JP2837276B2 - 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類 - Google Patents

改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類

Info

Publication number
JP2837276B2
JP2837276B2 JP6525458A JP52545894A JP2837276B2 JP 2837276 B2 JP2837276 B2 JP 2837276B2 JP 6525458 A JP6525458 A JP 6525458A JP 52545894 A JP52545894 A JP 52545894A JP 2837276 B2 JP2837276 B2 JP 2837276B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
dioxetane
enzyme
assay
chlorine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP6525458A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH07509736A (ja
Inventor
ブロンスタイン，イレーナ
エドワーズ，ブルックス
スパークス，アリソン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TOROPITSUKUSU Inc
Original Assignee
TOROPITSUKUSU Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/057,903 external-priority patent/US5538847A/en
Application filed by TOROPITSUKUSU Inc filed Critical TOROPITSUKUSU Inc
Publication of JPH07509736A publication Critical patent/JPH07509736A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2837276B2 publication Critical patent/JP2837276B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B1/00—Footwear characterised by the material
    • A43B1/0027—Footwear characterised by the material made at least partially from a material having special colours
    • A43B1/0036—Footwear characterised by the material made at least partially from a material having special colours with fluorescent or phosphorescent parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B1/00—Footwear characterised by the material
    • A43B1/0072—Footwear characterised by the material made at least partially of transparent or translucent materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B3/00—Footwear characterised by the shape or the use
    • A43B3/0031—Footwear characterised by the shape or the use provided with a pocket, e.g. for keys or a card
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
    • C07C205/27—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups
    • C07C205/35—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C07C205/36—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system
    • C07C205/37—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
    • C07C205/44—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by —CHO groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/78—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C217/80—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings
    • C07C217/82—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C217/84—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/26—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C271/28—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/40—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C271/58—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/03—Ethers having all ether-oxygen atoms bound to acyclic carbon atoms
    • C07C43/14—Unsaturated ethers
    • C07C43/178—Unsaturated ethers containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C43/1788—Unsaturated ethers containing hydroxy or O-metal groups containing six-membered aromatic rings and other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/18—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C43/196—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/215—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having unsaturation outside the six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/225—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/23—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/30—Compounds having groups
    • C07C43/315—Compounds having groups containing oxygen atoms singly bound to carbon atoms not being acetal carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
    • C07C45/67—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
    • C07C45/673—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton by change of size of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/56—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing hydroxy groups
    • C07C47/565—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing hydroxy groups all hydroxy groups bound to the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/575—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/01—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C65/03—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups monocyclic and having all hydroxy or O-metal groups bound to the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/21—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/40—Esters thereof
    • C07F9/4003—Esters thereof the acid moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/4056—Esters of arylalkanephosphonic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6551—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring
    • C07F9/65512—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/65742—Esters of oxyacids of phosphorus non-condensed with carbocyclic rings or heterocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G3/00—Glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/70—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/74—Adamantanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Electroluminescent Light Sources (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本願は、代理人事案記録番号第4085−061−27 CIPと
して1994年４月25日に提出された米国特許出願第08/
号及び1993年５月７日で提出された米国特許出
願第08/057,903号の優先権を主張するものである。
発明の背景 発明の分野 本発明は、酵素により活性化されて分解し、分解する
間に光を放出する化学発光性1,2−ジオキセタン誘導体
に関する。本ジオキセタン類は、ジオキセタンに結合し
た芳香族環（フェニル又はナフチル）を有することを特
に特徴とし、この芳香族環は、メタ位に、酵素によって
切断され得る、切断されると、ジオキセタンのフェノキ
シアニオン又はナフチルオキシアニオンを残す開裂性な
いし分解性置換基を有し、さらにフェニルの場合はその
４位又は５位に、例えば電子供与又は電子求引基を有す
る。４位又は５位の置換基（Ｚ残基）の種類を選択する
ことによって、ジオキセタンの化学発光特性、特に半減
期、量子収率、S/N比などの特性を変更することができ
る。
発明の背景 1,2−ジオキセタン酵素基質については、高効率の化
学発光リポーター分子として、非常に広範囲の酵素免疫
測定法及び核酸プローブ測定法における使用が確立され
ている。これらの測定法は、放射性同位元素、蛍光発色
団、複雑な色変化、二次反応などに依存する従来の測定
法に替わる、より望ましい方法を供するものである。こ
の目的のために開発されたジオキセタン類としては、米
国特許4,978,614号及び5,112,960号に開示されているも
のが挙げられる。米国特許4,978,614号は、他の物質と
ともに、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メト
キシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−1,2
−ジオキセタンを開示しており、この物質は世界的に注
目され、AMPPDの商品名で市販されている。米国特許5,1
12,960号は、アダマンチル安定環がその橋頭位のいずれ
かにおいて、水素、ハロゲン等の各種置換基によって置
換されている化合物を開示しており、これらの置換基
が、これらがなければ安定又は非活性であるアダマンチ
ル安定基を、ジオキセタン環の分解の動力学に関連する
活性基に変換しているのである。この種類の化合物もま
た、多くの用途においてAMPPDよりも速やかかつ強力な
信号を発するため、同様に国際的に注目された。CSPDは
アダマンチル基に塩素置換基を有するスピロアダマンチ
ル−フェニルホスフェート−ジオキセタンであり、AMPP
Dと同様にマサチューセッツ、ベドフォードのトロピッ
クス社（Tropix,Inc.）により販売されている。
この種類の化合物は、分析物が10-12M又はそれ未満の
ような低濃度で存在する場合の測定法のため、感受性の
増大を特に目的として開発された。この種類の化合物
を、10-12M又はそれ未満の濃度の被検体を検出するため
に、増強剤と併用して使用する場合もある。これらの増
強剤は、天然及び合成水溶性巨大分子を含むものであ
り、詳細には米国特許5,145,772号に開示されている。
好ましい増強剤としては、ポリ（ビニルベンジルトリメ
チルアンモニウムクロリド）（TMQ）、ポリ（ビニルベ
ンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（TBQ）及び
ポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムク
ロリド）（BDMQ）などの水溶性重合性第四級アンモニウ
ム塩が挙げられる。
これらの増強剤は、明らかにジオキセタンが封鎖され
る疏水性環境を供することによって、ジオキセタンリポ
ーター分子による化学発光信号を改良する。体液を使用
するため、ほとんどの測定法において避けることのでき
ない要素である水は、ジオキセタンの化学発光の天然の
「消光剤」である。増強剤分子は明らかに、ジオキセタ
ン分子又は少なくとも励起状態の発光種が存在する微小
環境から水を除外して、化学発光の増強をもたらす。こ
の増強剤とジオキセタンとの相互作用に関連した他の作
用も又、化学発光の増強をもたらす。
ナイロン膜及び処理済みニトロセルロースなど、膜に
基づく測定法において同様の疏水表面をもたらす膜や、
上述したような増強剤の種類のポリマーで被覆した膜を
選択使用することによっても、さらに有利な効果が得ら
れる。
しかし、これらの安定化された化学発光性ジオキセタ
ンリポーター分子の性能を向上し、ジオキセタン類によ
って放出される化学発光信号に依存した免疫測定法にお
ける機械の判読性、感度、及び性能を向上させること
は、本業界にとってはいまだ一般的な目標である。
背景技術において、及び上記で引用したいずれの特許
においても開示されているように、酵素により活性化さ
れるジオキセタン類は、リポーター分子として、ジオキ
セタン環上の芳香族置換基に結合した、酵素に不安定な
基を切断する酵素の基質として使用される。従って、通
常の抗原抗体リガンド結合測定法又は核酸測定法におけ
る核酸プローブにおいては、酵素、例えばアルカリホス
ファターゼは単独で存在するか、あるいは抗原又は抗体
のいずれかと共有結合するか、そうでなければ複合体を
形成する。酵素を有する抗原若しくは抗体、又は核酸プ
ローブを、抗原／抗体又はプローブ／核酸配列との間で
複合体の形成又はハイブリダイゼーションと可能とする
条件で、標的抗原を含んでいる疑いのある被検体又は核
酸配列と混合する。複合体又はハイブリッドを形成しな
かったすべての物質を洗い落とすか分離した後、ジオキ
セタン基質を加える。存在を疑われる被検体が存在する
場合、酵素は、ジオキセタン上の芳香族置換基、例えば
フェニル又はナフチル上の、酵素に不安定な基を切断し
て、フェノキシ又はナフチルオキシアニオン中間体を生
じる。このアニオンが、芳香族環を介した電子伝達によ
り分解し、ジオキセタン環を切断して、２種類のカルボ
ニル化合物を生じる。この切断／分解の過程において、
発光が得られる。
臨床的測定を自動化し、ある程度の処理能力を達成す
るには、半減期、すなわちジオキセタンのT1 ］ ２の連続
的な短縮とリポーター分子が光を最大放出するまでに要
する時間の短縮が必要である。同時に、非常に低濃度、
例えば約10-12M以下の濃度の被検体を検出するには、ジ
オキセタンリポーター分子の信号の強度を向上させるこ
とが必要であり、同時に測定法の全体的な感度を向上さ
せるには酵素以外の物質に誘発される発光を原因とする
バックグラウンドノイズの増大を避けることも必要であ
る。このため、化学発光性ジオキセタンリポーター分子
のさらなる改良が望まれている。
発明の概要 上記目標及びその他の目標は、ジオキセタンに結合し
た芳香族環上の置換基と、酵素に不安定なｍ位の置換基
を特徴とする新しい種類のジオキセタン類によって達成
される。ここで、本発明の新規ジオキセタン類は、以下
の一般式Ｉ、II又はIIIの構造を有する。
式中、ＲはC1−12アルキル、アラルキル又はアリール
であり、好ましくはC1−４アルキルであり、Ｘは酵素に
不安定な基を認識する特定の酵素によって切断されてフ
ェノキシ又はナフトキシアニオンとなる、酵素に不安定
な基であり、好ましくはホスフェート、ガラクトシド又
はグルクロニドである。Y1及びY2はそれぞれ独立して水
素又は電子供与若しくは求引基であり、好ましくは水
素、メトキシ、カルボキシ又はハロゲンであり、最も好
ましくはY1及びY2の一方が水素であり、他方が塩素であ
り、そしてＺは電子活性基であり、最も好ましくは塩
素、アルコキシ、アルキル又はアミドである。Ｚがフェ
ニル環上にある場合、Ｚは４位又は５位に存在する。OX
及びＺがナフチル基上に置換基として存在する場合、米
国特許4,952,707号に開示されているように、ジオキセ
タン環との結合部位と置換部位との間の環の原子の数の
合計が、ジオキセタン環への結合部位と置換部位も含め
て奇数であるように、OXは置換基として存在する。置換
基Ｚは、ジオキセタン環との結合部位に隣接した部位以
外であればナフチル環上のいずれの部位に存在してもよ
い。
電子求引基又は電子供与基であるＺの特定の種類及び
位置を選択することによって、t1 ］ ２すなわち化学発光
半減期、最大発光に至るまでの時間、最大発光波長及び
化学発光信号強度など、ジオキセタンの化学発光態様の
特定の特徴を変更することができる。
図面の簡単な説明 図１及び図２は、ジナトリウム３−（４−メトキシス
ピロ［1,2−ジオキセタン−3,2′−（５′−クロロ）ト
リシクロ［3.3.1.13,7］デカン］−４−イル）−フェニ
ルホスフェートのジオキセタン（CSPD）の性能を、本発
明の化合物であってフェニル残基が、４位に塩素置換基
を有しているジナトリウム２−クロロ−５−（４−メト
キシスピロ［1,2−ジオキセタン−3,2′（５′−クロロ
−）トリシクロ−［3.3.1.13,7］−デカン］−４イル）
−フェニルホスフェート（CDP−Star）と比較したもの
である。図２は、化学発光増強剤であるポリビニルベン
ジルトリブチルアンモニウムクロリドの存在を反映して
いる。
図３は、ビオチン化されたpBR322−35merのナイロン
膜測定におけるCSPD及びCDP−Starとを比較したもので
ある。
図４及び図５は、CSPD及びCDP−Starを比較したナイ
ロン及びPVDF膜を用いて行われたウエスタンブロット法
によるコダック（Kodak）XAR−５フィルムの露光の複写
図である。
図６、図７及び図８は、酵母の遺伝子RPB1に対して、
ナイロン膜を用いて行った測定においてそれぞれ10分、
70分及び19時間CSPD及びCDP−Starをインキュベートし
て比較した場合のＸ線フィルムの複写図である。
図９は、CSPD及びCDPStarを比較した、ナイロン膜を
用いて行った梯子型DNA配列の化学発光検出を反映した
Ｘ線フィルム露光の複写図である。
図10及び図11は、本発明で請求されているジオキセタ
ンを使用して得られたDNA配列のＸ線フィルムの映像の
電子写真による複写図である。これらを、現在市販され
ている標準品であるCSPDと比較している。
図12〜図21は、本発明のジオキセタン類、本発明の範
囲外のジオキセタン類、及び市販されている標準品であ
るCSPD及びAMPPDを用い、記載した膜を用いて行ったド
ットブロット法による測定結果の電子写真による複写図
である。これらの測定を行った膜は、図中に記載してあ
る。
発明の詳細な説明 本発明のジオキセタン類は、ジオキセタンに結合した
芳香族環上の置換基を、決定的な特徴とし、この芳香族
環が、アリールオキシアニオンにおける電子伝達を決定
し、分解と化学発光をもたらす。従って、本発明のフェ
ニルジオキセタン類は、以下の一般式（Ｉ）を有する。
従って、本発明のアダマンチル安定化ジオキセタン類
は、ジオキセタンの結合部位のほかフェニル環上に２種
類の置換基を有し、さらにアダマンチル環上にも０、１
又は２個の非水素置換基を有する。これらの置換基が、
ジオキセタン、そのオキシアニオン及びその分解挙動の
電子的特徴を決定する。各置換基の種類は、以下に述べ
るとおりである。
Ｒは、炭素数１−12のアルキル、アラルキル、シクロ
アルキル又はアリールであってよい。Ｒは好ましくはC1
−C4アルキルであり、より好ましくはC1−C3アルキルで
あり、最も好ましくはメチルである。Ｒの種類は、溶解
性に関しては、異常な被検体又は緩衝液が、特に問題を
引き起こす場合に最適に選ばれる。Y1及びY2はそれぞれ
独立して水素、ヒドロキシ基、ハロゲン置換基、ヒドロ
キシ低級アルキル基、ハロ低級アルキル基、フェニル
基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、アルコキ
シフェノキシ基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、
アミド基、カルボキシル基若しくは置換されたカルボキ
シル基、アルコキシ基及びその他の同様の電子活性種を
示す。Y1及びY2の一方について好ましい種類は、他方が
水素である場合、塩素、ヒドロキシ及びメトキシであ
る。
Ｘは酵素によって切断される残基である。従って、適
当な酵素に適宜接触させることによって、Ｘは分子から
切断して、フェニル環に酸素を結合させたまま、従って
フェノキシアニオンとして残す。Ｘは理想的にはホスフ
ェート、ガラクトシド、アセテート、１−ホスホ−2,3
−ジアシルグリセリド、１−チオ−Ｄ−グルコシド、ア
デノシントリホスフェート、アデノシンジホスフェー
ト、アデノシンモノホスフェート、アデノシン、α−Ｄ
−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルクロ
ニド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−
Ｄ−フルクトフラノシド、β−グルコシドウロネート、
ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル、及
びｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミドであ
る。Ｘは好ましくはホスフェート、ガラクトシド又はグ
ルクロニドであり、最も好ましくはホスフェートであ
る。フェニル環上に置換基を有する場合は、OXはジオキ
セタン環との結合部位を基準としてｍ位にある、つまり
３位に存在することが重要である。
Ｚは、４又は５位のいずれかを占める。Ｚは、電子活
性種（電子供与又は電子求引）の特徴である電子活性置
換基であり、各種ジオキセタン残基を有効に利用する。
例えば、メトキシ基などの電子供与基は、芳香族環のO-
供与基からの遊離電子のジオキセタン環への伝達を促進
することによって、ジオキセタンフェノキシアニオン分
解の過程を促進させる。反対に、電子求引基は、遊離電
子のジオキセタンへの伝達能を低下させ又は阻害し、そ
の結果、分解反応及び発光を遅れさせるが、最終的には
強度の大きい光信号を発する。これは、塩素など、実質
的に発光を促進し、T1 ］ ２を急激に短縮する、アダマン
チル基上の電子求引置換基による効果とは対比的であ
る。６位に置換基を有することが特に好ましくないとい
う事実には、驚くべき意味がある。このように６位が置
換されたフェニルジオキセタン類は、異常に早い分解の
動力学を示し、ほとんど発光を示さない。出願人はこの
理論に限定することを望むわけではないが、このような
挙動は、立体的な面の考慮、つまりオルト位の置換基
が、ジオキセタン環を不安定化（電子伝達ではなく、立
体的な力による不安定化）するようにフェニル環を「回
転」させるためであり、６位の置換基、例えばメトキシ
は、電子伝達には関与しないと考えられている。以下に
述べるように、６位置換フェニルジオキセタン類を用い
た実験では、信号は実質的に得られない。
ジオキセタン環のフェニル置換基は、替わりに などのナフチル（式II及びIII）であってもよい。
ナフチルジオキセタンにおいても、Ｒ、Y1、Y2、Ｘ及
びＺの種類は、フェニルジオキセタンにおけるのと同じ
である。OXは、「メタ」位に制限される替わりに、ナフ
チル環における対応する位置、つまり非共役位、又は米
国特許4,952,707号に記載されているように置換部位と
ジオキセタン環との結合部位の間の炭素原子の数が、結
合部位と置換部位の両方の炭素を含めて奇数であるよう
な位置を占めてもよい。メタ位が置換されたフェニルジ
オキセタン類及び上述したように置換されているナフチ
ルジオキセタン類は一般的には、対応するパラ位に置換
基を有する系や共役系におけるよりも高い量子収率を示
すことが予想されている。
上述したように、Ｚは、ジオキセタンの化学発光の挙
動に干渉しないいかなる電子活性置換基であってもよ
く、従って、非常に広い範囲から選択することができ
る。好ましい電子活性置換基としては、クロロ、アルコ
キシ（−−OR）、アリールオキシ（−−OAr）、トリア
ルキルアンモニウム（−−NR3 +）、アルキルアミド（−
−NHCOR、−−NRCOR′）、アリールアミド（−−NHCOA
r、−NRCOAr、−−NArCOAr）、アリールカルバモイル
（−−NHCOOAr、−−NRCOOAr）、アルキルカルバモイル
（−−NHCOOR、−−NRCOOR′）、シアノ（−−CN）、ニ
トロ（−−NO2）、エステル（−−COOR、−−COOAr）、
アルキル−若しくはアリールスルホナミド（−−NHSO
2R、−−NHSO2Ar）、トリフルオロメチル（−−CF3）、
アリール（−−Ar）、アルキル（−−Ｒ）、トリアルキ
ル−、トリアリール−若しくはアルキルアリールシリル
（−−SiR3、SiAr3、−−SiArR2）、アルキル−若しく
はアリールアミドスルホニル（−−SO2NHCOR、−−SO2N
HCOAr）、アルキル若しくはアリールスルホニル（−−S
O2R、SO2Ar）、及びアルキル−若しくはアリールチオエ
ーテル（−−SR、SAr）が挙げられる。Ｚ置換基の大き
さは一般的には、その溶解性によってのみ制限される。
アルキル、つまりＲ、Ｒ′などについて述べる場合、ア
ルキル残基は１〜12の炭素原子を有すべきである。好適
なアリール残基としては、代表的な残基としてフェニル
及びナフチルが挙げられる。特に好ましい種類は、クロ
ロ及びアルコキシを含む。
上述したような種類のジオキセタン類は、上述したよ
うなＺ置換基を含まないが、ここで一般的に挙げた特許
に開示されている。Ｙ及びＺ置換基を含まずにこの種の
ジオキセタン類を示した特許としては、特許4,962,192
号など、ウエイン州立大学（Wayne state University）
に帰せられる特許が挙げられる。ジオキセタン類のＺ置
換基の置換により、新規トリ置換フェニル1,2−ジオキ
セタンホスフェートの名称を有し、以下に述べるトリ置
換フェニルホスホネートの合成法の開発が必要となっ
た。同一の一般的な合成ルートを、上記で論じたような
所望置換パターンを考慮して、ここに含まれるナフチル
ジオキセタン類に用いることができる。以下に述べるル
ートによるこれらの化合物の合成には、新規トリ置換ベ
ンゼン類の製法が含まれる。従って、以下に述べるよう
に、この種類のジオキセタン類の合成に含まれる代表的
化合物としては、３−クロロ−５−メトキシ−ベンズア
ルデヒドが挙げられる。これらのトリ置換化合物は、各
種合成経路において、重要な中間体であり、この1,3,5
置換パターンが、一般的に好ましく、広く適用可能なパ
ターンである。これらの中間体はこれまでに製造された
ことがないと出願人は信ずるものであり、以下に述べる
合成ルートにおいてアステリスクを付けて記載した。
新規トリ置換フェニル1,2−ジオキセタンホスフェート
類合成 一般的説明 市販の試薬をそのままさらに精製せずに
用いた。ベーカー（Baker）シリカゲル（グラムスケー
ルで60−200メッシュ、ミリグラムスケールで230−400
メッシュ）をフラッシュクロマトグラフィに用いた。31
P NMRスペクトルが、リン酸標準と比較して百万分の数
位（ppm）であると報告された。ジョンズホプキンス大
学（Johns Hospkins University）のJ.L.カチンスキ
（J.L.Kachinski）によって高解像度質量スペクトルに
よる解析が行われた。ジオキセタン３及び４の合成は、
それぞれジオキセタン１及び２について以下に記載した
過程により行われた。分離された中間体に関して、その
収量、融点（正確ではない）及びスペクトルのデータを
要約する。
３−クロロ−５−メトキシ−４−トリフルオロメタンス
ルホニルオキシ−ベンズアルデヒド（５） ５−クロロ−バニリン１（13.0g、70mmol）、クロロ
ホルム（4ml）及びピリジン（16ml）の溶液を、０℃で
撹拌した。無水トリフルオロメタンスルホン酸（12.4m
l、75mmol）を０℃で30分間かけて加え、トリフラート
を完全に生成させた。反応混合物をEtOAc及び3NのHClに
分配し、希ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧
下で蒸発させた。得られた黄色の油をシリカゲルクロマ
トグラフィ（30％etOAc/ヘキサン）で精製し、18.5g（8
3％）のトリフラート５を黄色結晶として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:1705,1590,1461,1425,1225,1205,113
2,1049,875,6241 H NMR（ppm）:3.99（3H,s）,7.44（1H,d,J＝1.6Hz）,
7.57（1H,d,J＝1.7Hz）,9.92（1H,s） ＊３−クロロ−５−メトキシ−ベンズアルデヒド（６） トリフラート５（9g、28mmol）、酢酸パラジウム（I
I）（120mg、0.5mmol）、1,1′−ビス（ジフェニルホス
フィノ）フェロセン（620mg、1mmol）及びHPLCグレード
のCH3CN（10ml）をテフロンで裏打ちしたステンレスス
チール製ボンベ中でよく混合した。調製したばかりの微
粉プロトンスポンジホルマート２（7.84g、30mmol）を
加え、ボンベを密封し、90℃で４時間加熱した。反応物
を冷却後ろ過して、プロトンスポンジの結晶を除去し、
EtOAc及び3NのHClに分配し、それぞれを希ブラインで１
回ずつ洗浄し、NaHCO3で希釈し、Na2SO4で乾燥し、蒸発
させた。シリカゲルクロマトグラフィ（15％、EtOAc/ヘ
キサン）により精製し、融点45℃の4.25g（88.5％）の
クロロメトキシベンズアルデヒド６を得た。
IR（CHCl3,cm-1）:2835,1700（Ｃ＝０）,1590,1576,146
1,1425,1380,1320,1280,1265,1144,1050,850,6951 H NMR（ppm）:3.84（3H,s）,7.13（1H,m）,7.26（1H,
m）,7.41（1H,m）,9.89（1H,s） 質量スペクトル（電圧、70eV）:C8H7ClO2の正確な質量
計算値170.0135、測定値170.0134。
３−クロロ−５−メトキシ−ベンズアルデヒドジメチル
アセタール（７） ベンズアルデヒド６（8.76g、51mmol）のメタノール
溶液（20ml）をトリメチルオルトホルマート（5.62ml、
51mmol）及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下
で、ジメチルアセタール７へ完全に変換させた。pH7の
トリエチルアミンにより反応を停止させ、蒸発させて少
量としてからEtOAc及びNAHCO3に分配した。有機層を乾
燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィ
（10％EtOAc/ヘキサン）により精製して、10.68g（96
％）のアセタール７を淡黄色の油として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:2960,2938,2830,1596,1578,1458,127
0,1104,1050, 989,872,865,8401 H NMR（ppm）:3.31（6H,s）,3.79（3H,s）,5.31（1H,
s）,6.85（1H,s）,6.88（1H,s）,7.04（1H,s）． ジエチル １−メトキシ−１−（３−クロロ−５−メト
キシ−フェニル）−メタンスルホネート（８） アセタール７（4.0g、18.5mmol）、ボロントリフルオ
リドエテラート（2.3ml、19mmol）及びCH2Cl2（20ml）
の溶液に、トリエチルホスファイト（3.2ml、19mmol）
を０℃で加えた。反応物を室温まで徐々に温めた後（30
分）、溶液を希NaHCO3に分配し、Na2SO4で乾燥し、蒸発
させ、シリカゲル（40％−100％EtOAc/ヘキサン）で精
製して、4.6g（77.5％）のホスホネート８を淡黄色の油
として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:2990,1591,1573,1458,1254（Ｐ＝
０）,1050（Ｐ−Ｏ）,1025（Ｐ−Ｏ）,969,870,6871 H NMR（ppm）:1.24（3H,t,J＝7Hz）,1.26（3H,t,J＝7H
z）,3.37（3H,s）,3.78（3H,s）,4.01−4.09（4H,m）,
4.40（1H,d,J＝16Hz）,6.83（1H,t,J＝2Hz）,6.88（1H,
qt,J＝2Hz）,6.98（1H,qt,J＝2Hz） ３−クロロ−５−メトキシ−１−（メトキシ−トリシク
ロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデン−メチル）−ベン
ゼン（９） ホスホネート８（4.62g、14mmol）及び２−アダマン
タノン（2.58g、17mmol）をアルゴン下で無水THF（35m
l）に溶解し、−68℃に冷却した。無水THF（20ml）に溶
解したリチウムジイソプロピルアミド（18.6mmol）を−
68℃で滴下してイリドを生成し、その後、ケトンオレフ
ィン化した。反応物を２時間かけて徐々に室温にまで温
め、75℃で１時間撹拌した。本溶液をEtOAc/NH4Clに分
配し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させ、シリカゲルクロマト
グラフィ（２％EtOAc/ヘキサン）により精製し、2.5g
（55％）のエノールエーテル９を油として得た。1 H NMR（ppm）:1.55−1.95（12H,m）,2.61（1H,br s）,
3.21（1H,br s）,3.28（3H,s）,3.78（3H,s）,6.74（1
H,s）,6.80（1H,s）,6.87（1H,s） ３−クロロ−５−ヒドロキシ−１−（メトキシ−トリシ
クロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデン−メチル）−ベ
ンゼン（10） エタンチオール酸ナトリウム（11.7mmol）の存在下
で、エノールエーテル９（2.5g、7.8mmol）をDMF（14m
l）中155℃で加熱することによって、エノールエーテル
フェノール10への脱メチル化を完全に進行させた。冷却
後、混合物をEtOAc及びNH4Clに分配し、Na2SO4により乾
燥し、高減圧下で蒸発させて残存しているDMFを除去し
た。クロマトグラフィによる精製（シリカゲル、20％Et
OAc/ヘキサン）により、2.3g（96％）のフェノール10を
油として得、この油は放置したところ結晶化した。この
固体を５％EtOAc/ヘキサンにより粉末化したところ、融
点133℃の白色結晶が得られた。
IR（CHCl3,cm-1）:3584（OH）,3300（OH）,2910,1590,1
310,1285,1163,1096,1080,1011,900,8401 H NMR（ppm）:1.73−1.96（12H,m）,2.62（1H,br s）,
3.20（1H,br s）,3.32（3H,s）,5.65（3H,br s）,6.73
（1H,s）,6.79（1H,m）,6.85（1H,s） ピリジニウム ３−クロロ−５−（メトキシ−トリシク
ロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデン−メチル）−１−
フェニルホスフェート（11） 無水THF（10ml）に溶解したエノールエーテル10（709
mg、2.3mmol）にアルゴン雰囲気下でトリエチルアミン
（450μｌ、3.2mmol）を加えた。本溶液を０℃に冷却
し、この時に２−クロロ−２−オキソ−1,3,2−ジオキ
サホスホレーン（フルカ（Fluka）、285μｌ、3.0mmo
l）を滴下した。反応物を室温にまで温め、非活性雰囲
気下でアルゴンフラッシュカラム中を速やかに通過させ
て塩酸トリエチルアンモニウムの結晶を除去した。結晶
ケーキをTHFで１回濯いだ後、溶液を蒸発させ、ポンプ
で乾燥させて、粗ホスホレーン11aを得た。
11aを無水DMF（6ml）中アルゴン下でNaCN（真空乾燥
したもの、179mg、3.65mmol）と反応させて、ホスホレ
ーン環を開環し、所望のβ−シアノエチルジエステルホ
スフェート11bを得るとともに、エノールエーテルフェ
ノール10を再び生成した。フラスコを55℃にまで温めな
がら、高真空下でDMFを除去し、化合物10及び11bの混合
物を黄橙色の油として得た。
上記混合物をメタノール（8ml）に溶解し、NaOMe（1m
lの4.25MのNaOMe/MeOH、6.4mmol）の存在下40℃で撹拌
して、シアノエチル基のβ脱離を行い、エノールエーテ
ルホスフェート11をジナトリウム塩として得た。メタノ
ールを蒸発させた後、固体を水に溶解し、最少量のEtOA
cに分配して、フェノール10（333mg）を回収した。CH3C
N/H2Oグラジエントを用い、ポリスチレンカラム（PLRP
−Ｓ、ポリマーラボラトリーズ（Polymer Laboratorie
s））による分取HPLCにより水層を精製し、さらにピリ
ジニウムトルエンスルホネート（アンバーリストIR−12
0（Amberlyst−IR 120）＋樹脂）によるイオン交換を行
い、凍結乾燥を行って、448mg（３段階にわたって78
％、回収されたフェノールのため）のエノールエーテル
ホスフェート11を、けば立ったオフホワイト色の粉末と
して得た。
IR（CHCl3,cm-1）:2910,1590,1567,1278,1160,1095,9451 H NMR（ppm）:1.73−1.96（12H,m）,2.63（1H,br s）,
3.20（1H,br s）,3.32（3H,s）,5.89（1H,s）,6.72（1
H,m）,6.79（1H,t,J＝2Hz）,6.85（1H,d,J＝2Hz）31 P NMR（ppm）:54（1P） ジナトリウム ３−クロロ−５−（メトキシ−スピロ
［1,2−ジオキセタン−3,2′−トリシクロ［3.3.1.
13,7］−デカン］−４−イル）−１−フェニルホスフェ
ート（１） エノールエーテルホスフェート11及び5,10,15,20−テ
トラフェニル−21H,23H−ポルフィン（TPP、0.5mlの２
重量％CHCl3溶液）のCHCl3溶液（8ml）を、溶液に酸素
流を通過させながら、250Wの高圧ナトリウムランプで10
℃で照射した。ランプと反応混合物の間に5milのカプト
ン（Kapton）ポリイミドフィルム片（デュポン（DuPon
t）社）を配置して、望ましくない紫外線照射を遮っ
た。分取HPLC（270nm紫外線検出器）により、５分間の
照射によりジオキセタンが完全に生成したことが認めら
れた。０℃でクロロホルムを蒸発させた後、残渣をNa2C
O3（27mg、0.25mmol）の存在下で氷水に溶解し、上述し
たように分取HPLCにより精製した。分画を凍結し、０℃
で凍結乾燥して、65.3mg（90％）のジオキセタン１をけ
ば立った白色粉末として得た。ジオキセタンのTLCによ
り、加熱による熱分解により、青色の化学発光が示され
た。ホスフェートの酵素による開裂によっても水溶液中
で化学発光性分解が誘発された。1 H NMR（D2O,ppm）:0.93（1H,d,J＝13Hz）,1.21（1H,d,
J＝13Hz）,1.44−1.69（10H,m）,2.16（1H,br s）,2.78
（1H,brs）,3.14（3H,s）,7.20（2H,br s）,7.30（1H,
s）31 P NMR（D2O,ppm）:24（1P） ３−クロロ−５−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドジメチ
ルアセタール（12） ５−クロロ−３−メトキシ−ベンズアルデヒドジメチ
ルアセタール（７、3.21g、14.8mmol）を、150℃で加熱
しながら、DMF（14ml）中でエタンチオール酸ナトリウ
ム（19mmol）により脱メチル化した。得られたフェノー
ル12を冷却し、EtOAc及びNH4Clに分配し、NaSO4で乾燥
し、高真空でポンプにより蒸発乾固させて、残存してい
たDMFを除去した。クロマトグラフィによる精製（シリ
ガゲル、20％EtOAc/ヘキサン）により、2.75g（92％）
のフェノール12が黄色の油として得られた。この油の分
析サンプルは、さらに精製することによって、融点153
℃の結晶となった。
IR（CHCl3,cm-1）:3580（OH）,3325（OH）,2940,2830,1
599,1585,1449,1350,1155,1105,1055,894,845.1 H NMR（ppm）:3.32（6H,s）,5.30（1H,s）,5.73（1H,b
r s）,6.81（2H,m）,7.01（1H,s）． ３−クロロ−５−ピバロイルオキシ−ベンズアルデヒド
ジメチルアセタール（13） フェノール12（2.7g、13.3mmol）及びトリエチルアミ
ン（2.8ml、20mmol）をCH2Cl2（20ml）中０℃で撹拌し
た。トリメチルアセチルクロリド（1.64ml、13.3mmol）
を加えたところ、ピバロイルエステルが完全に生成し
た。標準的な操作により、粗ピバロエート13が油として
得られ、これを生成せずに次の反応に供した。重量は測
定しなかった。少量のサンプルを、スペクトルによる同
定のために分取TLCにより精製した。
IR（CHCl3,cm-1）:2980,2940,1749（Ｃ＝０）,1585,144
8,1349,1250,1150,1109,1056,8981 H NMR（ppm）:1.34（9H,s）,3.31（6H,s）,5.36（1H,
s）,7.06（2H,br s）,7.31（1H,s） ジエチル １−メトキシ−１−（３−クロロ−５−ピバ
ロイルオキシフェニル）メタンホスホネート（14） アセタール13、ボロントリフルオリドエテラート（2.
6ml、21mmol）及びCH2Cl2（10ml）の溶液を−78℃で撹
拌した。トリエチルホスファイト（3.0ml、17.5mmol）
を加えて、このアセタールをホスホネート14に変換させ
た。操作と精製（シリカゲル、10％EtOAc/ヘキサン）に
より、2.43gの油が得られた（２段階で47％）。
IR（CHCl3,cm-1）:2995,2980,1750（Ｃ＝Ｏ）,1600,158
1,1442,1247（Ｐ＝Ｏ）,1110,1028（Ｐ−Ｏ）,975,8901 H NMR（ppm）:1.22−1.26（6H,d of t,J＝2Hz,7Hz）,
1.31（9H,s）,3.39（3H,s）,4.02−4.08（4H,m）,4.44
（1H,d,J＝16Hz）,7.04（2H,m）,7.27（1H,br s） ３−クロロ−５−ピバロイルオキシ−１−（メトキシ−
５−クロロ−トリシクロ［3.3.1.13,7］−デカ−２−イ
リデンメチル）ベンゼン（15） ホスホネート14（2.4g、6.1mmol）をアルゴン下、無
水THF（10ml）に溶解し、−68℃に冷却した。無水THF
（7ml）に溶解したリチウムジイソプロピルアミド（6.6
mmol）を低温で滴下し、濃色の発色によって証明される
イリドを生成させた。５分後、５−クロロ−２−アダマ
ンタノン（941mg、5mmol）のTHF溶液を加え、反応物を4
0分かけて室温にまで徐々に温め、次いで75℃で１時間
加熱して、完全にオレフィン化を行った。本溶液をEtOA
c/NH4Clに分配し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、エノ
ールエーテルピバロエート15及び対応するエノールエー
テルフェノール16の粗混合物を得た。粗油を、以降の加
水分解には精製せずに用いた。少量のサンプルを、スペ
クトルの定性用に分取TLCにより精製した。
IR（CHCl3,cm-1）:2935,1750（Ｃ＝Ｏ）,1595,1571,145
0,1420,1397,1275,1160,1110,1024,918,906,887,8291 H NMR（ppm）:1.34（9H,s）,1.68−1.78（4H,m）,2.14
−2.25（7H,m）,2.77（1H,br s）,3.30（3H,s）,3.42
（1H,br s）6.88（1H,d,J＝1.5Hz）,7.04（1H,m）,7.11
（1H,d,J＝1.5Hz） ３−クロロ−５−ヒドロキシ−１−（メトキシ−５−ク
ロロ−トリシクロ［3.3.1.13,7］−デカ−２−イリデン
メチル）ベンゼン（16） 粗ピバロエート15を、K2CO3（1.45g、10.5mmol）によ
りメタノール10ml中室温で加水分解した。メタノールの
蒸発後、標準的な操作と精製（シリカゲル、30％EtOAc/
ヘキサン）により、微黄色の油1.095g（２段階にわたっ
て63％）を得た。この物質は、放置すると固化した。こ
の固形物を粉末化することによって融点130℃の白色結
晶のエノールエーテルフェノール16が得られた。
IR（CHCl3,cm-1）:3590（OH）,3300（OH）,2935,1595,1
163,1100,1082,1030,9111 H NMR（ppm）:1.69−1.83（4H,m）,2.14−2.27（7H,
m）,2.77（1H,br s）,3.30（3H,s）,3.41（1H,br s）,
5.21（1H,br s）,6.67（1H,d,J＝1.5Hz）.6.81（1H,
m）,6.84（1H,d） ジナトリウム ３−クロロ−５−（メトキシスピロ［1,
2−ジオキセタン−3,2′−（５−クロロ−）トリシクロ
−［3.3.1.13,7］−デカン］４−イル）−１−フェニル
ホスフェート（２） 無水THF（5ml）に溶解したエノールエーテル16（356m
g、1.05mmol）にアルゴン雰囲気下でトリエチルアミン
（230μｌ、1.65mmol）を加えた。溶液を０℃に冷却
し、この時に２−クロロ−２−オキソ−1,3,2−ジオキ
サホスホレーン（フルカ（Fluka）、143μｌ、1.55mmo
l）を滴下した。反応物を室温に温め、不活性雰囲気下
でアルゴンフラッシュカラムに速やかに通過させて塩酸
トリエチルアンモニウム結晶を除去した。結晶ケーキを
THFで１回濯いだ後、溶液をポンプで蒸発乾固させて粗
ホスホレーン17aを得た。
アルゴン下無水DMF（5ml）中NaCN（真空乾燥したも
の、69mg、1.4mmol）により、ホスホレーン環を開環し
て所望のβ−シアノエチルジエステルホスフェート17b
を得た。フラスコを55℃にまで温めながら高真空でDMF
を除去して、粗ジエステルホスフェートを橙色の油状物
質として得た。
シアノエチルホスフェート17b及び5,10,15,20−テト
ラフェニル21H,23H−ポルフィン（TPP、２重量％CHCl3
溶液1.5ml）のCHCl3溶液（10ml）を、溶液に酸素流を通
過させながら、250Wの高圧ナトリウムランプで10℃で照
射した。ランプと反応混合物の間に5mil片のカプトン
（Kapton）ポリイミドフィルム（デュポン（DuPont）
社）を配置して、望ましくない紫外線照射を遮った。分
取HPLC（270nm紫外線検出器）により、15分間の照射に
よりジオキセタンが完全に生成したことが認められた。
０℃でクロロホルムを蒸発させた後、残渣をメタノール
に溶解し、NaOMe（0.5mlの4.25MNaOMe/MeOH、2mmol）に
より保護基を脱離させてジナトリウムホスフェートジオ
キセタンとした。シアノエチル基のβ−脱離に際し、溶
媒を０℃で蒸発させ、残渣を氷水に溶解した。上述した
ような分取用HPLCによる精製と、０℃での凍結乾燥の結
果、、289mg（４段階にわたって60℃）のジオキセタン
２をけば立った白色粉末として得た。1 H NMR（D2O,ppm,シン−アンチ異性体の混合物）:0.86
（1H,d）,1.13（1H,d,J＝14Hz）,1.30（1H,d）,1.37（1
H,d）,1.45−2.07（18H,m）,2.27（1H,br s）,2.32（1
H,Sb s）,2.95（2H,br s）,3.09（3H,s）,3.11（3H,
s）,7.0−7.3（4H,br s）,7.25（1H,s）,7.28（1H,s） 3,5−ジメトキシ−ベンズアルデヒドジメチルアセター
ル（18） IR（CHCl3,cm-1）:2958,2935,1598,1460,1426,1357,119
0,1154,1101,1053,8401 H NMR（ppm）:3.32（6H,s）,3.78（6H,s）,5.28（1H,
s）,6.41（1H,m）,6.60（2H,m） ３−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンズアルデヒドジメ
チルアセタール（19） IR（CHCl3,cm-1）:3590（OH）,3345（OH）,2940,2830,1
600,1462,1432,1355,1190,1150,1110,1055,8411 H NMR（ppm）:3.32（6H,s）,3.77（3H,s）,5.28（1H,
s）,6.37（1H,d,J＝2Hz）,6.53（1H,br s）,6.58（1H,b
r s） ３−メトキシ−５−ピバロイルオキシ−ベンズアルデヒ
ドメチルアセタール（20）（３段階かけて73％、油） IR（CHCl3,cm-1）:2960,2935,1741（Ｃ＝Ｏ）,1608,159
7,1462,1350,1273,1190,1139,1115,1056,999,902,8481 H NMR（ppm）:1.34（9H,s）,3.31（6H,s）,3.80（3H,
s）,5.35（1H,s）,6.57（1H,d,J＝2Hz）,6.75（1H,br
s）,6.87（1H,br s） ジエチル １−メトキシ−１−（３−メトキシ−５−ピ
バロイルオキシフェニル）メタンホスホネート（21）
（40％、油） IR（CHCl3,cm-1）:2990,2980,2742（Ｃ＝Ｏ）,1606,159
0,1463,1272,1240,1136,1110,1100,1055,1023,9701 H NMR（ppm）:1.21（3H,t,J＝3Hz）,1.23（3H,t）,1.3
2（9H,s）,3.39（3H,s）,3.78（3H,s）,4.06（4H,m）,
4.44（1H,d,J＝16Hz）,6.56（1H,m）,6.72（1H,m）,6.8
5（1H,m） ３−メトキシ−５−ピバロイルオキシ−１−（メトキシ
−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチ
ル）−ベンゼン（22a） IR（CHCl3,cm-1）:2910,1740（Ｃ＝Ｏ）,1600,1580,146
0,1325,1272,1140,1114,1097,10551 H NMR（ppm）:1.35（9H,s）,1.56−1.96（12H,m）,2.6
8（1H,br s）,3.23（1H,br s）,3.31（3H,s）,3.80（3
H,s）,6.53（1H,t,J＝2Hz）,6.61（1H,br s）,6.72（1
H,m） ３−ヒドロキシ−５−メトキシ−１−（メトキシ−トリ
シクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチル）−ベ
ンゼン（22）（64％、融点159℃の白色結晶） IR（CHCl3,cm-1）:3590（OH）,3320（OH）,2910,1591,1
342,1150,10981 H NMR（ppm）:1.78−1.97（12H,m）,2.68（1H,br s）,
3.23（1H,br s）,3.33（3H,s）,3.78（3H,s）,5.49（1
H,s）,6.37（1H,m）,6.45（2H,m） ピリジニウム ５−メトキシ−３−（メトキシ−トリシ
クロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチル）−１−
フェニルホスフェート（23）（62％、オフホワイト色の
けば立った粉末） IR（CHCl3,cm-1）:2911,1584,1448,1425,1328,1149,109
9,960,8701 H NMR（ppm）:1.68−1.92（12H,m）,2.63（1H,br s）,
3.17（1H,br s）,3,23（3H,s）,3.68（3H,s）,6.55（1
H,br s）,6.72（1H,br s）,6.76（1H,br s）,6.98（1H,
br s） ジナトリウム ５−メトキシ−３−（メトキシスピロ
［1,2−ジオキセタン−3,2′−トリシクロ［3.3.1.
13,7］デカン］−４−イル）−１−フェニルホスフェー
ト（３）（85％、白色のけば立った粉末） 1H NMR（D2O,ppm）:0.98（1H,br d）,1.22（1H,br d）,
1.46−1.76（10H,m）,2.20（1H,br s）,2.78（1H,br
s）,3.14（3H,s）,3.74（3H,s）,6.91（1H,br s）,6.68
−6.97（2H,非常に幅広の信号）31 P NMR（D2O,ppm）:44.8（1P） ３−ヒドロキシ−５−メトキシ−１−（メトキシ−５−
クロロ−トリシクロ［3.3.1.3,7］−デカ−２−イリデ
ンメチル）ベンゼン（24）（63％、融点134℃の白色結
晶） IR（CHCl3,cm-1）:3590（OH）,3330（OH）,2930,1610,1
591,1450,1430,1341,1150,1100,1080,1056,1028,8291 H NMR（ppm）:1.68−2.40（11H,m）,2.82（1H,br s）,
3.31（3H,s）,3.42（1H,br s）,3.78（3H,s）,6.37−6.
41（3H,m） ジナトリウム ５−メトキシ−３−（メトキシスピロ
［1,2−ジオキセタン−3,2′−（５−クロロ−）トリシ
クロ［3.3.1.13,7］−デカン］−４−イル）−１−フェ
ニルホスフェート（４）（４段階かけて57％、白色のけ
ば立った粉末） 1H NMR（D2O,ppm,シン−アンチ異性体の混合物）:0.94
（1H,br d）,1.19（1H,br d）,1.42（1H,br d）,1.50
（1H,br s）,1.58（1H,br d）,1.67−2.16（17H,m）,2.
38（1H,br s）,2.40（1H,br s）,3.00（2H,br s）,3.15
（3H,s）,3.16（3H,s）,3.73（3H,s）,3.74（3H,s）,6.
90（1H,br s）,6.93（1H,br s）,6.65−7.00（4H,非常
に幅広の信号）31 P NMR（D2O,ppm,シン−アンチ異性体の混合物:44.8
（2P）参考 1. ５−クロロバニリンは、ハン（Hann）及びスペンサ
ー（Spencer）（J.Am.Chem.Soc.,1927,49:535−537）が
記載しているように合成した。融点163℃。
2. プロトンスポンジホルマート（N,N,N′,N′−テト
ラメチル−1,8−ナフタレンジアンモニウムホルマー
ト）：ギ酸（98％、1.2ml、31mmol）を、プロトンスポ
ンジ（6.8g、32mmol）及びCH2Cl2（8ml）の溶液に０℃
で加えた。溶液を室温まで温めた後、溶媒を蒸発させ、
最小限温めて高真空で乾燥しながら、プロトンスポンジ
ホルマートを結晶化させて白色結晶を得た。プロトンス
ポンジホルマートの結晶（融点79℃）は、調製後速やか
に使用しなければならない。放置することによってギ酸
が蒸発して、プロトンスポンジ（融点50℃）となってし
まうからである。
３−メトキシ−５−ニトロ−４−ヒドロキシ−ベンズア
ルデヒドジメチルアセタール（25） ５−ニトロバニリン（5.0g、97％、18.4mmol）のメタ
ノール溶液（30ml）を、トリメチルオルトホルマート
（2.8ml、25mmol）及び触媒量のｐ−トルエンスルホン
酸の存在下でジメチルアセタール25に完全に変換させ
た。pH8のトリエチルアミンにより反応を失活させ、蒸
発させて少量とし、EtOAc及びNaHCO3に分配させた。水
層をEtOAcにより１回洗浄し、有機層をNa2SO4により乾
燥し、デカンテーションを行い、蒸発させて橙赤色の油
を得た。この油はポンプを用いて乾燥したところ結晶化
した。50％EtOAc/ヘキサンにより再結晶して、5.55g（9
3％）の融点58〜59℃のアセタール25を、赤橙色の結晶
として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:3300,3010,2930,2820,1620,1543,146
0,1445,1392,1341,1320,1254,1132,1101,1058,990,8651 H NMR（ppm）:3.31（6H,s）,3.94（3H,s）,5.31（1H,
s）,7.22（1H,d,J＝1.7Hz）,7.78（1H,d） ３−メトキシ−５−ニトロ−４−トリフルオロメタンス
ルホニルオキシ−ベンズアルデヒドジメチルアセタール
（26） ジメチルアセタール25（5.0g、20.6mmol）、クロロホ
ルム（3ml）及びピリジン（8ml）の溶液を、アルゴン下
０℃で撹拌した。０℃で10分間かけて無水トリフルオロ
メタンスルホン酸（4.0ml、23.8mmol）を加え、室温で
一晩撹拌して、トリフレートを完全に生成させた。油状
物質を45℃にまで温めながら、高真空で溶媒を蒸発させ
て、痕跡量のピリジンをトルエン4mlで除去した。得ら
れた油を高真空でよくポンプにより乾燥して、50％EtOA
c/ヘキサンに溶かして50％EtOAc/ヘキサンと共にすり潰
し、微細なピリジニウムトリフラート結晶から所望のト
リフラート（溶液中）を分離した。粉末化溶液を蒸発
し、30％EtOAc/ヘキサンにより溶離を行ってシリカゲル
カラムにより油を精製し、6.43g（84％）のトリフラー
ト26を淡黄色の油として得た。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm）:3.35（6H,S）,4.00（3H,s）,5.42（1H,
s）,7.42（1H,d,J＝1.6Hz）,7.73（1H,d） ＊３−メトキシ−５−ニトロ−ベンズアルデヒドジメチ
ルアセタール（27） ５−ニトロフェニルトリフラート26（7g、18.7mmo
l）、酢酸パラジウム（II）（88mg、0.39mmol）、1,1′
−ビス（ジフェニル−ホスフィノ）フェロセン（430m
g、0.78mmol）及びHPLCグレードのCH3CN（10ml）を、テ
フロンで裏打ちしたステンレススチール製ボンベ中でよ
く混合した。調製したしたばかりの微粉プロトンスポン
ジホルマート（5.1g、19.6mmol）を加え、ボンベを密封
し、90℃で２時間加熱した。反応混合物をEtOAcに溶か
して、シリカゲルプラグを通過させ、０−30％EtOAc/ヘ
キサンにより溶離を行ってシリカゲルカラムにより精製
し、1.5g（35％）のメトキシニトロベンズアルデヒドア
セタール27を得た。
IR（CHCl3,cm-1）:3005,2960,2935,2835,1532（−N
O2）,1463,1450,1343（−NO2）,1280,1190,1158,1104,1
055,990,8711 H NMR（ppm）:3.33（6H,s）,3.89（3H,s）,5.41（1H,
s）,7.33（1H,s）,7.68（1H,s）,7.92（1H,s） ジエチル １−メトキシ−１−（３−メトキシ−５−ニ
トロフェニル）メタンホスホネート（28） トリエチルホスファイト（0.98ml、5.7mmol）を、ジ
メチルアセタール27（1.08g、4.7mmol）、ボロントリフ
ルオリドエテラート（1.2ml、9.8mmol）及びCH2Cl2（10
ml）の溶液に０℃で滴下した。反応物を一晩かけて室温
に温めた後、溶液を3NのHClに分配し、水層をCH2Cl2で
２回洗浄した。有機層を、希NaHCO3で洗浄し、Na2SO4で
乾燥し、デカンテーションを行って、蒸発させた。０−
80％EtOAc/ヘキサンで溶離を行って粗残渣をシリカゲル
カラムにより精製し、1.36g（86％）のホスホネート28
を淡黄色の油として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:2995,1532（−NO2）,1350（−NO2）,
1280,1258,1243,1096,1053,1025,973,7211 H NMR（ppm）:1.28（6H,t,J＝7.1Hz）,3.44（3H,s）,
3.90（3H,S）,4.08−4.15（4H,m）,4.55（1H,d,J＝16H
z）,7.34（1H,d）,7.69（1H,d,J＝2.1Hz）,7.87（1H,d,
J＝1.6Hz） ジエチル １−メトキシ−１−（３−アミノ−５−メト
キシフェニル）メタンホスホネート（29） ニトロホスホネート28をメチレンクロリドに溶解し、
これを、ｎ−Bu4NBr及びヒドロ亜硫酸ナトリウムを含む
1M NaOH溶液に加える。２層性の溶液を、ニトロ置換基
のアニリン29への還元反応が終了するまで、必要であれ
ば加熱しながら激しく撹拌する。冷却した溶液をCH2Cl2
及び最小限の水に分配し、水層を必要であればCH2Cl2で
洗浄して、粗アニリンを得る。有機層を集めて乾燥し、
デカンテーションを行い、蒸発させる。残渣を短いシリ
カゲルプラグに通過させてアニリン29を得る。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm） （このほかの還元条件に関する参考文献は、合成法の要
約に追加した。） ジエチル １−メトキシ−１−（３−メトキシ−５−ト
リフルオロアセタミドフェニル）メタンホスホネート
（30） CH2Cl210mlに溶解した無水トリフルオロ酢酸（1eq）
及びトリエチルアミン（1.3eq）を０℃で加えることに
よって、ホスホネート29を定量的にアセチル化する。溶
媒を蒸発させ、シリカゲルカラムによる精製により、ト
リフルオロアセタミド30を得る。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm）： ３−メトキシ−５−トリフルオロアセタミド−１−（メ
トキシトリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデン−
メチル）ベンゼン（31） ホスホネート30を無水THFに溶解し、アルゴン雰囲気
下で−68℃に冷却する。同様に別のフラスコで２−アダ
マンタノン（1.1eq）を無水THFに溶解し、アルゴン下で
−68℃に冷却する。このホスホネート溶液に、イリドの
赤色が持続するようになるまで、アルゴン下−68℃で2.
5Mのｎ−BuLiを加える。この時点で、1.2epのｎ−BuLi
を加えて、イリド生成を終了させ、得られる着色溶液を
−68℃で５分間撹拌する。低温を維持しながら、THFに
溶解した２−アダマンタノンを１時間かけてイリドに徐
々に加える。ケトンを最終的に加えた後に、反応混合物
を、室温に温めながら２時間撹拌する。反応物を１時間
還流しながら加熱し、冷却し、EtOAc及び飽和NH4Clに分
配することによって、失活させた。有機層をNa2SO4によ
り乾燥し、シリカゲルカラムを用いてEtOAc/ヘキサンに
よりクロマトグラフによる分離を行って、エノールエー
テル31を得る。
IR（CHCl3,cm-1）：1 H NMR（ppm）： ３−アミノ−５−メトキシ−１−（メトキシトリシクロ
［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチル）ベンゼン
（32） トリフルオロアセタミドエノールエーテル31を、痕跡
量の水を含有するMeOH中、微細に粉砕したK2CO2（3eq）
により60℃で加水分解する。混合物を、EtOAc/H2Oに分
配し、シリカゲルクロマトグラフィによる精製を行っ
て、エノールエーテルアニリン32を得る。
IR（CHCl3,cm-1）：1 H NMR（ppm）： ３−カルバモイル−５−メトキシ誘導体（３−NHCO
2X）： ３−パラ−メトキシフェニルカルバモイル−５−メトキ
シ−１−（メトキシトリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２
−イリデンメチル）ベンゼン（33） メチレンクロリドに溶解したエノールエーテルアニリ
ン32を、トリエチルアミン（2.0eq）の存在下０℃で、
４−メトキシフェニルクロロホルマート（1.1eq）によ
りカルボキシル化する。反応混合物をCH2Cl2/H2Oに分配
し、希NaHCO3により洗浄し、Na2SO4により乾燥し、蒸発
させ、シリカゲルを用いてクロマトグラフィによる精製
を行って、エノールエーテルｐ−メトキシフェニルカル
バメート33を得る。
IR（CHCl3,cm-1）：1 H NMR（ppm）： ３−tert−ブチルカルバモイル−５−メトキシ−１−
（メトキシトリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデ
ンメチル）ベンゼン（34） エノールエーテルアニリン32、トリエチルアミン（1.
5eq）及びBOC−ON（1.3eq）のメチレンクロリド溶液
を、固く栓をしたキマックス（Kimax）管中55℃で撹拌
して、ｔ−ブチルカルバメートを生成させた。溶液を冷
却し、蒸発させて少量とし、残渣にMeOHを加えて所望の
カルバメート34の沈殿物を得る。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm）： ３−Ｎ−スルホナミド−５−メトキシ誘導体（３−NHSO
2X）： ３−Ｎ−トルエンスルホナミド−５−メトキシ−１−
（メトキシトリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデ
ンメチル）ベンゼン（35） エノールエーテルアニリン32のメチレンクロリド溶液
を、トリエチルアミン（2.0eq）の存在下０℃でトシル
クロリド（1.1eq）によりスルホニル化する。反応混合
物をCH2Cl2/H2Oに分配し、希NaHCO3により洗浄し、Na2S
O4により乾燥し、蒸発させてシリカゲルを用いたクロマ
トグラフィにより精製してＮ−トルエンスルホナミドエ
ノールエーテル35を得る。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm）： ３−Ｎ−トリフルオロメチルスルホナミド−５−メトキ
シ−１−（メトキシトリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２
−イリデンメチル）ベンゼン（36） エノールエーテルアニリン32のメチレンクロリド溶液
を０℃で無水トリフルオロメチルスルホン酸（1.1eq）
によりスルホン化する。反応混合物をCH2Cl2/H2Oに分配
し、Na2SO4により乾燥し、蒸発させ、シリカゲルを用い
たクロマトグラフィによって精製し、Ｎ−ノリフルオロ
メチルスルホナミドエノールエーテル36を得る。
IR（CHCl3,cm-1）1 H NMR（ppm）： ３−アミド−５−メトキシ誘導体（３−NHCOX）： ３−Ｎ−ベンズアミド−５−メトキシ−１−（メトキシ
トリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチル）
ベンゼン（37） エノールエーテルアニリン32のピリジン溶液を０℃で
ベンゾイルクロリド（1.1eq）と反応させる。溶媒を蒸
発させ、ポンプを用いて乾燥させ、粗油を得、これをCH
2Cl2/H2Oに分配し、乾燥し、蒸発させる。シリカゲルを
用いたクロマトグラフィによる精製を行って、ベンズア
ミドエノールエーテル37を得る。
IR（CHCl3,cm-1）：1 H NMR（ppm）： ３−窒素置換フェニルエノールエーテル（化合物33〜
37）を、ナトリウムエタンチオレートにより脱メチル化
し、ついでホスホリル化し、ジオキセタン１及び２につ
いて記載したように光酸素化して、ジオキセタン類似物
を得る。
式Ｉの構造の範囲内の他の化合物中、特に好ましい化
合物は、以下の構造を有する： 本化合物の名称は、ジナトリウム ２−クロロ−５−
（４−メトキシ−スピロ［1,2−ジオキセタン−3,2′−
（５′−クロロ−）トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン］
−４−イル−１−フェニルホスフェートである。
この化合物は、一般的にはCDP−Starと呼ばれてい
る。本化合物は、以下の反応式において示されるように
合成することができる。
４−クロロ−３−メトキシ−ベンズアルデヒドジメチル
アセタール ３ メタノール（2ml）、CH2Cl2（3ml）、４−クロロ−３
−メトキシ−ベンズアルデヒド（2g、11.7mmol;実質的
にR.M.Riggsら、J.Med.Chem.、30 1887、1987.に記載さ
れたように調整した）、トリメチルオルトホルマート
（1.7ml、15.5mmol）およびｐ−トルエンスルホン酸大
結晶の不均質混合物を、室温で１時間撹拌した。次に、
MeOH（1ml）およびｐ−トルエンスルホン酸結晶を添加
し、その溶液を均一になるまで温めた。反応終了後、そ
の溶液を過剰のNaHCO3固体とともに５分間撹拌し、回転
蒸発させて溶媒を除去した。ペーストを、EtOAc40mlに
溶解させ、希NaHCO3溶液に分配させ、かつ蒸発させて明
褐色の油状物を得た。この反応を、他の４−クロロ−３
−メトキシベンズアルデヒド2gを用いて繰り返し、両方
の生成油状物を併せてジメチルアセタール３を4.37g（8
6％）得た。
IR（neat,cm-1）:2930,2810,1582,1580,1483,1460,140
2,1348,1268,1100,1059,989,861,827,7901 H NMR（CDCl3,ppm）:3.30（6H,s）,3.90（3H,s）,5.33
（1H,s）,6.95（1H,d）,7.03（1H,s）,7.32（1H,d） ジエチル １−メトキシ−１−（４−クロロ−３−メト
キシフェニル）メタンホスホネート ４ ジメチルアセタール ３（4.3g、20mmol）、ふるい乾
燥（sieve−dried）CH2Cl2（20ml）およびトリエチルホ
スファイト（4.1ml、24mmol）の溶液をアルゴン下、−7
8℃で撹拌した。ボロントリフルオライドエテリエート
（2.95ml、24mmol）を−78℃で滴下し、その溶液を５分
間撹拌し、−20℃で一晩保存した。翌日、反応物を室温
まで温め、５時間撹拌してホスホネートの形成を完了さ
せた。激しく撹拌しながら、反応物をNaHCO3固体で、次
いでNaHCO3飽和溶液によってクエンチした。ガスの発生
がなくなった後、CH2Cl240mlおよび水20mlを添加し、２
層混合物を分配し、CH2Cl2層を回収し、Na2SO4によって
乾燥し、蒸発させた。真空で吸引した後、油状物をCH2C
l2で溶離を行いながらシリカゲルプラグで精製し、ホス
ホネート ４を淡黄色の油状物（6.01g、99％）として
得た。
IR（neat,cm-1）:2980,2930,1590,1580,1480,1460,140
8,1280,1250,1095,1055,1025,967,871,809,790,754,728 ４−クロロ−３−メトキシ−１−（メトキシ−５−クロ
ロ−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメチ
ル）−ベンゼン ５ ホスホネート ４（3.2g、10mmol）をアルゴン下乾燥
THF30mlに溶解し、−78℃まで冷却した。ｎ−BuLi（2.3
M、4.4ml、10.1mmol）の滴下によって、黄色−橙色のホ
スホネートイリドが生成した。得られたイリド溶液を10
分間撹拌した後、THF8mlに溶解させた５−クロロ−２−
アダマンタノン（1.75g、9.5mmol）を−78℃でイリドに
滴下した。反応物を室温に45分間かけてゆっくり温め、
２時間還流させた。冷却後、THFを真空で除去し、生成
物をEtOAc/ヘキサン（1:1）およびNaHCO3希釈液との間
に分配した。有機層をNaHCO3で乾燥させた。有機層をNa
2SO4で乾燥させ、溶媒を除去し、シリカゲル（２〜４％
のEtOAc/ヘキサン）で精製してエノールエーテル ５を
3.3g（96％）、無色粘性ゴム状物質として得た。
４−クロロ−３−ヒドロキシ−１−（メトキシ−５−ク
ロロ−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカ−２−イリデンメ
チル）−ベンゼン ６ エノールエーテルフェノール ６への脱メチル化を、
エノールエーテル ５（3.3g、9.3mmol）をDMF22ml中、
エタンチオール酸ナトリウム（14mmol）の存在下135℃
で1.5時間加熱して、完全に進行させた。反応物を冷却
し、EtOAc50ml、1MのNH4Clを100mlおよびNaHCO3飽和溶
液10mlの間に分配した。有機層を回収し、良く水洗する
一方、水性層をEtOAcで一度洗浄した。EtOAc層を併せ、
塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空下溶媒を除去し
た。50％のCH2Cl2/ヘキサンで溶離を行いながら、粗油
状物をシリカゲルカラムで精製し、フェノール ６を3.
6g、粗油状物として得た。冷却した15％のCH2Cl2/ヘキ
サン溶液から２回の結晶化によって更に精製してフェノ
ール ６を固体（2.18g、68％）として得た。
IR（CHCl3,cm-1）:3530（OH）,3300（OH）,2920,2845,1
568,1478,1308,1190,1166,1090,1079,1042,1020,8211 H NMR（CDCl3,ppm）:1.57−2.28（11H,m）,2.75（1H,b
r s）,3.27（3H,s）,3.41（1H,br s）,5.57（1H,s）,6.
79（1H,dd,J＝8Hz,2Hz）,6.93（1H,d,J＝2Hz）,7.28（1
H,d,J＝8Hz） ナトリウム ２−シアノエチル ２−クロロ−５−（メ
トキシ−（５−クロロ）トリシクロ［3.3.1.13,7］デカ
−２−イリデンメチル）−１−フェニルホスフェート
７ フェノール ６（0.75g、2.2mmol）、トリエチルアミ
ン（400μｌ、2.86mmol）および無水THF（8ml）の溶液
に、２−クロロ−２−オキソ−１、３、２−ジオキサホ
スホラン（Fluka、240μｌ、2.6mmol）を室温でアルゴ
ン下添加した。塩酸トリエチルアンモニウムが析出する
までの間、反応物を３時間撹拌した。反応溶液から、ア
ルゴン強気流下、析出物を、先端に綿をつけた注射器を
用いてピペットで除去した。析出物をエーテルで数回す
すぎ、併せた溶液とすすぎ液を真空で蒸発させて、湿気
への露出から保護された泡を得た。
泡を無水DMF（4ml）に溶解し、乾燥NaCN（140mg、2.8
mmol）と共に室温で24時間撹拌してβ−シアノエチルホ
スフェートジエステルを形成させた。反応混合物を高減
圧かつ55℃で吸引してDMFを除去し、ホスフェートジエ
ステル ７をゴム状物質として得た。粗ホスフェートジ
エステルを更に精製することなく光酸素化を行った。
シン及びアンチ−ジナトリウム ２−クロロ−５−（４
−メトキシスピロ［１、２−ジオキセタン−3,2′−
（５′−クロロ−）トリシクロ［3.3.1.13,7］−デカ
ン］−４−イル）−１−フェニルホスフェート １ ホスフェートジエステル ７を、５、10、15、20−テ
トラフェニル−21H、23H−ポルフィン（TPP、2mg/mlのC
HCl3溶液0.8ml）を添加した10％MeOH/CHCl320mlに溶解
させた。反応混合物を酸素で飽和し、溶液に酸素を通過
させながら、カプトンフィルムで包んだ250W高圧ナトリ
ウム蒸気ランプを用いて照射した。逆相HPLC分析によれ
ば、照射20分後にジオキセタンの完全な形成が示され
た。溶媒を室温で真空下除去し、残渣を、高真空下で吸
引してゴム状物質とし、−20℃で保存した。
MeOH11mlに溶解させた粗シアノエチルホスフェートジ
エステルジオキセタン ８を、ナトリウムメトキシド
（MeOH中の25重量％NAOMeを0.5ml）を用いて室温で30分
間保護基を脱離させた。シアノエチル基のβ−除去完了
後、NaHCO3飽和溶液2mlを添加し、MeOHを回転蒸発させ
た。HPLCグレード水（15ml）を添加し、褐色溶液を0.45
μナイロンフィルターに通過させた。溶液量をHPLCグレ
ード水で40mlに調整し、ポリスチレンカラム（PLRP−
Ｓ、Polymer Laboratories）を通したCH3CN/H2O勾配液
を用いて予備HPLCによって精製した。画分を凍結乾燥し
たところ、ジオキセタン１を0.81g（フェノール ６か
ら74％）を得た。アセトニトリルと0.1％NaHCO3との勾
配を用いたポリスチレンカラム逆相HPLCおよび270nmに
おけるUV検出によれば、シン及びアンチ異性体混合物を
表す、前方に肩をもつ１個のピークが示された。異性体
混合物としての生成物試料を、0.1Mジエタノールアミン
緩衝液（1mMのMgCl2）にpH10で溶解させた。アルカリ性
ホスファターゼで処理した後、予期したように光が発せ
られた。このように、生成物を表題の構造の１、２−ジ
オキセタンと確認した。
実施例 本発明の範囲内にある種々のジオキセタンを調製し、
本質的な性質について試験を行った。調製され試験され
たジオキセタンとしては、Ｒがメチルであり、Ｘがホス
フェートであり、Y2が塩素でありかつＺがフェニル環の
４または５位にあるジオキセタンが挙げられる。下記の
試験においては、これらのジオキセタンを市販されてい
る標準CSPD およびAMPPDTMと比較した。
溶液中のアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出 アルカリ性ホスファターゼ（5.25×10-17モル）を、
0.4mMジオキセタンを含有する0.1Mジエタノールアミン
および1mMのMgCl20.5ml（pH10）中で室温にてインキュ
ベートした。化学発光（５秒間の総和）をBerthold LB9
52Tルミノメータで、５、10、20、30、44、50および60
分に測定した。図１および２では、CSPD およびCDP−S
tarTMの性能が比較されている。図１には、相対光単位
（RLU）対時間としてプロットされたCSPD およびCPD−
StarTMの比較が示されている。３個を重ねた平均がプロ
ットされている。図２には、化学発光増強ポリマーであ
るポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド
1mg/mlを含有する、別の試料から得られた結果が示され
ている。
ナイロン膜でのビオチン化pBR322−35merの化学発光検
出 ビオチン化pBR322 35−mer（１μｌ中13.1pg）を、陽
電荷処理されたナイロン膜（Tropilon−PlusTM）の小片
上に点在させた。膜を完全に乾燥させ、DNAをUV架橋（1
20mJ/cm2）によって膜に固着させた。その膜をPBSで湿
らせ、次いで、ブロッキング緩衝液（0.2％１−Bloc
kTM、PBS中0.5％SDS）中で10分間、ストレプトアビジン
−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Avidx−A
PTM、Tropix;ブロッキング緩衝液中1:5000で希釈され
た）中で20分間インキュベートし、ブロッキング緩衝液
で５分間１回、洗浄緩衝液（PBS中0.5％SDS）で５分間
３回洗浄した。次いで、膜を分析緩衝液（0.1M DEA、1m
MMgCl2、pH10.0）で５分間２回洗浄した。最後に、膜を
調整し、ヒートシール可能なプラスチックの小片で0.25
mMのCSPDまたはCDP−Star（分析緩衝液で希釈された）4
0μｌを用いてシールした。膜のシールされた小片を管
（22℃で予備インキュベートされた）に即座にテープで
貼り付け、Turner Model 20eルミノメーター（Turner D
esigns,Inc.Mountain view,CA）中に置いた。光の放出
を、22℃で24時間５分毎に記録した。図３は、CSPD及び
CDP−Starについての化学発光強度（RLU）対時間のプロ
ットである。
ウエスタンブロットヒトトランスフェリンの化学発光検
出 精製されたヒトトランスフェリン（Boehringer/Mannh
eim cat＃1317 415）を、1X SDS−PAGE負荷緩衝液（0.0
6Mトリス−HCl、pH6.8、2.25％グリセロール、0.5％β
−メルカプトエタノール、２％SDS、0.05％ブロモフェ
ノールブルー）を用いて順次希釈した。希釈液を95℃で
５分間加熱し、希釈された試料５μｌをゲルレーン毎に
負荷した。試料を、Hoefer SE250ミニゲル装置を用いて
10％ポリアクリルアミドミニゲルによるSDS−PAGEによ
って電気泳動的に分離した。各ブロットは、トランスフ
ェリンを10、3.3、1.1、0.37、0.12および0.04ng含有す
る。電気泳動に続いて、ゲルおよび膜を、移送緩衝液
（5mMのMOPS pH7.5、2mMの酢酸ナトリウム、20％MeOH）
を用いて15分間平衡化させた。蛋白を、PVDF（Tropiflu
orTM）および陽電荷処理されたナイロン（Tropilon−Pl
usTM）膜に90V、４℃で１時間移動させた。ブロット
を、ブロッキング緩衝液（BB−１［PBS中0.2％１−Bloc
kTM、0.1％Tween−20］をPVDFのために用い、BB−２［P
BS中３％１−BlockTM、0.1％Tween−20］をナイロンの
ために用いた）中で30分間インキュベートした。次い
で、ブロットを、ウサギポリクローナル抗ヒトトランス
フェリン（Boehringer/Mannheim cat ＃615 015;適切な
ブロッキング緩衝液中1:5000に希釈された）で30分間イ
ンキュベートし、次いで、５分間２回洗浄した（PVDFを
BB−１で、及びナイロンを洗浄緩衝液［PBS中0.1％Twee
n−20］で）。次に、ブロットを、ヤギ抗ウサギIgGアル
カリ性ホスファターゼコンジュゲート（Tropix;適切な
ブロッキング緩衝液中1:10,000に希釈）で30分間インキ
ュベートし、次いで、上記のように５分間２回洗浄し
た。ブロットを、分析緩衝液（0.1M DEA、1mMのMgCl2、
pH10.0）中５分間２回洗浄した。最後に、ブロットを0.
25mMのCSPDまたはCDP−Star（分析緩衝液中で希釈）で
５分間インキュベートした。ブロットからの過剰の基質
溶液を奪い、プラスチックリポートカバー内に置き、こ
れにKodak XAR−５フィルムを曝した。ナイロンおよびP
VDF膜について得られた結果を図４−５に示す。
ナイロン膜上での単一コピー酵母遺伝子の化学発光検出 酵母Saccharomyces cerevisiaeからのゲノムDNA全体
を、EcoR 1およびBg1 11制限酵素エンドヌクレアーゼで
切断した。各DNA断片物5.0、0.5および0.05μｇを、水
平な0.8％アガロース1X TBEゲルにおける電気泳動によ
って分離させた。電気泳動に続いて、そのゲルを1.5Mの
NaCl、0.5MのNaOHに45分間浸してDNAを変性し、次い
で、中和緩衝液（1Mトリス、1.5MのNaCl、pH7.4）中で4
5分間インキュベートした。DNAを、20X SSCを用いて毛
細管移動を一晩行うことによって、陽電荷処理されたナ
イロン膜（Tropilon−PlusTM）に移動させた。その膜を
空気乾燥させ、DNAをその膜に120mJ/cm2でUV架橋した。
酵母遺伝子RPB 1から切断された1 kb Bg1 11フラグメン
トをゲル精製し、ビオチン−14−dCTPを取り込ませるラ
ンダムプライミング反応によってビオチン化した。その
膜を、ハイブリダイゼイション溶液（７％SDS、0.25Mの
Na2PO4、1.0mMのEDTA）中で68℃30分間予備ハイブリド
化し、変性したプローブ5ng/mlを含有する未使用のハイ
ブリダイゼイション溶液5mlを用いて68℃で一晩ハイブ
リド化し、次いで、ハイブリダイゼイション溶液から除
去し、以下の様に洗浄した。すなわち、室温で2X SSC、
１％SDSで５分間２回;68℃で0.1XSSC、１％SDSで15分間
２回；および室温で1XSSCで５分間２回洗浄した。次い
で、その膜を、ブロッキング緩衝液（0.2％カゼイン、
0.5％SDS、PBS）中で10分間およびブロッキング緩衝液
中1:5000希釈AVIDx−APTMを用いて20分間インキュベー
トした。次いで、その膜を、ブロッキング緩衝液で５分
間、洗浄緩衝液（0.5％SDS、PBS）で10分間３回および
分析緩衝液（0.1Mジエタノールアミン、1.0mMのMgCl2、
pH10.0）で２分間２回洗浄し、続いて、分析緩衝液中0.
25mMジオキセタンで５分間インキュベートした。過剰の
基質溶液を奪った後、その膜をプラスチックで包み、こ
れにＸ線フィルムを曝した。基質インキュベーション後
それぞれ10分後、70分後、および19時間後に行れた60分
の露光が、以下の露光に反映されている。CSDPおよびCD
P−Starの比較を、図６、７および８に示す。
DNA配列梯子の化学発光検出 DNA配列決定反応を、ビオチン化（−20）普遍的プラ
イマーと一本鎖M13 mp18テンプレートDNAを用いたTropi
x−SEQ−lightTMキットを用いて行った。反応生成物
を、６％ポリアクリルアミドの8M尿素ゲルで分離し、毛
細管作用によってTropilon−PlusTMナイロン膜に移動さ
せ、その膜にUV架橋させた（全照射:120mJ/cm2）。化学
発光検出を、膜をブロッキング緩衝液（0.2％ｉ−Block
TM、0.5％SDS、PBS）中で10分間、コンジュゲート溶液
（ブロッキング緩衝液中のAvidx−APストレプトアビジ
ンアルカリ性ホスファターゼコンジューゲートの1/5000
希釈液）中で20分間インキュベートし、次いで、ブロッ
キング緩衝液で１回５分間、洗浄緩衝液（0.5％SDS、PB
S）で３回５分間、分析緩衝液（0.1Mジエタノールアミ
ン、1mMのMgCl2、pH10）で２回２分間洗浄した。各膜片
を、分析緩衝液中の0.25mMのCSPDまたはCDP−Starのい
ずれかで５分間インキュベートした。すべての工程を、
穏やかに震動（140−170rpm）させながら、ヒートシー
ルした大きなプラスチックバッグ中で室温で行った。３
ケ所の時間点でのCSPD及びCDP−Starの比較が与えられ
ている。基質とのインキュベーション後の時間とKodak
XAR−5 X線フィルムへの露光時間を図９に示す。
別の試験は、量子収率（以下に掲げられた操作に従っ
た独立の実験室によって達成される）、Ｔ1/2および放
出波長最大値等の値をもたらす。これらのジオキセタン
を数によって同定し、数の後に続く表には、アダマンチ
ル環の置換基の同定、もしあれば引き続いてＺ置換基の
同定が与えられる。試験された化合物においては、Ｘは
ホスフェートである。量子収率とＴ1/2の値は、0.1モル
DEA中でのジオキセタンのみ、及び増強剤、Sapphire II
の存在下の両方について得られる。
量子収率決定のためのプロトコル 0.1MのDEA、pH10.0中のジオキセタンの3.2×10-4M溶
液500μＬを12×75mm管内に20℃で入れた。その溶液を
冷却水浴内で10分間20℃で平衡化した。アルカリ性ホス
ファターゼ懸濁液２μＬを、ジオキセタンを含有する管
に添加し、即座に１秒間うずを起こし、20℃水浴内に置
いた。次いで、管をMGM Optocomp Ｉルミノメーター内
に置き、光信号を１秒総和時間で測定した。光信号を測
定した後、管を20℃水浴内に戻し、測定を繰り返した。
ジオキセタンについての全体の総数を強度データから決
定した。ジオキセタンの与えられた濃度について観察さ
れた全体の総数は、ルミノメーターの光子検出効率（PD
E）、ジオキセタンの量子収率および光を放出可能な分
子の数（脱リン酸化ジオキセタンの濃度）の結果であ
る。MGM Optocomp IルミノメーターのPDEを、Biolink
絶対標準で測定し、ルミノメーターのPMTの既知のスペ
クトル応答とジオキセタンの既知の放出スペクトルを利
用して2.56×10-3と決定した。量子収率は、測定された
全総数をPDEとジオキセタンの濃度によって割ることに
よって計算される。
安定状態にある光放出における、半減期またはハーフタ
イムの計算 ターナールミノメーターの読み取りから、最大信号を
測定した。最大信号から、30、150、300または600秒間
隔でのターナー光ユニット読み取り値を引いたものを計
算し、対時間でグラフ化した。グラフから、半減期を決
定するために指数式を計算した。
ジオキセタンの半減期はまた、ターナールミノメータ
ー印字出力から直接的に決定された。
放出最大値 0.4mMのジオキセタン、0.1Mのジエタノールアミンお
よび1mMのMgCl2のpH10の溶液2mlに、9.9×10-11Mのアル
カリ性ホスファターゼを添加した。その溶液をSpex Flu
orolog Fluorimeter中で５分間平衡化させ、次いで、化
学発光放出について、0.5sec/nmで５回走査した。化学
発光放出波長最大値を記録した。
化学発光によるDNA配列決定 化学発光検出によるDNAの配列決定を、Tropix SEQ−L
ightTMプロトコルに記載されているように行った。簡単
には、DNA配列決定反応を、M13一本鎖ファージDNAをテ
ンプレートとして用いるビオチニル化プライマーを用い
て始めた。反応物を、8M尿素変性PAGEによって分離し、
毛細管作用によってTropilon−Plusナイロン膜に水平に
移動させ、Spectronics SpectoLinkerXL−1500を用いて
200mJ/cm2でUV光を露光させることによって膜に架橋さ
せた。その膜をブロッキング緩衝液（リン酸塩緩衝食塩
水/PBS［20mMリン酸ナトリウム、pH7.2、150mMのNaCl］
中の0.2％Ｉ−BlockTM、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム/
SDS）で10分間インキュベートし、ブロッキング緩衝液
中Avidx−APストレプトアビジン−アルカリ性ホスファ
ターゼの1/5000希釈液で20分間インキュベートし、ブロ
ッキング緩衝液で５分間、洗浄緩衝液（0.5％SDS、PB
S）で３回５分間、分析緩衝液（0.1Mジエタノールアミ
ン、1mMのMgCl2、pH10）で２回５分間洗浄し、次いで、
ジオキセタン溶液（分析緩衝液中で0.25mMに希釈された
CSPD、140−17または128−87のいずれか）を用いて５分
間インキュベートした。その膜の水気をきり、プラスチ
ックホルダーでシールし、Kodack XAR−5 X線フィルム
に露光させた。ジオキセタン128−87については、露光
時間は70分であり、140−17については80分であり、両
方とも基質溶液添加後65分に行った。ジオキセタン128
−87対CSPDの比較については、膜露光時間は、基質との
24時間インキュベーション後５分であった。図10および
11。このタイプのプロトコルの詳細は、トロピックス
インコーポレーテッドから商業上入手可能なTropix SEQ
−LightTMDNA配列決定システムに示されている。0.1Mの
DEA、pH10、25℃ ジオキセタン濃度3.7×10-7M〜６×10-6M 0.09MのDEA＋0.1％Sapphire II、pH9.95、25℃ ジオキセタン濃度1.8×10-7M〜6.1×10-9M ジオキセタンに関連する使用について知られているタ
イプの増強剤と共に、ジオキセタンまたは少なくとも励
起状態の発光種との相互作用を積極的に示すために、放
出最大値についての波長を、いかなる増強剤も存在しな
い条件下、BDMQの存在下、及びナイロン膜で検出した。
データを以下の表に示す。
ドットプロット分析 上記から分かるように、本発明のジオキセタンは、ド
ットブロット分析の使用に適切である。上記合成経路に
従って合成されたジオキセタンを、ドットブロット分析
に用いた。６位にＺ置換基をもつジオキセタンの化学発
光がないことを確認するに当たって、化合物140−62
が、首尾一貫した信号を与えないかまたは最適条件下で
わずかに検出可能な信号を与える行ことに留意すべきで
ある。同様に、アダマンチル環上の塩素置換基と共に、
６位にメトキシ置換基を有するジオキセタン140−73
は、ドットブロット分析では信号を与えず、６位置換メ
タホスフェートフェニルジオキセタンの化学発光活性の
欠如を確認した。図12〜21。
ニトロセルロースおよびナイロン膜に、ビオチン化35
塩基 オリゴヌクレオチドプローブを点在させた。その
プローブを1X SSCで希釈して出発希釈液210pgを得た。
出発希釈液の連続1:2希釈液を、膜に全体で12スポット
点在させた。その膜を乾燥させ、最適U.V.架橋（120mJ/
cm2）を行い、ブロッキング緩衝液（ニトロセルロース:
0.2％Ｉ−Block、0.1％Tween−20、1X PBS;ナイロン:0.
2％Ｉ−Block、0.5％SDS、1X PBS）で30分間ブロック
し、ブロッキング緩衝液中で希釈されたストレプトアビ
ジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートの1/50
00希釈液中で20分間インキュベートし、以下のように洗
浄した。ブロッキング緩衝液で１回５分間;1X PBS、0.3
％Tween−20（ニトロセルロース）で３回５分間または1
X PBS、0.5％SDS（ナイロン）で３回５分間；基質緩衝
液（0.1Mジエタノールアミン、0.1mMのMgCl2、pH10）で
２回５分間；基質緩衝液（ニトロセルロース実験のみ）
中で希釈されたNitro−Block（トロピックス社、ベッド
フォード、MA）の1/20の希釈液中で１回５分間；および
基質緩衝液（ニトロセルロース実験のみ）で２回５分間
洗浄した。その膜を基質緩衝液中で希釈された0.25mMの
ジオキセタンを用いて５分間インキュベートした。ニト
ロセルロースおよびナイロン実験の両方における数枚の
膜を、0.25mg/ml Calfax DB−45、Calfax 10L−45また
はCalsoft T−60（Pilot Chemical Company、ロサンゼ
ルス、CA）、Tween−20を1.0mg/ml、Nitro−Blockを1.0
mg/ml、および基質溶液中で希釈された0.25mMのジオキ
セタンを用いて５分間インキュベートした。これらの膜
は、Nitro−Blockの1/20希釈を受けなかった。次いで、
その膜をＸフィルムに露光させ、現像した。
このように、上記結果から分かるように、ジオキセタ
ンの芳香環に加えられた電子吸引基は、化学発光信号を
増加させる傾向がある一方、光放出の動力学を改める。
これに反し、電子供与基は、酸素から芳香族基を介して
ジオキセタンへの電子の移動を促進させることによって
明らかにＴ1/2を短縮する。このように、所望の場合に
は、電子供与または電子吸引Ｚ置換基の性質および性能
の適切な選択および同時にアダマンチル環のための適切
な置換基の選択によって、最適信号強度、最適強度、特
定の放出波長等を含む特性を有するジオキセタンを得る
ことができる。
これらのジオキセタンは、ジオキセタンを切断可能な
酵素が単独で存在する、またはもし被検体が存在するな
らば形成するであろう最終錯体の一部に付着され得るす
べてのタイプの分析に用いることができる。従来の分析
形態は、当業者に知られており、また、発明の背景で述
べられている特許に記載されている。適切な分析法の具
体的な開示は、米国特許5,112,960号に見られ、同一の
開示が文献によって本明細書に包含されている。その分
析形態自体は、本発明のジオキセタンによって向上され
た性能を除けば本発明の概要を構成しない。
したがって、中間体と共に本発明のジオキセタンは、
一般的な記載および特定の態様の両方を参照することに
よって開示されている。加えて、ジオキセタンの性質は
一般的に記載され、かつ例証されている。本実施例は、
本発明を限定するものとして意図されておらず、そのま
ま解釈されるべきではない。開示と一致している置換基
パターンの変形、同一性等は、当業者にとって起こるも
のである。このような変形および変化は、生井課の請求
項に述べられる限定によって除外される場合を除いては
本発明の範囲内にある。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/52 Ｇ０１Ｎ 33/52 33/532 33/532 Ｂ 33/58 33/58 Ａ (72)発明者 スパークス，アリソン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01845、ノース・アンドーバー、ジョン ソン・ストリート 325 (56)参考文献 特開 昭52−89632（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501589（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／4341（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，28（９）, （1985）（米），ｐ．1295−1301 Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，23 （６），（1985），（日），ｐ．1483− 1491 Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ．Ｊ．Ｃｈｅ ｍ．，34（６），（198）．ｐ．1319− 1324 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07D 321/00 C07F 9/655 C12Q 1/42 C12Q 1/34 C12Q 1/68 G01N 33/532 G01N 33/52 G01N 33/58 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式（Ｉ）： （式中、Y1及びY2は、独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲ
    ン、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル
    基、ハロ低級アルキル基、フェニル基、ハロフェニル
    基、アルコキシフェニル基、アルコキシフェノキシ基、
    ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、アミド基、アルコ
    キシ基またはカルボキシル基であり、Ｒは、C1−12アル
    キル、アリールまたはアラルキルであり、Ｘは、ホスフ
    ェート、ガラクトシド、アセテート、１−ホスホ−２、
    ３−ジアシルグリセリド、１−チオ−Ｄ−グルコシド、
    アデノシントリホスフェート、アデノシンジホスフェー
    ト、アデノシンモノホスフェート、アデノシン、α−Ｄ
    −グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルクロ
    ニド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−
    Ｄ−フルクトフラノシド、β−グルコシドウロネート、
    ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル及び
    ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミドからな
    る群より選ばれた酵素による作用を受けやすい基であ
    り、Ｚは、電子吸引基及び電子供与基からなる群から選
    ばれた電子活性基であり、かつフェニル環の４位または
    ５位を占有している） で示されることを特徴とするジオキセタン。
  2. 【請求項２】Ｚが、Cl、OM、OAr、NM3 +、NHCOM、NMCO
    M1、NHCOAr、NHCOOAr、NHCOOM、NMCOOM1、CM3、NO2、CO
    OM、COOAr、NHSO2OM、NHSO2Ar、CF3、Ar、Ｍ、SiM3、Si
    Ar2、SiArM2、SO2NHCOM、SO2NHCOAr、SO2M、SO2Ar、SM
    及びSArからなる群より選ばれ、ここでＭ及びM1は独立
    してC1−６アルキルであり、Arはフェニルまたはナフチ
    ルである請求項１記載のジオキセタン。
  3. 【請求項３】Ｚが、５位にあるクロロ、メトキシまたは
    アミド置換基である請求項２記載のジオキセタン。
  4. 【請求項４】Ｚが塩素である請求項３記載のジオキセタ
    ン。
  5. 【請求項５】Y2が水素であり、Y1が塩素である請求項４
    記載のジオキセタン。
  6. 【請求項６】Ｚがメトキシまたは塩素であり、かつ４位
    にある請求項２記載のジオキセタン。
  7. 【請求項７】Ｚが塩素であり、Y2が水素であり、かつY1
    が塩素である請求項６記載のジオキセタン。
  8. 【請求項８】Ｚが５位にあるメトキシであり、Y2が水素
    であり、かつY1が塩素である請求項２記載のジオキセタ
    ン。
  9. 【請求項９】Ｘがホスフェート基である請求項５、７ま
    たは８記載のジオキセタン。
  10. 【請求項１０】ＲがC1−４アルキルである請求項９記載
    のジオキセタン。
  11. 【請求項１１】Y2が水素であり、Y1が塩素であり、Ｚが
    ５位にある−OCH3であり、Ｒがメチルであり、かつＸが
    ホスフェートである請求項１記載のジオキセタン。
  12. 【請求項１２】Y2が水素であり、Y1が塩素であり、Ｚが
    ５位にある塩素であり、Ｒがメチルであり、かつＸがホ
    スフェートである請求項１記載のジオキセタン。
  13. 【請求項１３】Y2が水素であり、Y1が塩素であり、Ｚが
    ４位にある塩素であり、Ｒがメチルであり、かつＸがホ
    スフェートである請求項１記載のジオキセタン。
  14. 【請求項１４】式IIまたはIII: （式中、Y1及びY2は、独立して、Ｈ、水酸基、ハロゲ
    ン、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ低級アルキル
    基、ハロ低級アルキル基、フェニル基、ハロフェニル
    基、アルコキシフェノキシ基、アルコキシフェニル基、
    ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、アミド基、アルコ
    キシ基またはカルボキシル基であり、ＲがC1−12アルキ
    ル、アリールまたはアラルキルであり、Ｘは、ホスフェ
    ート、ガラクトシド、アセテート、１−ホスホ−２、３
    −ジアシルグリセリド、１−チオ−Ｄ−グルコシド、ア
    デノシントリホスフェート、アデノシンジホスフェー
    ト、アデノシンモノホスフェート、アデノシン、α−Ｄ
    −グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルクロ
    ニド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−
    Ｄ−フルクトフラノシド、β−グルコシドウロネート、
    ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル及び
    ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミドからな
    る群より選ばれた酵素によって作用を受けやすい基であ
    り、Ｚは、電子吸引基及び電子供与基からなる群より選
    ばれた電子活性基であり、OXは、ジオキセタンへのナフ
    チル環の置換部位と、OXの置換部位との間の環員炭素の
    数（置換部位の炭素を含む）が、奇数であるようにナフ
    チル環に置換されており、Ｚは、ジオキセタン環の置換
    部位に隣接した炭素を除いて、いかなる環員炭素上にあ
    ってもよい置換基である） で示されることを特徴とするジオキセタン。
  15. 【請求項１５】Ｚが、Cl、OM、OAr、NM3 +、NHCOM、NMCO
    M1、NHCOAr、NHCOOAr、NHCOOM、NMCOOM1、CM3、NO2、CO
    OM、COOAr、NHSO2OM、NHSO2Ar、CF3、Ar、Ｍ、SiM3、Si
    Ar3、SiArM2、SO2NHCOM、SO2NHCOAr、SO2M、SO2Ar、SM
    及びSArからなる群より選ばれここでＭ及びM1は独立し
    てC1−６アルキルであり、Arはフェニルまたはナフチル
    である請求項１記載のジオキセタン。
  16. 【請求項１６】Ｚが、４位、５位または７位にあるクロ
    ロ、メトキシまたはアミド置換基である請求項14記載の
    ジオキセタン。
  17. 【請求項１７】請求項１または14記載のジオキセタン及
    び水溶液中で前記ジオキセタンの基Ｘを切断することが
    できる酵素を含むことを特徴とする化学発光ジオキセタ
    ンリポーター分子を用いて検定を行うためのキット。
  18. 【請求項１８】水溶液中での前記Ｘ基の切断に際し、前
    記ジオキセタンから得られる化学発光信号を増加させる
    ための増強物質を更に含有する請求項17記載のキット。
  19. 【請求項１９】前記検定が、免疫検定であり、前記酵素
    が、被検体に結合可能な試薬と複合体を形成し、その存
    在の有無または濃度を検出するために前記検定が行われ
    る請求項17記載のキット。
  20. 【請求項２０】前記検定が、DNAプローブ検定であり、
    前記キットが前記検定が行われる膜を更に含有する請求
    項17記載のキット。
  21. 【請求項２１】水溶液中での前記Ｘ基の切断の際に前記
    ジオキセタンから得られた化学発光信号を増加させるた
    めの増強物質を更に含有する請求項17記載のキット。
  22. 【請求項２２】前記酵素が、試料中に存在する被検体と
    順次複合体を形成し得る試薬と複合体を形成し、検定が
    前記被検体の存在または濃度のために行われる請求項20
    記載のキット。
  23. 【請求項２３】前記検定が、DNA配列分析検定であり、
    前記キットが、前記配列分析検定が行われる膜を更に含
    有する請求項17記載のキット。
  24. 【請求項２４】前記キットが、水溶液中でのＸ基の切断
    に際し、前記ジオキセタンから得られる化学発光信号を
    増加させるための増強物質を更に含有する請求項23記載
    のキット。
  25. 【請求項２５】前記酵素が、前記検定において配列決定
    されるべきDNAへの酵素の付着を可能にする試薬と複合
    体を形成する請求項23記載のキット。
  26. 【請求項２６】試料中の酵素の存在を検出する方法であ
    って、該試料を請求項１または14のジオキセタンと接触
    させ、かつそれによって生じた光の放出を検出する工程
    を含み、ここで前記酵素が、前記酵素によって作用を受
    けやすい基Ｘを切断し、かつ放出された光の検出が、試
    料中の前記酵素の存在を示すことを特徴とする検出方
    法。
  27. 【請求項２７】前記Ｘ基が、ホスフェートであり、前記
    酵素が、アルカリ性ホスファターゼである請求項26記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】第１及び第２の部位をもつ特定の結合対
    のうち第１の部位を検出する方法であって、請求項１ま
    たは14のジオキセタンと、前記ジオキセタンの前記酵素
    によって作用を受けやすい基Ｘを切断する酵素との反応
    によって生じた化学発光を、光学的に検出し、ここで前
    記酵素が前記特定の結合対の第２の部位と複合体を形成
    することを特徴とする検出方法。
  29. 【請求項２９】前記方法が、免疫検定を含む請求項28記
    載の方法。
  30. 【請求項３０】前記方法が、核酸プローブ検定を含む請
    求項28記載の方法。
JP6525458A 1993-05-07 1994-05-06 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類 Expired - Lifetime JP2837276B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57,903 1993-05-07
US08/057,903 US5538847A (en) 1989-07-17 1993-05-07 Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US231,673 1994-04-25
US08/231,673 US5582980A (en) 1989-07-17 1994-04-25 Chemiluminescent 1,2-dioxetanes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH07509736A JPH07509736A (ja) 1995-10-26
JP2837276B2 true JP2837276B2 (ja) 1998-12-14

Family

ID=26737008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6525458A Expired - Lifetime JP2837276B2 (ja) 1993-05-07 1994-05-06 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5582980A (ja)
EP (3) EP1120423B1 (ja)
JP (1) JP2837276B2 (ja)
KR (1) KR0154209B1 (ja)
AT (3) ATE205839T1 (ja)
AU (2) AU676327B2 (ja)
CA (1) CA2139348C (ja)
DE (3) DE69434940T2 (ja)
FI (1) FI950075A (ja)
NO (2) NO309143B1 (ja)
WO (1) WO1994026726A1 (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988000695A1 (en) * 1986-07-24 1988-01-28 Quest Systems, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
USRE36536E (en) * 1986-07-24 2000-01-25 Tropix. Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US6022964A (en) 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes
JPH09507571A (ja) * 1993-12-23 1997-07-29 トロピックス・インコーポレーテッド 化学発光エネルギー移動検定
US5721370A (en) * 1995-07-31 1998-02-24 Lumigen Inc. Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds and assay compositions having increased storage stability
US5777135A (en) * 1995-07-31 1998-07-07 Lumigen, Inc. Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions
US5631167A (en) * 1995-07-31 1997-05-20 Bayer Corporation Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence
ATE221061T1 (de) * 1995-10-17 2002-08-15 Tropix Inc Chemilumineszente 1,2-dioxetane mit verbesserter leistung
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5834456A (en) * 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
WO1998030329A1 (fr) * 1997-01-14 1998-07-16 Daicel Chemical Industries, Ltd. Catalyseurs de nitration ou de carboxylation
US6660529B2 (en) 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
CA2338883A1 (en) 1998-07-28 2000-02-10 Tropix, Inc. Benzothiazole dioxetanes
US6555698B1 (en) * 1998-11-17 2003-04-29 Tropix, Inc. Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor
CA2353872C (en) 1998-12-15 2011-05-03 Tropix, Inc. Multiple enzyme assays
WO2000063423A2 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US6893827B1 (en) 2000-02-07 2005-05-17 Applera Corporation Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation
US7214546B2 (en) * 2001-01-08 2007-05-08 Applera Corporation Dendritic chemiluminescent substrates
US7368296B2 (en) * 2002-01-17 2008-05-06 Applied Biosystems Solid phases optimized for chemiluminescent detection
EP1592805A1 (en) * 2003-02-12 2005-11-09 Promega Corporation Methods and kits for dual enzymatic assays whereby light is quenched from luminescent reactions
US7390670B2 (en) * 2003-02-20 2008-06-24 Lumigen, Inc. Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide
US20060079699A1 (en) * 2004-08-27 2006-04-13 Brooks Edwards Intermediate compounds and methods for synthesizing chemiluminescent dioxetane substrates
WO2006029302A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Applera Corporation Dioxetane-nanoparticle assemblies for energy transfer detection systems, methods of making the assemblies, and methods of using the assemblies in bioassays
US7451802B2 (en) * 2006-01-25 2008-11-18 Nabco Entrances, Inc. Slidable door assemblies with automatic pivot latching
JP2007225547A (ja) * 2006-02-27 2007-09-06 Fujifilm Corp 標的物質の疎水部位の検出方法
US20080248511A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-09 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
CN101462316A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 维斯塔斯风力系统有限公司 预成型件的制备方法
WO2010101839A2 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Life Technologies Corporation Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes
US10031142B2 (en) 2010-07-08 2018-07-24 Life Technologies Corporation In situ chemiluminescent substrates and assays
CN103649069B (zh) * 2011-05-03 2016-09-14 生命科技公司 闪光和辉光1,2-二氧杂环丁烷类
CN103772433A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 深圳市美凯特科技有限公司 一种用于免疫分析的化学发光试剂amppd的合成方法
CN103073589A (zh) * 2012-12-30 2013-05-01 杭州师范大学 一种1,2-二氧环乙烷类化合物的合成方法
CN104557890A (zh) * 2015-01-12 2015-04-29 王国平 一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用
DE102016119810A1 (de) * 2016-10-18 2018-04-19 Hamilton Bonaduz Ag Schichten zum Nachweis von Sauerstoff

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5289632A (en) * 1975-11-12 1977-07-27 Valeas Srl Aminoethanol derivatives*process for producing same and therapeutical pharmaceutical containing these
JPS59501589A (ja) * 1982-08-23 1984-09-06 ジ・オ−ストラリアン・ナシヨナル・ユニバ−シテイ ３−アミノ−５−ヒドロオキシ安息香酸及びその誘導体ならびに類似体の合成方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5616729A (en) * 1986-07-17 1997-04-01 Board Of Governors Of Wayne State University Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers
US4983779A (en) * 1986-07-17 1991-01-08 The Board Of Governors Of Wayne State University Process for the preparation of vinyl ethers
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US5220005A (en) * 1986-07-24 1993-06-15 Tropix, Inc. Substituted adamantyl dioxetanes
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5112960A (en) * 1989-07-17 1992-05-12 Bronstein Irena Y Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
CA1340590C (en) * 1986-07-24 1999-06-08 John C. Voyta Chemiluminescence enhancement
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US5538847A (en) * 1989-07-17 1996-07-23 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5330900A (en) * 1987-12-31 1994-07-19 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5089630A (en) * 1987-12-31 1992-02-18 Bronstein Irena Y Dioxetanes for use in assays
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US5132204A (en) * 1989-05-31 1992-07-21 Chiron Corporation Chemiluminescent double-triggered 1, 2-dioxetanes
US5326882A (en) * 1989-07-17 1994-07-05 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes
BR9105888A (pt) * 1990-08-30 1992-11-10 Tropix Inc 3-(adamant substituido-2'-ilideno) 1,2-dioxetanos quimiluminescentes
US5336596A (en) * 1991-12-23 1994-08-09 Tropix, Inc. Membrane for chemiluminescent blotting applications
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5289632A (en) * 1975-11-12 1977-07-27 Valeas Srl Aminoethanol derivatives*process for producing same and therapeutical pharmaceutical containing these
JPS59501589A (ja) * 1982-08-23 1984-09-06 ジ・オ−ストラリアン・ナシヨナル・ユニバ−シテイ ３−アミノ−５−ヒドロオキシ安息香酸及びその誘導体ならびに類似体の合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，３４（６），（１９８）．ｐ．１３１９−１３２４
Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，２３（６），（１９８５），（日），ｐ．１４８３−１４９１
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８（９），（１９８５）（米），ｐ．１２９５−１３０１

Also Published As

Publication number Publication date
NO20003485D0 (no) 2000-07-06
EP1120423B1 (en) 2007-03-14
DE69428321D1 (de) 2001-10-25
WO1994026726A1 (en) 1994-11-24
EP0649417B1 (en) 2001-09-19
US5582980A (en) 1996-12-10
KR0154209B1 (en) 1998-11-16
NO950065D0 (no) 1995-01-06
DE69434814T2 (de) 2007-03-29
CA2139348A1 (en) 1994-11-24
EP0649417A4 (en) 1995-02-27
FI950075A0 (fi) 1995-01-05
US5851771A (en) 1998-12-22
EP0649417A1 (en) 1995-04-26
ATE356822T1 (de) 2007-04-15
DE69428321T2 (de) 2002-07-04
US5840919A (en) 1998-11-24
NO309143B1 (no) 2000-12-18
NO950065L (no) 1995-01-06
ATE205839T1 (de) 2001-10-15
DE69434814D1 (de) 2006-09-14
AU2474997A (en) 1997-08-14
EP1120422A1 (en) 2001-08-01
AU676327B2 (en) 1997-03-06
JPH07509736A (ja) 1995-10-26
DE69434940D1 (de) 2007-04-26
EP1120423A1 (en) 2001-08-01
CA2139348C (en) 2004-03-16
DE69434940T2 (de) 2007-11-29
AU695229B2 (en) 1998-08-06
KR950702546A (ko) 1995-07-29
AU6774194A (en) 1994-12-12
FI950075A (fi) 1995-01-05
EP1120422B1 (en) 2006-08-02
NO20003485L (no) 1995-01-06
ATE334996T1 (de) 2006-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2837276B2 (ja) 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類
US5981768A (en) 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
US4956477A (en) Synthesis of 1,2-dioxetanes
US5538847A (en) Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US6124478A (en) Methods of using 1,2-dioxetanes and kits therefore
US5326882A (en) Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes
US5220005A (en) Substituted adamantyl dioxetanes
JP3280342B2 (ja) １，２−ジオキセタン類の中間体の合成
US5177241A (en) Synthesis of 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
JP2552413B2 (ja) 化学発光性３ー（置換アダマントー２′ーイリデン）１，２ージオキセタン
US6852548B2 (en) Benzothiazole dioxetanes
US5605795A (en) Assays using chemiluminescent, enzymatically cleavable substituted 1,2-dioxetanes and kits therefor
US5625077A (en) 1,2-dioxetanes
EP1019390B1 (en) 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
US6140495A (en) Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5679802A (en) 1,2-dioxetanes useful in chemiluminescent immunoassays
JPH11515004A (ja) 改良された性能を有する１，２化学発光性ジオキセタン類
US5639907A (en) Synthesis of 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
US6660529B2 (en) Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
JP2999810B2 (ja) １，２−ジオキセタン化合物
US20060024762A1 (en) Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes

Legal Events

Date Code Title Description
S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R371 Transfer withdrawn

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081009

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009

Year of fee payment: 11

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009

Year of fee payment: 11

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009

Year of fee payment: 11

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009

Year of fee payment: 11

R370 Written measure of declining of transfer procedure

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091009

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101009

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101009

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111009

Year of fee payment: 13

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111009

Year of fee payment: 13

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111009

Year of fee payment: 13

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009

Year of fee payment: 14

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131009

Year of fee payment: 15

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term