CN104557890A

CN104557890A - 一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用

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Publication number: CN104557890A
Application number: CN201510011888.3A
Authority: CN
Inventors: 王国平; 马毅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用，该类化合物具有以下几个特点：1.含有碳碳氧氧四元环结构，2.含有能被质普仪检测到的阴离子基团，3.含有能够与大分子相连的官能团。通常为了稳定碳碳氧氧四元环，分子中入金刚烷的骨架。当该类化合物与大分子结合后，用质普仪检测时，就专一断裂碳碳氧氧四元环，通过检测该分子断裂后带阴离子基团的淬片含量，就能计算出被标记的大分子含量。这里的大分子指蛋白，多肽和酶。在临床上一些大分子的含量与疾病有一定的关联，能够准确且快速地检测大分子的含量，在临床上有广泛的应用。

Description

一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用

技术领域

本发明属于质谱检测领域，尤其涉及一种含有碳碳氧氧四元环结构的化合物以及在质谱检测时用于标记检测物。

背景技术

目前，在临床上最常用检测各种生物蛋白或酶的含量是用酶免疫检测的方法。酶免疫检测法具有较大的优势是发展的时间较长，方法比较成熟。但它的局限是有时检测的结果不准确，对有些酶或蛋白的检测目前还没有很好的酶免疫检测方法。

以前由于质普技术不够成熟，无法定量的检测样品中被检测物的准确含量。所以在临床检测中的应用不广泛。近年来，由于质普检测技术的飞速发展，先进的质普仪已经能够检测几百个分子的水平，也就是说能检测的最低极限能到10^-21 mol/L。这样的检测极限已经远远超过实际的检测要求。

但是质普通常能灵敏的检测分子量相对较小的分子。无法有效且灵敏的检测大分子，如酶和蛋白。因此，常用的方法是吧小分子标记到蛋白或酶上。通过检测标记小分子的含量来间接的测定大分子的含量。但对该类小分子具有特殊的要求。该类用于标记的小分子要具有当被质普检测时能专一的断裂同一个键，从而用质普仪灵敏的检测到这个断裂片段。从片段的含量能够计算出被标记的蛋白或酶的含量。然而目前，具有这种标记功能的小分子还不多。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于质谱标记的碳碳氧氧四元环化合物，能够专一的断裂于碳碳氧氧四元环处，被断裂的一个片段任仍然连接在大分子上，而断裂的另一个片段能被质普仪检测到。

为此采用如下的技术方案：一种用于质谱标记的碳碳氧氧四元环化合物，具有如（I）或（II）所示的通式：

式中：X为O或S；R₁，R₂，R₄为氢或烷基或烷氧基或芳基，且其末端带有一个含阴离子的官能团；R₃为含有能与蛋白质或酶或多肽相联的官能团，具体选自下列官能团（III）、（IV）、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)中的一个：

。

进一步地，R₁，R₂，R₄末端的官能团选自SO₃ ^-, OSO₃ ^-, COO^-, C₆H₅SO₃ ^-, P(O)O₃ ^-。

进一步地，所述的碳碳氧氧四元环化合物应用于标记蛋白或多肽或酶。具体如下：

上式，化合物（XI）中Y为蛋白或多肽或酶。

进一步地，所述的碳碳氧氧四元环化合物标记蛋白或多肽或酶后，在质普检测中的应用。

通常情况下，含有氧氧四元环的这类化合物是不稳定的，在合成的过成中就分解了，如下，化合物（XII）在合成中易分解为通式（XIII）和通式（XIV）的两种断链段。

但是当一边引入金刚烷基时，这类化合物（XV）是稳定的，通常能在室温下保存几年，

然而，在质普分析时，这个氧氧四元环是最弱的键，总是最优先断裂这个四元环。用比较柔和的质普断裂方法，能控制只断裂这个四元环，其它的键不被打断。这样含有阴离子的完整裂片（XVIII）就可以被质普仪完整检测到, 而不像通常的化合物质普断裂是没有规律或有类似的键被多处打裂，没有分析上的应用价值

。

由于这类化合物(XVI)在质普分析中有规律的断裂，不同浓度的化合物会得到不同峰值大小的质普图，并且他们成正比关系。因此利用这种化合物来标记蛋白质或酶，当用质普检测时，标有不同标记化合物蛋白质或酶就能被分别检测到，它们的相对浓度大小也可以从峰值大小看出来。如果，有一张标准工作曲线，就能算出标记蛋白质或酶的真实浓度。现在灵敏的质普仪已能检测到几百个分子的水平，也就是说能检测到10^-21mol/L的水平。

蛋白质或酶的简单而灵敏的检测在临床医学诊断上有重要的应用。例如某种酶的含量于某种癌相关，但现在还没有很好的检测这种酶的方法。本发明所公开的这种质普标记化合物与这种酶结合，然而用质普仪能快速检测出其含量。本发明所公开的质普标记化合物可以标记到所有的蛋白或酶上面，具有广泛的应用性。

具体实施方式

实施例1氧氧四元环化合物的制备：

A)化合物（XXI）的合成：

在250毫升的干燥三颈瓶中，加入200毫升无水四氢呋喃（THF），3 毫摩尔铝锂氢(LAH)，在漏斗中慢慢加入3 毫摩尔的三氯化钛(TiCl₃)在10毫升甲苯中的溶液。加完之后，继续搅拌半个小时。在另外一个50毫升的单口瓶中，加入3毫摩尔的5-氯金刚烷酮（XIX）及1 毫摩尔的酯（XX），再加入20 毫升的无水四氢呋喃(THF)溶解所有的固体。这个混合液在慢慢加入到反应瓶中，加完之后再继续搅拌3小时。10 毫升三乙胺(TEA)加入到反应中，继续搅拌5分钟。然后把所有的反应液倒入500 克的冰水中，用玻璃棒搅拌5分钟淬灭反应。然后用200毫升乙酸乙酯萃取五次，合并所有的有机相，用盐水洗，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去有机溶液，残余物用硅胶柱分离，得到烯醚键的化合物（XXI）。

B)化合物（XXII）的合成：

在50 毫升的单口瓶中，加入1毫摩尔的化合物（XXI），5毫升2-羟基乙醇和3毫摩尔的碳酸钾，加热至120度过夜。反应冷却到室温。用乙酸乙酯稀释，再用盐水洗。无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去有机溶液，残余物用硅胶柱分离，得到烯醚键的化合物（XXII）。

C)化合物（XXIII）的合成

在15 毫升的反应管中，连接氧气进出去管。100毫克的化合物（XXII）和0.5毫克的光敏催化剂（rose bengal）加入到5毫升的二氯甲烷和1毫升的甲醇混合溶液中，通入氧气，把反应管冷却到冰水中，打开1000瓦的钠灯。继续反应30至40分钟。关掉钠灯及氧气，把反应液倒入50 毫升的单口瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂，残余物用20X20厘米的制备硅胶板分离。用10%的甲醇在二氯甲烷的混合溶剂作为展开剂。分离得到碳碳氧氧四元环化合物（XXIII）。

D)化合物(XXV)的合成

在25 毫升的单口瓶中，25毫克化合物（XXIII）与30 毫克带活化酯（XXIV）在5 毫升的二氯甲烷中反应。用三乙胺作碱。室温反应一小时后，浓缩，残余物用20X20厘米的制备硅胶板分离。用10%的甲醇在二氯甲烷的混合溶剂作为展开剂。分离得到所需带官能团的碳碳氧氧四元环化合物(XXV)。

E)化合物（XXI）的合成

在25 毫升的单口瓶中，30毫克化合物（XXIII）与40 毫克带活化酯(XXVI)在10 毫升的二氯甲烷中反应。用三乙胺作碱。室温反应一小时后，浓缩，残余物用20X20厘米的制备硅胶板分离。用10%的甲醇在二氯甲烷的混合溶剂作为展开剂。分离得到带官能团的碳碳氧氧四元环化合物（XXVII）。

实施例2老鼠单克隆抗体(mlgG)与化合物（XXV）的结合：

老鼠单克隆抗体(mlgG)的缓冲液转换成50 毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15摩尔每升NaCl, pH=7.2的缓冲液，并配成5 毫克每毫升的溶液。化合物(XL)配成10毫克每毫升的二甲基甲酰胺（DMF）溶液。取10毫克老鼠单克隆抗体(mlgG)加入到10毫克每毫升的化合物(XXV)。在室温慢慢摇动反应过夜，然后反应液用葡聚糖凝胶G-25（sephadax G-25）柱子分离，用50毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15摩尔每升NaCl, pH=7.2做分离缓冲液。用紫外280纳米的吸收，及校正因子1.36，计算出抗体(mlgG)与化合物(XXV) 结合物（XXVIII）的浓度。

实施例3牛血清白蛋白（BSA）与化合物（XXVII）的结合：

牛血清白蛋白（BSA）配成5 毫克每毫升在50 毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15摩尔每升 NaCl, pH=7.2的缓冲液。化合物(XXVII)配成10毫克每毫升的二甲基甲酰胺（DMF）溶液。取20毫克牛血清白蛋白（BSA），加入10毫克每毫升的化合物(XXVII)。在室温慢慢摇动反应过夜，然后反应液用葡聚糖凝胶G-25（sephadax G-25）柱子分离，用50 毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15毫摩尔每升 NaCl, pH=7.2做分离缓冲液。用二辛可宁酸法测定结合物(XXIX)的浓度。

实施例4另一种氧氧四元环化合物的制备：

A)化合物(XXXI)的合成：

在250毫升的干燥三颈瓶中，加入200毫升无水四氢呋喃（THF），10毫摩尔铝锂氢(LAH)，在漏斗中慢慢加入10 毫摩尔的四氯化钛(TiCl₄)在10毫升甲苯中的溶液。加完之后，继续搅拌半个小时。在另外一个50毫升的单口瓶中，加入10毫摩尔的5-氯金刚烷酮（XIX）及3.5 毫摩尔的酯（XXX），再加入20 毫升的无水四氢呋喃(THF)溶解所有的固体。这个混合液在慢慢加入到反应瓶中，加完之后再继续搅拌3小时。15毫升三乙胺(TEA)加入到反应中，继续搅拌5分钟。然后把所有的反应液倒入500 克的冰水中，用玻璃棒搅拌5分钟淬灭反应。然后用200毫升乙酸乙酯萃取五次，合并所有的有机相，用盐水洗，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去有机溶液，残余物用硅胶柱分离，得到烯醚键的化合物（XXXI）。

B)化合物(XXXIII)的合成：

在50 毫升的单口瓶中，加入1毫摩尔的化合物（XXXI），15 毫升的无水四氢呋喃（THF），在氮气氛下，加入1 毫摩尔的氢化钠（NaH）。室温反应1小时后，化合物（XXXII）加入到反应液中。继续搅拌反应过夜。旋转蒸发除去有机溶液，残余物用20x20 厘米的硅胶薄板分离，得到所需的烯醚化合物（XXXIII）。

C)化合物（XXXIV）的合成：

在50 毫升的单口瓶中，加入1毫摩尔的化合物（XXXIII），5毫升2-羟基乙醇和3毫摩尔的碳酸钾，加热至120度过夜。反应冷却到室温。用乙酸乙酯稀释，再用盐水洗。无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去有机溶液，残余物用硅胶柱分离，得到所需的烯醚化合物（XXXIV）。

D)化合物（XXXVI）的合成

在25 毫升的单口瓶中，50毫克化合物（XXXIV）与30 毫克带活化酯（XXXV）在5 毫升的二氯甲烷(CH₂Cl₂)中反应。用三乙胺(TEA)作碱。室温反应一小时后，浓缩，残余物用20X20厘米的制备硅胶板分离。用15%的甲醇在二氯甲烷的混合溶剂作为展开剂。分离得到所需带官能团的碳碳氧氧四元环化合物（XXXVI）。

E)化合物（XXXVII）的合成

在15 毫升的反应管中，连接氧气进入及出去的管子。30毫克的化合物（XXXVI）和5毫克的聚苯乙烯支载的光敏催化剂（PS-rose bengal）加入到5毫升的二氯甲烷和1毫升的甲醇混合溶液中，通入氧气，把反应管冷却到零下78度的干冰丙酮中，打开1000瓦的钠灯。继续反应30至40分钟。关掉钠灯及氧气，把反应液倒入50 毫升的单口瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂，残余物用20X20厘米的制备硅胶板分离。用10%的甲醇在二氯甲烷的混合溶剂作为展开剂。分离得到所需的碳碳氧氧四元环化合物（XXXVII）。

实施例5荧光素抗体与化合物（XXXVII）的结合：

荧光素抗体（anti-FTIC）配成5 毫克每毫升在50 毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15摩尔每升 NaCl, pH=7.2的缓冲液。化合物（XXXVII）配成15毫克每毫升的二甲基甲酰胺（DMF）溶液。取10毫克荧光素抗体（anti-FTIC），加入10毫克每毫升的化合物（XXXVII）。在室温慢慢摇动反应3小时，然后反应液用葡聚糖凝胶G-25（sephadax G-25）柱子分离，用50 毫摩尔每升磷酸缓冲液（PBS），0.15毫摩尔每升 NaCl, pH=7.0做分离缓冲液。用紫外280纳米的吸收，及校正因子1.36，计算出抗体与化合物结合物（XXXVIII）的浓度。

Claims

1.一种用于质谱标记的碳碳氧氧四元环化合物，具有如（I）或（II）所示的通式：

。

2.按照权利要求1所述一种用于质谱标记的碳碳氧氧四元环化合物，其特征在于：R₁，R₂，R₄末端的官能团选自SO₃ ^-, OSO₃ ^-, COO^-, C₆H₅SO₃ ^-, P(O)O₃ ^-。

3.按照权利要求1或2所述的碳碳氧氧四元环化合物应用于标记蛋白或多肽或酶。

4.按照权利要求1或2所述的碳碳氧氧四元环化合物标记蛋白或多肽或酶后，在质普检测中的应用。