WO1998042844A1 - SONDES POUR LE DIAGNOSTIC D'INFECTIONS DUES AU $i(BACTEROIDES FRAGILIS) - Google Patents

SONDES POUR LE DIAGNOSTIC D'INFECTIONS DUES AU $i(BACTEROIDES FRAGILIS) Download PDF

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WO1998042844A1
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bacteria
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fragilis
probes
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Hiroshi Ueyama
Kanako Abe
Hiroyuki Keshi
Akio Matsuhisa
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Definitions

  • the present invention relates to a probe useful for the detection and identification of bacteria causing infectious diseases, in particular, Bacteroides fragilis, which is the causative agent of intraperitoneal infection, gynecological infection, and sepsis. (Background technology)
  • infectious diseases Diseases caused by infection with pathogenic microorganisms are collectively referred to as infectious diseases.
  • Pathologically, infection means that pathogenic microorganisms (hereinafter referred to as "fungi") invade living organisms and establish a foothold for growth.
  • fungi pathogenic microorganisms
  • the pathogenesis caused by bacterial growth in a living body depends on the correlation between host resistance and bacterial virulence.
  • anaerobic bacteria By the way, about 20% of all strains isolated from various infectious diseases are anaerobic bacteria. Among them, anaerobic gram-negative bacilli account for 30 to 50% of all anaerobic bacteria, of which it is known that the most frequently detected bacterium is Bacteroides fragilis.
  • Pacteroides fragilis is a bacteriotaxically genus of anaerobic, anaerobic, gram-negative bacilli, and is resident in the lower gastrointestinal tract, vulva, vagina, and urethra of humans. Also present especially 1 0 9-1 0 1 1 per stool 1 g is in the colon, the number is about more than E. coli.
  • Infection with Pacteroides fragilis is an endogenous infection and its pathogenic role is opportunistic.
  • Clinically intraperitoneal infection, gynecological sensation Highly detected in infections, pressure sores, diabetic ulcers, osteomyelitis, bacteremia, soft tissue infections from the lower back and lower pus (Chemothrapy, Vol. 37, pp. 1229-1244, 1989; Clinical Science, Vol. 22, pp. 322-333, 1986).
  • perforation caused by trauma, surgery, ulceration, cancer, diverticulitis or appendicitis of the intestinal tract, especially the large intestine causes an abdominal abscess involving the bacterium.
  • anaerobic bacteria are detected in 90% of cases, but about half of them are due to the bacteria. Furthermore, 5 to 10% of the causative bacteria of bacteremia are anaerobic bacteria, and it is known that this bacterium also plays a major role.
  • anaerobic anaerobic bacteria such as Pacteroides fragilis are resistant to aminoglycoside and polymyxin antibiotics. Resistant to many /?-Lactams, including systems.
  • resistance to common antibacterial drugs is remarkable, and strains resistant to cephamycin antibiotics and imibenem drugs are being detected (chemotherapy, Vol. 6, 9, pp. 1915-1925, 1990).
  • the causative organism it is usually difficult to determine the causative organism. Particularly in the case of anaerobic bacteria, contamination with indigenous bacteria, exposure to air and drying must be avoided as much as possible.
  • the method of searching for the causative bacteria of a patient suspected of having an anaerobic bacterial infection is as follows: blood, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites, ascites, aspirate such as abscess, or sample collected from pus, secretions, etc.
  • This bacterium is a resident bacterium in the lower gastrointestinal tract and in the vagina of humans. Therefore, infectious diseases at these sites should be collected while minimizing contamination with resident bacteria.
  • the collected sample is stored in a container for anaerobic bacteria testing that can prevent drying and avoid contact with oxygen immediately. . Then, by culturing for 48 hours under anaerobic conditions using a selective medium, the causative organism is identified by a general procedure.
  • the cultivation of the bacterium takes a long time, and further requires 3 to 4 days of cultivation before obtaining the results of drug sensitivity results. It is said that about 70 to 80% of the cases detected by this bacterium are infected with complex bacteria with other aerobic bacteria, etc. Process the sample under aerobic conditions and There is a risk of overlooking the existence of.
  • bacterial enrichment and growth may be suppressed even if the specimen contains bacteria. In fact, the culture of bacteria from these specimens is extremely low.
  • subroutine methods include instrumental analysis of metabolites of bacterial components and bacteria (Yoshimi Benno, "Accelerated identification of bacteria by gas chromatography", Clinical Laboratory, vol.29, No.12, pp. 1618-1623, November 1985, Medical School), a method using a specific antibody (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-224068), and a method using hybridization utilizing the specificity of DNA.
  • instrumental analysis of metabolites of bacterial components and bacteria Yoshimi Benno, "Accelerated identification of bacteria by gas chromatography", Clinical Laboratory, vol.29, No.12, pp. 1618-1623, November 1985, Medical School
  • a method using a specific antibody see Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-224068
  • a method using hybridization utilizing the specificity of DNA are required.
  • At least one to two days for selective separation of bacteria from the sample, one day for enrichment, one day or more for fixation, and a total of three to four days are sufficient as pretreatment operations.
  • this culture is actually continued until the bacteria grow, so that the pretreatment operation often requires one week or more, and even if bacteria other than the disease-causing bacteria are mixed during the culture of the bacteria. In some cases, they cannot be distinguished.
  • the present invention has been completed in view of the above-mentioned problems in the technical field, and the gist of the present invention is that it is unique to DNA or: NA possessed by infectious disease-causing bacteria, in particular, P. fragilis bacteria.
  • the purpose of the present invention is to elucidate the nucleotide sequence of a probe having a specific reactivity and the gene portion essentially contained in Pacteroides' fragilis bacteria contained in the probe. That is, by using the probe of the present invention, for example, the DNA of a bacterium that is still maintained in a bacterium that is being taken up and destroyed by phagocytic cells can be significantly separated based on its specificity using the hybridization method.
  • the infectious disease-causing bacterium can be identified by amplification of the DNA by the PCR method without performing hybridization.
  • the probe used for hybridization is non-radioactive, for example, if a biotinylated probe is used, it can be detected using an optical microscope even in a general laboratory without radioisotope use facilities, making detection work quick and easy. I can do it.
  • Fig. 1 (a) is a diagram showing the arrangement of DNA strains in each dot-plot / hybridization file.
  • Fig. 1 (b) shows the results of hybridization using each probe and color development.
  • FIG. 9 is a view showing a later result.
  • Example 1 DNA probe from Pacteroides fragilis
  • the clinical strain Pacteroides fragilis was cultured in BHI (Brain Heart Infusion) medium under anaerobic conditions (5% C0 overnight), and the cultured cells were collected.
  • BHI Brain Heart Infusion
  • N-Acetylmuramidase SG was added in the lysis step. Genomic DNA was extracted.
  • the extracted DNA was completely digested with the restriction enzyme Hindi 11 and randomly cloned into the vector pGEM-3Z. Six types of probes containing DNA fragments showing specific reactivity were selected.
  • probe BF-7 The selected probes were named probe BF-7, probe BF-17, probe BF-21, probe BF-28, probe BF-34, and probe BF-35.
  • Table 1 Clinical isolates and deposited strains listed in Table 1 below were prepared as strains to be examined.
  • the sources of human genomic DNA and control samples in Table 1 were Escherichia coli K-12, JM109 containing leukocytes collected from four healthy adult males and plasmid pGEM-3Z. Each transformant was prepared. table 1
  • each clinical strain was stored according to the method described in Example 1 (1).
  • the extracted DNA was extracted, and a fixed amount (for example, 10 to 100 ng) of the extracted DNA was spotted on a nylon filler every night, and the alkali-denatured DNA was used as a sample for dot-protocol hybridization.
  • the human genomic DNA sample was prepared by applying the previously obtained leukocyte to the modified Saito-Miura method described above.
  • the Escherichia coli K-12, JM109 transformant containing the previously obtained plasmid PGEM-3Z was applied to the plasmid DNA preparation method described in Example 2 (1) described below.
  • Hypridie's Significance of Hypridie's As is clear from FIG. 1 and Table 2 above, all of the probes show reactivity only with DNA derived from Bacteroides fragilis, and not only DNA derived from species other than Bacteroides but also Bacteroides. No reactivity (hybrid formation) was observed with DNA derived from Bacillus sp. Species, and the species specificity was confirmed.
  • the nucleotide sequences of the DNA probes (six in total) whose species specificity was confirmed in Example 1 were determined according to the following method.
  • the culture was collected by centrifugation (5,000 rpm, 5 min.). To the precipitate was added 100 mM of 50 mM glucose / 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 10 mM EDTA solution containing lysozyme (Sigma) at a concentration of 2.5 mg / ml, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. A 0.2 M aqueous sodium hydroxide solution containing sodium dodecyl sulfate (Sigma) at a concentration of 1% was added to the obtained suspension and mixed. Further, 150/1 of a 5 M aqueous acetic acid solution (pH 4.8) was added and mixed, followed by ice cooling for 15 minutes.
  • Type III DNA 32 ⁇ 1 was transferred to a 1.5 ml minitube (Eppendorf), and 8 M 1 of a 2 M aqueous sodium hydroxide solution was added and mixed gently. After light centrifugation, the mixture was left at room temperature for 10 minutes.
  • the precipitate was dissolved in 10/1 distilled water, and a fluorescent primer [Fluorescent Primer, Universal Primer; 5'-Fluoresce in-d [CGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT (SEQ ID NO: 7)]-3, (1.6 pmol / ⁇ L; 0.42 A 26. Unit / ml); Reverse Primer, 5'-Fluoresce in-d [CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 8)]-3, (2.1 pmol / ⁇ l; 0.42 A 26. Unit / ml) 2 il (0.42 A 26. Unit / ml, 4 to 6 pmol) and an annealing buffer (2 ⁇ 1) were added and mixed gently.
  • a fluorescent primer [Fluorescent Primer, Universal Primer; 5'-Fluoresce in-d [CGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT (SEQ ID NO: 7)]-3, (1.6 pmol / ⁇ L;
  • the sample was prepared by adding 1 ⁇ ⁇ 1 of the buffer for extension and 31 of dimethyl sulfoxide. Fill A, C, and G and T in four mini tubes (of dATP and ddATP, dCTP, was also dissolved with c 7 dGTP and dTTP) it AMix that of tubing, dATP and C Mix (ddCTP , dCTP, obtained by dissolving with c 7 dGTP and dTTP), dATP and G Mix (ddGTP, dCTP, those were dissolved with c 7 dGTP and dTTP) and T Mix (dATP to ddTTP, dCTP, together with c 7 dGTP and dTTP Was dissolved in 2.5) 1 each. Each solution was kept on ice until use and kept at 37 ° C for 1 minute or more before use.
  • the solution was incubated at 37 ° C for 5 minutes, and the stop solution was added to each reaction solution in 5 ⁇ 1 portions.
  • the ALF DNA Sequencer system disclosed in Examples 1 and 2 was used to determine the base sequence of each probe having specificity for DNA carried by Pacteroides' fragilis bacterium at a migration temperature of 45 ° and a migration time of 6 hours. (Pharmacia). Primers were designed in order from each stream and the sequence revealed from the downstream, and the above operation was repeated.
  • probe BF-7 (SEQ ID NO: 1), probe BF-17 (SEQ ID NO: 2), probe BF-21 (SEQ ID NO: 3), probe BF-28 (SEQ ID NO: 2) : 4), probe BF-34 (SEQ ID NO: 5), and probe BF-35 (SEQ ID NO: 6).
  • an infectious disease-causing bacterium incorporated into a phagocyte can be directly detected without multiplying by the hybridization method, and the bacterium can be quickly and accurately identified. That is, in the diagnosis using the probe of the present invention, bacteria can be identified in one sample, and the time required for diagnosis is about 1 to 4 days (the detection rate is low), which is 3 to 4 days of the conventional method. The time can be dramatically reduced to two days, and the detection rate is extremely high. Therefore, in addition to providing technological guidelines for the treatment of infectious diseases, it is expected that patients with infectious diseases will be able to receive effective and early treatment and that mortality will be reduced.
  • the infectious disease-causing bacterial species can be rapidly identified.
  • the present invention not only provides a probe for diagnosing infectious disease, which was the intended purpose, but also serves as a guideline for preparing a primer for PCR and as a comparison with genomic DNA contained in clinical samples. It is expected to have excellent utility as a reference sequence suitable for reference, and will provide valuable clues in the future search and development of probes that specifically react with DNA possessed by infectious disease-causing bacteria. It has excellent effects.
  • the nucleotide sequence disclosed in the present application was obtained by randomly cloning Genomic DNA of a clinical isolate, and therefore, the usefulness of the nucleotide sequence of the present invention extends to its complementary strand. Reach.
  • the DNA mutated portion is used for hybridization for infectious disease diagnosis.
  • the present invention relates to the specificity of the probe of the present invention at the time of use, or the use of the nucleotide sequence information disclosed in the present application to design primers for PCR for the purpose of rapid diagnosis of infectious diseases. It does not have any effect on the usefulness that it plays.
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis)
  • AAGCTTCTAC ACGCTTCAAT TCTTGAAACA CAAGTTCTAC CGCAAGCTGC GGATTTACTT 60 TGGGCGTGGT GTCCTTTCTC TTTCGGGGGC TGTACTGCCC CTGCTTATAG GTGTAATCCT 120 CCGTCTTTGG GTTTGAGGGT GTTTCCATAA TTCCTGCTGA TTGAGCT TTTCTTCGTCTTCGTTATA CTTCTTCTGCT TTCCTTCGTT TTCCTTCGTC O t—
  • AAAGCTCATC AAGAAATGCG TTTGCGCTCT TGGCTGGCTG CTCACCAGCT TCGATTCGTT 1920
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Bacteroides fragil is
  • AAGCTTACGG CAGCGGGCGG CGCTACTCCT TTCTTCTGCA CGACTGCTTC CGGATCCGGA 60 TCGGCCGGCA CGATGTCCCT GACGGATGGC GCTTTGTCCG GACTGGCCGC GGTGGGTGAA 120 ATCTCTTTTA CCCCATCGGC CCGTCCGCAA CAGGTCGGCA CCTCGGGCCC CGTTACAGTG 180 GCCTACGGGC TGGTGGCTCC GAAGCTGAGG CGGCTTCGGG CATGCGGGTG ACGTTGACGC 240 TGACACTGGG TGAACAAAGC TCGGACGCTA CCGAACGGGA TCTTACCCTC TCGACCGATG 300 CCTTCAACCC GGCATGGCAG AAAGGATACC GCTACGTCTA TACCTTGACG CTCGGCGAAC 360 GGGGAATCAG CCTGCAACCT GTCGATATAA AAGGGTGGAC GGAAGTTTCC GAGGAGAGCA 420 GTGACGTAGA TCCCGGCT
  • GAACTCCGCT TCTTCCGGCA ACAGTACGGG CGAGTGGAAA CCTTCGGTGA CGGGTACGGA 900
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Bacteroides fragil is
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Bacteroides fragil is
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)

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Description

明 細 フラジリス菌に起因する感染症の診断用プロ一ブ 〔技術分野〕
本発明は、 感染症疾患の原因菌、 特に、 腹腔内感染や婦人性器感染、 敗血症などの起因菌であるバクテロイデス ·フラジリス (Bacteroides fragilis) 菌の検出および同定に有用なプロ一ブに関する。 〔背景技術〕
病原微生物の感染によって起こる疾患を総称して感染症というが、 病 理学的に、 感染とは病原性の微生物 （以下、 「菌」 と称する） が生体内 に侵入し、 増殖の足がかりを確立することを指し、 生体内での菌の増殖 に起因する発症は、 宿主の抵抗力と菌の毒力との相互関係に依存するも のである。
ところで、 各種の感染症から分離される全菌株のうち約 2 0 %は、 嫌 気性菌が占めている。 なかでも嫌気性グラム陰性桿菌は全嫌気性菌の 3 0〜5 0 %に達するが、 そのうち最も検出頻度の高い菌は、 パクテロ イデス .フラジリス（Bacteroides fragilis)菌であることが知られてい る。
パクテロイデス ·フラジリス菌は、 細菌分類学的には無胞芽嫌気性の グラム陰性桿菌に属し、 ヒトの下部消化管や外陰部、 膣、 尿道内などに 常在している。 特に大腸内では糞便 1 gあたり 1 0 9〜 1 0 1 1個も存在し、 その数は大腸菌よりも多いほどである。
パクテロイデス ·フラジリス菌による感染は内因性感染であり、 その 病原的役割は日和見的である。 臨床的には、 腹腔内感染症、 婦人性器感 染症、 褥創、 糖尿病性潰瘍、 骨髄炎、 菌血症、 腰から下部の軟部組織感 染症および膿から高率に検出される（Chemothrapy、 第 37卷、 1229 〜 1244頁、 1989年；臨床科学、 第 22巻、 322〜 333頁、 1986年）。 また、 腸管、 特に大腸の外傷、 手術、 潰瘍、 癌、 憩室炎や 虫垂炎などで穿孔が起こると本菌が関与する腹腔内膿瘍が惹起される。 骨盤内膿瘍においては 90%の症例に嫌気性菌が検出されるが、 その約 半数は本菌によるものである。 さらに菌血症の原因菌の 5〜10%は嫌 気性菌であるが、 これにも本菌の関与が大きいことが知られている。 一般に、 パクテロイデス ·フラジリス菌のような無胞芽性嫌気性菌は アミノグリコシド系およびポリミキシン系抗生物質に耐性を示すが、 特 に本菌は 5—ラク夕マーゼを産生することから、 ぺニシリンゃセフエム 系などの多くの/?—ラクタム剤に耐性である。 また、 他の嫌気性菌に比 ベて常用抗菌薬に対する耐性化が著しく、 セファマイシン系抗生物質や イミべネム系薬剤に対する耐性株も検出されつつある（化学療法の領域、 第 6卷、 第 9号、 19 15〜 1 925頁、 1990年） 。 したがって、 ひとたび本菌による感染が成立すると治療が極めて困難になる。 特に敗 血症に至った症例では死亡率が高いことが報告されている。 また、 抗生 物質の術前投与などでは菌交代症として、 かえって本菌の感染を招来す ることもある。
このように、 バクテロイデス ·フラジリス感染症については、 的確な早 期診断のもとに、 適切な薬剤選択を実施する必要があることから、 迅速 な診断方法の確立が待望されている。
嫌気性菌感染症は、 局所の破綻によって常在菌が組織内に侵入するこ とに端を発する。
そして、 従来の診断においては、 （1) 臨床症状、 （2) 検体の培養、 (3) 検体に含まれる菌のグラム染色などの確認が必須であり、 これら の項目が確認されて初めて治療方針が決定される。 具体的には、 ①直接 グラム染色標本でグラム陰性桿菌を認める、 ②検体が悪臭を放つ、 ③横 隔膜より下部の感染症、 ④ペニシリン系、 セファロスボリン系薬剤が無 効の感染症、 ⑤糖尿病性潰瘍、 褥創および菌血症患者、 であれば一応、 バクテロイデス ·フラジリス感染症が疑われるものの、 正確を期するた めには、 検体から起因菌を検索 ·確定した上で、 菌の種類に応じた適切 な抗生物質を使用し、 治療にあたらねばならない。 従って、 臨床現場に おいては、 迅速かつ確実な原因菌の同定が望まれている。
また、 近年は、 耐性株の出現もみられ、 起因菌検索の重要性はさらに 増大してきている。
しかしながら、 実際には、 起因菌の確定は困難を伴うのが通常である。 特に嫌気性菌の場合、 常在菌の混入、 空気暴露および乾燥を極力避けな ければならない。 すなわち、 嫌気性菌感染症が疑われた患者の起因菌の 検索方法としては、 血液、 髄液、 胸水、 腹水、 膿瘍などの穿刺液、 ある いは膿、 分泌物などからの採取試料を検体として使用する力 本菌はヒ トの下部消化管や膣内の常在菌であるので、 これらの部位の感染症では 常在菌の混入をできうる限り避けて採取しなければならない。 採取され た検体は乾燥を防ぎ、 直ちに酸素との接触を避けることのできる嫌気性 菌検査用の容器に保存し、 肉眼観察および悪臭の有無を確認した後、 直 接塗抹標本のグラム染色を行う。 次いで、 選択培地を用いて嫌気性条件 下で 4 8時間培養することで、 起因菌の同定が行われるのが一般的な手 順である。 ところが、 この方法によると、 菌の培養に長時間を有する上 に、 薬剤感受性成績の結果を得るまでには、 さらに 3〜4日の培養が必 要であり、 また、 本菌は単独で検出される場合は比較的少なく、 本菌検 出例の約 7 0〜8 0 %は、 他の好気性菌などとの複合菌感染例であると いわれており、 好気性菌検出のために、 好気条件で検体を処理して本菌 の存在を見逃すおそれもある。 加えて、 感染症を疑われた時点で、 大量 に抗生物質を投与されている場合には、 たとえ検体中に菌が含まれてい ても、 増菌 ·増殖が抑えられている場合があり、 実際には、 これらの検 体からの菌の培養の極めて低レ、ものとなっている。
さらに、 サブルーチンとしての方法に、 菌体成分ゃ菌の代謝産物の機 器分析法 （辨野義己、 「ガスクロマトグラフィーによる細菌同定の迅速 化」、 臨床検査、 vol .29, No. 12， pp. 1618-1623、 1985年 11月、 医学書 院参照） 、 特異抗体を利用した方法 （特開昭 60— 224068号参照） 、 さら には、 D N Aの特異性を利用したハイブリダイゼ一シヨンによる方法 (特表昭 61— 502376号） 等があるが、 いずれも、 菌の分離及び増菌培養 が必須とされている。
一方、 感染症における食細胞の機能に着目したものとして、 血液試料 中の白血球成分が集中しているバフィ一コート （Buffy coat) の塗抹染 色標本を検鏡する方法がある。 一般にパフィ一コ一ト標本で菌が検出さ れる頻度は、 成人菌血症では耳朶血の頻度と同様に 30%程度にとどまる が、 新生児の場合、 10例中 7例 （70% ) で菌を検出している報告もあり、 塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関する情報は治療における大 きな指針となっている。
上記従来技術においては、 その前処理操作として、 少なくとも検体か らの菌の選択的分離に 1〜2日、 増菌に 1日、 固定操作に 1日以上、 合 計で 3〜 4日は十分かかり、 現実にはこの培養を菌が発育するまで続け ることになるので、 前処理操作に一週間以上要する場合が多く、 さらに、 菌の培養時に疾患の原因菌以外の菌が混入しても区別できない場合もあ る。
そして重要なことは、 前述した事情から、 培養すべき検体中の多くの 菌は食細胞に取り込まれ、 抗生物質投与のため死んでいるか静止状態に あるため、 培養条件下でも増殖できる菌の数は少なく、 臨床検体を用い た培養による実際の菌の検出率は 10%前後と、 非常に低い。 換言すれば、 臨床的に感染症の可能性が疑われた患者の血液をさらに一昼夜以上培養 して検査しても結局、 その 90%は菌の存在すら判明しないのが現状であ る。
このような状況から、 現在は起因菌の確定と、 それに即した抗生物質 の選択が要求されているにもかかわらず、 臨床的に感染症の可能性が疑 われた段階で、 検出結果が出るのを待たずに治療、 すなわち、 起因菌不 明のまま、 最も広範囲な種類の菌に有効な抗生物質を投与し、 1、 2日 間様子を見て、 効果が現れなレ、と別の抗生物質に切換えるという試行錯 誤的な方法に頼っているのである。 また、 こういった治療方法では、 菌 交代症により、 かえって本菌の感染を招来してしまうおそれもある。 また、 検体中の菌を染色により検出する方法では、 生体成分も菌と同 様に染色されるため、 検鏡して認められる形態によってのみ迅速に菌を 判別するのは、 熟練が必要であり、 判定が困難な場合もある。
このように、 バクテロイデス ·フラジリス菌による感染症は、 迅速 ' 確実な診断が求められる疾患であるにもかかわらず、 従来の診断方法で は十分対応できていなかったのが実情である。
〔発明の開示〕
本発明は上記当該技術分野が抱えている課題に鑑みて完成されたもの であり、 その要旨とするところは、 感染症原因菌、 特に、 パクテロイデ ス · フラジリス菌が保有する D N Aまたは: N Aと特異的な反応性を有 するプローブ、 および、 当該プローブに含まれるパクテロイデス ' フラ ジリス菌が本質的に保有している遺伝子部分の塩基配列を解明すること にある。 すなわち、 本発明のプローブにより、 例えば、 食細胞に取り込まれて 破壊されつつある菌においてなお維持されている菌の D N Aを、 ハイブ リダィゼ—シヨン法を用いて、 その特異性に基づいて有為に検出でき、 これにより、 菌を培養 ·増殖せずに、 感染症疾患の原因菌が迅速かつ確 実に検出できる。 また、 これらのプローブの塩基配列情報を参照してプ ライマーをデザィンすれば、 ハイプリダイゼーシヨンを行わなくとも、 P C R法による D N Aの増幅により、 感染症原因菌を同定することがで きる。
また、 ハイブリダイゼ一シヨンに用いるプローブを非放射性のもの、 例えば、 ビォチン化したプローブを用いれば、 放射性同位元素使用施設 のない一般検査室でも光学顕微鏡を用いて検出でき、 検出作業が迅速、 簡便に行える。
〔図面の簡単な説明〕
第 1図（a)は、 ドット 'プロット ·ハイブリダイゼ一ションの各フィル 夕一における D N Aの菌株の配置を示す図であり、 同 (b)は各プローブを 用いてハイプリダイゼ一シヨンを行ない発色させた後の結果を示す図で ある。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明をさらに詳細に説述するため、 感染症疾患起因菌であるバクテ ロイデス · フラジリス菌に由来するプローブの実施例を示す。
実施例 1 ：パクテロイデス · フラジリス菌由来 D N Aプローブ
( 1) パクテロイデス ·フラジリス菌由来 D N Aプローブの調製
臨床菌株パクテロイデス ·フラジリス菌を BHI (Brain Heart Infus- ion)培地にて嫌気性条件下 （5% C0 で一晩培養し、 培養菌体を集菌し て、 溶菌ステップで N-Acetylmuramidase SG を加えた、 Saito-Miura変 法 ("Preparation of transforming deoxyribonucleicacia by phenol treatment" , Biochem. Biophys. Acta vol . 72, pp.619-629 ( 1963) )に 準じて、 Genomic D N Aを抽出した。
抽出した D N Aを、 制限酵素 Hindi 11で完全消化し、 ベクタ一 pGEM-3Z にランダムクローニングし、 得られたクローンからパクテロイデス ·フ ラジリス菌特有の、 すなわち、 天然のパクテロイデス 'フラジリス菌が 保有する D N Aとの特異反応性を示した D N A断片を含む 6種のプロ一 ブを選抜した。
そして選抜された各プローブを、 プローブ BF- 7、 プロ一ブ BF- 17、 プロ —ブ BF- 21、 プローブ BF- 28、 プローブ BF- 34、 およびプローブ BF- 35と命 名した。
(2) バクテロイデス ·フラジリス菌由来 D N Aプローブの種特異性の 難
各プローブと各種感染症原因菌株の D N Aとの反応性を、 以下の方法 により検討した。
まず、 検討対象菌株として、 下記表 1に列挙した臨床単離株および寄 託菌株を準備した。 なお、 表 1中の、 ヒト ·ゲノミック D N Aおよび対 照試料の入手源として、 4名の健康な成人男子から採取した白血球、 な らびにプラスミ ド pGEM- 3Zを含んだ Escherichia coli K-12, JM109形質 転換体をそれそれ準備した。 表 1
歸 o.嚇 菌 名
1 BF ハ、 ィテ、、ス'フテン、、リス (Bacteroides fragilis)
2 BT
Figure imgf000010_0001
3 BV 八'、^1ロイテ、 ·フ、、 タス (Bacteroides vulgutus) 臣1¾¾¾*
4 SA ス ィ讀'纏 (Staphylococcus aureus) ATCC 25923
5 SE ス^ィ Πコ'、ノカス ·ΐ!:°τルミデイス (Staphylococcus epidermidis) ATCC 12228
6 EC ェ 'コリ (Escherichia coli) ATCC 25922
7 KP クレア、、：^ラ ':^ (Klebsiella meun iiae) WF.
8 EBC 、、、クタ-'クロ-カェ (Merobacter cloacae)
9 EF 1 ¾コ、、¾ス*ファヱカリス (Merococcus faecalis)
10 PA 、 ス' 1^リーサ (Pseudcmms aeruginosa) ATCC 27583 11 HI へ Ϊィリス'インフル ! T:i:(HaaDP ms influenzae) ¾3¾ 5»
12 HPA へ f7ィリス 'ハ。ライ WiOfaaiPp ills parainfluenzae) 臣^^
13 SP ストレフ。トコ、 ν¾ス 'ヒ°オ、ネス (Streptococcus pyogenes) 臣^
14 SAG ス卜レフ。トコ、 Streptococcus agalactiae)
15 SPN ストレフ0卜： i、v¾ス ·:ί^( Streptococcus meunmiae) NYSDH DP-2
16 HUM U937ヒト · ノミ、 Λ
删
NYSffl:New York State Department of Health( Albany, New York, USA)
そして、 各臨床菌株を実施例 1 ( 1 )に記載の方法に従って、 各菌株が保 有する DNAを抽出し、 この抽出した DNAの一定量 （例えば、 10〜 100 ng) をナイロンフィル夕一にスポットし、 アルカリ変性したものを ドット ·プロヅト ·ハイプリダイゼ一ションの試料とした。 なお、 ヒト 'ゲノミック DNA試料は、 前出の Saito- Miura変法に、 先に入手した白 血球を適用することで調製した。 一方、 対照試料は、 後述する実施例 2 (1) に記載のプラスミ ド DNAの調製方法に、 先に入手したプラスミ ド PGEM-3Zを含んだ Escherichia coli K-12, JM109形質転換体を適用す ることで調製した。 次いで、 Digoxigenin- 11- dUTP (BRL社製） でラベル したバクテロイデス · フラジリス菌由来の DNAプローブで、 マニアテ イスのマニュアル （T. Maniatis,et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual Second Edition)", Cold Spring Harbour Laboratory (1989))に従い、 45%ホルムアミ ド、 5XSS 42°Cの条件下で、 終夜ハ ィブリダイゼ一シヨンを実施した。
終夜ハイブリダィゼーシヨンを終えた試料を、 マニュアルに従い、 55 °Cにて O.lxSSC、 0.1%SDSによる 20分間の洗浄を 2回行った後に、 Anti-Dig-ALP conjugates (BRL社製) で検出 ·発色させ、 ハイブリダイセ' ーシヨンの状況を確認した。 得られた結果は図 1に示すとおりである。 図 1 (a)は、 ドット .プロッ ト .ハイプリダイゼ一シヨンを行った各フィ ルターにスポットしておいた DN Aの菌株の配置を示し、 図 1 (b)は上記 のそれぞれのプローブ BF-7、 BF- 17、 BF- 21、 BF-28, BF- 34およびプロ一 ブ BF- 35を用いてハイプリダイゼーシヨンを行ない発色させた後の結果を 示す。
各プローブと各臨床菌株の D N Aとの反応性に関する実験結果を、 下 H3¾乙 に †こ。 表 2
藤 o. 嚇 菌 名 7 17 21 28 34 35
1 BF ハ、、ク ΐϊΗΐ、、ス 'フテン、、リス + + + + +
2 ΒΤ ハ、、ク ΐϋィテ、、ス'セ才タイオタォミクロン - - - - -
3 BV ； fクテ卩イデス 'フ、、ルケ、タス - - - - -
4 SA スタフィ ϋコツカス';^レウス — ― — — ― 5 SE スタフィ ϋコツカス ·ΐヒ。 ϊ、、ルミデ、イス - - - - -
6 EC Iシエリヒア 'コリ - - - - -
7 KP
Figure imgf000012_0001
- - - - -
8 EBC 1テロ;、、、クタ -'クロ-カェ 一 — 一 一 一
9 EF ιテロコッカス'ファ — — — — 一 10 ΡΑ シユ-ドモナス 'ァ霜リ-サ - - - - -
11 HI へモフィリス 'インフル ザ、、 I — — — — 一
12 HPA へモフィリス'ハ。ラインフル iVTi - — - - ー
13 SP ストレフ。トコツカス 'ヒ°オケ、、ネス - - - - -
14 SAG ストレフ。卜コッカス 'ァカ、、 - - - - - 15 SPN ストレフ。トコッカス';^ Ώ — 一 一 一 一
16 匪 U937ヒト 'ケリミック DNA - - - - -
[H例]
+：ハイブリダイズのシグナノレを献
—：ハイプリダイス'のシグナノレを せず 上記図 1および表 2から明らかなように、 いずれのプローブもバクテ ロイデス ·フラジリス菌に由来する D N Aに対してのみ反応性を示し、 パクテロイデス属以外の菌種由来の D N Aはもちろん、 バクテロイデス 属の他の菌種由来の D N Aに対しても反応性 （ハイブリッドの形成） が 認められず、 その種特異性が確認された。
実施例 2 ：塩基配列の解析
実施例 1にて種特異性が確認された D N Aプローブ （計 6本） の塩基 配列を下記の方法に従って決定した。
( 1 ) プラスミ ド D N Aの調製
サブクローン化された （塩基配列を決定すべき） 挿入断片を PGEM-3Z (Promega)に含んだ Escherichia coli K- 12, JM109形質転換体を、 5 ml の Luria-Bactani Medium (bacto-tryptone, 10g/lL; bacto-yeast extract, 5g/lL; NaCl, 10g/lL 5 N NaOH で pH 7.0に調整) に植菌し、 一晩培養した。
培養液を遠心分離 (5, 000rpm, 5 min. ) して集菌した。 沈澱物に 2.5mg/ mlの濃度でリゾチーム（Sigma) を含む 50mM グルコース /50mM Tris-HCl (pH8.0)/10mM EDTA 溶液を 100〃1 加え、 室温で 5分間放置した。 得ら れた懸濁液に 1 %の濃度でドデシル硫酸ナトリゥム（Sigma) を含む 0.2 M水酸化ナトリゥム水溶液を加えて混合した。 5 M酢酸力リゥム水溶液 (pH4.8) 150/ 1 をさらに加えて混合し、 15分間氷冷した。
そして、 遠心分離 （15, 000rpm, 15min. )して得た上清を、 フエノ一ル /CHC13処理し、 上清に 2倍量のエタノールを加え、 さらに遠心分離 ( 125000rpm, 5 min. ) して沈澱を得た。 この沈澱物を、 lOmM Tris- HC1 (pH7.5 )/0.1mM EDTA溶液 100〃 1 に溶解し、 10mg/ml RNaseA (Sigma)溶 液を加え、 室温で 15分間放置した。
この調製物に 0.1M酢酸ナトリウム水溶液 (pH4.8) を 300〃1 加え、 フエノール/ CHC13処理し、 上清にエタノールを加えて沈澱を得た。 この 沈澱物を乾燥し、 の蒸留水に溶解したものを DN A試料とした。
(2) 塩基配列决定の前処理
塩基配列決定の前処理を AutoRead (登録商標） Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて行った。
すなわち、 銪型となる DNAが 32〃1 溶液中に 5〜10〃g の濃度にな るように調整した。 1.5mlのミニチューブ （エツペンドルフ） に、 銪型 DNA 32^1 を移し、 2 M水酸化ナトリウム水溶液を 8〃1 加えて穏やか に混合した。 そして、 軽く遠心した後、 室温で 10分間放置した。
3M酢酸ナトリウム（pH4.8) 7 jul と蒸留水 4〃1 を加え、 さらにェ 夕ノールを 加えて混合し、 エタノール ' ドライアイス上で 15分 間放置した。 そして、 15分間遠心分離して沈澱した DN Aを集め、 注意 しながら上清を除去した。 得られた沈澱物を 70%エタノールで洗浄し、 10分間遠心分離した。 そして、 注意しながら再度上清を除去し、 減圧条 件下で沈澱物を乾燥した。
沈澱物を蒸留水 10/ 1 に溶解し、 螢光性のプライマ一 〔Fluorescent Primer, Universal Primer; 5' -F luoresce in-d [CGACGTTGTAAAACGACGGCC AGT (配列番号： 7) ]- 3，（1.6pmol/〃l; 0.42 A26。 unit/ml); Reverse Primer, 5' -F luoresce in-d [ CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号： 8) ]-3， (2.1pmol/〃l; 0.42 A26。 unit/ml) 〕 2 il (0.42 A26。 unit/ml, 4〜 6pmol) とアニーリング用緩衝液 2〃1 を加え穏やかに混合した。
そして、 軽く遠心した後、 65°Cで 5分間熱処理を行い、 素早く 37°C条 件下に置き、 そこで 10分間保温した。 保温後 10分以上室温で放置し、 軽 く遠心した。
そして、 延長用緩衝液 1〃1 とジメチルスルホキシド 3 1 を加えた ものを試料とした。 4本のミニチューブに A、 C、 Gおよび Tと記入し、 それそれのチュ ーブに AMix (ddATPを dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解したも の） 、 C Mix (ddCTP を dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解した もの） 、 G Mix (ddGTP を dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶解し たもの） および T Mix(ddTTPを dATP、 dCTP、 c7dGTPおよび dTTPと共に溶 解したもの） を 2.5〃1 ずつ分注した。 なお、 それそれの溶液は使用時 までは氷中で保存し、 使用時には 37°Cで 1分間以上保温してから使用し た。
希釈した T7DNA ポリメラ一ゼ （Pharmacia; 6〜8 units/ 2〃1 ) 2〃1 を D N A試料に加え、 ピペッティングもしくは穏やかな混合により、 完 全に混合した。
混合後すぐに、 この混合液を 4.5/ 1 ずつ保温しておいた 4種の溶液に 分注した。 なお、 分注に際しては新しいチップを用いた。
37°Cで 5分間保温し、 停止溶液を 5〃1 ずつそれそれの反応液に加え た。
この分注においても、 新しいチップを用いた。 90°Cで 2〜3分間保温 し、 すぐに氷中で冷却した。 電気泳動には 1レーンあたり 4〜 6〃1 を 泳動した。
( 3 ) 塩基配列の決定
実施例 1および 2に開示した、 パクテロイデス 'フラジリス菌が保有 する D N Aに対して特異性を有するプローブそれそれの塩基配列の決定 を、 泳動温度 45° 泳動時間 6時間として、 A. L.F .DNA Sequencer シス テム（Pharmacia) を用いて行った。 各条流と下流から明らかになった配 列から順次プライマーをデザインし、 上記の操作を繰り返した。
その結果、 プローブ BF- 7 (配列番号： 1 ) 、 プローブ BF- 17 (配列番 号： 2 ) 、 プローブ BF- 21 (配列番号： 3 ) 、 プローブ BF- 28 (配列番号 ： 4) 、 プロ一プ BF- 34 (配列番号： 5 ) 、 およびプロ一ブ BF- 35 (配列番 号： 6 ) それそれの塩基配列の全容が明らかになった。
〔産業上の利用可能性〕
本発明のプローブを用いれば、 例えば、 食細胞に取り込まれた感染症 原因菌をハイブリダィゼ一シヨン法を用いて、 増殖することなく直接検 出し、 かつ菌を迅速にしかも正確に同定できる。 すなわち、 本発明のプ ローブを用いた診断では、 1回分の検体で菌の同定まで行え、 診断に要 する時間も従来法の 3〜4日 （検出される率は低い） から、 約 1〜2日 と飛躍的に短縮でき、 しかもその検出率は格段と高い。 それ故、 感染症 の治療に対して画期的な指針を与えるばかりでなく、 感染症患者に早期 の内に有効な治療が実施でき、 ひいては死亡率の低減も期待される。 また、 感染症疾患起因菌の中でも、 パクテロイデス · フラジリス菌が 保有する D N Aに特異的に反応するプロ一ブの塩基配列を明らかにした ことにより、 これらプローブを人工的に調製することを可能とした。 さ らに、 解析した塩基配列の情報の一部を利用して作製したプライマ一を 用いて、 臨床検体に含まれる感染症原因菌の D N Aを、 P C R法によつ て増幅して、 原因菌の迅速な診断に役立てることができる。
さらに、 臨床検体に含まれる Genomic D N Aの塩基配列と本発明によ つて解析された塩基配列とを比較参照することにより、 感染症起因菌種 の迅速な同定が行える。
上記したように、 本発明は、 所期の目的であった感染症診断用プロ一 ブを提供するのみならず、 P C R用プライマ一作製の指針として、 また 臨床検体に含まれる Genomic D N Aとの比較参照用に適した標準配列と して優れた有用性が期待され、 さらには感染症疾患起因菌が保有する D N Aに特異的に反応するプローブの今後の探究 ·開発における貴重な手 がかりをもたらすなどの優れた効果を奏するものである。 また、 本願出願にて開示した塩基配列は、 臨床分離株の Genomic D N Aをランダムにクロ一ニングして得られたものであり、 それ故、 本発明 の塩基配列の有用性はその相補鎖にまで及ぶものである。
さらに、 野性株が保有する D N Aに変異部分が存在することは当然考 えられるが、 上記実施例の開示から明らかなように、 当該 D N A変異部 分が、 感染症診断のためのハイプリダイゼ一シヨンへ利用する際の本発 明プローブの特異性、 あるいは本願出願にて開示した塩基配列情報を感 染症の迅速診断を目的とした P C R法のプライマ一をデザィンするため に利用できる等の、 本発明が奏する有用性には何ら影響を与えるもので はない。
配 列 表
( 1 ) 出願人名称：抉桑薬品工業株式会社
(2) 発明の名称：パクテロイデス ·フラジリス菌に起因する感染症の診
断用プローブ
(3) 書類記号： 9 8 P 0 5 6 WO
(4) 優先権のもととなった出願をした国名及び出願番号：
国 名： 日本国
出願番号：平成 9 ( 1997)年特許願第 7 1 0 7 9号
(5) 優 先 日 ：平成 9年 3月 2 5日
(6 ) 配列の数： 8 配列番号： 1
配列の長さ ： 2184
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ：バクテロイデス ' フラジリス (Bacteroides fragilis)
株名 ：臨床分離株 BF- 7
配列：
AAGCTTCTAC ACGCTTCAAT TCTTGAAACA CAAGTTCTAC CGCAAGCTGC GGATTTACTT 60 TGGGCGTGGT GTCCTTTCTC TTTCGGGGGC TGTACTGCCC CTGCTTATAG GTGTAATCCT 120 CCGTCTTTGG GTTTGAGGGT GTTTCCATAA TTCCTGCTGA TTGAGTTATA CTTCAATTTT 180 TTCTGTGTCT TCTCGATATG GGCAAGCGTA TAGCCTTTCC CTATCTCGCT TGCCTTGTAT 240 O t—
Figure imgf000019_0001
SQUV一 V3v3 3333fgv3v Ilvwi , 。
1 o
CTTATACCTT TTTGCAAGGA TTTTCGCTTC CCTCTCAAAA TGTGGGGTGG TCTTTACTTC 1860
AAAGCTCATC AAGAAATGCG TTTGCGCTCT TGGCTGGCTG CTCACCAGCT TCGATTCGTT 1920
TCACTTCATT CAAGCCCTCT CTTATTCGAG TGGCTATTTT TTCTTCTACG GACACTGGCA 1980
CCAATTTAAA ATCACCGATA CGTGAAGTCA GAAAGACGGA TTCTCCCTGA ATAGCACGAA 2040
GAAGGGTCGC TGTCTGATTC GTCCGAAATT TGCTCAATGG AATTACTTGC ATATATCTTA 2100
AACTTTTTGA TTGTGATACA AATGTAACCA TTGTCACCGA TATTGTAACC AAATTAATAT 2160
ACTTTAACAC GCAAAAAAAA GCTT 2184 配列番号： 2
配列の長さ ： 2163
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：バクテロイデス · フラジリス (Bacteroides fragil is)
株名：臨床分離株 BF-17
配列：
AAGCTTACGG CAGCGGGCGG CGCTACTCCT TTCTTCTGCA CGACTGCTTC CGGATCCGGA 60 TCGGCCGGCA CGATGTCCCT GACGGATGGC GCTTTGTCCG GACTGGCCGC GGTGGGTGAA 120 ATCTCTTTTA CCCCATCGGC CCGTCCGCAA CAGGTCGGCA CCTCGGGCCC CGTTACAGTG 180 GCCTACGGGC TGGTGGCTCC GAAGCTGAGG CGGCTTCGGG CATGCGGGTG ACGTTGACGC 240 TGACACTGGG TGAACAAAGC TCGGACGCTA CCGAACGGGA TCTTACCCTC TCGACCGATG 300 CCTTCAACCC GGCATGGCAG AAAGGATACC GCTACGTCTA TACCTTGACG CTCGGCGAAC 360 GGGGAATCAG CCTGCAACCT GTCGATATAA AAGGGTGGAC GGAAGTTTCC GAGGAGAGCA 420 GTGACGTAGA TCCCGGCTGG CAATGAAACA AATGATTCAG AATGACAAAT GATTCAGAAC 480 AATAAATGGT TCAGAATGAC AAATGGTTCA GAATGACAAA TGACAAATGA TTCAGAATGA 540
ATGATTCAGT ATGAAAACAG ATAGATTATA CCAAACGGTT TTAGGCTGCC TGCTGCTTAC 600
CGCAGTTGTT CGGACAATGC GCTGACCCCT TCGTTGCCCG AAGACCTCCG CTTACGGTGT 660
CCGCCGCGAT CTGCGCTTCC GGTGAAGGCC GGGAGTCTGA GACCCGGGCG GCCGTGGCAG 720
CCGGGACCCG TGCCGTGGCA GCCGACAACG GTTACGACCG CAGCACCTTT GCCGCAGTGA 780
CAAAATCCGT ATCATCCGCT CGCGGAACGG CTCGTCATCC ACTCCGGTGG ACTATATATT 840
GAACTCCGCT TCTTCCGGCA ACAGTACGGG CGAGTGGAAA CCTTCGGTGA CGGGTACGGA 900
GCTGCTCGTT GAATCCGGTG CCACCTACCA GGCGAGTTAC CCTATCGAAT ACTCGGGTAT 960
CCGTGCCGAC CAGCGAAAGG CGGGAGGTGA GGACTACCGC CTGAGCAATC TGCTGGAGAC 1020
TCCTGAGAAG GTGGCGATCG GCCGTGACGG AACCCTCTCC TTTACAGGCG AAAGCCCTTT 1080
GTGCACAAAG GCGTGAAGCT GACCCTGAAA TTTTCGAGAA AGCATACACT GTCCAAGGAT 1140
TTTACGAGTA TGACCGTAAC CGGGAATGGG CTTTACTCCG GAGAAGCAAG CAAGGATGAA 1200
ACCGTCTACC TGTATCACCC CGGCGGTACA GACAAAGAGC AATATACCTG GCATGGCATT 1260
ATCGCCCCGC TTACCTTCCC AACAGTCGAT ACAGGTATCG GTGACGGATG CTAACGGAGT 1320
GGTCTATGAC GTCACCCTTA TTTGCGCAAG GGCGGCGAAC AGTCACTACA CCTATACGCT 1380
CACCCTGAAA AATGATGTGC TGGTTCCCAC CGGTCAGGAG ATCAAAGAGT GGCAAAGCGG 1440
GGATTCGCAT ACAGGAACCT TAAGTTGATG TAACTTAGTT TGATGTAATA TTAGTTGATG 1500
TAATATTAGT TTGATGTAAC CCCATGAAAA AGAAAAAGAA TAGAATCCTA TCGGTATCCG 1560
GCGCGGCTCT CTGCCTGTTC TTCCCGGTTC TGCTGGCCGC CTGCTCGCAA GAGGATGCTT 1620
TGCCCCGTCC GTTGGAAGTA TCGGCGGAGG TGGGGAATCC CGCTACCCGT GCGGCGGCAG 1680
ACTCGCATGC CGATGATTAT GATAAAAGTG AATTTGTAGC GGGTGATGTC ATCCGGATTA 1740
CGGACGGCAC GAAAACTGCC GACTACCAAC GGGTGGTCAC CGGCACAACC GGCACCTGGC 1800
AACCCGCAAG CGGACAAACA GCGCTCACCA CCACCGGTAG TGAAACGTTT ACGGCTTCGT 1860
ATCTACGGCG TTCACCCGGA TTCTAACCGA TCAGCGCACA GCCACCAATT TCTGGCAAAG 1920
CAACCAGCTG ACGGCTAAAG GAGTACTCGA TGGCAATAAG GCTACGTTCT CGTTCGCTCC 1980
GGAAGCGGCG AAGGTGACCT TGGTGGTGAA GTATGGAAAT AGTGATAGTG ACAAGAAGCT 2040 TCATTATGGC CAACAACGTT CCTGTTGTTT TAGACAGAGA AGCCAAATCA TAAATATCCG 2100 TCGGCTTCAC TTTCTCGCTA TTTGCATCTG TATGGTATCC GAAGCACCGG TCATACAAAG 2160 CTT 2163 配列番号： 3
配列の長さ ： 1657
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：バクテロイデス ' フラジリス (Bacteroides fragil is)
株名：臨床分離株 BF- 21
配列：
AAGCTTATCT TATGGACCGT ACCCGAAGGA GAATTGCTTG AAGAAGCGAT TGAATGGTGC 60 CGCCAACGGG GAGTCTTTTT CTATTCTGTC AACAAGGACT ATCCGGAAGA AGAAAAGAGT 120 CATAACGGAT TCTCCCGTAA ACTGAAAGCA GACCTGTTTA TTGATGACCG GAACCTGGGA 180 GGTTTGCCTG ACTGGGGAAC CATCTACCAG ATGATCCATG AACAAAAGCC ATACGAACCT 240 GTTCTATGTG ACAGGCAGAA ACCGACCGGC GATTTAAGCT GGATAGAGAA ACTGCTCGGC 300 AAACGTAACA AATAAAGAAA GAGGTTGACA ATGAACAATC ATGTAGTAAT TATGGCCGGT 360 GGCATAGGAA GTCGATTTTG GCCCATGAGT ACACCGGAAT GTCCCAAACA ATTCATAGAT 420 ATATTGGGAT GTGGAAAAAC ACTGATTCAG CTAACTGTAG AGAGATTCGG TAATGTTTGT 480 CCACAGGAGA ACATGTGGGT GGTCACTTCG GAAAAGTATA GAGATACTAT TCGGGAGCAA 540 CTGCCGGGTA TCCCGGAAAG TAATATACTG GCAGAACCCT GTCCCAGAAA TACAGCTCCC 600 TGCATTGCGT ATGCCTGCTG GAAAATAAAA AAGAAATATC CGGAAGCCAA CATTGTCGTG 660 ACTCCTTCCG ATCAAGTGGT AATCGATACC ACTGAATTTC GCAGGGTGAT TGAGAAAGCG 720 CTTTTGTTCA CTGATAAAAG CAGTGCTATC ATCACATTGG GAATAAAACC CGCCCGTCCG 780
GAAACCGGAT ATGGATATAT CGCCGCAGGT GAACCGATAA CGAGAGACAA AGAAATATTC 840
CACGTAGAAG CATTCAAGGA AAAGCCTGAT AAAGAAACTG CTGAAAAATA TCTGGCAGCA 900
GGCAACTACT TCTGGAATGC AGGAATATTC GTTTGGAATG TGAGAACGAT CACAGCCGTA 960
ATGCGGGTAT ATGCACCGGG GATAGCTCAG ATTTTCGACC GGATATATCC CGACTTTTAT 1020
ACAGAACGCG AGGAAGAAAG TGTGAAGAAG CTATTCCCCA CTGCCGAAAG TATCTCGATA 1080
GATTATGCAG TGATGGAAAA AGCGGAAGAG ATTTATGTAT TACCTGCCCA AATGGGGTGG 1140
TCGGACTTAG GTACCTGGGG AGCATTACAC ACCTTGTTGC CAAAAGATAA AGAAGGAAAT 1200
GCAACAGTAG GACCGGATAT CCGGATGTAT GAAAGTCGAA ACTGCATGGT GCATGCCTCA 1260
CAGGAAAAAC GAGTAGTCAT ACAAGGGCTG AACGATTACA TCATAGCCGA AAAAGACAAT 1320
ATATTATTAA TATGCCAGTT ATCAGAAGAG CAACGAATTA AAGATTTCTC AAAAGAATAA 1380
ATGTTGATCC CTTTCAATAT TTATAAATCC CGGTTATAAT ACCGGGTGTA GGGGCGTCCC 1440
GATGCGAATC GTGACTGCTT TTATTTGTTT TGTTTGTGTG TGTTCCTCCG GCCAGGCGTG 1500
GTCGGAGGAA CATTTTTTTA TGCCCGTATT CTACAACTTG TGATTCAAGA TCCAATCCGA 1560
AAATTTCTTT AAAGACTATC TCGTCCAAGT CACCAATCTC AACCTTAAAA TGAAAGATTC 1620
ATACCAAATG TTTCAACGAT AAAGTATAAA AAAGCTT 1657 配列番号： 4
配列の長さ ： 2079
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic MA
起源
生物名：バクテロイデス ' フラジリス (Bacteroides fragilis)
株名：臨床分離株 BF- 28
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麵3。 ,。 ij,- 33333vEVVE 1 i TATTGTGAAG CTACACTTGA ATTATTAACG ATATAAATAT TCCTCATATC GAAGATTGAT 1560
CCCAAATTAT TTTTAATCCT TTTTTCCAAG ACAAATTATT ATCGCCATCA CTCCCTCTTA 1620
TGATCTCTGC CTGTATCTGT TGTATAGAAT AATTCACAGG ACAAGCTACA CATAATGCTT 1680
GAAGAAAAGC CGTATCAAAA AACGACTCTC TACCTATATC CAGTACTAAA CGAATACGTA 1740
TATATGAAGC TATACCAAGC AAGCCTGTTT CCAGAGAATG ATTATTCATT TTTTAAAAGA 1800 TTGTATTCCA ACAGCTTATT ATCAAGAGAT TTTAAAACGT CATCCACATT TCCATCTACA ' 1860
AATTTTTGCT GAAACAGATA TACTATTCCC CACCCAATGC CACATAAGCC ATCCGCAAAG 1920
TAAATCGGTA TATCTTCATG AACATCTTCA AAAACCTCAT CCAATAATTC ACCAGCAAAT 1980
TCCTCATATA AAGGGTTTTG TATATAACGG CTATAATGAA AGAAAAACAA GACAAGTCCC 2040
ATCTTGCCAT TAAAAAGTCC CAAACTTGGA AGGAAGCTT 2079 配列番号： 5
配列の長さ： 1847
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：バクテロイデス ' フラジリス (Bacteroides fragilis)
株名：臨床分離株 BF-34
配列：
AAGCTTATAA AGAAGATTAT ATCCAACGAT TATTCGTCTT TAAAATTATG GATTGGAGCT 60 GATGAATTCA AGGAATTGCT TTATCTGAAT CAGGAAGGCG GTTCAGAGGG CACTACAGAA 120 GTCTATGATT ATGATGGTAA CTATCAAGGA AATATTGCTG AATTGTATAA TATGCCATAT 180 CATTCTCAAT ATGTACATCG ACTGAATGAA AAATTCCTGG CTGCTTTTTC ACCATGGTGT 240 ATGCCATTGA CTGATAAGAA TTATTTTGGC GGAGCCGTAT TTTCAGAAAA GGGGGAAATG 300 o o o o o o o o o o o o o Cr-
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O CO CO O
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VI 配列番号： 6
配列の長さ ： 1673
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状 一 配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：バクテロイデス ' フラジリス (Bacteroides fragil is)
株名：臨床分離株 BF-35
配列：
AAGCTTTTCA TTATACCCCC CCAAGAAGGA AAGAAGGTCT TCATACCACC CAGATCATCT 60 ATAATCTGTT TCACCGCAAA TGTCTCACCC GTACGTTTAT TGTAAATGGC TGTTAATAGA 120 GGAGGCTTAG GCAGTTTACG CAGCTCCCAG TATGCCATAT ATTCATAGAC AGATAAAAAA 180 ACAAAACGCT CTGTTTCAAA AACACCGGAT ACTATATATT TGTGATCCAG CATTTTAATC 240 ATTTTTGCAT TTTCCAAGTT GCCCGATTCC CAACATTTAA AAGCATCAGA AAATAATCCA 300 TCTTCATATA GATACTGGGT AGGAAACCGT AATTCTTCAT CCAACTCCAC CACCCAGCGA 360 GGTACCAGGG AAGTGGGGGT AACAGTAAAA ACTGTATCCG TATAAAAATT ATAAAATAAG 420 GTCGTATCTT TATAGTAGCT CGTATACTTC ACACTCCCCA TGGACGGAGC GATCCCTTTC 480 CTGTTCCACG GCATCATACT GCGTTTGGCT ACAAACTCGT AATCCGTATT TATGAAATAA 540 ACCGTATCCG GAGAATTATA AAACATCAGG TTTTCTCCTG CCGGAGCAAA GCAGACCTGA 600 TTGACCAAAT GTCCAACCGG TGCAGTGTCC ATTGTTTTCT GGGTAAACCA GCTTAGCTCT 660 TTCCCCGTAC ACTTCCCCCG GTCATCATAT TCTATTATTT TAGAGGCATT CCCATAGAAA 720 TGATTATTCA AATATACTAT TTCGGCCACA TGCGCATAGA TATCTTCACA AGCCCCTTGA 780 CCCTGGCTCC CAATACGGAA CAAGAACTGC CCATTCCAAT CAAAACAATA GTTTAAGTAA 840 AATATGTATT GGGGAGAAAA GGTCAAACGC TGATAATTAC CTAACATACA ATTCGGATTC 900 2 β
GTTTCCAAAG GAATATAACT GACACTATCC ACCAGCTCCG AAAGCATCAT TTCCTCCCGA 960
ACATTCTTTA TCGCAGTTGA CAAATGAATA ATATTATCCC GAACAACAGG ATTAGGATCC 1020
ACTGTTTTTT TGTTACTACA AGCCGTGAAG CCCAATACCA TAACACCCAG TATCAATATC 1080
ATTCGCATAA AAAATTCCAT ATCCACCTAT TCTTTAAATT AGCAATTACA AGAACCGGAT 1140
TTTGCTCCTC ATCCAGTGAA TCGGTAAGCA TAACCAAACG CTCACTCACA ATTCCTCCCT 1200
TTTCTTTCTT CTCTTGAATA TATTCCTTCA ACTCAAACGG CCAAACCGAA GAAAAAAAAC 1260
TTTAGATTCA AAATAATAAT TCTTCTATTT TAAAGTTGCA ATCATCAAAA TCGGATTGCT 1320
ATCCTCAGTC GCACTTTCCA AAACTCGGAT TAGCTCCTTT TTCTTGGACT CATCTATTAC 1380
GGTAGATGAT TTTATTTGGT CGATATCAAT CCAGTTCTCA TCACCGCCGG GTTCTAATAT 1440
ATCTACCCAG TATTTACCGG AAGAACGGCT GTCAACAGTA AAATCACCTC CACCTAAATC 1500
ATTATCTAAC ACAAAATCAC GTTTCATTTG GCGCAAAGGA AAGCTAAACC AGGGGACATC 1560
ACGCTCGGTT ATTGCACTTT GTCGCTTCTG CAGTCTAACA TTTCCATCTT TTTTATTATA 1620
GCAATAGGTA TATACCTCCT CGCCTTTACT ACCCACCAAA TAAATGAAAG CTT 1673 配列番号： 7
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGT 24 配列番号： 8
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列：
CAGGAAACAG CTATGAC 17

Claims

O 請 求 の 範 囲
1 . 感染症疾患起因菌であるパクテロイデス · フラジリス
(Bacteroides fragjlis) 菌が保有する D N Aを制限酵素 Hindi 11で処 理して得ることができる D N A断片を含み、 およびパクテロイデス · フ ラジリス菌が保有する D N Aと特異的にハイプリッド形成することを特 徴とする感染
症診断用プローブ。
2 . 前記感染症診断用プローブが、 配列番号 1乃至 6に記載の少なく とも一つの塩基配列を含む請求項 1に記載の感染症診断用プローブ。
PCT/JP1998/001287 1997-03-25 1998-03-23 SONDES POUR LE DIAGNOSTIC D'INFECTIONS DUES AU $i(BACTEROIDES FRAGILIS) WO1998042844A1 (fr)

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DATABASE MPSRCH GENBANK 1 January 1900 (1900-01-01), NOVICKI T J, HECHT D W: "BACTEROIDES FRAGILIS MOBILIZATION PROTEIN MBPA (MBPA), MBPB (MBPB) AND MBPC (MBPC) GENES COMPLETE CDS.", XP002914697, Database accession no. U25716 *

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