DE69434940T2 - 1,2-Dioxetane mit verbesserter Chemolumineszenz - Google Patents
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Description
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Gebiet der Erfindung:
- Diese Erfindung betrifft chemolumineszierende 1,2-Dioxetan-Derivate, deren Zersetzung enzymatisch aktiviert werden kann, und die durch Zersetzung Licht freisetzen. Die Dioxetane sind insbesondere durch das Vorliegen eines aromatischen (Phenyl- oder Naphthyl-) Rings, der an das Dioxetan gebunden ist, gekennzeichnet, wobei der Ring eine meta-substituierte oder enzymatisch spaltbare Gruppe, die, wenn sie gespalten ist, das Phenoxyanion oder Naphthyloxyanion des Dioxetans zurücklässt, und in der Vier- oder Fünf-Position im Falle des Phenyl beispielsweise eine Elektronen-liefernde oder eine Elektronen-ziehende Gruppe trägt. Durch Auswahl der Identität des Substituenten in der Vier- oder der Fünf-Position (die Z-Gruppierung) können besondere Aspekte der Chemolumineszenzeigenschaften des Dioxetans abgeändert werden, was die Halbwertszeit, die Quantenausbeute, das S/N-Verhältnis usw., einschließt.
- Hintergrund der Erfindung
- 1,2-Dioxetan-Enzym-Substrate sind als hochgradig effiziente chemolumineszierende Reportermoleküle zur Verwendung in Enzym-Immunoassays und Nucleinsäure-Sondenassays mit einer großen Vielfalt an Typen gut etabliert worden. Diese Assays bieten eine bevorzugte Alternative zu herkömmlichen Assays, die auf Radioisotopen, Fluorophoren, komplizierter Farbverschiebung, Sekundärreaktion und dergleichen beruhen. Für diesen Zweck entwickelte Dioxetane beinhalten diejenigen, die in der US-PS 4 978 614 sowie der US-PS 5 112 960 offenbart sind. Die US-PS 4 978 614 offenbart unter anderem 3-(2 -Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan, das weltweite Beachtung gefunden hat und im Handel unter dem Handelsnamen AMPPD erhältlich ist. Die US-PS 5 112 960 offenbart Verbindungen, in denen der Adamantyl-stabilisierende Ring in einer Brückenkopfposition mit einer Vielzahl von Substituenten substituiert ist, welche Hydroxy, Halogen und dergleichen einschließen, die die ansonsten statische oder passive Adamantyl-stabilisierende Gruppe in eine aktive Gruppe umwandeln, die an den kinetischen Eigenschaften der Zersetzung des Dioxetanrings beteiligt ist. Verbindungen dieses Typs haben in ähnlicher Weise internationale Beachtung gefunden, wobei sie in vielen Anwendungen ein schnelleres und stärkeres Signal als AMPPD ergeben. CSPD ist ein Spiroadamantylphenylphosphat-Dioxetan, das einen Chlor-Substituenten an der Adamantylgruppe trägt und wie AMPPD von Tropix, Inc., Bedford, Mass., erhältlich ist.
- Verbindungen dieses Typs sind insbesondere für eine erhöhte Empfindlichkeit in den Assays auf die Gegenwart von Analyten in so niedrigen Konzentrationen, wie 10–12M oder weniger, entwickelt worden. Bei bestimmten Anwendungen werden Verbindungen dieses Typs in Verbindung mit Verstärkern zur Detektion von Analyten in einer Konzentration von 10–12M oder darunter verwendet. Diese Verstärkungsmittel, die natürliche und synthetische wasserlösliche Makromoleküle beinhalten, sind im Detail in der US-PS 5 145 772 offenbart. Bevorzugte Verstärkungsmittel beinhalten wasserlösliche polymere quaternäre Ammoniumsalze, wie Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) (TMQ), Poly(vinylbenzyltributylammoniumchlorid) (TBQ) und Poly(vinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid) (BDMQ).
- Diese Verstärkungsmittel verbessern das Chemolumineszenzsignal der Dioxetan-Reportermoleküle scheinbar dadurch, dass sie eine hydrophobe Umgebung erzeugen, in der das Dioxetan maskiert wird. Wasser, aufgrund der Verwendung von Körperflüssigkeiten ein unvermeidbarer Gesichtspunkt der meisten Assays, ist ein natürlicher "Quencher" der Dioxetan-Chemolumineszenz. Die Verstärkungsmoleküle schließen Wasser scheinbar von der Mikroumgebung aus, in der sich die Dioxetanmoleküle oder zumindest die Emitterspezies im angeregten Zustand befinden, was zu einer verstärkten Chemolumineszenz führt. Andere mit der Verstärker-Dioxetan-Wechselwirkung in Verbindung stehende Effekte können ebenso zur Chemolumineszenzverstärkung beitragen.
- Zusätzliche Vorteile können durch die Verwendung von ausgewählten Membranen gewährleistet werden, welche Nylonmembranen und behandelte Nitrocellulose, welche eine ähnliche hydrophobe Oberfläche für Membran-basierte Assays liefern, und andere Membranen, die mit dem beschriebenen Polymeren vom Verstärker-Typ beschichtet sind, beinhalten.
- Dennoch bleibt es ein allgemeines Ziel der Industrie, das Leistungsverhalten dieser stabilisierten, chemolumineszierenden Dioxetan-Reportermoleküle zu verbessern, die Maschinenlesbarkeit, Empfindlichkeit und Leistungsgesichtspunkte der Immunoassays in Abhängigkeit vom Chemolumineszenzsignal, das durch die Dioxetane freigesetzt wird, zu verbessern.
- Als Hintergrund und wie es in allen der voranstehend genannten Patentschriften offenbart ist, werden die enzymatisch aktivierten Dioxetane als Reportermoleküle, als Substrate für Enzyme verwendet, die die Enzym-labile Gruppe spalten, welche an eine aromatischen Substituenten am Dioxetanring gebunden ist. Somit ist das Enzym, beispielsweise alkalische Phosphatase, allein vorhanden oder mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper in herkömmlichen Antigen/Antikörper-Ligand-Bindungsassays oder einer Nukleinsäuresonde in Nukleinsäureassays kovalent gebunden oder in sonstiger Weise damit komplexiert. Das Enzymtragende Antigen oder der Enzym-tragende Antikörper oder die Nukleinsäuresonde werden dann mit dem Analyten, von dem vermutet wird, dass er das Ziel-Antigen oder die Nukleinsäuresequenz enthält, unter Bedingungen vermischt, die ein Komplexieren oder eine Hybridisierung zwischen dem Antigen/Antikörper oder der Sonde-Nukleinsäuresequenz erlauben. Nach dem Wegwaschen oder Abtrennen des gesamten nicht-komplexierten oder nicht-hybridisierten Materials wird das Dioxetan-Substrat zugesetzt. Wenn der vermutete Analyt vorhanden ist, wird das Enzym die Enzym-labile Gruppe an dem aromatischen Substituenten an dem Dioxetan, z.B. Phenyl oder Naphthyl, spalten, was zu dem Phenoxy- oder Naphthyloxyanion-Intermediat führt. Dieses Anion zersetzt sich mittels Elektronentransfer durch den aromatischen Ring, wobei der Dioxetanring gespalten wird und zwei Carbonyl-basierte Produkte resultieren. Der Spaltungs-/Zersetzungs-Vorgang ist der Licht-freisetzende Vorgang.
- Zur Automatisierung klinischer Assays und zur Gewährleistung eines erheblichen Durchsatzes sind fortschreitende Reduzierungen der Halbwertszeit, oder T1/2, des Dioxetans sowie eine Reduktion der zum Erreichen der maximalen Lichtemission des Reportermoleküls erforderlichen Zeit wünschenswert. Gleichzeitig ist es zur Bestimmung von Analyten in äußerst geringen Konzentrationen unterhalb von beispielsweise etwa 10–12M erforderlich, die Intensität des Signals des Dioxetan-Reportermoleküls zu verbessern, und gleichzeitig ist es wünschenswert, den Anstieg des Hintergrundrauschens aufgrund einer nicht-enzymatisch induzierten Lichtfreisetzung zu verhindern, um die Gesamtempfindlichkeit des Assays zu verbessern. Deshalb wird nach weiteren Verbesserungen bei chemolumineszierenden Dioxetan-Reportermolekülen gesucht.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Die voranstehend genannten Ziele sowie weitere werden durch eine neue Klasse von Dioxetanen erreicht, die insbesondere durch einen Substituenten an dem aromatischen Ring, der an das Dioxetan gebunden ist, zusätzlich zu der meta-substituierten Enzym-labilen Gruppe gekennzeichnet ist. Somit weisen die neuen Dioxetane der vorliegenden Erfindung die nachstehende allgemeine Struktur I auf: worin Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, eine Hydroxylgruppe, ein Halogen, eine unsubstituierte C1-C12-Alkylgruppe, eine Hydroxy-C1-C12-alkylgruppe, eine Halogen-C1-C12-alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine C1-C12-Alkoxyphenylgruppe, eine C1-C12-Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxy-C1-C12-alkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine C1-C12-Alkoxygruppe oder eine Carboxylgruppe sind,
worin R C1-C12-Alkyl, Phenyl, Naphthyl, Phenyl-C1-C12-alkyl oder Naphthyl-C1-C12-alkyl ist,
worin X eine Enzym-labile Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphat, einem Galactosid, einem Acetat, einem 1-Phospho-2,3-diacylglycerid, einem 1-Thio-D-glucosid, einem Adenosintriphosphat, einem Adenosindiphosphat, einem Adenosinmonophosphat, einem Adenosin, einem α-D-Glucosid, einem β-D-Glucosid, einem β-D- Glucuronid, einem α-D-Mannosid, einem β-D-Mannosid, einem β-D-Fructofuranosid, einem β-Glucosiduronat, einem p-Toluolsulfonyl-L-argininester und einem p-Toluolsulfonyl-L-argininamid,
worin Z eine Elektronen-aktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cl, OAr, NM3+, NHCOM, NMCOM1, NHCOAr, NHCOOAr, NHCOOM, NMCOOM1, CM3, NO2, COOM, COOAr, NHSO2OM, NHSO2Ar, CF3, Ar, SiM3, SiAr2, SiArM2, SO2NHCOM, SO2NHCOAr, SO2M, SO2Ar, SM und SAr, worin M und M1 unabhängig voneinander C1-6-Alkyl sind und Ar Phenyl oder Naphthyl ist;
und worin Z die Vier- oder Fünf-Position an dem Phenylring besetzt. - Durch Auswahl der speziellen Identität und Stellung von Z als eine Elektronen-ziehende oder eine Elektronen-liefernde Gruppe können spezielle Charakteristika des Chemolumineszenzverhaltens des Dioxetans beeinflusst werden, was seine t1/2-Chemolumineszenz-Halbwertszeit, die Zeit bis zur maximalen Emission, die maximale Emissionswellenlänge und die Intensität des Chemolumineszenzsignals einschließt.
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
- Die
1 und2 vergleichen das Leistungsverhalten von Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2-(5-chlor)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphatdioxetan (CSPD) mit einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, nämlich mit einem Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2-(5-chlor)tricyclo-{3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat, wobei die Phenylgruppierung einen Chlor-Substituenten in der 4-Position trägt (CDP-Star).2 spiegelt die Gegenwart eines Chemolumineszenzverstärkers, nämlich Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid, wider. -
3 ist ein Vergleich zwischen CSPD und CDP-Star in einem Nylonmembran-Assay für biotinyliertes pBR322-35-mer. - Die
4 und5 sind Wiedergaben von Kodak XAR-5-Filmbelichtungen von Westernblot-Assays, die an Nylon- und PVDF-Membranen durchgeführt worden sind, wobei CSPD und CDP-Stern verglichen worden sind. - Die
6 ,7 und8 sind Wiedergaben eines Röntgenfilms eines an Nylonmembranen durchgeführten Assays auf das Hefegen RPB1, wobei CSPD- und CDP-Stern-Inkubationen von 10 Minuten, 70 Minuten bzw. 19 Stunden einander gegenübergestellt werden. -
9 ist eine Wiedergabe von Röntgenfilmbelichtungen, die die Chemolumineszenzdetektion von DNA-Sequenzleitern widerspiegeln, welche an Nylonmembranen durchgeführt worden sind, wobei CSPD und CDP-Star einander gegenübergestellt werden. -
10 und11 sind elektrophotographische Vervielfältigungen von Röntgenfilmbildern von DNA-Sequenzierungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Dioxetane erhalten worden sind. Diese werden mit dem gegenwärtigen kommerziellen Standard CSPD verglichen. - Die
12 –21 sind elektrophotographische Vervielfältigungen von Dotblot-Assay-Ergebnissen an den angegebenen Membranen, wobei erfindungsgemäße Dioxetane, Dioxetane außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und die kommerziellen Standards CSPD und AMPPD verwendet werden. Die Membran, an der diese Assays durchgeführt wurden, ist in den Figuren angegeben. - DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Die Dioxetane der vorliegenden Erfindung sind in entscheidender Weise durch die Substituenten am aromatischen Ring gekennzeichnet, der an die Dioxetane gebunden ist, wobei der Ring den Elektronentransfer in dem Aryloxyanion bestimmt, was zur Zersetzung und Chemolumineszenz führt. Somit haben die Phenyldioxetane der vorliegenden Erfindung die folgende und verallgemeinerte Struktur (I):
- Somit tragen die Adamantyl-stabilisierten Dioxetane der beanspruchten Erfindung zwei Substituenten am Phenylring zusätzlich zur Bindungsstelle des Dioxetans sowie 0, 1 oder 2 Nicht-Wasserstoff-Substituenten am Adamantylring. Diese Substituenten charakterisieren entscheidend die elektronischen Charakteristika des Dioxetans, des Oxyanions und dessen Zersetzungsverhalten. Die Identitäten jedes Substituenten sind in den beigefügten Ansprüchen dargestellt.
- R kann Alkyl, Aralkyl, Cycloalkyl oder Aryl mit 1-12 Kohlenstoffatomen sein. R ist vorzugsweise C1-C4-Alkyl, stärker bevorzugt C1-3-Alkyl, und am stärksten bevorzugt Methyl. Die Identität von R kann im Hinblick auf Löslichkeitsbelange optimiert werden, wobei ungewöhnliche Analyten oder Puffer besondere Probleme aufwerfen können. Jedes aus Y1 und Y2 steht individuell und unabhängig voneinander für Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, einen Halogen-Substituenten, eine Hydroxyniederalkylgruppe, eine Halogenniederalkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine Alkoxyphenylgruppe, eine Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxyalkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine Carboxylgruppe oder eine substituierte Carboxylgruppe, eine Alkoxygruppe und andere ähnliche Elektronenaktive Spezies. Bevorzugte Identitäten für eines von Y1 und Y2 sind Chlor, Hydroxy und Methoxy, wobei das andere Wasserstoff ist.
- X ist eine Enzym-spaltbare Gruppierung. Somit wird X bei geeignetem Kontakt mit einem geeigneten Enzym vom Molekül abgespalten, was das Sauerstoffatom an den Phenylring gebunden und auf diese Weise das Phenoxyanion zurücklässt. Idealerweise ist X Phosphat, Galactosid, Acetat, 1-Phospho-2,3-diacylglycerid, 1-Thio-D-glucosid, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinmonophosphat, Adenosin, α-D-Glucosid, β-D-Glucosid, β-D-Glucuronid, α-D-Mannosid, β-D-Mannosid, β-D-Fructofuranosid, β-Glucosiduronat, p-Toluol-sulfonyl-L-argininester und p-Toluolsulfonyl-L-arginin.
- Z kann entweder die Vier- oder die Fünf-Position einnehmen. Z ist ein Elektronenaktiver Substituent, wobei der Charakter der Elektronen-aktiven Spezies (Elektronen-liefernd oder Elektronen-ziehend) die verschiedenen Gesichtspunkte der Dioxetangruppierung optimiert. Als ein Beispiel kann eine Elektronen-liefernde Gruppe, wie eine Methoxygruppe, den Dioxetan-Phenoxyanion-Zersetzungsprozess fördern, wodurch die Übertragbarkeit des freien Elektrons von der O–-Donorgruppe am aromatischen Ring auf den Dioxetanring unterstützt wird. Im Gegensatz dazu würde eine Elektronen-ziehende Gruppe die Fähigkeit zur Übertragung des freien Elektrons auf das Dioxetan verringern oder verschlechtern, wobei die Zersetzungsreaktion und die Lichtemission auf diese Weise verlangsamt werden, obwohl dies letztlich ein Lichtsignal von größerer Intensität ergibt. Dies sollte dem Einfluss des Elektronenziehenden Substituenten an der Adamantylgruppe, wie z.B. Chlor, gegenübergestellt werden, welcher die Lichtemission erheblich beschleunigt, wobei T1/2 stark verringert wird. Von überraschender Bedeutung ist die Tatsache, dass eine Substitution in der Sechs-Position in besonderem Maße unerwünscht ist. Derartige Sechs-substituierte Phenyldioxetane zeigen überaus schnelle Zersetzungskinetiken und nahezu keine Lichtemission. Während die Anmelder nicht auf diese Theorie beschränkt sein wollen, glaubt man, dass dieses Verhalten auf sterischen Gesichtspunkten beruht. Der ortho-Substituent "dreht" nämlich den Phenylring derart, dass er den Dioxetanring destabilisiert (Destabilisierung durch sterische Kräfte, nicht durch Elektronentransfer) und ein Substituent in der Sechs-Position, z.B. Methoxy, nimmt nicht am Elektronentransfer teil. Wie nachstehend erörtert, ergeben Experimente, an denen 6-substituierte Phenyldioxetane beteiligt sind, im Wesentlichen kein Signal.
- Im Allgemeinen kann man erwarten, dass meta-substituierte Phenyldioxetane höhere Quantenausbeuten als die entsprechenden para-Systeme und konjugierten Systeme ergeben.
- Wird auf Alkyl oder auf R, R' usw., Bezug genommen, sollte die Alkylgruppierung 1-12 Kohlenstoffatome aufweisen. Geeignete Arylgruppierungen beinhalten Phenyl und Naphthyl als exemplarische Gruppierungen. In besonderem Maße bevorzugte Spezies beinhalten Chlor und Alkoxy.
- Dioxetane der voranstehend beschriebenen Art ohne den Z-Substituenten sind, wie bereits angemerkt, in den gemeinsam hiermit übertragenen Patentschriften offenbart. Patentschriften, die auf Dioxetane dieser Art ohne die Y- und Z-Substituenten gerichtet sind, sind ebenso auf die Wayne State University übertragen worden, wie z.B. 4 962 192.
- Die Substitution des Z-Substituenten an den Dioxetanen erforderte die Entwicklung der Synthese von trisubstituierten Phenylphosphonaten, die nachstehend unter dem Titel "Neue trisubstituierte Phenyl-1,2-dioxetanphosphate" beschrieben sind. Derselbe allgemeine Syntheseweg kann für die hierin umfassten Naphthyldioxetane eingesetzt werden, wobei die erforderlichen Substitutionsmuster beachtet werden, wie es voranstehend erörtert ist. Diese These dieser Verbindungen durch die nachstehend beschriebene Route beinhaltet die Herstellung neuer trisubstituierter Benzole. Somit beinhaltet, wie es nachstehend beschrieben ist, eine exemplarische Verbindung, die an der Synthese der Dioxetane dieser Klasse beteiligt ist, 3-Chlor-5-methoxybenzaldehyd. Diese trisubstituierten Verbindungen stellen Schlüsselintermediate in einer Vielzahl von Synthesewegen dar, wobei das 1,3,5-Substitutionsmuster ein allgemein bevorzugtes und in weitem Umfang anwendbares Muster ist. Die Anmelder glauben, dass diese Intermediate bislang nie hergestellt worden sind, und sie sind in dem nachstehend beschriebenen Syntheseweg mit einem Stern gekennzeichnet.
- NEUE TRISUBSTITUIERTE PHENYL-1,2-DIOXETANPHOSPHATE
- Synthese
- Allgemeines: Im Handel erhältliche Reagentien wurden wie erhalten, ohne weitere Reinigung verwendet. Baker-Silicagele (60–200 Mesh für den Gramm-Maßstab und 230–400 Mesh für den Milligramm-Maßstab) wurden zur Flashchromatographie verwendet. 31P-NMR-Spektren wurden in ppm ("parts per million") in Bezug auf einen Phosphorsäure-Standard aufgenommen. Hochaufgelöste Massenspektroskopie-Analysen wurden von J.L. Kachinski an der Johns Hopkins University durchgeführt. Die Synthesen der Dioxetane 3 und 4 wurden den nachstehend beschriebenen Vorgehensweisen für die Dioxetane 1 bzw. 2 folgend durchgeführt. Ausbeuten, Schmelzpunkte (nicht korrigiert) und spektroskopische Daten sind für die isolierten Intermediate zusammengefasst.
- Eine Lösung von 5-Cl-Vanillin1 (13,0 g, 70 mmol), Chloroform (4 ml) und Pyridin (16 ml) wurde bei 0°C gerührt. Die Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid (12,4 ml, 75 mmol) bei 0°C im Verlauf von 30 min ergab die glatte Bildung des Triflats. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen EtOAc und 3N HCl verteilt, mit verdünnter Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Reinigung des resultierenden Öls durch Silicagelchromatographie (30% EtOAc/Hexane) ergab 18,5 g (83%) des Triflats 5 als gelbe Kristalle.
IR (CHCl3, cm–1): 1705, 1590, 1461, 1425, 1225, 1205, 1132, 1049, 875, 624
1H-NMR (ppm): 3.99 (3H, s), 7.44 (1H, d, J = 1,6Hz), 7.57 (1H, d, J = 1,7Hz), 9,92 (1H, s) - Triflat (5) (9 g, 28 mmol), Palladium(II)-acetat (120 mg, 0,5 mmol), 1,1-Bis(diphenylphosphino)ferrocen (620 mg, 1 mmol) und CH3CN (10 ml) mit HPLC-Standard wurden in einer mit Teflon ausgekleideten Edelstahlbombe gut vermischt. Nach der Zugabe von frisch hergestelltem, pulverisierten Protonenschwamm-Formiat2 (7,84 g, 30 mmol) wurde die Bombe verschlossen und 4 h lang auf 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde dann zur Entfernung der Protonenschwamm-Kristalle filtriert, zwischen EtOAc und 3N HCl verteilt, jeweils einmal mit verdünnter Kochsalzlösung und verdünnter NaHCO3 gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und eingedampft. Silicagelchromatographie (15% EtOAc/Hexane) ergaben 4,25 g (88,5%) Chlormethoxybenzaldehyd 6, Smp. 45°C.
IR (CHCl3, cm–1): 2835, 1700 (C=O), 1590, 1576, 1461, 1425, 1380, 1320, 1280, 1265, 1144, 1050, 850, 695
1H-NMR (ppm): 3.84 (3H, s), 7.13 (1H, m), 7.26 (1H, m), 7.41 (1H, m), 9.89 (1H, s). Massenspektrum (EI, 70 eV): Exakte Masse berechnet für C8H7ClO2 170,0135, gefunden 170,0134. - Eine Methanollösung (20 ml) von Benzaldehyd (6) (8,76 g, 51 mmol) wurde in der Gegenwart von Dimethylorthoformiat (5,62 ml, 51 mmol) und einer katalytischen Menge an p-Toluolsulfonsäure glatt in das Dimethylacetal (7) umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Triethylamin auf pH 7 gequencht, auf ein kleines Volumen eingedampft und zwischen EtOAc und NaHCO3 verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet, unter reduziertem Druck eingedampft und durch Silicagelchromatographie (10% EtOAc/Hexane) gereinigt, um 10,68 g (96%) des Acetals 7 als ein hellgelbes Öl zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1): 2960, 2938, 2830, 1596, 1578, 1458, 1270, 1104, 1050, 989, 872, 865, 840
1H-NMR (ppm): 3.31 (6H, s), 3.79 (3H, s), 5.31 (1H, s), 6.85 (1H, s), 6.88 (1H, s), 7.04 (1H, s) - Triethylphosphit (3,2 ml, 19 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung des Acetats 7 (4,0 g, 18,5 mmol), von Bortrifluoridetherat (2,3 ml, 19 mmol) und CH2Cl2 (20 ml) bei 0°C gegeben. Nach langsamem Erwärmen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur (30 min) wurde die Lösung mit verdünnter NaHCO3 verteilt, über NaSO4 getrocknet, eingedampft und an Silicagel (40%–100% EtOAc/Hexane) gereinigt, um 4,6 g (77,5%) des Phosphonats 8 als ein hellgelbes Öl zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1): 2990, 1591, 1573, 1458, 1254 (P=O), 1050 (P-O), 1025 (P-O), 969, 870, 687
1H-NMR (ppm): 1.24 (3H, t, J = 7Hz), 1.26 (3H, t, J = 7Hz), 3.37 (3H, s), 3.78 (3H, s), 4.01-4.09 (4H, m), 4.40 (1H, d, J = 16Hz), 6.83 (1H, t, J = 2Hz), 6.8 8 (1H, qt, J = 2Hz), 6.98 (1H, qt, J = 2Hz) - Das Phosphonat 8 (4,62 g, 14 mmol) und 2-Adamantanon (2,58 g, 17 mmol) wurden in wasserfreiem THF (35 ml) unter Argon gelöst und auf –68°C abgekühlt. Tropfenweise Zugabe von Lithiumdiisopropylamid (18,6 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) bei –68°C erzeugte das Ylid, worauf sich die nachfolgende Olefinierung des Ketons anschloss. Das Reaktionsgemisch wurde langsam im Verlauf von 2 h auf Raumtemperatur erwärmt und dann 1 h lang bei 75°C gerührt. Die Lösung wurde zwischen EtOAc/NH3Cl verteilt, über NaSO4 getrocknet, eingedampft und durch Silicagelchromatographie (2% EtOAc/Hexane) gereinigt, was 2,5 g (55%) des Enolethers 9 als ein Öl ergab.
1H-NMR (ppm): 1.55-1.95 (12H, m), 2.61 (1H, br s), 3.21 (1H, br s), 3.28 (3H, s), 3.78 (3H, s), 6.74 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.87 (1H, s) - Die Demethylierung zum Enoletherphenol 10 lief sauber unter Erwärmen des Enolethers 9 (2,5 g, 7,8 mmol) in DMF (14 ml) bei 155°C in der Gegenwart von Natriumethanthiolat (11,7 mmol) ab. Nach Abkühlen wurde das Gemisch zwischen EtOAc und NH4Cl verteilt, über NaSO4 getrocknet und unter Hochvakuum eingedampft, um übriges DMF zu entfernen. Chromatographische Reinigung (Silicagel, 20% EtOAc/Hexane) erzeugte 2,3 g (96%) des Phenols 10 als ein Öl, das beim Stehen kristallisierte. Verreiben des Feststoffs mit 5% EtOAc/Hexanen ergab weiße Kristalle, Smp. 133°C.
IR (CHCl3, cm–1): 3584 (OH), 3300 (OH), 2910, 1590, 1310, 1285, 1163, 1096, 1080, 1011, 900, 840
1H-NMR (ppm): 1.73-1.96 (12H, m), 2.62 (1H, br s), 3.20 (1H, br s), 3.32 (3H, s), 5.65 (1H, br s), 6.73 (1H, s), 6.79 (1H, m), 6.85 (1H, s) - Triethylamin (450 μl, 3,2 mmol) wurde unter einer Argonatmosphäre zu Enolether 10 (709 mg, 2,3 mmol), der in wasserfreiem THF (10 ml) gelöst worden war, gegeben. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und dann wurde 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, 285 μl, 3,0 mmol) tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und unter einer inerten Atmosphäre schnell durch eine mit Argon gespülte Säule geführt, um Triethylammoniumhydrochlorid-Kristalle zu entfernen. Nach einmaligem Spülen des Kristallkuchens mit THF wurde die Lösung eingedampft und trockengepumpt, um das rohe Phospholan 11a zu ergeben.
- Das Öffnen des Phospholanrings nach Umsetzung von 11a mit NaCN (Vakuumgetrocknet, 179 mg, 3,65 mmol) in wasserfreiem DMF (6 ml) unter Argon erzeugte das gewünschte β-Cyanoethyldiesterphosphat 11b und bildete das Enoletherphenol 10 zurück. Entfer nen von DMF unter Hochvakuum während des Erwärmens des Kolbens auf 55°C ließ ein Gemisch der Verbindungen 10 und 11b als ein gelb-orangefarbenes Öl zurück.
- Das voranstehend genannte Gemisch wurde in Methanol (8 ml) gelöst und bei 40°C in der Gegenwart von NaOMe (1 ml einer 4,25 M NaOMe-Lösung in MeOH, 6,4 mmol) gerührt, wodurch die β-Eliminerung der Cyanoethylgruppe bewirkt wurde, um das Enoletherphosphat 11 als das Dinatriumsalz zu ergeben. Nach Verdampfen des Methanols wurde der Feststoff in Wasser gelöst und mit minimaler Menge EtOAc verteilt, um das Phenol 10 (333 mg) zurückzugewinnen. Die Reinigung der wässrigen Phase durch präparative HPLC unter Verwendung eines CH3CN/H2O-Gradienten durch eine Polystyrolsäule (PLRP-S, Polymer Laboratories), nachfolgendem Ionenaustausch mit Pyridiniumtoluolsulfonat (Amberlyst-IR 120+ Harz) und Sprühtrocknen ergaben 448 mg (78% über 3 Stufen, unter Berücksichtigung von zurückgewonnenem Phenol) des Enoletherphosphats 11 als ein flockiges, cremefarbenes Pulver.
IR (CHCl3, cm–1): 2910, 1590, 1567, 1278, 1160, 1095, 945
1H-NMR (ppm): 1.73-1.96 (12H, m), 2.63 (1H, br s), 3.20 (1H, br s), 3.32 (3H, s), 5.89 (1H, s), 6.72 (1H, m), 6.79 (1H, t, J = 2Hz), 6.85 (1H, d, J = 2Hz)
31P-NMR (ppm): 54 (1P) - Eine Lösung des Enoletherphosphat 11 und 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H-porphin (TPP, 0,5 ml einer 2%igen Lösung in CHCl3, auf das Gewicht bezogen) in CHCl3 (8 ml) wurden mit einer 250 Watt Hochdruck-Natriumlampe bestrahlt, während man einen Strom von Sauerstoff durch die Lösung perlen ließ. Ein 5 MIL-Stück eines Kapton-Polyimidfilms (Du-Pont) das zwischen die Lampe und das Reaktionsgemisch eingesetzt worden war, filterte unerwünschte UV-Strahlung heraus. Analytische HPLC UV-Detektor bis 270 nm) zeigte eine vollständige Dioxetanbildung nach 5-minütigem Bestrahlen. Nach Verdampfen des Chloroforms bei 0°C wurde der Rückstand in Eiswasser in der Gegenwart von Na2CO3 (27 mg, 0,25 mmol) gelöst und durch präparative HPLC wie voranstehend beschrieben gereinigt. Die Fraktionen wurden eingefroren und bei 0°C sprühgetrocknet, was 65,3 mg (90%) des Dioxetans 1 als ein flockiges weißes Pulver ergab. Dünnschichtchromatographie ("TLC") des Dioxetans zeigte eine blaue Chemolumineszenz bei thermischer Zersetzung nach Erwärmen. Eine enzymatische Spal tung des Phosphats induzierte ebenfalls eine Zersetzung unter Chemolumineszenz in wässrigen Lösungen.
1H-NMR (D2O, ppm): 0.93 (1H, d, J = 13Hz), 1.21 (1H, d, J = 13Hz), 1.44-1.69 (10H, m), 2.16 (1H, br s), 2.78 (1H, br s), 3.14 (3H, s), 7.20 (2H, br s), 7.30 (1H, s).
31P-NMR (D2O, ppm): 24 (1P) - 5-Chlor-3-methoxybenzaldehyddimethylacetal (7, 3,21 g, 14,8 mmol) wurde mit Natriumethanthiolat (19 mmol) in DMF (14 ml) unter Erwärmen auf 150°C demethyliert. Das resultierende Phenol 12 wurde abgekühlt, zwischen EtOAc und NH4Cl verteilt, über Na2SO4 getrocknet, eingedampft und zur Trockene unter Hochvakuum abgepumpt, um zurückgebliebenes DMF zu entfernen. Chromatographische Reinigung (Silicagel, 20% EtOAc/Hexane) ergab 2,75 g (92%) Phenol 12 als ein gelbes Öl. Eine analytische Probe des Öls kristallisierte bei weiterer Reinigung, Smp. 153°C.
IR (CHCl3, cm–1): 3580 (OH), 3325 (OH), 2940, 2830, 1599, 1585, 1449, 1350, 1155, 1105, 1055, 894, 845
1H-NMR (ppm): 3.32 (6H, s), 5.30 (1H, s), 5.73 (1H, br s), 6.81 (2H, m), 7.01 (1H, s) - Phenol 12 (2,7 g, 13,3 mmol) und Triethylamin (2,8 ml, 20 mmol) in CH2Cl2 (20 ml) wurden bei 0°C gerührt. Die Zugabe von Trimethylacetylchlorid (1,64 ml, 13,3 mmol) ergab sauber den Pivaloylester. Standardaufarbeitung lieferte das rohe Pivaloat 13 als ein Öl, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion eingesetzt wurde: Es wurde kein Gewicht bestimmt. Eine kleine Probe wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie zur spektroskopischen Charakterisierung gereinigt.
IR (CHCl3, cm–1): 2980, 2940, 1749 (C=O), 1585, 1448, 1349, 1250, 1150, 1109, 1056, 898
1H-NMR (ppm): 1.34 (9H, s), 3.31 (6H, s), 5.36 (1H, s), 7.06 (2H, br s), 7.31 (1H, s) - Eine Lösung des Acetals 13, von Bortrifluoridetherat (2,6 ml, 21 mmol) und CH2Cl2 (10 ml) wurde bei –78°C gerührt. Zugabe von Triethylphosphit (3,0 ml, 17,5 mmol) wandelte das Acetal in das Phosphonat 14 um. Aufarbeitung und Reinigung (Silicagel, 10% EtOAc/Hexane) ergab 2,43 g Öl (47% über 2 Stufen).
IR (CHCl3, cm–1): 2995, 2980, 1750 (C=O), 1600, 1581, 1442, 1247 (P=O), 1110, 1028 (P-O), 975, 890
1H-NMR (ppm): 1.22-1.26 (6H, d von t, J = 2Hz, 7Hz), 1.31 (9H, s), 3.39 (3H, s), 4.02-4.08 (4H, m), 4.44 (1H, d, J = 16Hz), 7.04 (2H, m), 7.27 (1H, br s) - Das Phosphonat 14 (2,4 g, 6,1 mmol) wurde in wasserfreiem THF (10 ml) unter Argon gelöst und auf –68°C abgekühlt. Tropfenweise Zugabe von Lithiumdiisopropylamid (6,6 mmol) in wasserfreiem THF (7 ml) bei niedriger Temperatur erzeugte das Ylid, was durch tiefe Färbung ersichtlich war. Nach 5 min wurde eine THF-Lösung von 5-Chlor-2-adamantanon (941 mg, 5 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde langsam im Verlauf von 40 min auf Raumtemperatur erwärmt, wonach 1 h lang zur vollständigen Olefinierung auf 75°C erwärmt wurde. Die Lösung wurde zwischen EtOAc/NH4Cl verteilt, über NaSO4 getrocknet und eingedampft, um ein rohes Gemisch des Enoletherpivaloats 15 und des entsprechenden Enoletherphenols 16 zu ergeben. Das rohe Öl wurde ohne Reinigung in der folgenden Hydrolyse verwendet. Eine kleine Probe wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie zur spektroskopischen Charakterisierung gereinigt.
IR (CHCl3, cm–1): 2935, 1750 (C=O), 1595, 1571, 1450, 1420, 1397, 1275, 1160, 1110, 1024, 918, 906, 887, 829
1H-NMR (ppm): 1.34 (9H, s), 1.68-1.78 (4H, m), 2.14-2.25 (7H, m), 2.77 (1H, br s), 3.30 (3H, s), 3.42 (1H, br s), 6.88 (1H, d, J = 1,5Hz), 7.04 (1H, m), 7.11 (1H, d, J = 1,5Hz) - Rohes Pivaloat 15 wurde bei Raumtemperatur mit K2CO3 (1,45 g, 10,5 mmol) in 10 ml Methanol hydrolysiert. Verdampfen des Methanols, nachfolgende Standardaufarbeitung und Reinigung (Silicagel, 30% EtOAc/Hexane) lieferten 1,095 g (63% über 2 Stunden) eines leicht gelben Öls, das sich beim Stehen verfestigte. Verreiben des Feststoffes erzeugte weißes kristallines Enoletherphenol 16, Smp. 130°C.
IR (CHCl3, cm–1): 3590 (OH), 3300 (OH), 2935, 1595, 1163, 1100, 1082, 1030, 911
1H-NMR (ppm): 1.69-1.83 (4H, m), 2.14-2.27 (7H, m), 2.77 (1H, br s), 3.30 (3H, s), 3.41 (1H, br s), 5.21 (1H, br s), 6.67 (1H, d, J = 1,5Hz), 6.81 (1H, m), 6.84 (1H, d) - Triethylamin (230 μl, 1,65 mmol) wurde unter einer Argonatmosphäre zu dem Enolether 16 (356 mg, 1,05 mmol), der in wasserfreiem THF (5 ml) gelöst worden war, gegeben. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und zu diesem Zeitpunkt wurde 2-Chlor-2-oxo-1.3.2-dioxaphospholan (Fluka, 143 μl, 1,55 mmol) tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und schnell durch eine mit Argon gespülte Säule unter einer inerten Atmosphäre geführt, um Triethylammoniumhydrochlorid-Kristalle zu entfernen. Nach einmaligem Spülen des Kristallkuchens mit THF wurde die Lösung eingedampft und trockengepumpt, um das rohe Phospholan 17a zu ergeben.
- Öffnen des Phospholanrings durch Umsetzung mit NaCN (vakuumgetrocknet, 69 mg, 1,4 mmol) in wasserfreiem DMF (5 ml) unter Argon erzeugte das gewünschte β-Cyanoethyldiesterphosphat 17b. Entfernen von THF unter Hochvakuum während des Erwärmens des Kolbens auf 55°C ließ das rohe Diesterphosphat als ein orangefarbenes Öl zurück.
- Eine Lösung des Cyanoethylphosphats 17b und 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H-porphin (TPP, 1,5 ml einer Lösung mit 2 Gew.-% in CHCl3) in CHCl3 (10 ml) wurde mit einer 250 W-Hochdruck-Natriumlampe bei 10°C bestrahlt, während ein Sauerstoffstrom durch die Lösung geführt wurde. Ein 5 mm-Stück Kapton-Polyimidfilm (DuPont), das zwischen die Lampe und das Reaktionsgemisch eingesetzt worden war, filtrierte nicht erwünschte UV-Strahlung heraus. Analytische HPLC (UV-Detektor bei 270 nm) zeigte eine vollständige Dioxetan-Bildung nach 15-minütiger Bestrahlung. Nach dem Verdampfen des Chloroforms bei 0°C wurde der Rückstand in Methanol gelöst und mit NaOMe (0,5 ml einer 4,25 M NaOMe/MeOH-Lösung, 2 mmol) zu dem Dinatriumphosphatdioxetan entschützt. Nach β-Eliminierung der Cyanoethylgruppe wurde das Lösungsmittel bei 0°C verdampft und der Rückstand in Eiswasser gelöst. Reinigung durch präparative HPLC, wie sie voranstehend beschrieben worden ist, sowie nachfolgendes Sprühtrocknen bei 0°C lieferte 289 mg (60% über 4 Stufen) des Dioxetans 2 als ein flockiges weißes Pulver.
1H-NMR (D2O, ppm, Gemisch aus syn/anti-Isomeren): 0.86 (1H, d), 1.13 (1H, d, J = 14Hz), 1.30 (1H, d), 1.37 (1H, d), 1.45-2.07 (18H, m), 2.27 (1H, br s), 2.32 (1H, br s), 2.95 (2H, br s), 3.09 (3H, s), 3.11 (3H, s), 7.0-7.3 (4H, br s), 7.25 (1H, s), 7.28 (1H, s) -
- IR (CHCl3, cm–1): 2958, 2935, 1598, 1460, 1426, 1357, 1190, 1154, 1101, 1053, 840
- 1H-NMR (ppm): 3.32 (6H, s), 3.78 (6H, s), 5.28 (1H, s), 6.41 (1H, m), 6.60 (2H, m)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 3590 (OH), 3345 (OH), 2940, 2830, 1600, 1462, 1432, 1355, 1190, 1150, 1110, 1055, 841
- 1H-NMR (ppm): 3.32 (6H, s), 3.77 (3H, s), 5.28 (1H, s), 6.37 (1H, d, J = 2Hz), 6.53 (1H, br s), 6.58 (1H, br s)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 2960, 2935, 1741 (C=O), 1608, 1597, 1462, 1350, 1273, 1190, 1139, 1115, 1056, 999, 902, 848
- 1H-NMR (ppm): 1.34 (9H, s), 3.31 (6H, s), 3.80 (3H, s), 5.35 (1H, s), 6.57 (1H, d, J = 2Hz), 6.75 (1H, br s), 6.87 (1H, br s)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 2990, 2980, 1742 (C=O), 1606, 1590, 1463, 1272, 1240, 1136, 1110, 1100, 1055, 1023, 970
- 1H-NMR (ppm): 1.21 (3H, t, J = 3Hz), 1.23 (3H, t), 1.32 (9H, s), 3.39 (3H, s), 3.78 (3H, s), 4.06 (4H, m), 4.44 (1H, d, J = 16Hz), 6.56 (1H, m), 6.72 (1H, m), 6.85 (1H, m)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 2910, 1740 (C=O), 1600, 1580, 1460, 1325, 1272, 1140, 1114, 1097, 1079, 1055
- 1H-NMR (ppm): 1.35 (9H, s), 1.56-1.96 (12H, m), 2.68 (1H, br s), 3.23 (1H, br s), 3.31 (3H, s), 3.80 (3H, s), 6.53 (1H, t, J = 2Hz), 6.61 (1H, br s), 6.72 (1H, m)
- 3-Hydroxy-5-methoxy-1-(methoxytricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol (22): (64%, weiße Kristalle, Smp. 159°C)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 3590 (OH), 3320 (OH), 2910, 1591, 1342, 1150, 1098
- 1H-NMR (ppm): 1.78-1.97 (12H, m), 2.68 (1H, br s), 3.23 (1H, br s), 3.33 (3H, s), 3.78 (3H, s), 5.49 (1H, s), 6.37 (1H, m), 6.45 (2H, m)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 2911, 1584, 1448, 1425, 1328, 1149, 1099, 960, 870
- 1H-NMR (ppm): 1.68-1.92 (12H, m), 2.63 (1H, br s), 3.17 (1H, br s), 3.23 (3H, s), 3.68 (3H, s), 6.55 (1H, br s), 6.72 (1H, br s), 6.76 (1H, br s), 6.98 (1H, br s)
-
- 1H-NMR (D2O, ppm): 0.98 (1H, br d), 1.22 (1H, br d), 1.46-1.76 (10H, m), 2.20 (1H, br s), 2.78 (1H, br s), 3.14 (3H, s), 3.74 (3H, s), 6.91 (1H, br s), 6.68-6.97 (2H, sehr breites Signal)
- 31P-NMR (D2O, ppm): 44,8 (1P)
-
- IR (CHCl3, cm–1): 3590 (OH), 3330 (OH), 2930, 1610, 1591, 1450, 1430, 1341, 1150, 1100, 1080, 1056, 1028, 829
- 1H-NMR (ppm): 1.68-2.40 (11H, m), 2.82 (1H, br s), 3.31 (3H, s), 3.42 (1H, br s), 3.78 (3H, s), 6.37-6.41 (3H, m)
-
- 1H-NMR (D2O, ppm, Gemisch aus syn/anti-Isomeren): 0.93 (1H, br d), 1.19 (1H, br d), 1.42 (1H, br d), 1.50 (1H, br s), 1.5 8 (1H, br d), 1.67-2.16 (17H, m), 2.3 8 (1H, br s), 2.40 (1H, br s), 3.00 (2H, br s), 3.15 (3H, s), 3.16 (3H, s), 3.73 (3H, s), 3.74 (3H, s), 6.90 (1H, br s), 6.93 (1H, br s), 6.65-7.00 (4H, sehr bereites Signal)
- 31P-NMR (D2O, ppm, Gemisch aus syn/anti-Isomeren): 44,8 (2P)
- Anmerkungen
-
- 1. 5-Chlorvanillin wurde wie von Hann und Spencer (J. Am. Chem. Soc., 1927, 49:535– 537) beschrieben synthetisiert, Smp. 163°C.
- 2. Protonenschwamm-Formiat (N,N,N',N-Tetramethyl-1,8-naphthalindiammoniumformiat): Ameisensäure (98%, 1,2 ml, 31 mmol) wurde zu einer Lösung von Protonenschwamm (6,8 g, 32 mmol) und CH2Cl2 (8 ml) bei 0°C gegeben. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abgedampft und das Protonenschwamm-Formiat kristallisierte als weiße Kristalle während des Trocknens im Hochvakuum unter minimalem Erwärmen. Protonenschwamm-Formiat-Kristalle (Smp. 79°C) müssen bald nach ihrer Herstellung verwendet werden, weil Ameisensäure beim Stehen abdampft, wobei Protonenschwamm (Smp. 50°C) zurückgelassen wird.
- Eine Methanol-Lösung (30 ml) von 5-Nitrovanillin (5,0 g, 97%, 18,4 mmol) wurde sauber in das Dimethylacetal 25 in der Gegenwart von Trimethylorthoformiat (2,8 ml, 25 mmol) und einer katalytischen Menge an p-Toluolsulfonsäure umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Triethylamin auf pH 8 gequencht, auf ein kleines Volumen eingedampft und zwischen EtOAc und NaHCO3 verteilt. Die wässrige Schicht wurde einmal mit EtOAc gewaschen. Die organischen Schichten wurden über Na2SO4 getrocknet, dekantiert und zu einem orangeroten Öl eingedampft, das beim Trockenpumpen kristallisierte. Umkristallisieren aus 50% EtOAc/Hexanen ergab 5,55 g (93%) des Acetals (25) als rot-orangefarbene Kristalle, Smp. 58– 59°C.
IR (CHCl3, cm–1): 3300, 3010, 2930, 2820, 1620, 1543, 1460, 1445, 1392, 1341, 1320, 1254, 1132, 1101, 1058, 990, 865
1H-NMR (ppm): 3.31 (6H, s), 3.94 (3H, s), 5.31 (1H, s), 7.22 (1H, d, J = 1,7Hz), 7:78 (1H, d) - Eine Lösung des Dimethylacetals 25 (5,0 g, 20,6 mmol), Chloroform (3 ml) und Pyridin (8 ml) wurde bei 0°C unter Argon gerührt. Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid (4,0 ml, 23,8 mmol) bei 0°C im Verlauf von 10 min und nachfolgendes Rühren bei Raumtemperatur über Nacht ergab eine saubere Bildung des Triflats. Die Lösungsmittel wurden unter hohem Vakuum während des Erwärmens des Öls auf 45°C abgedampft, und Spuren von Pyridin wurden mit 4 ml Tokluol ausgetrieben. Das resultierende Öl wurde unter Hochvakuum gut trocknegepumpt, in 50% EtOAc/Hexanen aufgenommen und mit 50% EtOAc/Hexanen verrieben, um das gewünschte Triflat (in Lösung) von den feinen Pyridiniumtriflat-Kristallen abzutrennen. Eindampfen der Verreibungslösung und nachfolgende Reinigung des Öls an einer Silicagelsäule, wobei mit 30% EtOAc/Hexanen eluiert wurde, ergab 6,43 g (84%) des Triflats 26 als ein hellgelbes Öl.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR(ppm): 3.35 (6H, s), 4.00 (3H, s), 5.42 (1H, s), 7.42 (1H, d, J = 1,6Hz), 7.73 (1H, d) - 5-Nitrophenyltriflat 26 (7 g, 18,7 mmol), Palladium(II)-acetat (88 mg, 0,39 mmol), 1,1-Bis(diphenylphosphino)ferrocen (430 mg, 0,78 mmol) und CH3CN (10 ml) mit HPLC-Reinheit wurden in einer mit Teflon ausgekleideten Edelstahlbombe gut miteinander vermischt. Nach Zugabe von frisch hergestelltem, pulverisierten Protonenschwamm-Formiat (5,1 g, 19,6 mmol) wurde die Bombe verschlossen und 2 h lang auf 90°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde in EtOAc aufgenommen, durch eine Silicagelschicht passiert und dann an einer Silicagelsäule gereinigt, wobei mit 0–30% EtOAc/Hexanen eluiert wurde, um 1,5 g (35%) Methoxynitrobenzaldehyd 27 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1): 3005, 2960, 2935, 2835, 1532 (–NO2), 1463, 1450, 1343 (–NO2), 1280, 1190, 1158, 1104, 1055, 990, 871
1H-NMR (ppm): 3.33 (6H, s), 3.89 (3H, s), 5.41 (1H, s), 7.33 (1H, s), 7.68 (1H, s), 7.92 (1H, s) - Triethylphosphit (0,98 ml, 5,7 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung des Dimethylacetals 27 (1,08 g, 4,7 mmol), Bortrifluoridetherat (1,2 ml, 9,8 mmol) und CH2Cl2 (10 ml) bei 0°C gegeben. Nach dem Erwärmen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur über Nacht wurde die Lösung mit 3N HCl verteilt und die wässrige Schicht mit CH2C1l zweimal gewaschen. Die organischen Schichten wurden mit verdünnter NaHCO3 gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, dekantiert und eingedampft. Der rohe Rückstand wurde an einer Silicagel säule gereinigt, wobei mit 0–80% EtOAc/Hexanen eluiert wurde, um 1,36 g (86%) Phosphonat 28 als ein hellgelbes Öl zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1): 2995, 1532 (–NO2), 1350 (–NO2), 1280, 1258, 1243, 1096, 1053, 1025, 973, 721
1H-NMR (ppm): 1.28 (6H, t, J = 7,1Hz), 3.44 (3H, s), 3.90 (3H, s), 4.08-4.15 (4H, m), 4.55 (1H, d, J = 16Hz), 7.34 (1H, d), 7.69 (1H, d, J = 2,1Hz), 7.87 (1H, d, J = 1,6Hz) - Nitrophosphonat 28 wird in Methylenchlorid gelöst und mit einer 1 M NaOH-Lösung, die nBu4Br und Natriumhydrosulfit enthält, versetzt. Die zweiphasige Lösung wird kräftig gerührt, wenn nötig unter Erwärmen, bis die Reduktion des Nitrosubstituenten zum Anilin 29 vollständig ist. Die abgekühlte Lösung wird zwischen CH2Cl2 und einer minimalen Menge Wasser verteilt, und die wässrige Schicht wird nach Bedarf mit CH2Cl2 gewaschen, um das rohe Anilin zu erhalten. Die vereinigten organischen Schichten werden getrocknet, dekantiert und eingedampft. Der Rückstand wird dann durch eine dünne Silicagelschicht geführt, um das Anilin 29 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm):
(Hinweise auf andere Reduktionsbedingungen sind der Zusammenfassung der Synthesen beigefügt). - Phosphonat 29 wird durch Zugabe von Trifluoressigsäureanhydrid (1 Äq.) und Triethylamin (1,3 Äq.) in 10 ml CH2Cl2 bei 0°C quantitativ acetyliert. Verdampfen der Lösungsmittel sowie nachfolgende Silicagelsäulenreinigung ergibt Trifluoracetamid 30.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Phosphonat 30, gelöst in wasserfreiem THF, wird unter einer Argonatmosphäre auf –68°C abgekühlt. In ähnlicher Weise wird 2-Adamantanon (1,1 Äq.) in einem separaten Kolben in wasserfreiem THF gelöst und unter Argon auf –68°C abgekühlt. Zu der Phosphonatlösung wird 2,5M nBuLi bei –68°C unter Argon gegeben, bis die rote Farbe des Ylids bestehen bleibt. Zu diesem Zeitpunkt werden 1,2 Äq. nBuLi zugesetzt, um die Ylid-Bildung zu vervollständigen, und die resultierende gefärbte Lösung wird 5 min lang bei –68°C gerührt. Während die niedrige Temperatur aufrecht erhalten wird, wird 2-Adamantanon in THF im Verlauf von einer Stunde langsam zu dem Ylid gegeben. Nach abgeschlossener Zugabe des Ketons wird das Reaktionsgemisch 2 h lang gerührt, während auf Raumtemperatur erwärmt wird. Das Reaktionsgemisch wird dann 1 h lang zum Refluxieren erwärmt, abgekühlt und durch Verteilen mit EtOAc und gesättigter NH4Cl gequencht. Die organische Schicht wird über Na2SO4 getrocknet und mit EtOAc/Hexanen an einer Silicagelsäule chromatographiert, um den Enolether 31 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Trifluoracetamidenolether 31 wird bei 60°C mit fein gemahlenem K2CO3 (3 Äq.) in MeOH, das eine Spur Wasser enthält, hydrolysiert. Aufarbeitung durch Verteilen des Gemisches mit EtOAc/H2O und nachfolgender Silicagelchromatographie liefert das Enoletheranilin 32.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Enoletheranilin 32 in Methylenchlorid wird mit 4-Methoxyphenylchlorformiat (1,1 Äq.) in der Gegenwart von Triethylamin (2,0 Äq.) bei 0°C carboxyliert. Das Reaktionsgemisch wird zwischen CH2Cl2/H2O verteilt, mit verdünnter NaHCO3 gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, eingedampft und an Silicagel chromatographiert, um das Enolether p-methoxyphenylcarbamat 33 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Eine Methylenchloridlösung des Enoletheranilins 32, Triethylamin (1,5 Äq.) und BOC-ON (1,3 Äq.) wird bei 55°C in einem mit einem Deckel dicht verschlossenen Kimax-Röhrchen gerührt, um die t-Butylcarbamat-Bildung zu bewirken. Die Lösung wird abgekühlt, auf ein geringes Volumen eingedampft und nach Zugabe von MeOH zum Rückstand präzipitiert das gewünschte Carbamat 34.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Eine Methylenchloridlösung des Enoletheranilins 32 wird mit Tosylchlorid (1,1 Äq.) in der Gegenwart von Triethylamin (2,0 Äq.) bei 0°C sulfonyliert. Das Reaktionsgemisch wird mit CH2Cl2/H2O verteilt, mit verdünnter NaHCO3 gewaschen, über NaSO4 getrocknet, einge dampft und an Silicagel chromatographiert, um den N-Toluolsulfonamidoenolether 35 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Eine Methylenchloridlösung des Enoletheranilins 32 wird mit Trifluormethylsulfonsäureanhydrid (1,1 Äq.) bei 0°C sulfonyliert. Das Reaktionsgemisch wird mit CH2Cl2/H2O verteilt, über NaSO4 getrocknet, eingedampft und an Silicagel chromatographiert, um den N-Trifluormethylsulfonamidoenolether 36 zu ergeben.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Eine Pyridinlösung des Enoletheranilins wird mit Benzoylchlorid (1,1 Äq.) bei 0°C umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und gut abgepumpt, um ein rohes Öl zu ergeben, das zwischen CH2Cl2/H2O verteilt, getrocknet und eingedampft wird. Chromatographie an Silicagel ergibt den Benzamidoenolether 37.
IR (CHCl3, cm–1):
1H-NMR (ppm): - Die 3-Stickstoff-substituierten Phenylenolether (Verbindungen 33–37) werden mit Natriumethanthiolat demethyliert und dann phosphoryliert und photooxygeniert, wie es für die Dioxetane 1 und 2 beschrieben ist, um die analogen Dioxetane zu erhalten.
-
- Der Name dieser Verbindung lautet Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2-(5-chlor)tricyclo[3,3,1.13,7]decan]-4-yl)-1-phenylphosphat.
- Diese Verbindung wird im Allgemeinen als CDP-Star bezeichnet. Sie kann wie in dem nachstehenden Reaktionsschema gezeigt synthetisiert werden.
- 4-Chlor-3-methoxybenzaldehyddimethylacetal 3
- Ein heterogenes Gemisch von Methanol (2 ml), CH2Cl2 (3 ml), 4-Chlor-3-methoxybenzaldehyd (2 g, 11,7 mmol; im Wesentlichen hergestellt wie von RM. Riggs et al., J. Med. Chem., 30, 1887, 1987, beschrieben), Trimethylorthoformiat (1,7 ml, 15,5 mmol) und ein großer Kristall p-Toluolsulfonsäure wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Weiteres MeOH (1 ml) und ein Kristall p-Toluolsulfonsäure wurden zugesetzt, und die Lösung wurde erwärmt, bis sie homogen war. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Lösung 5 min lang mit überschüssigem festen NaHCO3 gerührt und am Rotationsverdampfer eingedampft, um die Lösungsmittel zu entfernen. Die Paste wurde in 40 ml EtOAc gelöst, gegen verdünnte NaHCO3-Lösung verteilt und eingedampft, um ein hellbraunes Öl zu ergeben. Die Reaktion wurde mit weitern 2 g 4-Chlor-3-methoxybenzaldehyd wiederholt, und beide Produktöle wurden vereinigt, um 4,37 g (86%) Dimethylacetal 3 zu ergeben.
IR (rein, cm–1): 2930, 2810, 1582, 1580, 1483, 1460, 1402, 1348, 1268, 1100, 1059, 989, 861, 827, 790
1H-NMR (CDCl3, ppm): 3.30 (6H, s), 3.90 (3H, s), 5.33 (1H, s), 6.95 (1H, d), 7.03 (1H, s), 7.32 (1H, d) - Diethyl-1-methoxy-1-(4-chlor-3-methoxyphenyl)methanphosphonat 4
- Eine Lösung des Dimethylacetals 3 (4,3 g, 20 mmol), Molekularsieb-getrocknetes CH2Cl2 (20 ml) und Triethylphosphit (4,1 ml, 24 mmol) wurden bei –78°C unter Argon gerührt. Bortrifluoridetherat (2,95 ml, 24 mmol) wurde tropfenweise bei –78°C zugesetzt, die Lösung wurde 5 min lang gerührt und über Nacht bei –20°C gelagert. Am nächsten Tag wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und 5 Stunden lang gerührt, um die Phosphonat-Bildung zu vervollständigen. Unter kräftigem Rühren wurde die Reaktion mit festem NaHCO3 und nachfolgend mit 40 ml gesättigter NaHCO3-Lösung gequencht. Nach Beendigung der Gasentwicklung wurden 40 ml CH2Cl2 und 20 ml H2O zugesetzt, das 2-Phasen-Gemisch wurde verteilt, und die CH2Cl2-Phase wurde gewonnen, über NaSO4 getrocknet und eingedampft.
- Nach Trockenpumpen im Vakuum wurde das Öl an einer Silicagelschicht gereinigt, wobei mit CH2Cl2 eluiert wurde, um das Phosphonat 4 als ein hellgelbes Öl (6,01 g, 99%) zu erhalten.
IR (rein, cm–1): 2980, 2930, 1590, 1580, 1480, 1460, 1408, 1280, 1250, 1095, 1055, 1025, 967, 871, 809, 790, 754, 728 - 4-Chlor-3-methoxy-1-(methoxy-5-chlortricyclo[3,3,1,13,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol 5
- Phosphonat 4 (3,2 g, 10 mmol) wurde in 30 ml trockenem THF unter Argon gelöst und auf –78°C abgekühlt. Tropfenweises Zugebe von nBuLi (2,3M, 4,4 ml, 10,1 mmol) erzeugte ein gelb-orangefarbenes Phosphonat-Ylid. Nach 10-minütigem Rühren der Ylid-Lösung wurde 5-Chlor-2-adamantanon (1,75 g, 9,5 mmol), gelöst in 8 ml THF, bei –78°C tropfenweise zu dem Ylid gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde langsam im Verlauf von 45 min auf Raumtemperatur erwärmt und 2 h lang refluxiert. Nach dem Abkühlen wurde das THF im Vakuum abgezogen und das Produkt zwischen EtOAc/Hexanen (1:1) und verdünnter NaHCO3 verteilt. Die organische Schicht wurde über NaHCO3 getrocknet. Die organische Schicht wurde über Na2SO4 getrocknet, vom Lösungsmittel befreit und an Silicagel (2–4% EtOAc/Hexane) gereinigt, um 3,3 g (96%) des Enolethers 5 als eine farblose, viskose, zähe Masse zu ergeben.
- 4-Chlor-3-hydroxy-1-(methoxy-5-chlortricyclo[3,3,1,13,7]dec-2-ylidenmethyl)benzol 6
- Die Demethylierung zum Enoletherphenol 6 verlief sauber beim 1,5-stündigen Erwärmen des Enolethers 5 (3,3 g, 9,3 mmol) in 22 ml DMF bei 135°C in der Gegenwart von Natriumethanthiolat (14 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und zwischen 50 ml EtOAc, 100 ml 1M NH4Cl und 10 ml gesättigter NaHCO3-Lösung verteilt. Die organische Phase wurde gewonnen und mit Wasser gut gewaschen, während die wässrige Phase einmal mit EtOAc gewaschen wurde. Die EtOAc-Schichten wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Das rohe Öl wurde an einer Silicagelsäule gereinigt, wobei mit 50% CH2Cl2/Hexanen eluiert wurde, um 3,6 g des Phenols 6 als ein rohes Öl zu ergeben. Weitere Reinigung durch zwei Kristallisationen aus einer gekühlten 15%igen CH2Cl2/Hexane-Lösung lieferte das Phenol 6 als einen Feststoff (2,18 g, 68%).
IR (CHCl3, cm–1): 3520 (OH), 3300 (OH), 2920, 2845, 1568, 1478, 1308, 1190, 1166, 1090, 1079, 1042, 1020, 821
1H-NMR (CDCl3, ppm): 1.57-2.28 (11H, m), 2.75 (1H, br s), 3.27 (3H, s), 3.41 (1H, br s), 5.57 (1H, s), 6.79 (1H, dd, J = 8Hz, 2Hz), 6.93 (1H, d, J = 2Hz), 7.28 (1H, d, J = 8Hz) - Natrium-2-cyanoethyl-2-chlor-5-(methoxy-(5-chlor)tricyclo[3,3,1,13,7]dec-2-ylidenmethyl)-1-phenylphosphat 7
- Zu einer Lösung des Phenols 6 (0,75 g, 2,2 mmol), Triethylamin (400 μl, 2,86 mmol) und wasserfreiem THF (8 ml) wurde 2-Chlor-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, 240 μl, 2,6 mmol) bei Raumtemperatur unter Argon gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang gerührt, und während dieser Zeit fiel Triethylammoniumhydrochlorid aus. Die Reaktionslösung wurde mit einer Spritze mit Baumwollspitze unter einem starken Argonstrom vom Präzipitat abpipettiert. Das Präzipitat wurde einige Male mit Ether gespült, und die vereinigte Lösung und die Waschflüssigkeiten wurden im Vakuum eingedampft, um einen Schaum zu ergeben, der vor Feuchtigkeit geschützt wurde.
- Der Schaum wurde in wasserfreiem DMF (4 ml) gelöst und mit trockenem NaCN (140 mg, 2,8 mmol) bei Raumtemperatur gerührt, um den β-Cyanoethylphosphatdiester zu bilden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C im Hochvakuum trockengepumpt, um DMF zu entfernen, wobei der Phosphatdiester 7 als eine zähe Masse zurückgelassen wurde. Der rohe Phosphatdiester wurde ohne weitere Reinigung photooxygeniert.
- syn- und anti-Dinatrium-2-chlor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricyclo[3,3,1,13,7]decan]-4-yl)-1-phenylphosphat 1
- Der Phosphatdiester 7 wurde in 20 ml 10% MeOH/CHCl3 gelöst, wozu 5,10,15,20-Tetraphenyl-21H,23H-Porphin (TPP, 0,8 ml einer 2 mg/ml CHCl3-Lösung) gegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit Sauerstoff gesättigt und mit einer 250 W-Hochdruck-Natriumdampflampe, die mit einem Kapton-Film eingewickelt worden war, bei 5°C bestrahlt, während Sauerstoff durch die Lösung geführt wurde. Analytische Umkehrphasen-HPLC-Analyse zeigte eine vollständige Dioxetan-Bildung nach 20-minütigem Bestrahlen. Die Lösungsmittel wurden bei Raumtemperatur im Vakuum abgezogen, der Rückstand unter Hochvakuum zu einer zähen Masse trockengepumpt und bei –20°C gelagert.
- Das rohe Cyanoethylphosphatdiesterdioxetan 8, gelöst in 11 ml MeOH, wurde mit Natriummethoxid (0,5 ml 25 Gew.-% NaOMe in MeOH) bei Raumtemperatur für 30 min entschützt. Nach Abschluss der β-Eliminierung der Cyanoethylgruppe wurden 2 ml gesättigte NaHCO3-Lösung zugesetzt, und das MeOH wurde am Rotationsverdampfer abgedampft. Wasser (15 ml) mit HPLC-Reinheit wurde zugesetzt, und die braune Lösung wurde durch einen 0,45 μ-Nylonfilter passiert. Das Lösungsvolumen wurde mit Wasser mit HPLC-Reinheit auf 40 ml eingestellt, und es wurde mit präparativer HPLC unter Verwendung eines CH3CN/H2O-Gradienten durch eine Polystyrol-Säule (PLRP-S, Polymer Laboratories) gereinigt. Die gefriergetrockneten Fraktionen ergaben 0,81 g (74% vom Phenol 6) des Dioxetans 1. Analytische Umkehrphasen-HPLC an einer Polystyrol-Säule unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril und 0,1% NaHCO3 sowie UV-Detektion bei 270 nm zeigte einen Peak mit einer vorauslaufenden Schulter, welcher ein Gemisch der syn- und anti-Isomere darstellte. Eine Probe des Produkts, als ein Isomerengemisch, wurde in einem 0,1M Diethanolamin-Puffer (1mM MgCl2) bei pH 10 gelöst. Nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase wurde erwartungsgemäß Licht emittiert, wodurch bestätigt wurde, dass es sich bei dem Produkt um ein 1,2-Dioxetan mit der im Titel angegebenen Struktur handelt.
- BEISPIELE
- Verschiedene Dioxetane innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind hergestellt worden und in Bezug auf wesentliche Eigenschaften getestet worden. Als hergestellte und getestete Dioxetane enthalten sind diejenigen, in denen R Methyl ist, X Phosphat ist und Y2 Chlor ist und Z in der 4- oder der 5-Position an einem Phenylring steht. In den nachstehenden Tests werden diese Dioxetane mit den im Handel erhältlichen Standards CSPD® und AMPPD® verglichen.
- Chemolumineszenz-Detektion von alkalischer Phosphatase in Lösung
- Alkalische Phosphatase (5,25 × 10–17 mol) wurde in 0,5 ml 0,1M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10, das 0,4 mM Dioxetan enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Chemolumineszenz (5 Sekunden-Integral) wurde in einem Berthold LB952T-Luminometer nach 5, 10, 20, 30, 44, 50 und 60 Minuten gemessen. Die
1 und2 vergleichen das Leistungsverhalten von CSPD® und CDP-Star.1 zeigt den Vergleich von CSPD® und CDP-Star als relative Lichteinheiten (RLU) gegen die Zeit aufgetragen. Der Durchschnittswert von drei Wiederholungen ist aufgetragen.2 zeigt die Ergebnisse, die aus einem anderen Satz von Proben erhalten worden sind, welche 1 mg/ml des Chemolumineszenz-verstärkenden Polymers Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid enthielten. - Chemolumineszenz-Detektion von biotinyliertem pBR323-35-mer an einer Nylonmembran
- Biotinyliertes pBR322-35-mer (13,1 pg in 1 μl) wurde auf ein kleines Stück einer positiv geladenen Nylonmembran (Tropilon-Plus) aufgetüpfelt. Die Membran wurde vollständig getrocknet, und DNA wurde durch UV-Vernetzung (120 mJ/cm2) an der Membran fixiert. Die Membran wurde mit PBS benetzt und dann in Blocking-Puffer (0,2% 1-BlockTM, 0,5% SDS in PBS) 10 Minuten lang, in Strepatvidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Avidx-APTM, Tropix; verdünnt 1:5000 in Blocking-Puffer) 20 Minuten lang inkubiert und einmal 5 Minuten lang mit Blocking-Puffer und dreimal 5 Minuten lang mit Washing-Puffer (0,5% SDS in PBS) gewaschen. Nachfolgend wurden die Membranen zweimal 5 Minuten lang mit Assay-Puffer (0,1M DEA, 1 mM MgCl2, pH 10,0) gewaschen. Letztlich wurden die Membranen zugeschnitten und mit 40 μl 0,25 mM CSPD oder CDP-Star (verdünnt in Assay-Puffer) in ein kleines Quadrat aus einem wärmeverschließbaren Kunststoff eingeschlossen. Das verschlossene Stück der Membran wurde sofort auf ein Röhrchen (bei 22°C vorinkubiert) aufgeklebt und in ein Turner Modell 20e-Luminometer (Turner Designs, Inc. Mountain View, CA) eingesetzt. Die Lichtemission wurde alle 5 Minuten über einen Zeitraum von 24 h hinweg bei 22°C aufgezeichnet.
3 ist eine graphische Darstellung der Chemolumineszenzintensität (RLU) gegen die Zeit für CSPD und CDP-Star. - Chemolumineszenz-Detektion von einem Western-Blot-unterzogenen Humantransferin
- Gereinigtes Humantransferin (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1317 415) wurde seriell mit 1X SDS-PAGE-Loading-Puffer (0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 2,25% Glycerin, 0,5% β-Mercaptoethanol, 2% SDS, 0,05% Bromphenolblau) verdünnt. Die Verdünnungen wurden 5 Minuten lang auf 95°C erwärmt, und 5 μl der verdünnten Probe wurden pro Gelspur aufgeladen. Die Proben wurden durch SDS-PAGE an 10% Polyacrylamid-Minigelen unter Verwendung einer Hoefer SE250-Minigel-Apparatur elektrophoretisch getrennt. Jeder Blot enthielt Mengen von 10, 3,3, 1,1, 0,37, 0,12 und 0,04 ng Transferrin. Nach der Elektrophorese wurden die Gele und Membranen mit Transfer-Puffer (15 mM MOPS pH 7,5, 2 mM Natriumacetat, 20% MeOH) 15 Minuten lang äquilibriert. Das Protein wurde auf PVDF (TropifluorTM) und positiv geladene Nylonmembran (Tropilon-Plus) 1 h lang bei 90 V und bei 4°C transferiert. Die Blots wurden in Blocking-Puffer (BB-1 [0,2% 1-BlockTM, 0,1% Tween-20 in PBS] wurde für PVDF verwendet, und BB-2[3% 1-BlockTM, 0,1% Tween-20 in PBS] wurde für Nylon verwendet) 30 Minuten lang inkubiert. Die Blots wurden mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Human-Transferrin (Boehringer/Mannheim, Kat. Nr. 615 015; verdünnt auf 1:5000 in dem geeigneten Blocking-Puffer) 30 Minuten lang inkubiert und dann zweimal 5 Minuten lang gewaschen (PVDF mit BB-1 und Nylon mit Waschpuffer [0,1% Tween-20 in PBS]). Als Nächstes wurden die Blots mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (Tropix; verdünnt auf 1:10.000 in dem geeigneten Blocking-Puffer) 30 Minuten lang inkubiert und dann zweimal 5 Minuten lang gewaschen. Die Blots wurden dann zweimal 5 Minuten lang in Assay-Puffer (0,1 M DEA, 1 mM MgCl2, pH 10,0) gewaschen. Schließlich wurden die Blots mit 0,25 mM CSPD oder CDP-Star (verdünnt in Assay-Puffer) 5 Minuten lang inkubiert. Die Blots wurden von überschüssiger Substratlösung befreit, in Kunststoffhüllen eingesetzt und auf einen Kodak XAR-5-Film belichtet. Die an Nylon- und PVDF-Membranen erhaltenen Ergebnisse sind in den
4 –5 gezeigt. - Chemolumineszenz-Detektion eines Single-Copy-Hefe-Gens an einer Nylonmembran
- Die gesamte genomische DNA der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde mit EcoR 1 und Bg1 11-Restriktionsendonukleasen verdaut. Mengen von 5,0, 0,5 und 0,05 μg jedes DNA-Verdaus wurden durch Elektrophorese in einem horizontalen 0,8%igen Agarose 1X TBE-Gel abgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH zur Denaturierung der DNA 45 Minuten lang getränkt und dann in Neutralisations-Puffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,4) 45 Minuten lang inkubiert. Die DNA wurde auf positiv geladene Nylonmembranen (Tropilon-Plus) durch einen über Nacht erfolgten Kapillartransfer unter Verwendung von 20X SSC transferiert. Die Membranen wurden luftgetrocknet, und die DNA wurde bei 120 mJ/cm2 an den Membranen vernetzt. Ein 1 kb Bg1 11-Fragment, das aus dem Hefe-Gen RPB 1 herausgeschnitten worden war, wurde Gel-gereinigt und durch eine Random-Priming-Reaktion, wobei Biotin-14-dCTP eingebaut wurde, biotinyliert. Die Membranen wurden in Hybridisierungslösung (7% SDS, 0,25 M Na2PO4, 1,0 mM EDTA) 30 Minuten lang bei 68°C vorhybridisiert, über Nacht bei 68°C mit 5 ml frischer Hybridisierungslösung, die 5 ng/ml der denaturierten Probe enthielt, hybridisiert und dann von der Hybridisierungslösung abgetrennt und folgendermaßen gewaschen: zweimal 5 Minuten lang mit 2X SSC, 1% SDS bei Raumtemperatur; zweimal 15 Minuten lang in 0,1XSSC, 1% SDS bei 68°C; und zweimal 5 Minuten lang in 1X SSC bei Raumtemperatur. Dann wurden die Membranen 10 Minuten lang in Blocking-Puffer (0,2% Casein, 0,5% SDS, PBS) und 20 Minuten lang mit einer 1:5000-Verdünnung von A-VIDx-APTM in Blocking-Puffer inkubiert. Dann wurden sie in Blocking-Puffer 5 Minuten lang, dreimal 10 Minuten lang in Wasch-Puffer (0,5% SDS, PBS) und zweimal 2 Minuten lang in Assay-Puffer (0,1 M Diethanolamin, 1,0 mM MgCl2, pH 10,0) gewaschen und nachfolgend 5 Minuten lang in 0,25 mM Dioxetan in Assay-Puffer inkubiert. Nach Abtropfenlassen überschüssiger Substratlösung wurden die Membranen in Kunststoff eingehüllt und auf einen Röntgenfilm belichtet. 60-minütige Belichtungen, die 10 Minuten, 70 Minuten bzw. 19 Stunden nach der Substratinkubation aufgenommen worden waren, sind in den folgenden Belichtungen gezeigt. Vergleiche von CSDP und CDP-Star sind in den
6 ,7 und8 gezeigt. - Chemolumineszenz-Detektion von DNA-Sequenzleitern
- DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden mit dem Tropix SEQ-lightTM-Kit unter Verwendung von biotinyliertem (–20) Universal-Primer und Einzelstrang-M13 mp18-Templat-DNA durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden an einem 6% Polyacrylamid 8 M Harnstoffgel separiert, auf Tropilon-PlusTM-Nylonmembranen durch Kapillarwirkung transferiert und an der Membran UV-vernetzt (Gesamtstrahlung –120 mJ/cm2). Chemolumineszenz-Detektion wurde durch Inkubieren der Membran für 10 Minuten in Blocking-Puffer (0,2% i-BlockTM, 0,5 % SDS, PBS), für 20 Minuten in Konjugat-Lösung (1/5000-Verdünnung von Avidx-AP Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat in Blocking-Puffer), nachfolgendes Waschen für 1 × 5 Minuten mit Blocking-Puffer, 3 × 5 Minuten mit Waschpuffer (0,5% SDS, PBS) und 2 × 2 Minuten mit Assay-Puffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10) durchgeführt. Jeder Membranstreifen wurde 5 Minuten lang entweder mit 0,25 mM CSPD oder CDP-Star in Assay-Puffer inkubiert. Sämtliche Stufen wurden bei Raumtemperatur in einem großen durch Hitze versiegelten Kunststoffbeutel unter mäßigem Schütteln (140–170 UpM) durchgeführt. Ein Vergleich von CSPD und CDP-Star zu drei Zeitpunkten ist angegeben. Die Zeit nach der Inkubation mit Substrat und die Belichtungszeit auf Kodak XAR-5-Röntgenfilm sind in
9 angegeben. - Ein zusätzliches Testen spiegelt Werte, wie Quantenausbeute (durchgeführt von einem unabhängigen Laboratorium gemäß der nachstehend aufgeführten Vorgehensweise), T1/2 und die Emissionswellenlängenmaxima wider. Dioxetane sind durch die Zahl identifiziert und in den Tabellen ist auf die Zahl folgend die Identität des Substituenten am Adamantylring und, wenn vorhanden, durch die Identität des Z-Substituenten angegeben. Bei den getesteten Ver bindungen steht X für Phosphat. Werte für Quantenausbeute und T1/2 wurden sowohl für das Dioxetan allein in 0,1 molarem DEA als auch der Gegenwart eines Verstärkungsmittels, Sapphire II, erhalten.
- Protokoll zur Bestimmung von Quantenausbeuten
- 500 μl einer 3,2 × 10–4M-Lösung eines Dioxetans in 0,1M DEA, pH 10,0, wurden in ein 12 × 75 mm-Röhrchen bei 20°C eingegeben. Die Lösung wurde in einem gekühlten Wasserbad 10 Minuten lang auf 20°C äquilibriert. 2 μl alkalische Phosphatase-Suspension wurde in das Dioxetan-enthaltende Röhrchen eingegeben und sofort 1 s lang gevortext und in das 20°C warme Wasserbad eingestellt. Das Röhrchen wurde dann in ein MGM Optocomp® I-Luminometer eingesetzt, und das Lichtsignal wurde bei 1-sekündigen Integrationszeiten gemessen. Nach der Messung des Lichtsignals wurde das Röhrchen in das 20°C warme Wasserbad zurückgestellt, und die Messung wurde wiederholt. Die Gesamtzählwerte für das Dioxetan wurden aus den Intensitätsdaten bestimmt. Die für eine gegebene Konzentration an Dioxetan beobachteten Gesamtzählwerte sind das Produkt aus Photonen-Detektionseffizienz (PDE) des Luminometers, der Quantenausbeute des Dioxetans und der Anzahl an Molekülen, die zur Lichtemission in der Lage sind (Konzentration an dephosphorylierten Dioxetanen). PDE für das MGM Optocomp® I-Luminometer wurde zu 2,56 × 10–3 bestimmt, wobei mit einem Biolink®-Absolut-Standard und unter Verwendung der bekannten spektralen Reaktion des PMT des Luminometers und dem bekannten Emissionsspektrum der Dioxetane gemessen worden war. Die Quantenausbeute wird durch Dividieren der gemessenen Gesamtzählwerte durch die PDE und die Konzentration des Dioxetans erhalten.
- Berechnung der Halbwertszeit der Steady State-Lichtemission
- Aus dem Ausleseergebnis des Turner-Luminometers wurde das maximale Signal gemessen. Das maximale Signal minus den Turner-Lichteinheitszählwerten bei 30-, 150-, 300- oder 600-Sekunden-Intervallen wurde berechnet und graphisch gegen die Zeit in Sekunden aufgetragen. Aus dem Graphen wurde eine Exponentialgleichung zur Bestimmung der Halbwertszeit berechnet.
- Die Halbwertszeit der Dioxetane wurde auch direkt aus den Turner-Luminometer-Ausdrucken bestimmt.
- Emissionsmaxima
- Zu 2 ml einer pH 10-Lösung von 0,4 mM Dioxetan, 0,1M Diethanolamin und 1 mM MgCl2 wurde 9,9 × 10–11M alkalische Phosphatase gegeben. Die Lösung wurde 5 Minuten lang in einem Spex-Fluorolog-Fluorimeter äquilibriert und dann 5 Mal bei 0,5 s/nm auf eine Chemolumineszenzemission abgescannt. Das Chemolumineszenz-Emissionswellenlängen-Maximum wurde aufgezeichnet.
- Chemolumineszenz-DNA-Sequenzieren
- Ein DNA-Sequenzieren mit Chemolumineszenz-Detektion wurde wie in dem Tropix SEQ-Light-Protokoll durchgeführt. Kurz gesagt, wurden DNA-Sequenzierungsreaktionen mit biotinylierten Primern unter Verwendung von M13-Einzelstrang-Phagen-DNA als ein Templat initiiert. Die Reaktionen wurden durch 8 M Harnstoff unter Denaturierung von PAGE separiert, horizontal durch Kapillarwirkung auf eine Tropilon-Plus-Nylonmembran transferiert und durch Belichten mit UV-Licht unter Verwendung eines Spectronics SpectroLinger XL-1500 bei 200 mJ/cm2 an die Membran vernetzt. Die Membranen wurden mit Blocking-Puffer (0,2% I-BlockTM, 0,5% Natriumdodecylsulfat/SDS, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/PBS [20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl]) 10 Minuten lang inkubiert, mit einer 1/5000-Verdünnung von Avidx-AP Streptavidin-alkalische Phosphatase in Blocking-Puffer 20 Minuten lang inkubiert, 5 Minuten lang in Blocking-Puffer gewaschen, 3 × 5 Minuten lang mit Waschpuffer (0,5% SDS, PBS) gewaschen, 2 × 5 Minuten mit Assay-Puffer (0,1M Diethanolamin, 1 mM Mgcl2, pH 10) gewaschen und dann mit Dioxetan-Lösung (entweder CSPD, 140-17 oder 128-87, verdünnt auf 0,25 mM in Assay-Puffer) 5 Minuten lang inkubiert. Die Membranen wurden abtropfen gelassen, in eine Kunststoffhülle eingesiegelt und auf einen Kodak XAR-S-Röntgenfilm belichtet. Für das Dioxetan 128-87 betrug die Belichtungszeit 70 Minuten und für 140-17 80 Minuten, jeweils 65 Minuten nach der Substratzugabe. Zum Vergleich des Dioxetans 128-87 gegen CSPD betrug die Membranblichtungszeit 5 Minuten nach einer 24-stündigen Inkubation mit Substrat (
10 und11 ). Die Details dieser Art von Protokoll sind im Tropix SEQ-Light-DNA-Sequenzierungssystems, im Handel von Tropix Inc. erhältlich, wiedergegeben. -
- *nicht gemäß der Erfindung
-
- *nicht gemäß der Erfindung
- Zum positiven Beweis der Wechselwirkung des Dioxetans oder zumindest der Emitterspezies im angeregten Zustand mit den Verstärkungsmitteln der zur Verwendung in Verbindung mit Dioxetanen bekannten Art wurde de Wellenlänge für das Emissionsmaximum in der Abwesenheit eines Verstärkungsmittels, in der Anwesenheit von BDMQ und an einer Nylonmembran detektiert. Die Daten sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
-
- *nicht gemäß der Erfindung
- DOT-BLOT-ASSAYS
- Wie voranstehend angemerkt, sind die Dioxetane dieser Erfindung zur Verwendung in Dot-Blot-Assays geeignet. Die gemäß der voranstehend beschriebenen Syntheseroute synthetisierten Dioxetane wurden in Dot-Blot-Assays eingesetzt. Zur Bestätigung der Abwesenheit einer Chemolumineszenz der Dioxetane, die einen Z-Substituenten in der 6-Position tragen, sollte angemerkt werden, dass Verbindung 140-62 ein konsistentes Fehlen eines Signals oder unter optimalen Bedingungen ein kaum bestimmbares Signal ergab. In ähnlicher Weise ergab das Dioxetan mit dem Methoxy-Substituenten in der Sechs-Position mit einem Chlor-Substituenten am Adamantylring (140-73) kein Signal im Dot-Blot-Assay, was wiederum die fehlende Chemolumineszenzaktivität bei sechs-substituierten Metaphosphatphenyldioxetanen bestätigt (
12 –21 ). - Nitrocellulose- und Nylonmembranen wurden mit einer biotinylierten 35 Basen-Oligonucleotid-Probe betüpfelt. Die Probe wurde in 1X SSC verdünnt, um eine Ausgangsverdünnung von 210 pg zu ergeben. Aufeinanderfolgende 1:2-Verdünnungen der Ausgangsverdünnung wurden auf die Membranen aufgetüpfelt, insgesamt 12 Punkte. Die Membrane wurden getrocknet, einem optimalen UV-Vernetzen (120 mJ/cm2) unterzogen, 30 Minuten lang in Blocking-Puffer (Nitrocellulose: 0,2% I-Block, 0,1 % Tween-20, 1X PBS; Nylon: 0,2% I-Block, 0,5% SDS, 1X PBS) blockiert, 20 Minuten lang in einer 1/5000-Verdünnung von Strepatvidinalkalische Phosphatase-Konjugat, in Blocking-Puffer verdünnt, inkubiert und folgendermaßen gewaschen: 1 × 5 Minuten in Blocking-Puffer; 3 × 5 Minuten in 1X PBS, 0,3% Tween-20 (Nitrocellulose) oder 3 × 5 Minuten in 1X PBS, 0,5% SDS (Nylon); 2 × 5 Minuten in Substrat-Puffer (0,1 M Diethanolamin, 0,1 mM MgCl2, pH 10); 1 × 5 Minuten in einer 1/20-Verdünnung von Nitro-Block (Tropix, Inc. Bedford, MA), verdünnt in Substrat-Puffer (nur Nitrocellulose-Experiment); und 2 × 5 Minuten in Substrat-Puffer (nur Nitrocellulose-Experiment). Die Membranen wurden 5 Minuten lang mit 0,25 mM Dioxetan, verdünnt in Substrat-Puffer, inkubiert. Einige Membranen wurden sowohl in den Nitrocellulose- als auch in den Nylon-Experimenten mit 0,25 mg/ml Calfax DB-45, Calfax 10L-45 oder Calsoft T-60 (Pilot Chemical Company, Los Angeles, CA), 1,0 mg/ml Tween-20, 1,0 mg/ml Nitro-Block und 0,25 mM Dioxetan, verdünnt in Substrat-Puffer, 5 Minuten lang inkubiert. Diese Membranen wurden keiner 1/20-Verdünnung von Nitro-Block unterzogen. Die Membranen wurden dann auf einem Röntgenfilm belichtet und entwickelt.
- Wie aus den voranstehend aufgeführten Ergebnissen ersichtlich ist, ändern an den aromatischen Ring des Dioxetans angefügte Elektronen-ziehende Gruppen die kinetischen Eigenschaften der Lichtemissionen, während sie dazu neigen, das Chemolumineszenzsignal zu erhöhen. Im Gegensatz dazu beschleunigen Elektronen-liefernde Gruppen T1/2 offenbar, indem sie einen Elektronentransfer vom Sauerstoff durch die aromatische Gruppe zum Dioxetan ermöglichen. Somit können durch geeignete Auswahl der Natur und Fähigkeit des Elektronenliefernden oder Elektronen-ziehenden Z-Substituenten und gleichzeitige Auswahl des geeigneten Substituenten für den Adamantylring, wenn dies gewünscht wird, Dioxetane mit spezifischen charakteristischen Eigenschaften erhalten werden, was eine optimierte Signalintensität, eine optimierte Geschwindigkeit, eine spezifische Emissionswellenlänge und dergleichen beinhaltet.
- Diese Dioxetane können für Assays sämtlicher Arten verwendet werden, in denen ein Enzym, das zur Spaltung des Dioxetans in der Lage ist, allein vorhanden ist oder an ein Element des letztlichen Komplexes angefügt werden kann, welches den Analyten, wenn vorhanden, bilden wird. Herkömmliche Assayformate sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind in den voranstehend zum Hintergrund der Erfindung angegebenen Patentschriften beschrieben. Eine exemplarische Offenbarung geeigneter Assays erscheint in der US-PS 5 112 960, und auf diese wird hierin expressis verbis Bezug genommen. Das Assayformat per se bildet mit Ausnahme des verbesserten Leistungsverhaltens durch die Dioxetane dieser Erfindung keinen Gesichtspunkt der Erfindung.
Claims (21)
- Dioxetan der Formel (I): worin Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, eine Hydroxylgruppe, ein Halogen, eine unsubstituierte C1-C12-Alkylgruppe, eine Hydroxy-C1-C12-alkylgruppe, eine Halogen-Cl-C12-alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine C1-C12-Alkoxyphenylgruppe, eine C1-C12-Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxy-C1-C12-alkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine C1-C12-Alkoxygruppe oder eine Carboxylgruppe sind, worin R C1-C12-Alkyl, Phenyl, Naphthyl, Phenyl-C1-C12-alkyl oder Naphthyl-C1-C12-alkyl ist, worin X eine Enzym-labile Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphat, einem Galactosid, einem Acetat, einem 1-Phospho-2,3-diacylglycerid, einem 1-Thio-D-glucosid, einem Adenosintriphosphat, einem Adenosindiphosphat, einem Adenosinmonophosphat, einem Adenosin, einem α-D-Glucosid, einem β-D-Glucosid, einem β-D-Glucuronid, einem α-D-Mannosid, einem β-D-Mannosid, einem β-D-Fructofuranosid, einem β-Glucosiduronat, einem p- Toluolsulfonyl-L-argininester und einem p-Toluolsulfonyl-L-argininamid, worin Z eine Elektronen-aktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cl, OAr, NM3+, NHCOM, NMCOM1, NHCOAr, NHCOOAr, NHCOOM, NMCOOM1, CM3, NO2, COOM, COOAr, NHSO2OM, NHSO2Ar, CF3, Ar, SiM3, SiAr2, SiArM2, SO2NHCOM, SO2NHCOAr, SO2M, SO2Ar, SM und SAr, worin M und M1 unabhängig voneinander C1-6-Alkyl sind und Ar Phenyl oder Naphthyl ist; und worin Z die Vier- oder Fünf-Position an dem Phenylring besetzt.
- Dioxetan nach Anspruch 1, wobei Z ein Chlor- oder Amido-Substituent in der Fünf-Position ist.
- Dioxetan nach Anspruch 2, wobei Z Chlor ist.
- Dioxetan nach Anspruch 1, wobei Z Chlor ist und in der Vier-Position ist.
- Dioxetan nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X eine Phosphatgruppierung ist.
- Dioxetan nach Anspruch 5, wobei R C1-4-Alkyl ist.
- Kit zur Durchführung eines Assays, der ein chemolumineszierendes Dioxetan-Reportermolekül enthält, umfassend das Dioxetan nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und ein Enzym, das dazu in der Lage ist, die Gruppierung X des Dioxetans in wässriger Lösung abzuspalten.
- Kit nach Anspruch 7, der des Weiteren eine Verstärkungssubstanz zur Steigerung des Chemolumineszenzsignals umfasst, das aus dem Dioxetan bei Spaltung der X-Gruppierung in wässriger Lösung erhalten worden ist.
- Kit nach Anspruch 7, wobei der Assay ein Immunoassay ist und das Enzym mit einem Mittel komplexiert ist, das zur Bindung an einen Analyten fähig ist, wobei der Assay durchgeführt wird, um das Vorliegen oder die Konzentration dessen zu detektieren.
- Kit nach Anspruch 7, wobei der Assay ein DNA-Sondenassay ist, und der Kit des Weiteren eine Membran umfasst, an welcher der Assay durchgeführt werden kann.
- Kit nach Anspruch 10, der des Weiteren eine Verstärkungssubstanz zur Steigerung des Chemolumineszenzsignals umfasst, das aus dem Dioxan bei Abspaltung der X-Gruppierung in wässriger Lösung erhalten wird.
- Kit nach Anspruch 10, wobei das Enzym mit einem Mittel komplexiert wird, das wiederum mit einem in einer Probe vorliegenden Analyten komplexiert werden kann, wobei das Vorliegen oder die Konzentration des Analyten dasjenige bzw. diejenige ist, für das bzw. die der Assay durchgeführt wird.
- Kit nach Anspruch 7, wobei der Assay ein DNA-Sequenzanalyseassay ist und der Kit des Weiteren eine Membran umfasst, auf der der Sequenzanalyseassay durchgeführt werden kann.
- Kit nach Anspruch 13, wobei der Kit des Weiteren eine Verstärkungssubstanz zur Steigerung des Chemolumineszenzsignals umfasst, das aus dem Dioxetan bei Abspaltung der X-Gruppierung in wässriger Lösung erhalten worden ist.
- Kit nach Anspruch 13, wobei das Enzym mit einem Mittel komplexiert wird, das das Binden des Enzyms an der in dem Assay zu sequenzierenden DNA ermöglicht.
- Verfahren zur Detektion des Vorliegens eines Enzyms in einer Probe, das das Inkontaktbringen der Probe mit einem Dioxetan nach den Ansprüchen 1 bis 6 und das Detektieren einer dadurch verursachten Freisetzung von Licht umfasst, wobei das Enzym die Enzym-labile Gruppe X abspaltet und wobei die Detektion von freigesetztem Licht das Vorliegen des Enzyms in einer Probe anzeigt.
- Verfahren nach Anspruch 17, wobei die X-Gruppe Phosphat ist und das Enzym alkalische Phosphatase ist.
- Verfahren zum Detektieren eines ersten Glieds eines spezifischen Bindungspaars mit ersten und zweiten Gliedern, umfassend: optisches Detektieren von Chemolumineszenz, die durch die Reaktion eines Dioxetans nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Enzym verursacht worden ist, das die Enzymlabile Gruppe X des Dioxetans abspaltet, wobei das Enzym mit einem zweiten Glied des spezifischen Bindungspaars komplexiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Verfahren einen Immunoassay umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Verfahren einen Nukleinsäuresondenassay umfasst.
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US5603868A (en) * | 1992-10-30 | 1997-02-18 | Abbott Laboratories | Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes |
AU1518195A (en) * | 1993-12-23 | 1995-07-10 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent energy transfer assays |
US5721370A (en) * | 1995-07-31 | 1998-02-24 | Lumigen Inc. | Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds and assay compositions having increased storage stability |
US5777135A (en) * | 1995-07-31 | 1998-07-07 | Lumigen, Inc. | Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions |
US5631167A (en) * | 1995-07-31 | 1997-05-20 | Bayer Corporation | Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence |
AU708266B2 (en) * | 1995-10-17 | 1999-07-29 | Applied Biosystems, Llc | 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance |
US5783381A (en) * | 1995-10-19 | 1998-07-21 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
US5834456A (en) * | 1996-02-23 | 1998-11-10 | The Dow Chemical Company | Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents |
EP0897747B1 (de) * | 1997-01-14 | 2006-04-05 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Nitrierungs- oder carboxylierungskatalysatoren |
JP4519320B2 (ja) * | 1998-07-28 | 2010-08-04 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | ベンゾチアゾールジオキセタン類 |
US6660529B2 (en) * | 1998-07-28 | 2003-12-09 | Pe Corporation | Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes |
US6555698B1 (en) * | 1998-11-17 | 2003-04-29 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor |
JP4668418B2 (ja) * | 1998-12-15 | 2011-04-13 | アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | 多種酵素アッセイ |
CA2370520A1 (en) * | 1999-04-16 | 2000-10-26 | Komandoor Elayavalli Achyuthan | Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates |
US6893827B1 (en) * | 2000-02-07 | 2005-05-17 | Applera Corporation | Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation |
ATE371747T1 (de) * | 2001-01-08 | 2007-09-15 | Applera Corp | Dendritische chemilumineszierende substrate |
US7368296B2 (en) | 2002-01-17 | 2008-05-06 | Applied Biosystems | Solid phases optimized for chemiluminescent detection |
JP2006517413A (ja) * | 2003-02-12 | 2006-07-27 | プロメガ コーポレイション | 光を発光反応から消失させる二重酵素アッセイの方法及びキット |
US7390670B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-06-24 | Lumigen, Inc. | Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide |
US20060079699A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-04-13 | Brooks Edwards | Intermediate compounds and methods for synthesizing chemiluminescent dioxetane substrates |
WO2006029302A2 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Applera Corporation | Dioxetane-nanoparticle assemblies for energy transfer detection systems, methods of making the assemblies, and methods of using the assemblies in bioassays |
US7451802B2 (en) * | 2006-01-25 | 2008-11-18 | Nabco Entrances, Inc. | Slidable door assemblies with automatic pivot latching |
JP2007225547A (ja) * | 2006-02-27 | 2007-09-06 | Fujifilm Corp | 標的物質の疎水部位の検出方法 |
WO2008118445A1 (en) * | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Promega Corporation | Methods to quench light from optical reactions |
CN101462316A (zh) * | 2007-12-19 | 2009-06-24 | 维斯塔斯风力系统有限公司 | 预成型件的制备方法 |
WO2010101839A2 (en) | 2009-03-02 | 2010-09-10 | Life Technologies Corporation | Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes |
EP2590958B1 (de) | 2010-07-08 | 2015-08-26 | Life Technologies Corporation | In-situ-chemilumineszenzsubstrate und assays damit |
KR101960113B1 (ko) * | 2011-05-03 | 2019-03-19 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 섬광 및 백열광 1,2-디옥세탄들 |
CN103772433A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 深圳市美凯特科技有限公司 | 一种用于免疫分析的化学发光试剂amppd的合成方法 |
CN103073589A (zh) * | 2012-12-30 | 2013-05-01 | 杭州师范大学 | 一种1,2-二氧环乙烷类化合物的合成方法 |
CN104557890A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-04-29 | 王国平 | 一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用 |
DE102016119810A1 (de) * | 2016-10-18 | 2018-04-19 | Hamilton Bonaduz Ag | Schichten zum Nachweis von Sauerstoff |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1521089A (en) * | 1975-11-12 | 1978-08-09 | Valeas Srl | Aminoethanol derivatives |
JPS59501589A (ja) * | 1982-08-23 | 1984-09-06 | ジ・オ−ストラリアン・ナシヨナル・ユニバ−シテイ | 3−アミノ−5−ヒドロオキシ安息香酸及びその誘導体ならびに類似体の合成方法 |
US4983779A (en) * | 1986-07-17 | 1991-01-08 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Process for the preparation of vinyl ethers |
US5616729A (en) * | 1986-07-17 | 1997-04-01 | Board Of Governors Of Wayne State University | Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers |
US4956477A (en) * | 1987-12-31 | 1990-09-11 | Tropix, Inc. | Synthesis of 1,2-dioxetanes |
US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
CA1340590C (en) * | 1986-07-24 | 1999-06-08 | John C. Voyta | Chemiluminescence enhancement |
US5112960A (en) * | 1989-07-17 | 1992-05-12 | Bronstein Irena Y | Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes |
US4931223A (en) * | 1986-07-24 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
US5220005A (en) * | 1986-07-24 | 1993-06-15 | Tropix, Inc. | Substituted adamantyl dioxetanes |
US5330900A (en) * | 1987-12-31 | 1994-07-19 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes |
US5538847A (en) * | 1989-07-17 | 1996-07-23 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
US5089630A (en) * | 1987-12-31 | 1992-02-18 | Bronstein Irena Y | Dioxetanes for use in assays |
US4952707A (en) * | 1988-06-30 | 1990-08-28 | Tropix, Inc. | Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes |
US5132204A (en) * | 1989-05-31 | 1992-07-21 | Chiron Corporation | Chemiluminescent double-triggered 1, 2-dioxetanes |
US5326882A (en) * | 1989-07-17 | 1994-07-05 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes |
DE69130668T2 (de) * | 1990-08-30 | 1999-05-20 | Tropix Inc | Chemolumineszente 3-(substituierte adamant-2'-ylidene)1,2-dioxetane |
US5336596A (en) * | 1991-12-23 | 1994-08-09 | Tropix, Inc. | Membrane for chemiluminescent blotting applications |
US5603868A (en) * | 1992-10-30 | 1997-02-18 | Abbott Laboratories | Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes |
-
1994
- 1994-04-25 US US08/231,673 patent/US5582980A/en not_active Expired - Lifetime
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1997
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2000
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