WO1998003681A1 - PROBES FOR DETECTING AND IDENTIFYING $i(HELICOBACTER PYLORI) - Google Patents

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WO1998003681A1
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dna
helicobacter pylori
probe
probes
pylori
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PCT/JP1997/002552
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English (en)
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Hiroyuki Keshi
Soji Eda
Hirotsugu Uehara
Keigo Nishida
Akio Matsuhisa
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Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a probe useful for detecting and identifying Helicobacter pylori, which is a causative bacterium of gastrointestinal diseases such as gastritis, gastric ulcer and duodenal ulcer.
  • Helicobacter pylori is frequently isolated and detected from the gastric mucosa of patients with gastritis and gastric ulcer (e.g., 50-80% of cases of chronic gastritis, superficial gastritis, atrophic gastritis, erosive gastritis, etc.). It has also been reported that the rate of gastrointestinal tract disease was detected at the same time.) Was suggested.
  • Helicobacter pylori does not penetrate into mucosal cells, but colonizes epithelial mucosal surfaces and intercellular spaces and proliferates.
  • PAS Periodic Acid-
  • the thinning of the reaction-positive layer reduces the effect of mucins that protect the mucous membranes and reduces the protective factors of the gastric mucosa (Takeshi Ito, V Helicobacter ylori Findings: Medical Technology, 19 (10), pp.892-893 (September 1991)).
  • Helicobacter pylori lives in contact with the gastric mucosal epithelium, and ammonia produced by the degradation of urea in the stomach by the urease possessed by the helicobacter pylori. Have been reported to cause gastric mucosal damage, reverse diffusion of hydrogen ions, and eventually tumor formation (Tsujii, M. et al., "Mechanism of gastric mucosa 1 damage Induced by ammonia, Gastroenterology 107: pp. 1881-1888 (1992)).
  • the method of detecting Helicobacter pylori from microaerobic culture of biopsy material of gastric mucosa is the most accurate and reliable method.
  • this method usually requires about one week as a culture time for the growth of the bacterium, so that it takes a long time to obtain test results.
  • the present invention relates to a technique for detecting Helicobacter pylori bacteria more easily, more specifically, and efficiently without introducing a medical device such as an endoscope into a patient. It was completed with the aim of establishing it.
  • the gist is that the DNA or RNA possessed by Helicobacter pylori, which is the causative / causative bacterium of gastrointestinal diseases such as gastritis, gastric ulcer, and duodenal ulcer, is specific.
  • the purpose of the present invention is to elucidate the nucleotide sequence of a probe having reactivity and a gene portion essentially contained in Helicobacter pylori contained in the probe.
  • the DNA maintained in the detection target Helicobacter pylori can be significantly detected based on the specificity between the probe of the present invention and the DNA, whereby the Helicobacter pylori can be detected.
  • Helicobacter pylori can be quickly and reliably detected and identified without culturing and growing the bacteria.
  • primers are designed based on the nucleotide sequence information of these probes, the presence or absence of DNA amplification by PCR can be detected and confirmed, so that the hybridization can be performed without performing hybridization.
  • Kopaku Yuichi H. pylori can be identified.
  • a non-radioactive probe such as a biotinylated probe
  • the identification and detection of bacteria can be performed quickly and easily.
  • FIG. 1 is a diagram showing the correspondence between the position of the gel and the test sample (prototype strain DNA).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of a dot hybridization reaction showing the reactivity of the probe of the present invention with DNA derived from various strains.
  • Example 1 Helicobacter—DNA probe from Vibrio parasite
  • the cells were collected, and the collected cells were subjected to a nucleic acid isolation method using Proteinase K (manufactured by Merck)-0.1.% SDS.
  • the genomic DNA was extracted by applying a modified method of the method (“PreparaUon of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment, Biochem. Biophys. Acta vol. 72, pp. 619-629 (1963)).
  • the DNA is completely digested with the restriction enzyme Hindlli and randomized to vector pGEM-3Z (promega). It was grayed.
  • probes containing DNA fragments that specifically react with Helicobacter pylori were selected from the obtained clones, and the obtained probes were used as probes HP-32, HP-34, and probe HP-34. They were named HP-49, probe HP-55 (down), probe HP-55 (up), probe HP-60, probe HP-64, and probe HP-66, respectively.
  • the human genomic DNA in Table 2 refers to human and genomic DNA derived from leukocytes collected from one healthy adult male (30 years old), and a control sample.
  • Escherichia coli K-12 and JM109 strains containing plasmid pGEM-3Z (manufactured by Seikagaku Corporation) were prepared.
  • Table 2
  • TIMM Teikyo University Medical Mycology Research Center Tokyo, Japan
  • Bacteria belonging to the genus Helicobacter in Table 2 were prepared according to the method described in Example 1 (1), and other bacteria were prepared using various lytic enzymes [Lizostafin (Sigma). ), Lysozyme (manufactured by Sigma), and acetilmuramidase SG (manufactured by Seikagaku Kogyo)] according to the Saito-Miura method (tij hb).
  • a fixed amount of the extracted DNA for example, 0.1 g / 51
  • Nylon filter Pall Dyne
  • the human genomic DNA sample was prepared by applying the previously obtained leukocytes to the Saito-Miura method (described above).
  • control sample was prepared by using the plasmid pGEM-3Z (promega) previously used for the cloning of the probe according to the method for preparing plasmid DNA described in Example 2 (1) described later. It was prepared by applying to Escherichia coli K-12, JM109 strain.
  • the sample was washed twice with 0.1 X SSC and 0.1% SDS at 55 ° C for 20 minutes, and then the Anti-Dig-ALP conjugates (Belinger. (Manufactured by Inheim Co., Ltd.), and color was confirmed to confirm the specificity of hybridization.
  • Figure 2 shows the results of experiments on the reactivity of each probe with the DNA of each clinical strain. Further, c shows the correspondence between the position and the test sample Ueru (pro Tsu Te I ing the strains DNA) in FIG. 1 Sunawa The position numbers of the cells in the schematic diagram of the microplate shown in FIG. 1 correspond to the numbers of the samples (strains) listed in Table 2.
  • the nucleotide sequence of the DNA probes (total of 8) whose species specificity was confirmed in Example 1 was determined according to the following method.
  • Escherichia coli K-12, JM109 strain containing pGEM-3Z (Promega) incorporating the subcloned insert (to be sequenced) should be added to 5 ml Luria-Bactani Medium ( bacto-tryptone, lOg / lL; bacto-yeast extract, 5 g / lL; NaCl, lOg / lL; adjusted to pH 7.0 with 5N NaOH) and cultured overnight.
  • 5 ml Luria-Bactani Medium bacto-tryptone, lOg / lL; bacto-yeast extract, 5 g / lL; NaCl, lOg / lL; adjusted to pH 7.0 with 5N NaOH
  • the culture was collected by centrifugation (5,000 rpm, 5 minutes). Then, 100 1 of a 50 mM glucose / 25 mM Tris-HCl ( ⁇ 8.0) / 10 ⁇ EDTA solution containing 2.5 mg / ml lysozyme (manufactured by Sigma) was added to the precipitate, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. . To the obtained suspension, a 0.2 M sodium hydroxide aqueous solution containing 1% sodium dodecyl sulfate (manufactured by Sigma) was added and mixed. Then, a 5 M aqueous solution of potassium acetate ( ⁇ 4.8: '150/1) was further added and mixed, followed by cooling on ice for 15 minutes.
  • 0.1M acetate Na Application Benefits um aqueous ( ⁇ 4.8) 300 ⁇ 1 was added to this preparation, the the et, of this solution an equivalent amount, of water and Hue node on Torque throat Hol arm (CHC1 3)
  • ethanol was added to the obtained supernatant in an amount twice (volume ratio) of that of the supernatant to obtain a precipitate.
  • the precipitate was dried and dissolved in 10 ⁇ 1 distilled water to obtain a DNA sample.
  • the type II DNA was adjusted to a concentration of 5 to 10 g in the 321 solution. Then, 32 1 of the type II DNA solution was transferred to a 1.5 ml minitube (Eppendorf), and 81 of a 2 M aqueous sodium hydroxide solution was added thereto and mixed gently. After light centrifugation, the mixture was left at room temperature for 10 minutes.
  • the precipitate was dissolved in distilled water 10 zl, Fluorescent primers one [Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; -Fluorescein -d [CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT ( SEQ ID NO: 1) bets 3 '(1.6pmol / u 1; 0.42 A 2 6 o unit / ml); M13 Reverse Primer, D-Fluorescein- d [CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 2)]-3 '(2.lpmol / u 1; 0.42 ⁇ 26 ⁇ unit / ml)] 2 u 1 (0.42 A 26. unit / ml, 4-6 pmol) and a buffering solution 21 were added and mixed gently.
  • the mixture was heat-treated at 65 ° C for 5 minutes, quickly placed at 37 ° C, and kept there for 10 minutes. After the incubation, the mixture was allowed to stand at room temperature for at least 10 minutes, and then briefly centrifuged.
  • AMix ddATP dissolved with dATP, dCTP, dGTP, and dTTP
  • C Mix ddCTP to dATP, dCTP, dGTP and dTTP
  • G Mix ddGTP dissolved with dATP, dCTP, dGTP and dTTP
  • T Mix ddTTP dissolved with dATP, dCTP, dGTP and dTTP
  • Dilute T7 DNA polymerase (Pharmacia; 6-8 units / 2 u ⁇ ) Add 2 u ⁇ to each DNA sample and mix thoroughly by pitting or gentle mixing. Mixed. Immediately after mixing, the mixed solution was dispensed at a ratio of 4.5 / 1 to each of four separately kept Mix solutions. A new tip was used for dispensing.
  • the base sequence of each probe having specificity for the DNA possessed by the Helicobacter pylori described in Example 1 was determined at an electrophoresis temperature of 45 ° C and an electrophoresis time of 6 hours. It was determined using a stem (manufactured by Pharmacia).
  • probe HP-32 SEQ ID NO: 3
  • probe HP-34 SEQ ID NO: 4
  • probe HP-49 SEQ ID NO: 5
  • probe HP-55 down
  • probe HP-55 The nucleotide sequences of (up) (SEQ ID NO: 7), probe HP-60 (SEQ ID NO: 8), probe HP-64 (SEQ ID NO: 9), and probe SP-66 (SEQ ID NO: 10) were revealed.
  • the probe of the present invention can be used quickly and accurately directly without the use of medical instruments such as endoscopes, and without the growth and culture of Helicobacter pylori. Can be detected and identified. That is, in the diagnosis using the probe of the present invention, not only the detection rate is dramatically improved, but also the time required for the diagnosis can be shortened to about 1 to 2 days since the bacteria can be identified in one sample. Therefore, an effective treatment policy can be presented at an early stage, and treatment can be performed immediately.
  • these probes can be artificially prepared by clarifying the nucleotide sequence of the DNA-specific probes possessed by Helicobacter pylori, which are deeply related to human digestive diseases.
  • the DNA of the causative bacterium contained in the clinical sample can be amplified by the PCR method.
  • Helicopter Piroli Bacteria can be quickly identified and used for diagnosis.
  • the present invention not only is it possible to provide a probe specific to the desired Helicobacter pylori but also as a guideline for preparing a primer for PCR, It is expected to have excellent usefulness as a standard sequence suitable for narrowing down the reference to the genomic DNA contained in the DNA.
  • the DNA-specific probe of Helicobacter pylori the causative agent of digestive tract diseases, has excellent effects, such as providing valuable clues for future research and development. It plays.
  • the nucleotide sequence disclosed in the present invention was obtained by randomly cloning genomic DNA of a clinical isolate, and therefore, the usefulness of the nucleotide sequence of the present invention. Extends to its phase capture.
  • the mutated portion of these DNAs may be used to determine the specificity of the probe of the present invention or its use in clinical practice (for example, the use of a primer for PCR for design). It does not have any effect on the usefulness of the system.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acids (synthetic DNA)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylori
  • TTTCATCTAG CATGCTTTCT TCAATCCTTG TGCCTATCAA ATCGGCATGG TGCTTTTTAA 900
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylor i
  • AAAGAAAAGA AAAAATTCCC CACTTTCAAA GGAGGGGTTT TAATGCGTTG GTGGTGTGTT 600
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylori (Helicobacter py loi 'i)
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylor i
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylor i
  • ACGCCTTCTT CATTTTCTGG CAAGACATTT TGTTTAAAAA AAAACTCGCT CCTAGCCCTT 1860
  • AACTATGTAA CHAACTATA GTATAATCTA GGGGCGTTGC TTATATTTTT TAGGTATTTT 2040
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylori
  • CTCCAAGTTT TGCGTTTGCT GGGGTTACTT ACCCGCAAAA TAACATGGAA ATTTHGGGA 480
  • AAAAGACATC GTAACGCAGC AAAAAATCGC CCCTTGTAGA TGAAGACAAT TCCTTTCTTT 840
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Helicobacter pylori (Hel i cobacter pylor i)

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Description

明 細 書 ヘリ ク タ一 ピロ リ 菌の
検出および同定のためのプローブ
〔技術分野〕
本発明は、 胃炎、 胃潰瘍および十二指腸潰瘍などの消化器系疾 患の起炎菌である、 へリ コパク ター ピロ り (Hel icobacter pylori) 菌の検出および同定に有用なプローブに関する。
〔技術背景〕
ク タ一 ピロ 〔旧名 ： カ ンピ ク タ一 ピロ (Campylobacter pylori) 〕 菌のヒ 卜の胃粘膜での存在が、
Warrenらによって報告されて以来 （Wai'ren J. R. et al. ,
'Unidentified curved bacilli on gastric epithel ium in active chronic gastritis", Lancet 1： 1273-1275 (1983))、 そ の生化学的性質、 特に、 胃 · 十二指腸潰瘍などの消化器系疾患と ヘリ コバク タ一 ピロ リ 菌との関連について数々の研究が進めら れている。
へリ コパクター ピロ リ 菌は、 胃炎や胃潰瘍患者の胃粘膜から 高頻度に分離 · 検出され 〔例えば、 慢性胃炎、 表層性胃炎、 萎縮 性胃炎、 糜爛性胃炎などの症例では、 50〜80%の率で検出された との報告もある〕 、 また、 薬剤投与によって除菌処置するこ とで 消化器系疾患の症状が改善するこ とから、 ヘリ コバク タ一 ピロ リ菌と消化器系疾患との関連性が示唆されていた。
ヘリ コバクタ一 ピロ リ菌は、 粘膜細胞内へ侵入する性質は無 く 、 上皮粘膜面や細胞間隙に定着して、 増殖する。 また、 ヘリ コパク ター ピロ リ菌の増殖による胃粘膜の PAS (Periodic Acid- Sciff)反応陽性層のひ薄化によ り、 粘膜を保護しているムチ ンの 効果が低下し、 胃粘膜の防御因子が減退すると考えられている (伊藤武、 V Hel icobacter ylori に関する最近の知見.： 、 Medical Technology, 19 (10), pp.892-893 (1991年 9 月））。
そ して、 へリ コパク ター ピロ リ菌が、 胃粘膜上皮に接して生 息し、 胃内の尿素がへ リ コパク ター ピロ リ菌の保有するゥ レア ーゼによって分解されて生成したア ンモニアによって、 胃粘膜障 害や、 水素イオ ンの逆拡散などを発生せしめ、 ひいては腫瘍の形 成に至るとの作用機序も報告されている （Tsuj i i, M. et al. , "Mechanism of gastric mucosa 1 damage Induced by ammonia , Gastroenterology 107： pp. 1881-1888 (1992))。
ヒ 卜の消化器系疾患との関連が指摘されているヘリ コバク 夕一 ピロ リ菌の診断方法と しては、 一般に ；
(1) 粘膜局所におけるヘリ コバク タ一 ピロ リ菌の直接的な存在 証明 〔塗抹法、 組織鏡検法、 培養法〕 、
(2) ウ レァ一ゼ活性などのへリ コバク ター ピロ リ菌の特性を利 用 した検出方法、 および
(3) 血清免疫診断法がある （白井孝之、 他、 Campylobacter pyloriの存在診断」 、 最新医学、 44 (2)、 284-288 (1989)) 。
この内、 胃粘膜の生検材料の微好気培養からへリ コバク 夕一 ピロ リ菌を検出する方法 （培養法） 力 最も精度が高く 、 確実な 方法である。 しかし、 この方法では、 菌の増殖のための培養時 間と して、 通常、 約 1 週間の時間を必要とするため、 検査結果を 得るまでに長時間を要するこ とになる。
また、 へリ コパク ター ピロ リ菌のゥ レアーゼ産生能力に鑑み 胃生検材料から直接ゥ レアーゼを検出する方法なども利用されて いる （伊藤武、 「特殊な細菌感染症の診断法/ 4. Campyiobacter pylorij 、 臨床医、 15 (増刊号） 、 pp.367-369 (1989)): しか し、 これら方法はいずれも内視鏡検査による生検材料を対象と し た検査法であり、 検査の実施にあたっては、 施術者の熟練を要す るのみならず、 患者に少なからずの苦痛を強いる ものであった c さ らに、 ヘリ コバク ター ピロ リ 菌によ って胃内の尿素が、 ァ ンモニァと H C02 に分解されるこ とに着目 し、 この 1 4 C02 をシ ン チ レーシ ヨ ンカウ ンタ一で測定する診断法もある。 と ころが、 この方法によっても、 放射性同位元素の取扱いという繁雑で熟練 を要する検査処置を経なければな らないと いう問題点がある。 〔発明の開示〕
本発明は上記した技術背景に鑑みて、 へリ コパク ター ピロ リ 菌を、 内視鏡などの医療器具を患者体内に導入せずに、 より簡便 に、 より特異的かつ効率良く 検出できる技術の確立を目指して完 成されたものである。
そ して、 その要旨とすると ころは、 胃炎、 胃潰瘍、 十二指腸潰 瘍などの消化器系疾患の起炎菌 /原因菌であるヘリ コパク ター ピ口 リ菌が保有する D N Aまたは R N Aと特異的な反応性を有す るプローブと、 このプローブに含まれるへリ コパク ター ピロ リ 菌が本質的に保有している遺伝子部分の塩基配列を解明する こと にある。
すなわち、 検出対象であるヘリ コパク ター ピロ リ菌において 維持されている D N Aを、 本発明のプローブとその D N Aとの間 の特異性に基づいて有為に検出でき、 これにより、 ヘリ コバク タ 一 ピロ リ 菌を培養 · 増殖せずに、 迅速かつ確実にへリ コバク タ 一 ピロ リ菌を検出 . 同定できるのである。
また、 これらプローブの塩基配列情報に基づいてプライマ ーを デザィ ンすれば、 P C R法による D N Aの增幅の有無を検出 · 確 認する こ とで、 ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ンをせずと も、 へリ コパク 夕一 ピロ リ 菌を同定できる。
さ らに、 ハイ プリ ダイゼ一シ ョ ンに用いるプロ一ブを非放射性 のもの、 例えば、 ピオチン化したプローブとすることで、 放射性 同位元素使用施設のない一般検査室でも菌の検出ができ、 それに よ り、 菌の同定検出作業が迅速、 簡便に行えるのである。
〔図面の簡単な説明〕
第 1 図は、 ゥ ルの位置と被験試料 （プロ ッ ティ ングされた菌 株 D N A ) との対応関係を示す図である。
第 2 図は、 本発明のプローブと各種菌株由来の D N Aとの反応 性を示す ドッ 卜ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンの結果を示す図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下に、 本発明のへリ コバク ター ピロ リ 菌に由来するプロ一 ブの実施例を示すが、 これら実施例の開示によって、 本願発明が 限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
実施例 1 ： へリ コパク ター—ピ口 リ菌由来の D N Aプローブ
(1) ヘリ コバク タ ピロ リ菌由来 D N Aプローブの調製
まず、 下記表 1 に記載の組成を有するスキロ (Ski r row) 培地 を調製した。 表 1 ブルセラ ブロス （ディ フコ社製）
(B 1 uce 11 a broth： D i f co Co. , ) 14 g 蒸 溜 水 500ml ポ リ ミ キシ ン B 1250単位 ノく ン コマイ シ ン 5 mg ト リぺ トプリ ム 2.5mg ゥマ血清 （ディ フコ社製） 50ml 寒 天 5 g 次に、 臨床分離されたへリ コパク ター ピロ リ 菌を、 ブルセラ 寒天培地 （ディ フコ社製） および前記スキロー培地にて、 微好気 的条件 〔 2 %水素、 5 %酸素、 7 %二酸化炭素、 86%窒素 （いず れも体積 の混合ガス ； 相対湿度 90%〕 下で、 37°Cで、 5 日間 培養して、 へリ コパクター ピロ り菌を分離および増殖した。 培養終了後に、 培養菌体を集菌した。 そ して、 集めた菌体に 対して、 プロティナーゼ K (メ ルク社製） - 0.1.%SDS を用いた、 核酸の単離法を利用する Sa 0- Miui-a法 （"PreparaUon of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment , Biochem. Biophys. Acta vol. 72, pp.619-629 (1963))の変法を 適用 して、 そのゲノ ミ ッ ク D N Aを抽出した。 抽出 した D N A を、 制限酵素 Hindlliで完全消化し、 ベク ター pGEM - 3Z (プロメ ガ 製） にラ ンダムク ローニングした。
得られたク ローンからへリ コパク ターピロ リ 菌と特異的に反応 する D N A断片を含む 8種のプローブを選抜し、 得られた各プロ —ブを、 プローブ HP- 32 、 プローブ HP- 34 、 プローブ HP- 49 、 プ ローブ HP- 55(down) 、 プローブ HP-55 (up), プローブ HP- 60 、 プ ローブ HP- 64 、 およびプローブ HP- 66 とそれぞれ命名した。
(2) ヘリ コバク タ一 ピロ リ菌由来 D N Aプローブ
の細菌種特異性の検討
実施例 1 (1) にて選抜した各プローブと各種感染症原因菌株の D N Aとの反応性を、 以下の方法により検討した。
まず、 検討対象菌株と して、 下記表 2 に列挙した臨床単離株お よび寄託菌株を準備した。 なお、 表 2 中の、 ヒ 卜 · ゲノ ミ ッ ク D N Aとは 1 名の健康な成人男子 （30才） から採取した白血球由 来のヒ 卜 ， ゲノ ミ ッ ク D N Aを、 そ して対照試料と してプラス ミ ド pGEM- 3Z (生化学工業製） を含んだ Escherichia col i K- 12， JM 109 株をそれぞれ準備した。 表 2 二
細菌 No. 細 菌 名 出所 · 由来
1 Helicobacter pylori ATCC 43629
2 Helicobacter pylori 臨床分離株
3 Helicobacter c i nead i ATCC 35683
4 Helicobacter f enne 11 i ae ATCC 35684
5 He 1 i cobacter muste lae ATCC 43772
6 Campylobacter jejuni CIP 702
7 Campylobacter coli CIP 7080
8 Campylobacter fetus CIP 5396
9 Streptococcus aureus ATCC 25923
10 Streptococcus epidermidis 臨床分離株
11 Escher i ch i a coli ATCC 25922
12 Klebsiella pneumoniae 臨床分離株
13 Streptococcus pneumoniae NYSDH DP - 2
14 Pseudomonas aeruginosa 臨床分離株
15 Enterobacter cloacae 臨床分離株
16 Haeraoph i 1 i s i nf 1 uenzae 臨床分離株
Λ Τ
Figure imgf000008_0001
！ Cand i da a 1 b i cans A 1 Γ
しし 4 Λ801 O A
丄 d(J
18 Aspergillus f umigatus TIMM 0063
19 Cry tococcus neof orraans TIMM 0354
20 Mucor sp inosus TIMM 1322
21 Absidia corymb i f era TIMM 2435
22 ヒ 卜 · ゲノ ミ ッ ク DNA
24 対照 (Escherichia col i K- 12， JM109(pGEM-3Z)) 凡例 ： ATCC ァ メ リ カ典型標準保存施設 （American Type
Culture Col lection;メ リ ー ラ ン ド州、 米国）
NYSDH ニューヨーク州保健局 （New York State
Department of Hea 1 th； ァ 1レ ノ ' 二 — 、 ニ ュ ー ヨーク州、 米国）
CIP パス ツール研究所保存施設（Col lection of the Institute Pasteur； ノ" リ 、 フ ラ ン ス )
TIMM 帝京大学医真菌研究セ ン タ ー （東京、 日本） そ して、 表 2 中のへリ コバク タ一属に属する細菌は実施例 1 (1) に記載の方法、 また、 その他の細菌については、 各種溶菌酵素 〔 リ ゾス タ フ ィ ン （シ グマ製） 、 リ ゾチーム （ シ グマ製） 、 ァセ チルムラ ミ ダ一ゼ SG (生化学工業製） 〕 を用いた Saito-Miura 法 (tij hb) に従って、 各菌株が保有する染色体 D N Aを抽出した。 抽出した D N Aの一定量 （例えば、 0.1 g/ 5 1)をナ イ ロ ン フ ィ ル夕 （ポールダイ ン製） にスポッ ト し、 アルカ リ変性した も のを ドッ ト ブロ ッ ト ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ンの試料と した。
なお、 ヒ ト ゲノ ミ ッ ク D N A試料は、 先に入手した白血球を Saito- Miura 法 (前出） に適用することで調製した。
一方、 対照試料は、 後述する実施例 2 (1) に記載のプラ ス ミ ド D N Aの調製方法を、 先にプローブのクローニングのために用い たプラス ミ ド pGEM- 3Z (プロメ ガ社製） を含んだ、 Escherichia coli K-12, JM109株に適用するこ とで調製した。
次いで、 各試料に対して、 Digoxigenin- 11- dUTP (ベ— リ ンガー ' マンハイム社製） でラベルしたへリ コバク タ一 ピロ リ菌由来 の D N Aプローブを、 マニアテイ スのマニュ アル （T. Maniatis, et a 1. , Molecular Cloning (A Laboratory Manual)' , Cold Spring Harbour Laboratory (1982)) に従い、 45%ホルムア ミ ド (メ ルク社製） 、 5 X SSC 、 42ての条件下で、 終夜ハイ ブリ ダィ ゼ一 シ ヨ ンを実施した。
終夜ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ンを終えた試料を、 55°Cにて、 0.1 X SSC 、 0.1% SDSによる 20分間の洗浄を 2回行った後に、 Anti- Dig- ALP conjugates (ベ一 リ ンガー . マ ンハイ ム社製） で検出 ' 発色させ、 ハイプリ ダイゼーシ ョ ンに関する特異性を確認した。
各プロ一ブと各臨床菌株の D N Aとの反応性に関する実験結果 を図 2 に示した。 また、 ゥエルの位置と被検試料 （プロ ッ テ ィ ングされた菌株 D N A ) との対応関係を図 1 に示した c すなわ ち、 図 1 に示したゥ ヱルプレー 卜の模式図に付したゥ ヱ ルの位置 番号は、 表 2 に列挙した試料 （菌株） に付した番号と符合する関 係にある。
図 2 の反応結果から明らかなように、 試験したいずれのプ口一 ブもへリ コバク ター ピロ リ菌 （細菌 Nos. 1 および 2 ) に由来す る D N Aに対してのみ反応性を示し、 ヘ リ コバク ター属に属さな ぃ菌種に由来する D N Aはもちろん、 ヘリ コバク タ一 ピロ リ 菌 以外のへリ コバク タ一属に属する他の菌種由来の D N Aに対して も反応性 （ハイ ブリ ツ ドの形成） が認められず、 本願発明のプロ -ブによる種特異性が確認された。 実施例 2 ： 塩基配列の解析
実施例 1 にて種特異性が確認された D N Aプローブ （計 8本） の塩基配列を、 下記の方法に従って決定した。
(1) プラ ス ミ ド D N Aの調製
サブク ロー ンされた （塩基配列を決定すべき） 挿入断片を取り 入れた pGEM- 3Z (プロメ ガ社製） を含む Escherichia col i K- 12, JM109 株を、 5 mlの Lur ia-Bactani Medium (bacto-tryptone, lOg/lL; bacto-yeast extract, 5g/lL; NaCl, lOg/lL; 5 N NaOH で pH 7.0に調整） に植菌し、 一晩培養した。
培養液を、 遠心分離（5，000rpm, 5分） して集菌した。 そ して、 沈澱物に、 2.5mg/mlの リ ゾチーム （シグマ製） を含む、 50mMグル コース /25mM Tris-HCl (ρΗ8.0)/10πιΜ EDTA 溶液を 100 1 加え、 室温で 5分間放置した。 得られた懸濁液に、 1 %の ドデシル硫 酸ナ ト リ ウム （シグマ製） を含む 0.2M水酸化ナ ト リ ウム水溶液 を加えて混合した。 次いで、 5 M酢酸カ リ ウ ム水溶液 （ρΗ4.8:' 150/ 1 をさ らに加えて混合し、 15分間氷冷した。
そ して、 遠心分離（15, OOOrpm, 15分） して得た上清に、 この上 清と等量の、 水と フ エ ノ ール Zク ロ口ホルム （CHC 13 ) からなる混 液 （水 ： フ エ ノ ール/ク ロ 口ホルム = 1 ： 1 の体積比） を添加し . 次いで混合した。 そ して、 得られた上清に対して、 この上清の
2倍量 （体積比） のエタ ノ ールを加え、 さ らに遠心分離 （12, 000 rpm, 5分） して沈澱を得た。 この沈澱物を、 lOmM Tris- HCKpH 7.5)/0. linM EDTA溶液 100 i l に溶解し、 これに iOmg/mi RNaseA (シ グマ製） 溶液を加え、 室温で 15分間放置した。
この調製物に 0.1M 酢酸ナ ト リ ウム水溶液（ρΗ4.8) を 300 ^ 1 加え、 さ らに、 この溶液と等量の、 水と フエ ノ ール ク ロ口ホル ム （CHC13) からなる混液 （水 ： フ エ ノ ール/ク ロ 口ホルム = 1 ： 1 の体積比） を添加し、 次いで混合した。 そ して、 得られた 上清に対して、 この上清の 2倍量 （体積比） のエタ ノ ールを加え て沈澱を得た。 この沈澱物を乾燥し、 10 ^ 1 の蒸留水に溶解し た ものを D N A試料と した。
(2) 塩基配列決定の前処理
塩基配列決定の前処理を、 AutoRead (登録商標） Sequencing Ki t (フ アルマ シア製） を用いて行った。
まず、 铸型となる D N Aを、 32 1 溶液中に 5〜10 g の濃度 になるよう に調整した。 そ して、 1.5ml の ミ ニチューブ （エツ ペン ドルフ） に、 铸型 D N Aの溶液 32〃 1 を移し、 2 M水酸化ナ ト リ ウ ム水溶液を 8 1 加えて穏やかに混合した。 そ して、 軽 く 遠心した後、 室温で 10分間放置した。
3 M酢酸ナ 卜 リ ゥム（pH4.8) 7 1 と蒸留水 4 ！ を加え、 さ らにエタ ノ ールを 120 / l 加えて混合し、 ドライアイ ス上で 15分 間放置した。 そ して、 15分間の遠心分離で沈澱した D N Aを集 め、 注意しながら上清を除去した。 得られた沈澱物を 70%エタ ノ ールで洗浄し、 10分間遠心分離した。 そ して、 注意しながら 再度上清を除去し、 減圧条件下で沈澱物を乾燥した。 沈澱物を蒸留水 10 z l に溶解し、 螢光性のプライマー 一 [Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; -Fluorescein -d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT (配列番号 ： 1 )ト3' (1.6pmol/ u 1； 0.42 A26 o unit/ml) ; M13 Reverse Primer, D -Fluorescein- d[CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号 ： 2 ) ]-3' (2. lpmol/ u 1； 0.42 Α26 ϋ unit /ml) 〕 2 u 1 (0.42 A26。 unit/ml, 4〜 6 pmol) とァ 二一リ ング用緩衝液 2 1 を加え穏やかに混合した。
そ して、 軽く 遠心した後、 65°Cで 5 分間熱処理を行い、 素早く 37 Cの温度条件下に置き、 そこで 10分間保温した。 保温後 10分 以上、 室温で、 放置し、 次いで、 軽く 遠心した。
そ して、 延長用緩衝液 と ジメ チルスルホキシ ド 3 1 を さ らに加えたものを試料と した。
4本の ミ ニチューブに A、 C , Gおよび Tと記入し、 それぞれ のチューブに、 AMix (ddATPを dATP、 dCTP、 dGTP、 および dTTPと 共に溶解したもの） 、 C Mix (ddCTP を dATP、 dCTP、 dGTP、 およ び dTTPと共に溶解したもの） 、 G Mix (ddGTP を dATP、 dCTP、 dGTP、 および dTTPと共に溶解したもの） および T Mix(ddTTPを dATP、 dCTP、 dGTP、 および dTTPと共に溶解したもの） を 2.5 1 ずつ分注した。 なお、 それぞれの溶液は使用時までは氷中で保 存し、 使用時には、 37°Cで、 1 分間以上保温してから使用 した。
希釈した T7DNA ポ リ メ ラ一ゼ （フ ア ルマシア製 ； 6〜 8 units/ 2 u \) 2 u \ を各 D N A試料に加え、 ピぺッティ ングも し く は穩 やかな混合により、 完全に混合した。 混合後すぐに、 この混合 液を 4.5/ 1 ずつ、 別途に保温しておいた 4種の Mix 溶液に分注し た。 なお、 分注に際しては新しいチップを用いた。
37°Cで 5分間保温し、 前出の AutoRead (登録商標） Sequencing K i tに添付されていた反応停止溶液を 5 1 ずつそれぞれの反応 液に加えた。 この分注においても、 新しいチッ プを用いた。 90°Cで、 2 ~ 3分間保温し、 すぐに氷中で冷却した。 電気泳 動には 1 レーンあたり 4〜 6 1 を泳動した。
(3) 塩基配列の決定
実施例 1 に記載のへリ コバク ター ピロ リ菌が保有する D N A に対して特異性を有する各プローブの塩基配列を、 泳動温度 45°C 泳動時間 6時間と して、 A. L. F. DNA Sequ ence rシ ステム （フ アル マ シア製） を用いて決定した。
その結果、 プローブ HP- 32 (配列番号 3 ) 、 プローブ HP- 34 (配列 番号 4 ) 、 プローブ HP-49 (配列番号 5 ) 、 プローブ HP- 55 (down) (配列番号 6 ) 、 プローブ HP-55 (up ) (配列番号 7 ) 、 プローブ HP-60 (配列番号 8 ) 、 プローブ HP-64 配列番号 9 ) 、 およびプロ 一ブ SP-66 (配列番号 10) それぞれの塩基配列が明らかとなつた。
〔産業上の利用可能性〕
本発明のプローブは、 内視鏡などの医療器具を用いずに、 また へリ コパク ター ピロ リ 菌の増殖 · 培養を経るこ とな く 、 迅速 · 正確に直接的にヘリ コバクタ一 ピロ リ菌を検出および同定でき る。 すなわち、 本発明のプローブを用いた診断では、 検出率が 飛躍的に向上するのみならず、 1 回分の検体で菌の同定まで行え 診断に要する時間も約 1〜 2 日程度と短く なる。 それ故、 早期 に有効な治療方針が提示でき、 即座に治療を施すこ とが可能とな る。
また、 ヒ 卜の消化器系疾患に深く 関連する、 ヘリ コバク ター ピロ リ 菌が保有する D N Aに特異的なプローブの塩基配列を明ら 力、にしたことにより、 これらプローブが人工的に調製可能となる さ らに、 解析した塩基配列の情報の一部を利用 して作製したブラ イマ一を用いることで、 臨床検体に含まれる原因菌の D N Aを、 P C R法によって増幅でき、 結果と してへリ コバク タ一 ピロ リ 菌を迅速に特定でき、 診断に役立てることができ る。
さ らに、 臨床検体に含まれるゲノ ミ ッ ク D N Aの塩基配列と本 発明によって解析された塩基配列とを比較参照する ことにより、 消化器系疾患原因菌の菌種の迅速な同定に寄与する。
このように、 本発明によると、 所期の目的であつたへリ コパク 夕一 ピロ リ菌に特異的なプローブを提供するのみならず、 P C R用プライマ一作製の指針と して、 また臨床検体に含まれるゲノ ミ ッ ク D N Aとの比絞参照用に適した標準配列と して優れた有用 性が期待されるのである。 さ らに、 消化器系疾患の原因菌であ るへリ コパク ター ピロ リ菌が保有する D N Aに特異的なプロ一 ブの、 今後の探究 · 開発における貴重な手がかりをもたらすなど の優れた効果を奏する ものである。 また、 本発明で開示した塩 基配列は、 臨床分離株のゲノ ミ ッ ク D N Aをラ ンダムにク ロ一二 ングして得られたものであり、 それ故、 本発明の塩基配列の有用 性はその相捕鎖にまで及ぶものである。
なお、 野性株が保有する D N Aに変異部分が存在するこ とは当 然考え られる。 しかしながら、 上記実施例の開示から明らかな ように、 それら D N Aの変異部分は、 本発明のプローブの特異性 や、 その臨床現場での用途 （例えば、 P C R用プラ イマーのデザ イ ンのための使用など） での有用性に何らの影響も与える もので はない。
配 列 表
(1) 出願人名称：扶桑薬品工業株式会社
(2) 発明の名称：へリコパクター ピロリ菌の検出および同定のためのプローブ
(3) 書類番号： 9 7 PX 0 0 9 8 SNG
(4) 優先権のもととなった出願をした国名および出願の番号：
国 名： 日本国
出願番号： 平成 8 (1996)年特許願第 1 94 3 1 7号
(5) 優 先 日 ： 平成 8 (1996)年 7月 24日
(6) 配列の数： 10 配列番号： 1
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー ：直鎖状■
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CGACGTTGTA AAACGACGGC CAGT 24 配列番号： 2
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)
配列
CAGGAAACAG CTATGAC 17 配列番号： 3
配列の長さ ： 1778
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名 ：へリコパクター ピロり (He l i cobacter pylori)
株名：臨床分離株 HP-32
配列
AAGCTTCTAG TAAAGAAATC ACTCTTTTTT GCTGTTCCAA TAGTGCGTCT ATCTTGGCAC 60 TCAAACGATT TATTTTACTT TCCATGCGTT CAATACTAAC CACTAAAAAT AAATAGCTAT 120 TTAATCAHA AAAATGATTA TTTTAATACC ATGCTC AA ATTAAGATGT GTTTTTATGA 180
TCATGCTACA ATAAAAACAC AAAATGATTT CAAAGAAAAA GGGTTTAAAA TGAAAACTTT 240
TGAAGTAATG ATTCAAACCG ATTCAAAAGG GTATTTGGAC GCTAAATTTG GCGGTACGCT 300
CCTAGAGGGT TTCTCAATCC AMCGGCTTA CCCACTTATT CGCCTAAAAT CTCATGGCAA 360
AAAGTAGAAG GCGCTCAAAG CTATGCACTA GAACTCATCG ATCATGACGC TCAAAAAGTG 420
TGTGGCATGT CGTTTGTCAT TGGGTCGTGG GCAATATTTC TTATAATGTT TTAGAAGAAA 480
ACGCTTCCAT GATGGATAAA AGAATTGTTC AAGGGGTCAA TTCGCTCACT CAAGGCTTTA 540
TCCGTTCCCC ACTTAATGAA AGCGAAAAAC AACGCTCCAA TCTCAATAAC AGCACCTATA 600
TCGGCCCCAT GCCCCCTAAT GGCGATCACC ATTACTTAAT CCAAGTGTAT GCCCTAGACA 660
TTCCTAAACT CGCC AAM GCCCCGTTTT TCTTAGGCGA TTTGCATGAC AGAATGCGCG 720
GACATATCAT CGCCATAGGG AGAAAAGAAT TTTTATACAA GCAGTTTGTG AGGAAATAGG 780
CTACTGCTTG TAGCTATTCT TTCGCTAAAT TGAATTTTTG ATACATCTCT AAAATTCTCT 840
TTTCATCTAG CATGCTTTCT TCAATCCTTG TGCCTATCAA ATCGGCATGG TGCTTTTTAA 900
AATCTTTTAA AGGGATTAAA TCATTATCAA CAAGAGCGTT TCGCCTCTTT TTAGCTAAAG 960
GGAAGTGCCA TTGCACGAGT TCTTTATCCT TAAATATGGT GTTTATCCTT AAGCCTTAAA 1020
GTTTTATAAG CATCACCATT ATATTGCCAA ATTTCAAAAG GCTCACAATC GTTATAAAAT 1080 AACCAATGAT CTCCCCATGC GTCTAAAAAT CCAAAATCCC CATCATTACG CATAAACACC 1 140 TCAAAATCTT GCACCACAAA ATTAATACGC GAATACATCA CAACCTCHT AATGCTCTTA 1200
GGGATATAAA AACTTTCATA AAGTTTTTTA GCGTCATAAA TATGATCACA ATCAATTTTG 1260
ATAACCCACT CATTTTTAGG GATAAAAGAA AGCGTATAAT TATAGTAATG ATAGAGTTGG 1320
TGCCACAAAC TCGGGCAATC CTTTAGTATG ACTTCATAAG GATAGCTGAT AGGGATAAAT 1380
GAGGGGAACT TTTTACAAAA CTCTAAAATC ACTTCTTTAG AGCCATCATC GCAATCATTA 1440
AAACCAATGA CCCCCCTTTG AATGGCAGGA AGCATAGAAA ACAAACTCTC TTCTAAAGTA 1500
ACGATTTCAT TTTTGACTCT AATAAAAGNC CATGGGTTTA GAGGGCTTTT AGGGTTTTGA 1560
CTTTTTTATC ATAGTCAAAA TAACCTGAAT GCGTGGGATT GGGTAGAGTT AAAGTGGGAT 1620
GGATAACCCT ATCTTCTAAA TGCCCCCCCC CCCCCCATAA TTATAATTAA GAGAACTATT 1680
ΤΤΤΛΤΑΑΑΤΑ CTCTTATTGC GTTCAATGAA ACTTTCATTA TTTAAAGAAG CGATAGCCAA 1740
AAACACGCTT TCTTGATGGT CATGGTTGAA TAAAGCTT 1778 配列番号： 4
配列の長さ ： 1426
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖伏
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：ヘリコバクタ一 ピロリ (He l icobacter pylor i)
株名：臨床分離株 HP - 34
配列
AAGCTTTACC TCTAATAGCG TTTTAAACTT TTTTGTGGTT TTGTCTTTCA TCACGATAGG 60 GCTAGTTTTT TTCTTTTTGC GTTCCCAACC CACTAGCGTG GTCTCTAAAG AAAATATTCC 120 TAAAATTGAA TTAGAAAATT TTAAAGCGTT TCAAATCAAC GATAAAATCC TTGATCTGTC 180 CATAGAGGGC AAAAAAGCTC TACAATACGA TGATCATGAG ATCTTTTTTG ATTCCAAAAT 240 CAAGCGTTAT GATGAAGACA CGATAGAAAG CGTTGAATCC CCTAAAGCCA AACGGCAGCA 300 GGATTTGTAT TTCTTCCCTA ATGGGGTAAC TTATAAAAGA AGCGATGATT CTAGTTTTTG 360 GAGTGAAACA GGGATTTACA ACCATAAGGA GCAAAATTTT AAAGGCAAGG GCCGTTTCAT 420 TCTCACTCAA AGGACAGCAA GGTTGAAGGG CTTGACATH CTTATTCGCA TGCTTTAGCC 480
ATTATTGAAG CCCAAAGCAT TCAAGCTAAT TTATTCTTAG ATGAAATCAA ACAAAGCCAG 540
AAAGAAAAGA AAAAATTCCC CACTTTCAAA GGAGGGGTTT TAATGCGTTG GTGGTGTGTT 600
CTTGTGTGTT GTTTTGGAAT TTTMGCGTG ATGAACGCTC AAAAAACAGA CAATAAAGGT 660
TTGAAAAAAG AAAGAGAAAC TTTTAGAAAT TACCGGCAAC AAATTCGTAG CGAACGACAA 720
AACAAAAACC GCCGTTATTC AAGGCAATGT GCAGATCAAA AAAGGTAAAG ACCGGTTGTT 780
TGCGGATAAG GTGAGCGTGT TTTTAAACGA TAAACGAAAG CCAGAGCGCT ATGAAGCCAC 840
AGGGAACACG CATTTTAACA TCTTTACAGA GGATAATCGT GAAATCAGCG GGAGTGCTGA 900
CAAGCTCATT TATAACGCAC TGAATGGGGA ATACAAATTA TTGCAAAATG CGGTGGTTAG 960
AGAAGTGGGG AAATCTAATG TTATTACCGG TGATGAGATC ATTTTAAACA AAGCTAAGGG 1020
TTATGCTGAT GTGTTGGGGA GCACGAAACG GCCCGCTAAA TTTGTGTHG ATATGGAAGA 1080
CATTAATGAA GAAAATCGTA AGGCCAAATT GAAGAAGAAA GGCGCTAAGG AAAAACCATG 1140
ATCGCTAnA AAGACGCTCA TTTTCTCACT TCTTCTAGCC AACTTTCGCA ATGCCCTGCG 1200
AGCTTGACTT CTGAAATGGT CATTTTAGGG CGCAGCAATG TCGGTAAAAG CTCGTTTATT 1260
AATACCTTGT TAGGAAAAAA TCTCGCTAAA AGTTCAGCAA CGCCTGGAAA AACCCGTTTA 1320
GTGMTTTTT TTTCCACCAC TTGGGAAGAT AAAGAAAACG CCTTAAGGGC CACTTTTAAT 1380
GTGATTGATT TGCCTGGGTT TGCTACGCTA AAGTTTCTAA AAGCTT 1426 配列番号： 5
配列の長さ ： 723
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：ヘリコバク夕— ピロリ （He l icobacter py loi' i)
株名：臨床分離株 HP - 49
配列
AAGCTTTGCC AACTTTACCA ACACAACAAA GATTTAGTAG CAAGTATATG ATTTTGGTCA 60 AATCAAATGA GTTATACTAT GCAATAGGTA GTGCTATTAA TCAAGATTTA AGCTCTTCTC 120 CTATCTTCAA AACAAATGTT TCCCCAAACA AATTGATGCT GTATAAAAAT GGAAAAATTT 180
CATCTATGAT CAAAGGAGAA AAAGGGTTTG GGGGTCATGA AGGTTCTGAG ATAGTAGATG 240
CTACTGAGCT AGCTACAGGA TTTATGAACC ACATTGTCCC TATTCTTAGT TATAAACTAG 300
ATTGTCCATA TTCTTAATTA TAAACTAGCG GAAATCTATT ATGAAGCATA TGTCGAAACT 360
AATCGTCTTT TAACGAAAAT CAAAGGCTAC TCGCACAACA AAACACTTTT GTTACCCAAC 420
AAATTAATGC CTTAAAAGCT AAAACTAAAT TTCTCCAAAA AGTTTATAAG GATATTTCTC 480
AAATTTCTAA AAGTGATGTT TTGATACAAT CAACATGCAC AAATTTACAA AGAATACGCA 540
TTGAACTAGA TGAAATTTTT TATAATTTTA TATCCCAAAT AAATCAAGGA CTAATGGTAA 600
AAAACTTTAA TGATGTAAGT GGTAACTACA TTTGTGCAAG ATACGCTCTT TCTCATTATA 660
TTTTTGCGTT GGTTTTAGAA TATGTTGTTG CAGGACTCAT TGATAATGAG AGCATGGAAG 720
CTT 723 配列番号： 6
配列の長さ ： 339
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖伏
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：へリコパクター ピロリ （Hel icobacter pylor i)
株名：臨床分離株 HP- 55 (down)
配列
AAGCTTTTGC CTGGCACGGC TATGCCTAGA GTGGGGTTGA GCGAACAGGC TCAAAAACAA 60 GTCATCGCAT ATTTGGAAAA AGCGGGCGAT AGGAAAAAAC ATGAAAGGAA CACCTTAGGG 120 ATAAAAATCA TGATTTTCTT TGCGGTGCTG TCGTTCTTGG CHATGCGTG GAAAAGAAAG 180 GTTTGGAGCG AAGTGCATTG AATTAAAAAA AGGGGGAGGG CATGGTTTTA TGATTTTTGA 240 TCTATGGTGG GGTGTTTGAA TGGCGTTTTC AAAACAACCT TTATTTTAGG ATTTTATTAT 300 TACTAATACC CCTATAAGGA THTATGGCT ACAAAGCTT 339 配列番号： 7
配列の長さ ： 925
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ：直鎖伏
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：ヘリコバク夕一 ピロリ （Hel i cobacter pylor i)
株名：臨床分離株 HP- 55 (up)
配列
AAGCTTGAAA TAHAATGCT TCAAATGAGT TTGGTTTAAT CTTTAATTAA AGAAAAAGTC 60 ATCAAACTAG CCCAAACATT AGGAATCAAC ATGATCATTG GCGGGCCTCC CTGTCAAGGC 120 TTTTCTAATA AAGGGAAAAA TTTAGGGCTA AAAGACTCTA GGAATTTTTT ATTTTTAGM 180 TATATAGAGA TAGTAAAAGC CTTAAAACCA GAAATTTTTA TCATTAAAAA CATGAAAAAC 240 CTCATCTCTT GCGCTAAAGG CTATTTTTTA GAAGAAATTA AAGAAAGATT GAACGCTTTA 300 GGGTATCAAT TAAGCTATCA AATCCTAAAT GCTAAAGATT ATGGCGTGCC TCAAAACAGA 360 GAGAGGGCCT TTATTGTGGG GGCTAGTCGT TTTAGTTTTG ATTTCAATCT TTTAGAGCCT 420 TCTCAAAGCG TGAATGTTCA GGATGCGATA AGCGATTTAG CCTATCTTGT TCTAATGAGG 480 GGGCGTTTGA AAGCGATTAT TTAAACCCTA TCCAATCAAG CTATCAAGCC TTGATGCGAA 540 AAGATAGCCC TAAATTATAC AACCATCAAG CCACCAACCA CTCGCAAGCC GCTTTAGAGA 600 AATTAAAGCT CATTAACAAA GAGCAAGGCA AAGAATGCTT GCCTAAAAAC TTGCATGGCA 660 AACAGCAATT CAAAAGCACA TGGGGGCGTT TGAATTGGAA TAAAATCAGC CCCACCATAG 720 ACACACGATT TGACACTCCA AGTAATGGCA CCAACTCCCA CCCTGAATTG CACCGCTCTA 780 TCACGCCCAG AGAAGCCGCT AGGATACAAA GTTTTAGCGA TAAHATATC TTTTATGGCA 840 ATAAAACGAG CGTTTGCAAG CAAATCGGTA ACGCTGTGCC CCCTCTTCTA GCCCTAGCTT 900 TAGGCAAAGC GATCTTAAAA AGCTT 925 配列番号： 8
配列の長さ ： 2393 OM0/86 :odfev i n.. ο < ο < < O O O D cr> o
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TCTGAAGCAA AGACCTTAM AGGCTTCATA GGCTCTAAAG AAGCGTTTTG GATGCAATAA 1680
ATTTCTTGAA AAAGCACCAC AAAAACCTTT CTTAATTCTT TAATTTGCGT TCTTATTTCT 1740
AAGACCTGCC CAAGGCTTGC GGGGGTGAAA AAATCCGCTT TGATAGAGCG GATAACAAAC 1800
ACGCCTTCTT CATTTTCTGG CAAGACATTT TGTTTAAAAA AAAACTCGCT CCTAGCCCTT 1860
TCGCAATATT TCAAATAAH CGCATGATAG ACCACGCCTT CAGAGTCGGT ATCTTCGTAA 1920
TATACCCTAC AGCGCATTGA TTCCCCTTAC TCAAATAATG AAATTTTCTT GAAATTATAC 1980
AACTATGTAA CHAACTATA GTATAATCTA GGGGCGTTGC TTATATTTTT TAGGTATTTT 2040
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AATACAGCAA TAGTTGGACG ATTAAAGACA TTGCTCTTTA ATTTTAATCA TTTATAAGGA 2160
GTTTGGTAGT TAAGATATGG GTAATCATTT TTCTAAATTA GGATTTGTTT TAGCCGCATT 2220
AGGAAGCGCG ATAGGTTTAG GGCATATCTG GCGATTCCCC TATATGACCG GGGTGAGTGG 2280
TGGGGGTGCT TTTGTTTTAT TGTTTTTATT TTTATCTTTA AGCGTTGGCG CGGCGATGTT 2340
TATCGCTGAA ATGCTATTAG GACAAAGCAC GCAAAAAAAT GTAACAGAAG CTT 2393 配列番号： 9
配列の長さ ： 926
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：へリコパクター ピロリ （He l icobacter pylori)
株名：臨床分離株 HP-64 配列
AAGCTTTAGT GCGAGATTCC AATTTGATTT CTGCTAAAGC CCAAGCGGTG CCTAHGTTT 60 TGCAATTGCA TGCGCTATAC AATGAAGAAA ACAATTACAC GCAATACCTT TTAAGCGTGA 120 TGCTGCCTTG CATGTGGCTT ATTTTGATTG CGATTGGCAT GCTCAATTTC ATTCAAAAAG 180
CCTCTAACAT GCACGAGCTT TTAATCAGTA TTTTAGCGAA TATGTGCGTG TTTAGTTTTT 240
GGGGGATGGG CATGGCGTTT TATTTTAATC TCATTGGCAT GGAGGGACAT TATGCGCATT 300
TGTCATTGGT CTTTTTGGCG GTCGTTTTAA TGGCGCTCAT TATGAGCGGG TTTGTGGTGT 360
TGGTTTATGG CGTTTCAAAA AGCGTTATTG AAACCGCTGG CGCAATTGGG GTCTATACCG 420
CTCCAAGTTT TGCGTTTGCT GGGGTTACTT ACCCGCAAAA TAACATGGAA ATTTHGGGA 480
GTTTTTGGAG CCATTGCTTG CCTATTAGCC ATTTTATGAA GTTCTTTTTA CAAGAGGCCT 540
ATTATAAGAC GGATTTTACA GAGTCTTTAA ATTCTCTAAT GCCGCTTGCG TTCTTTHAA 600
TCTTTHAGT CTTAGGGCH TTGATTTTTT ATTTTTCTTT TAAAAAAGGC AAGGCTAGCG 660
CATGAATTTT TTTAAAATCC TTTTAATGGA GTTAAGGGCT ATTGTTTCTC ATAAGGGCGT 720
TTTGTTAATC CTTATAGGCG CGCCTTTAAT CTATGGCTTA TTATACCCTT TGCCTTATTT 780
AAAAGACATC GTAACGCAGC AAAAAATCGC CCCTTGTAGA TGAAGACAAT TCCTTTCTTT 840
CCAGGCAATT AGCCTTCATG GTGCAAAGCT CCAACGAGTT AGAAATCGCT TTTTTTAGCC 900
CCTCTATGCT GGAAGCCAAA AAGCTT 926 配列番号： 10
配列の長さ ： 1219
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： Genomic DNA
起源
生物名：ヘリコバク夕一 ピロリ (Hel i cobacter pylor i)
株名：臨床分離株 HP - 66
配列
AAGCTTATGG GGTTTATGAA AGCAGCTATT TGCAAGAAGT CCCTAGAGAT CAATTTGAAG 60 一 2 l GCATTGAATT GGAAAAAGGC ATGAGCGTTT TTGGGCAAAC TGAAGACCAC AAAACCATTC 120 AAGCCACTAT CAAAGACTTT AGCAGCACGC ATGTGATGGT GGATTATAAC CATCCGTTAG 180 CCGGGAAAAC TTTAGCGTTT CGTTTCAAGG TTTTGGGCTT TAGGGAAGTG AGCGAAGAAG 240 AAATTTTAGC TTCACACCAT GGCGGTGGGA CAGGTTGCTG TGGCGGTCAT GGGGGTCATG 300 GCGGAAAGAA AGGTGGGGGC TGTGGTTGCT CATGTTCGCA TGGGTAGTAG GGTATAGGAG 360 CATTTAAAAG GCAAGGTCAT GAATAGTTCT AATCTCAAAA ATTGGCTGTT CCCTACCATT 420 TGCTTTTTTT TGTTTTGTTA TATTTTAATT TTTTTGATGT TTTTTATGTT TAAAAGTTTG 480 CAATCGCAAT CTTTTGGCTC TGTGGCAGAA ACCGGAAAAA AACCCATCAC CACCACCAAG 540 AAATHGGTA AGGAATTGCA AAAACAGATT TCAAAGATCC ATTAACTTTT TTTCTTTTTT 600 GCCGATACTT GCCGTAATGG AATGAATATC AAATTAAAGG ATTTTACMT GATCAATGCC 660 GTTTCTTCTC TTTCTCCGGT GCAATCTGTG GGGAATTACA AGCGTGTGGA AAAGAATGAA 720 AAAGTTGAAA ATAGCGAGGC CGCTCTTGAT AGGGTGGCTG AAATCAAGCA AGCTATTGAA 780 AACAACCAGT ATAAAATCAA CTTGCATGAG ACTTCTCACA AAATGGCACA GGATTTATTG 840 GGGATAGGCT AAGGGTTTTA AGGGCTTCAT TTCTAGGGGG GGTTATTCTT GCTGTCGTTT 900 TGTTTTTCAT TAAATTTTAG TTTCTTTATG TTTTGAGTTT TTTGCTCTCT TAAATAGGGC 960
GTGTTTTTGT TGCGTGTTAG GAATGATTGA TTGGGAATTT TAACTTTTAT GGATTHTGT 1020
TCTGGTATTG GTGGAGGCCG TTTGGGCTTG GAGCAATGCC ATTTAAAATG CGTAGGGCAT 1080
GCAGAAATCA ATCATGAAGC CATTAGAACT TATGGATTAT TTTTTAAAGA TACCCATAAT 1140
TTTGGGGATT TGATGCGAAT CAACCCTAAT GATTTACCCG ATTTTGATGC GCTCATTAGC 1200
GGGTTTCCTT GTCAAGCTT 1219

Claims

請 求 の 囲
1. ヘ リ コ ノく 'ク タ一 ピロ リ 〔//elzcof)i2cier :^ 菌力く保有す る D NAを制限酵素 Hindlllで消化して得られる DNA断片を 含み、 かつへリ コバク タ一 ピロ リ菌が保有する D N Aと特異 的に反応する、 ことを特徴とするプローブ。
2. 前記 D N A断片が、 配列番号 3乃至 10に記載の少な く と も一 つの塩基配列を含む請求の範囲第 1項に記載のプローブ。
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