계기를 가져오는 등의 우수한 효과를 나타내는 것이다.
또한, 본원 출원으로 개시한 염기배열은, 임상분리주인 게놈 DNA를 무작위로클로닝하여 얻어진 것이며, 따라서 본 발명의 염기배열의 유용성은 그 상보쇄(相補鎖)에까지 미치는 것이다.
게다가 야성주(野性株)가 보유하는 DNA에 변이부분이 존재하는 것은 당연히 생각할 수 있는 것이지만, 상기한 실시예의 개시에서 알 수 있듯이, 그 DNA 변이부분이 감염증 진단을 위한 하이브리디제이션에 이용될 경우, 본 발명의 프로브의 특이성, 또는 본원 출원에서 개시한 염기배열 정보를 감염증의 신속한 진단을 목적으로 한 PCR법의 프라이머를 디자인하는데에 이용할 수 있다는 등, 본 발명이 나타내는 유용성에는 아무런 영향을 끼치지 않는다.

Claims (2)

  1. 삭제
  2. 감염증 질환 기인균인 박테로이데스 프라질리스( Bacteroides fragilis )균이 보유하는 DNA를 제한 효소 HindⅢ로 처리하여 얻을 수 있는 DNA 단편을 포함하는 감염증 진단용 프로브로서,
    상기 감염증 진단용 프로브가, 배열번호 1 내지 배열번호 6으로 나타나는 염기배열의 적어도 하나를 가지며,
    상기 박테로이데스 프라질리스균이 보유하는 DNA와 특이적으로 하이브리드 형성하는 것을 특징으로 하는 감염증 진단용 프로브.
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