JP4519320B2 - ベンゾチアゾールジオキセタン類 - Google Patents
ベンゾチアゾールジオキセタン類 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4519320B2 JP4519320B2 JP2000562018A JP2000562018A JP4519320B2 JP 4519320 B2 JP4519320 B2 JP 4519320B2 JP 2000562018 A JP2000562018 A JP 2000562018A JP 2000562018 A JP2000562018 A JP 2000562018A JP 4519320 B2 JP4519320 B2 JP 4519320B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dioxetane
- group
- sample
- substance
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
- C07D277/60—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D277/62—Benzothiazoles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
- C07F9/6551—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring
- C07F9/65512—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
- C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
- C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein
Description
【０００１】
この出願は、１９９８年７月２８日に出願された米国出願番号６０／０９４,３３６号の仮出願を優先権主張してなされた、正規の国内出願である。この仮出願の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、改良された化学発光性１，２−ジオキセタン化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、改良された酵素的に除去しうる不安定性基を含む、酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン化合物に関する。この不安定性基は、不安定性基を除去するために適当な酵素が添加されるまで、分子が光、すなわち可視光または適当な機器で検出可能な光を発生して分解するのを防止する。
【０００３】
１個の酵素分子が、触媒サイクルを経て、数千の酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン分子からその優れた不安定性基の除去を行うことができる。このことは、各々のジオキセタン分子からその優れた不安定性基を除去するのに１分子の化学的な開裂剤が必要である、化学的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類とは、極めて対照的である。
【０００４】
酵素的に開裂可能な発光性の１，２−ジオキセタン化合物は、通常、ジオキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合した、例えばアダマンチリデン基のような安定化基をも有しており、それは、酵素的に開裂しうる不安定性基が残りの分子に結合している結合を意図的に開裂する前に、ジオキセタン化合物が室温（約２５℃）で自発的な分解を生起するのを防止することを助けている。(Wiervngaら、Tetrahedron Letters, 169 (1972) および McCapra ら、J. Chem. Soc., Chem. Comm., 944 (1977)）。このように、これらの安定化基により、そのようなジオキセタン類を使用前に極めて長期間、実質的な分解を生起することなく、例えば約４℃から約３０℃の温度範囲で約１２ヶ月から約１２年程にわたって貯蔵することが可能となる。
【０００５】
本発明は、さらに、そのジオキセタン分子を従来公知のイムノアッセイ、化学アッセイ、および核酸プローブアッセイに組み込むこと、ならびに、化学的または生物学的物質の存在、量、もしくは構造を同定あるいは定量する分析を可能とする、種々のミクロ分子、合成ポリマー、タンパク質、核酸、触媒的抗体などの分子構造やミクロ構造研究用の直接的な化学的／物理的プローブとしてのそれらの使用に関する。
【０００６】
発明の背景
発明者として本願中の発明者の一名以上の名が挙げられ、そしてトロピックス社（Tropix, Inc.）に譲渡された出願には、化学発光性化合物として１，２−ジオキセタン類が明確に記載されており、それらは、種々の生物学的材料の検出用に、外的条件や手の込んだ装置に依存することなく、迅速に行うことができる超高感度アッセイにおけるレポーターや標識として用いることができる。これらには、米国特許第４，９３１，２２３；４，９３１，５６９；４，９５２，７０７；４，９５６，４７７；４，９７８，６１４；５，０３２，３８１；５，１４５，７７２；５，２２０，００５；５，２２５，５８４；５，３２６，８８２；５，３３０，９００；５，３３６，５９６；および５，８７１，９３８号がある。前述のもの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。本願と共通して譲渡された他の特許は発行されており、他の出願は出願係属中である。この多くの特許文献は共に、ジオキセタン環の炭素の１つに結合した典型的にはスピロアダマンタンのような多環基および電子感受性であるジオキセタン環の残りの炭素に結合した基で安定化された、１，２−ジオキセタン類を取り扱っており、電子感受性基の保護、典型的にはアリール基は、アニオン、通常はオキシアニオンに導き、それは不安定であって、そして分解する。分解により、Ｏ−Ｏ結合は切断され、光子が発生する。この電子感受性基が結合している同一の炭素原子はアルコキシまたは他の電子活性基を有する。
【０００７】
最初に市販されたこのクラスのジオキセタン類は、３−(４−メトキシ−スピロ（１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ(３．３．１．１3,7)デカン）−４−イル）フェニルホスフェート、とくにその二ナトリウム塩であり、一般にＡＭＰＰＤ（登録商標）として知られている。この化合物は、ミシガン州、デトロイトのルミジェン社（Lumigen, Inc.）と共に、本願の譲受人、すなわちトロピックス社により市販されている。上記化合物の優れた性能は、スピロアダマンタン環上の選択的な置換によって得ることができる。いずれかの橋頭位炭素を塩素のような電子活性種で置換すると、反応速度およびシグナル／ノイズ比（ｓ/n）が改善される。ＡＭＰＰＤ（登録商標）の塩素置換体であるＣＳＰＤ（登録商標）は、マサチューセッツ州、ベッドフォードのトロピックス社により広く市販されている。アリール基が同じく塩素のような電子活性置換基を有する、同様構造の「第三世代」ジオキセタン化合物では、性能がさらに改善されており、トロピックス社が市販している。そのホスフェートは、ＣＤＰ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の商標で入手できる。
【０００８】
しかしながら、水溶液中でさらに化学発光向増強剤、例えばポリ〔ビニルベンゾチアゾール（ベンゾチアゾールジメチルアンモニウムクロリド）〕（「ＢＤＭＱ」）のようなポリマー状アンモニウム、ホスホニウムまたはスルホニウム塩および他のヘテロ極性ポリマーの存在下でのＡＭＰＰＤ（登録商標）は、一定の発光特性（「ｔ1/2」、一定の定常状態の発光レベルでの最大化学発光強度の半分を得るのに要する時間として定義される；この発光半減期は種々の環境において、ジオキセタンオキシアニオンの安定性の関数として変動する）に到達する最適時間がより長くなることが認められた。
【０００９】
統計的には、およそ７（ｔ1/2）の時間が、定常的な発光キネティックスに到達するのに必要とされる。ＢＤＭＱの存在下ｐＨ９.５の水溶液中２×１０-5Ｍより上の濃度でのＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2 は７.５分であることが見出された。ＢＤＭＱの不存在下４×１０-3Ｍでは、ｔ1/2 はおよそ３０〜６０分であることが見出され、一方、水溶液中２×１０-5Ｍでは、ＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2 は２.５分であることが見出された。
【００１０】
酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタンをレポーター分子として用いる迅速バイオアッセイにおいて、アッセイで「終点」を検出するように、できるだけ早く定常状態の発光キネティックスに到達することが望ましい。化学発光強度は定常状態のキネティックスが得られる前に測定することができるが、定常状態での発光キネティックス以前に正確なデータを得ようとすれば、精巧で、熱的に制御された発光測定機器を用いる必要がある。
【００１１】
さらに、ＡＭＰＰＤ（登録商標）は、水性緩衝液中、ＢＤＭＱ等の化学発光増強剤の存在下あるいは非存在下で、望ましい熱的かつ非酵素的に活性化された発光、あるいは「ノイズ」よりも強い値を示す。このようなノイズは、励起状態のアダマンタノンからの、およびＡＭＰＰＤ（登録商標）分子の芳香族部分に由来するｍ−オキシ安息香酸メチルアニオンの発光によるものである。測定されたＡＭＰＰＤ（登録商標）のノイズレベルは標準的な発光測定器における暗電流より約２オーダー以上であるため、このノイズは検出レベルを制限し、ひいては本来の感度の実現を妨害する。
【００１２】
重要なことには、ＣＣＤカメラ等の化学発光検出用の種々の機器は、緑色波長および赤色の波長においてより大きな検出感度を有している。
【００１３】
ＡＭＰＰＤ（登録商標）および類縁のジオキセタン類は、典型的には可視スペクトルの青色波長で発光する。従来は、発光波長を「シフト」させるために、ポリマー型エンハンサーを用いる必要があった。検出感度を高めるために、可視スペクトルの「赤色または緑色端」に近接した波長で発光するジオキセタン類を得ることが望ましい。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、レポーター分子として酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を用いるアッセイ、とくにバイオアッセイを行うのに要する時間を減少させることである。
【００１５】
また、アッセイ、とくにバイオアッセイにおいてレポーター分子として用いる際に、アッセイを完了するのに要する時間を減少させる、新規で改良された酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を提供することも本発明の目的である。
【００１６】
本発明の他の目的は、改良されたシグナル／バックグラウンド挙動をもたらし、したがって改良された検出レベルをもたらす、酵素ベースのアッセイ、とくにバイオアッセイ用の基質として用いるための新規で改良された酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、その発光波長が緑色および赤色側へシフトしたジオキセタンを提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、これらの改良された酵素的に開裂しうる１，２−ジオキセタン類の合成に有用な新規中間体を提供することである。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、これらの酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類およびそれらの中間体の製造方法を提供することである。
【００２０】
これらおよび他の目的は、本発明の性質、範囲、用途と共に、以下の記載および添付の請求の範囲から、当業者に容易に明らかなものとなる。
【００２１】
発明の概要
上記の目的およびその他のことは、下記一般式の新規な一群のジオキセタン類：
【００２２】
【化３】
【００２３】
（式中、Ｔは、
【００２４】
【化４】
【００２５】
であり、かつＲは独立してジオキセタンに安定性を付与する任意の分枝状のアルキルもしくはシクロアルキル基であっても、または両者のＲが一体となってジオキセタン環にスピロ結合したシクロアルキルもしくはポリシクロアルキル基を形成してもよく、１以上のＲ基は非置換、あるいはハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性有機基で置換されてもよく、Ｒ1は、１以上のハロゲン原子で任意に置換されてもよい、アリール基または炭素数１〜２０のアルキル基であり、ＹはＨまたは電子供与性基もしくは電子吸引性基、または（１）助蛍光団（ancillary fluorophore）もしくは（２）任意の生物学的基に結合する有機リンカー基であってもよく、Ｘは化学的又は酵素的手段で除去される任意の保護基であってもよく、Ｒ2〜Ｒ6は、独立してＨ、アルキル、分岐状アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであり、Ｒ3とＲ4はスピロ縮環したシクロアルキル基として一体化されてもよい）
によって達成される。
【００２６】
上記のジオキセタン類は、縮環ベンゾチアゾールアルデヒドまたはトルエン誘導体より過マンガン酸酸化を用いてカルボン酸を得ることで合成することができる。この酸のエステルが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,７３１，４４５号明細書に記載された方法に従って、上記化合物のジオキセタン前駆体を製造するために用いられる。
【００２７】
詳細な説明
本発明の構造、合成、使用の好ましい態様について記述する。
【００２８】
構造
本発明は、下記一般式を有するジオキセタン類を使用する。
【００２９】
【化５】
【００３０】
（式中、Ｔは、
【００３１】
【化６】
であり、かつＲは独立してジオキセタンに安定性を付与する任意の分枝状のアルキルもしくはシクロアルキル基であっても、または両者のＲが一体となってジオキセタン環にスピロ結合したシクロアルキルもしくはポリシクロアルキル基を形成してもよく、各々のＲ基もしくはスピロ結合した環式基は非置換、あるいはハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性基で置換されてもよく、Ｒ1は、１以上のハロゲン原子で任意に置換されてもよい、アリール基または炭素数１〜２０のアルキル基であり、ＹはＨまたは電子供与性基もしくは電子吸引性基、または助蛍光団もしくは任意の生物学的基に結合していてもよい有機リンカー基であってもよく、Ｘは化学的にあるいは酵素的手段で除去される任意の保護基であってもよく、Ｒ2〜Ｒ6は各々、独立してＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールであり、Ｒ3とＲ4はスピロ縮環したシクロアルキル基として一体化されてもよい）
【００３２】
式Ｉおよび式IIの置換基の各々についての代表的なものは、本明細書中および参照により本明細書に組み込まれる先のトロピックス社の特許に新規な化学式が与えられており、当業者がよく知っているものである。また。Ｒの好ましいものとして、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルキル、とくに好ましくは分枝状のアルキル基が挙げられる。各々のアルキル基は、１以上の電子吸引性基もしくは電子供与性基で置換されていてもよく、および／または各々のアルキル基Ｒは、全体としてのジオキセタンの溶解度を高める、通常はかなり疎水性である、１以上の基で置換されていてもよい。好ましい可溶化基として、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。
【００３３】
好ましい態様において、両者のＲ基は、一緒になってスピロアダマンチル基を形成し、その基は非置換であっても、あるいは、いずれかの橋頭位もしくは両方の橋頭位が、炭素数１〜７のアルコキシ、ハロ、アルキル等のような電子活性（電子吸引性もしくは電子供与性）基で置換されていてもよい。アダマンチル基上の置換基の例は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５,１１２,９６０号明細書に記載されている。スピロアダマンチル基以外では、各々のＲ基として、時期尚早の分解を防止するために、ジオキセタンを立体的に安定化するように選択される。
【００３４】
Ｒ2〜Ｒ6は各々独立に、Ｒ3とＲ4が一緒になってスピロ縮環したシクロアルキル基を形成することを除いて、Ｒ基について上記したと同様に選択される。その他、Ｒ2〜Ｒ6は独立に、水素、非置換あるいは炭素数１〜６のトリフルオロアルキルのような１以上のハロゲン、とくにフッ素で置換されたアルキル、ヒドロキシ、フェニル、ナフチル等から選択される。Ｒ2〜Ｒ6の各々、および／またはすべてあるいはどのような組合せも、上記のように、ジオキセタンの水溶性を向上させるように計算された基でさらに置換されていてもよい。Ｒ2〜Ｒ6の各々の基は、１又は２の水溶性を向上させる基を有していてもよい。アルキルの代わりに、Ｒ2〜Ｒ6の各々、および／またはすべてがアリール、好ましくはフェニルであってもよい。
【００３５】
置換基Ｙは、１以上の機能を果たしてもよい。Ｙは水素であってもよく、あるいは、保護されていないジオキセタンの分解キネティックスをもたらすために（下記のＸについての項参照)、Ｙは電子吸引性基（例えば、任意のヘテロアリール基）であってもよい。Ｙは電子供与性基（例えば、任意のアルキル基）であってもよい。さらに、ジオキセタンのアリール基上に置換する置換基として、広汎な他の電子活性置換基が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,５３８,８４７号明細書に置換基「Ｚ」として記載されている。その中に記載されているように、メトキシ基のような電子供与性基は、アニオン分解プロセスを促進し、一方、塩素のような電子吸引性基はその分解反応を遅らせる。驚くべきことに、アリール環上の置換基の影響は、アダマンチルまたは他の立体的に安定化させる基上の置換基とは全く反対である。その他に、Ｙは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８００，９９９号明細書に記載されているように、本発明のジオキセタンと検討されるべき生物学的な基との間での共有結合をもたらす、炭素数１〜２０の有機リンカー基であってもよい。この態様において、ジオキセタンあるいはその前駆体は、間接的というよりはむしろ、直接的な標識の役目を果たし、酵素以外の、例えばｐＨ、熱等が有効な引き金となるようになる。これらの態様において、（下記の）Ｘとしては、酵素標識基以外のものである。
【００３６】
その他の変形例において、ＹはＯＸ′であってもよい。以下で記述するように、Ｘは引き金となる基、すなわち、その活性化または除去が環のＣ−Ｃ結合およびＯ−Ｏ結合の開裂を経てジオキセタンを分解に導く基である。ベンゾチアゾール基がジオキセタンに結合している部位に関してメタ位にあるＯＸ基は、第一の引き金として作用するものである。ＹをＯＸ′に設定することにより、引き金を追加したり、減少させたりすることができる。この選択がなされる場合には、Ｘ′は独立に、Ｘを特徴づけるかもしれない同一のセットの種々のものから選択される。
【００３７】
古典的な態様においては、Ｘは酵素不安定性基である。好ましい基としてホスフェート基やガラクトシド基が挙げられるが、本質的には、開裂によってオキシアニオンを生じさせる任意の酵素開裂性基が本発明で使用するのに適している。多くの種類の酵素開裂性基が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９５号明細書に明示されている。一般にリン酸エステルに加えて、基Ｘは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９５号明細書に基Ｚとして特定されているいかなる基であってもよく、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスフォリパーゼ、α−またはβ−キシロシダーゼ、フコシダーゼ、グルコシダーゼおよびチオグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、フルクトフラノシダーゼ、グルコシドウロナーゼ、トリプシン等に対する基質が挙げられる。さらに、ＯＸ基は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，５９１号明細書に記載されているように、タンパク質分解酵素により開裂され得る広汎なペプチドのいずれかによって置き換えることができる。
【００３８】
前述のように、酵素的な引き金に対して、非酵素的で化学的な引き金の方が好ましいと思われる状況が存在する。このような例において、Ｘは好ましくはＨ、トリアルキルシリル等である。種々の化学的な引き金およびＸの例が、例えば、これも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,６５２,３４５号明細書に記載されている。
【００３９】
化学発光のモニターおよび測定（定量）において、広汎な装置が開発されている。最も高感度で、とくにスループットの高いスクリーニング用途等に適したものとして、ＣＣＤカメラがある。ジオキセタンからの典型的な化学発光は、可視スペクトルの青色波長において生じる。ＣＣＤカメラは青色発光を「見る」、すなわち自動計測することが困難である。典型的には、カメラは青色発色の長波長側の「端」のみを観測する。ジオキセタン上に縮環ベンゾチアゾール共鳴基を用いると、光は緑色側にシフト、つまり、発光が可視スペクトルの緑色端へシフトする。従来のジオキセタンは、通常、増強剤と共に用いられ、水の存在下で観察されうる化学発光の消光を避けるために、ジオキセタンを疎水性領域に隔離するように構成される。これらの増強分子は、好ましくは、例えばホスホニウム、スルホニウム、およびアンモニウムポリマーのような四級オニウムポリマーである。代表的なポリマーとそれらの効果は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３０，９００号明細書に記載されている。これらのポリマーは、単独で用いてもよく、また、さらに増強効果を向上させるために、参照により本明細書に同じく組み込まれる米国特許第５，５４７，８３６号明細書に記載されているように、界面活性剤添加物と共に用いてもよい。ジオキセタンの発光が緑色側にシフトし、また縮環ベンゾチアゾールの存在によりジオキセタンの疎水性が高くなっているため、より少量の増強剤と、要すれば、必要とされる添加剤が用いられる。前述のように、ジオキセタンのＹ基は、種々の機能に用いられうる。１つの機能は、結合手としての機能である。対象の生物学的基とのリンカーであることに加えて、Ｙは、分解におけるジオキセタンのエネルギー発生を吸収し、これに応答して蛍光を発する蛍光基である、エネルギー伝達型発蛍光基に結合する有機結合基（通常はアルキルまたはアルコキシ）であってもよい。エネルギー伝達型蛍光は、よく研究されており、図７および図８に示されている。
【００４０】
本出願の図面についてより詳細に言及すると、図１は本発明の好ましい態様の化学構造である、ベンゾチアゾールジオキセタンホスフェートを示している。この分子は、本明細書中で、ＢＺＰＤと称する。このジオキセタンの合成は、図３および図４に示されており、合成に必要な反応は以下に記されている。慣用の原料が本発明のジオキセタンの合成に使用され得るが、新規なイソチオシアネート類が本発明の１様相として記載されており、図５に示されている。
【００４１】
図９は、５５０nmより上のピーク波長を示しており、増強剤不存在下でのＢＺＰＤの発光波長の「グリーンシフト（緑色側へのシフト）」を示している。図１０に示すように、増強剤｛Sapphire-II（商標）｝の存在下で、長波長強度がさらに増大している。ＢＺＰＤの相対的な化学発光性能は、図１１〜１４において、他の商業的に成功を収めているジオキセタン類と比較されている。すなわち、ＣＳＰＤ（登録商標）（アダマンチル基上に塩素置換基を有するフェニルジオキセタン）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（さらにフェニル基上に塩素を有するもの）と比較して、ＢＺＰＤの相対的に「迅速な」あるいは短いＴ1/2が図１１−Ａに示されている。本発明のジオキセタンは、図１１−Ｂに示されているように、優れたＳ／Ｎ性能をも有している。もしバックグランドのノイズがあまりにも高い（低いＳ／Ｎ）と、ピーク強度の発現がいかに迅速であろうと、アッセイは相対的に感度の低いものとなるので、Ｓ／Ｎ値は重要である。
【００４２】
図１２−Ａおよび図１２−Ｂは２４分後に同様の性能を示すものであり、ＢＺＰＤの継続的に高い感度と発光プロフィールを示している。
感度はジオキセタン検出剤に必須の特性である。図１３−Ａおよび図１４−Ａにおいて、アルカリホスファターゼの様々な濃度でのＢＺＰＤについての４分後および２４分後のそれぞれの感度を測定した。明らかに示されているように、ＢＺＰＤはきわめて低い酵素濃度（１０-17モル以下)においてさえ、優れた検出感度（より大きなシグナル）を与える。図１３−Ｂおよび図１４−Ｂに示されているように、ＢＺＰＤのＳ／Ｎ比は、これまでに開発されたジオキセタンに匹敵するものであるので、高められた感度はごく少量の物質を検出するのに用いることができる。
【００４３】
ＢＺＰＤの直接合成法を下記する。
上記のジオキセタン類は、縮環型ベンゾチアゾールアルデヒドまたはトルエン誘導体より過マンガン酸酸化を用いて合成しうる。参照により本明細書に同じく組み込まれる米国特許第５，７３１，４４５号明細書に記載の方法に従って上記化合物のジオキセタン前駆体を製造するために、この酸のエステルが用いられる。
【００４４】
ベンゾチアゾールジオキセタン基質の合成
以下の例は、ベンゾチアゾールジオキセタン基質およびそれらの前駆体の代表的な合成であり、特許請求の範囲を一切限定するものではない。４，6-ジブロモ−ｏ−アニシジンは次の文献に従って得られた：Fuchs, Monatshefte fur Chemie, 36, 130, 1915。
【００４５】
バリアンユニティー（Varian Unity）３００ＮＭＲスペクトロメーターを使用した。全てのＮＭＲデータは、プロトン（ 1 Ｈ）ＮＭＲである。
【００４６】
実施例１：２−ベンズアミド−３，５−ジブロモアニソール
４，５−ジブロモ−ｏ−アニシジン（１１．３ｇ；４０．２mmol）を、ジクロロメタン７５ml及びピリジン６．７mlに溶解した。混合物をアルゴン下に室温で撹拌した。塩化ベンゾイル（４．８ml；１．０３当量）をシリンジにより滴下して加えた。混合物を８時間撹拌して、橙−茶色の懸濁液を得た。次に反応混合物をロータリーエバポレーターで１/３の容量に濃縮した。濃厚のスラリーを Buchner 漏斗で濾過し、フラスコ及び固形物をジクロロメタン／ヘキサン５０：５０で洗浄した。次に得られた白色の固形物を水で十分に洗浄して、あらゆるピリジン塩酸塩を除去した。固形生成物を真空下に乾燥して、上記の標記生成物１３．５６ｇを得た。２相の濾液を漏斗中に水で洗浄し、有機層を分離し、次にロータリーエバポレーターに付して、紫茶色の固形物を得た。ジクロロメタン／ヘキサン５０：５０によりこね、酢酸エチルの最小量から再結晶して、第２の産物を１．４３ｇの重量で得た。
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.81 (s, 3H), 7.36 (1H), 7.44-7.71 (m, 4H), 7.88-8.11 (m, 2H), 9.88 (s, 1H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3420, 2980, 2940, 1691, 1585, 1487, 1400, 1041, 875, 837.
【００４７】
実施例２：Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）フェニルチオベンズアミド
前記実施例の生成物（１４．４ｇ；３７．４mmol）を、無水ピリジン３５mlに僅かに温めながら溶解した。五硫化リン（１１ｇ；４９．５mmol）をアルゴン下に一部づつ加えた。濃厚で薄黄色の錯体が発熱して形成した。この混合物を油浴に９０℃で２時間撹拌して、稀薄で暗黄色の懸濁液を得た。次に混合物を１５分間還流し、室温に冷却した。混合物を酢酸エチル１２５mlで処理して、ガムを沈殿させた。次に水１mlを渦巻きながら加え、ガムを凝集させ、その後上澄みをデカントした。次にガムを酢酸エチル２×２５mlでこねた。合わせた有機物をロータリーエバポレーターに付して、ピリジンを含有する橙色の油状物を得た。水中の水酸化ナトリウムの７％水溶液を、２０分間激しく撹拌しながら油状物に加えた。溶液を濾過して不溶物を除去し、水酸化物溶液の最小量ですすぎ洗いした。次に濾液を３M ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、フロック状で薄黄色の固形物を沈殿させ、ジクロロメタンの最小量に溶解した。有機層を分離し、ロータリーエバポレーターに付して、レモンイエロー色の固形物として上記の標記生成物１２．６ｇを得た。エタノールからの再結晶により分析試料を得て、ＴＬＣ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン；Ｒｆ＝０．５６）で１点材料を得た。
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.81 (s, 3H), 7.40-7.59 (m, 6H), 7.90-7.93 (m, 2H), 11.36 (s, 1H).
IR (CHCl3/cm-1): 3380, 2990, 1584, 1490, 1400, 1345, 1040, 878, 838, 695.
【００４８】
実施例３：２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
前記実施例のチオアミド１２．６ｇ（３１．４mmol）を、メタノール３０ml中で温めた。メタノール中の４．３M ナトリウムメトキシド７．３５ml（３１．６mmol）を加えながら、懸濁液を渦巻いた。添加の間に固形物は溶解し、黄色は薄琥珀色に退色した。溶媒をロータリーエバポレーターに付し、真空に排出して、ガラスを被覆する琥珀色でガラス状の固形物を得た。Ｎ−メチルピロリドン２０mlを加える間、このチオアミド塩をアルゴン下に保持した。フラスコを隔膜で蓋をし、泡立て器に接続して、１１０〜１２０℃の油浴に配置した。３０分間撹拌して固形物を発生させ、色が緑茶色になった。次にフラスコを室温に冷却し、その後水１００mlを加えて、オフホワイトの固形物を生成した。混合物を濾過し、固形物を水で十分に洗浄した。真空下に乾燥し、固形物を酢酸エチル：ヘキサン５０：５０から再結晶して、白色で毛髪様の針状物７．０５ｇを得た。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４７で青色螢光生成物の点を示し、微量のＵＶ吸収不純物が、より高いＲｆ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）において存在した。不純物をシリカゲルクロマトグラフィーにより除去して、分析試料を得た。ＮＭＲ及びＩＲデータは、上記の標記生成物の構造と一致していた。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 4.10 (s, 3H), 7.07 (d, 1H), 7.49-7.52 (m, 3H), 7.66 (d, 1H), 8.11-8.14 (m, 2H).
IR (CHCl3/cm-1): 3003, 2940, 1590, 1562, 1517, 1440, 1400, 1387, 1322, 1260, 1055, 978, 830, 690.
【００４９】
実施例４：２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
前記実施例のクロマトグラフィーに付した生成物３ｇ（９．３７mmol）を、無水ＴＨＦ ７０mlにアルゴン下で溶解した。別のフラスコで無水ＴＨＦ ６０mlを冷却し、アルゴン下に−７８℃で撹拌した。このフラスコに２．５M ｎ−ブチルリチウム５．６ml（１４．１mmol）をシリンジにより加えた。次にブロモベンゾチアゾール出発物質の溶液を、添加漏斗からアルゴン下に２５分かけて滴下して加えた。添加の終了時にＴＨＦ ７mlを使用して、漏斗をすすぎ洗いした。赤茶色の溶液を低温度で更に１０分間撹拌した。次に無水ＤＭＦ １．８mlをシリンジにより滴下して加えた。１０分後、溶液を１時間かけて徐々に室温に温めた。反応を１M塩化アンモニウム水溶液２０mlの急速な添加によりクエンチした。ＴＨＦを Rotovap により除去し、生成物を酢酸エチルと残留水に分配した。酢酸エチル層を水で４回洗浄して、あらゆるＤＭＦを除去した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去して、半固形ペーストを得た。これをヘキサン中の２０％ジクロロメタン２０mlでこね、その後デカントし、真空に排気して、無水固形物を得た。得られた桃色生成物は１．８１ｇの重量であった。ＴＬＣは、実質的にＲｆ値０．６２（Kieselgel ６０−１０％酢酸エチル／ヘキサン）での１点を示した。同様にして得られた生成物のスペクトルデータは同一であり、上記の標記化合物に予想されるものと一致していた。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 4.18 (s, 3H), 7.48-7.56 (m, 4H), 8.04 (d, 1H), 8.17-8.20 (m, 2H), 10.08 (s, 1H).
IR (CHCl3/cm-1): 3010, 2840, 2740, 1695, 1595, 1572, 1480, 1470, 1395, 1290, 1270, 1145, 1057, 983, 850, 690.
【００５０】
実施例５：２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
アルゴン下に前記の実施例のアルデヒド１．８ｇ（６．７mmol）を、ジクロロメタン１１ml、トリメチルオルトホルマート０．９ml及び無水メタノール０．７mlにより処理した。懸濁液を撹拌して、トルエンスルホン酸一水和物１０５mgを一度に加えた。フラスコをアルゴンでパージした後、隔膜で閉じた。固形物は速やかに溶解して、黄−橙色の溶液を得た。室温で一晩撹拌を続けた。反応混合物を、過剰トリエチルアミン（０．１５ml）によりシリンジを使用して中和した。混合物から全ての揮発物をストリッピングし、混合物をジクロロメタンの最小量に溶解して、アルミナの２cm×１．５インチカラムのプラグクロマトグラフィーに付した。溶離剤をロータリーエバポレーターに付し、油状物を排気して徐々に凝固した。試料を直ぐにＩＲ分析し、カルボニル吸収の不在を示した。これは、アセタール形成が完了したことを示し、粗生成物は直ぐに次の反応に使用した。IR (CH2Cl2/cm-1): 2940, 2840, 1602, 1580, 1468, 1410, 1355, 1198, 1155, 1060, 996, 837.
【００５１】
実施例６：ジエチル−１−メトキシ−１−（２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル）メタンホスホナート
前記工程で得られた粗生成物を、篩−乾燥ジクロロメタン１１ml及びトリエチルホスファイト１．５mlにアルゴン下で溶解した。フラスコを隔膜で密閉し、撹拌された溶液をドライアイス／アセトン浴で−７８℃に冷却した。アルゴン風船によりこの温度で圧力を平衡させた。次に懸濁液となった混合物を、三フッ化ホウ素エテラート１．０mlを滴下して処理した。内容物を徐々に約−２０℃に温めると、懸濁固形物は溶解した。溶液を冷蔵庫に１時間保存し、次に一晩撹拌しながら徐々に室温に温めた。翌朝、固形重炭酸ナトリウム０．７ｇ、続いて飽和重炭酸ナトリウム水溶液１５mlを加えた。２相を激しく撹拌して二酸化炭素を放出させた。必要に応じて水を３時間かけて加え、あらゆる無機物を溶解した。ジクロロメタン層を分離し、水性層を同じ溶媒１５mlで逆抽出した。合わせた有機物をＴＬＣ（Kieselgel ６０−酢酸エチル）に付して、ほぼＲｆ＝０．１５に単一のＵＶ／青色螢光の点を示し、原点にテーリングしている。溶液を蒸発させ、４０℃で真空に排気した。次に粘性で黄色の油状物を、ジクロロメタン／酢酸エチル５０/５０の最小量に溶解し、非常に短いプラグのシリカゲルに通した。溶離剤を、ジクロロメタン／ヘキサンの混合物により数回ストリッピング及びチェーシングをした。油状生成物は２．７ｇの重量であった。ＮＭＲ及びＩＲ分光分析法は、実質的に純粋な生成物を示したが、水分の存在が示された。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.21-1.36 (m, 6H), 3.46 (s, 3H), 3.93-4.21 (m, 7H), 4.59-4.64 (d, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.47-7.52 (m, 3H), 7.57 (s, 1H), 8.11-8.14 (m, 2H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3660 & 3460 (H2O), 2980, 2935, 2860, 1597, 1570, 1510, 1480, 1460, 1445, 1408, 1342, 1245-1285(br), 1100, 1040(br), 965(br), 865, 840, 610.
【００５２】
実施例７：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
前記工程の排気されたホスホナートエステル２．７ｇ（６．４mmol）を、無水ＴＨＦ ２５mlにアルゴン下で溶解した。溶液を、隔膜及びアルゴン風船を装備したフラスコで、撹拌しながら−７８℃に冷却した。溶液を、ヘキサン中の２．５M ｎ−ＢｕＬｉの十分量により滴下して処理して、ほぼパーマネントレッドパープル色を達成した。この方法で、水分及びプロトン性不純物の全てを滴定した。続いて、同じｎ−ＢｕＬｉ溶液２．７ml（６．７５mmol）を滴下して加えて、バーガンディ色の溶液を得た。低温で１０分間撹拌した後、２−アダマンタノン（０．９５ｇ、６．３３mmol）を、水分を除外するためにアルゴンの強流下で、固形物として加えた。固形物を１０分かけて溶解した。次に溶液を徐々に室温に温めた。アルゴン雰囲気を維持しながら、還流冷却器を装着した。混合物を１．５時間還流して、薄橙色の溶液を得た。次にＴＨＦを、注意深く発泡を避けながら、ロータリーエバポレーターでストリッピングした。生成物を、酢酸エチル２５mlと飽和重炭酸ナトリウム／水１：１ ５０mlに分配した。次に有機層を水２５mlで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ストリッピングして、薄黄色のガムを得た。ガムを、微量の極性汚染物を除去するためにクロロメタンにより溶離して、短いカラムのシリカゲルのプラグクロマトグラフィーに付した。適切な画分を排気して、ジクロロメタン−ヘキサンによりチェーシングした。排気された生成物は２．１４ｇの重量であり、冷凍庫で保管すると半固形物になった。ＩＲ分光分析法では、小さい２−アダマンタノンカルボニルバンドを表し、それは微量の汚染を示し、次の工程で除去された。
IR (CH2Cl2/cm-1): 2920, 2850, 1597, 1567, 1450, 1402, 1330, 1320, 1310, 1252, 1165, 1100, 1057, 978, 865, 640, 620. トレースＡＤ＝1720 及び 1710で０。
【００５３】
実施例８：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−ヒドロキシベンゾチアゾール
ＤＭＦ中のナトリウムエタンチオラートを６０％水素化ナトリウム及びエタンチオールから調製した（６０％水素化ナトリウム２４０mg（６mmol）を、アルゴン雰囲気下にヘキサンで３回洗浄して鉱油を除去した）。ＤＭＦ １１mlを加えた。エタンチオール（０．４５ml、６mmol）を滴下して加え、撹拌しながら、得られた懸濁液を０℃に冷却した。水素の発生が停止した後、溶液を室温に温め、別個のフラスコ中のメトキシ〔２−フェニル−４−メトキシ（ベンゾチアゾール−６−イル）メチリデンアダマンタン１．６４ｇ（３．９mmol）にアルゴン下でピペットにより加えた。得られた溶液を油浴中に１３０℃で撹拌した。１時間後、溶液は濃橙色になり、懸濁固形物を含有した。反応混合物を冷却し、１Ｍ塩化アンモニウム及び７５％酢酸エチル／ヘキサンの各５０mlに分配した。有機層を水２５mlで３回洗浄した。合わせた水性層を同じ溶媒混合物で逆抽出し、次に水で数回洗浄した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥した。ＴＬＣ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）は、Ｒｆ＝０．２３で生成物を示したが、Ｒｆ＝０．３９で出発物質を示した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル：５０％ジクロロメタン−ヘキサン〜純粋ジクロロメタン）は、低Ｒｆ生成物の純粋な画分１個を単離した。混合画分を繰返しクロマトグラフィーに付して、更なる生成物を単離した。溶媒をストリッピングした後、上記の標記生成物の合計２４５mgを得た。
NMR (300 MHz/CD2Cl2): δ 1.74-2.07 (m, 14H), 2.71 (s, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.32 (s, 3H), 6.76 (s, 1H), 6.94 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.44-7.59 (m, 3H), 7.99-8.16 (m, 2H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3520, 2910, 2850, 1612, 1575, 1480, 1445, 1302, 1284, 1175, 1080, 980, 860.
【００５４】
実施例９：二ナトリウム６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスファート
分子篩乾燥ピリジン４．０mlをフラスコにアルゴン下で配置した。フラスコは、電磁撹拌棒を備え、氷浴に配置された。蒸留オキシ塩化リン０．１１２ml（１．２mmol）をシリンジにより滴下して加えた。他のフラスコで前記実施例のヒドロキシベンゾチアゾール誘導体２４５mgを、無水ＴＨＦ １５mlにアルゴン下で溶解した。次にＴＨＦ溶液を、リン酸化剤の撹拌した溶液に徐々に滴下して加えた。添加の間、沈殿物が発生した。添加の終了時に、フラスコ及びシリンジをＴＨＦ ２mlですすぎ洗いし、また、そのＴＨＦを反応フラスコに徐々に加えた。次に反応混合物を室温に温め、３時間撹拌した。先端に綿の付いたシリンジ２０mlを使用して上澄みを吸い取り、ピリジン塩酸塩を残した。この上澄みを、０．５M水酸化ナトリウム溶液１５mlに滴下して加え、氷浴温度で撹拌しながら、水で７５mlの容量に稀釈した。僅かに曇った溶液を室温に温めて透明にした。溶液を、注意深く排出してＴＨＦを除去し、容量を、アセトニトリル５．０ml及び水により１１０mlに調整した。この溶液を、Polymer Laboratories 社製２インチポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２分割して注入した。勾配５％〜１０％アセトニトリルを使用して、２７０nmにおいて最大ピーク吸収で分離させた。この勾配は、あらゆる特定の装置において最適化を必要とする。適切な画分を収集し、凍結乾燥して、薄黄色の固形物２９４mgを得た。分光データは上記の標記構造と一致した。同様の支持を有し、０．１％水性重炭酸ナトリウムに対するアセトニトリル勾配を使用した分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、１３．２分で溶離する単一生成物を示した（約５０％アセトニトリル）。
NMR (300 MHz/D2O): δ 1.38-2.02 (m, 14H), 2.51 (s, 1H), 3.00 (s, 3H), 7.26-7.53 (m, 5H), 7.75-8.04 (m, 2H).
【００５５】
実施例１０：二ナトリウム６−（メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デカン〕−４−イル）２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスファート
前工程のエノールエーテルホスファート２８５mgを管に配置した。固形物をメタノール１．０mlで湿潤し、次にジクロロメタン２５mlを加えて溶解した。次に溶液を５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＣＨＣｌ3中２mg/ml）の溶液０．５mlで処理した。溶液に酸素ガスを噴霧しながら管の内容物を０℃に冷却した。５分後、酸素が溶液から泡立ち続けている間、温度を５℃に維持しながら、冷却した４００ワットのナトリウムランプにより管を照射した。ランプと管の間に Kapton ポリイミドフィルムの５mm 厚切片を配置して、不要なＵＶ放射線を取り除いた。照射を１７分間続けた。分析ＨＰＬＣ〔０．１％ＮａＨＣＯ3（Ｈ2Ｏ）−アセトニトリル勾配〕は、出発物質（１３．２分で溶離）の１，２−ジオキセタン（１２．９４分で溶離）への変換が実質的に完了したことを示した。反応混合物から溶媒をストリッピングして、赤色のガムを得た。アセトニトリル５ml及び０．０５M水性水酸化ナトリウム２０mlを、渦巻き及び随時冷却しながら加えてガムを溶解した。次にＤＩ水を加えて総容量を７０mlにした。この溶液を高い保持力を有する紙フィルタを通して濾過し、少量づつ水で注意深く洗浄して、１１０mlの容量の濾液を得た。この溶液を、Polymer Laboratories 社製１インチポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２分割して注入した。勾配５％〜１００％アセトニトリル（水に対して）を使用して、２７０nmにおいて最大ピーク吸収で分離させた。この勾配は、あらゆる特定の装置において最適化を必要とする。同様の支持を有し、０．１％水性重炭酸ナトリウムに対するアセトニトリル勾配を使用した、合わせた生成物の分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、１２．９６分で溶離する単一生成物を示した（約５０％アセトニトリル）。適切な画分を収集し、凍結乾燥して、薄黄色の固形物２８７mgを得た。生成物１，２−ジオキセタンは、ｐＨ８．５で水性緩衝液中においてアルカリ性ホスファターゼによりトリガーされたとき、５５８nmで緑色光を発生した。UV: 213, 260.5 及び 50/50 CH3CN/H2Oにおける304 nm
【００５６】
実施例１１：２−メトキシ−４，６−ジブロモフェニルイソチオシアナート
４，６−ジブロモ−ｏ−アニシジン１９．７５ｇ（７０mmol）及び固形重炭酸塩２０ｇを、フラスコにアルゴン下で配置した。大型で強力な電磁撹拌棒を適用し、続いてアセトニトリル１２０ml及びジクロロメタン５０mlを加えた。チオホスゲン６．０mlをシリンジにより急速に加えながら、懸濁液を０℃で撹拌した。直後に濃厚な沈殿物が発生した。フラスコの内容物を徐々に室温に温めながら、激しく撹拌した。発生した二酸化炭素を、ニードルベントを有する泡立て器に導いた。混合物は温まると僅かに稀薄になり、より容易に撹拌された。激しい撹拌を２時間続けた。次に懸濁液を０℃に再冷却した。固形物を Buchner 漏斗で濾取し、フラスコをすすぎ洗いし、あらゆる残留固形物を冷却アセトニトリル３０mlによって移した。濾液をロータリーエバポレーターに付して、橙色の変色領域を含む固形物にした。この固形物をヘキサンでこね、排気乾燥し、白色の元のフィルターケークを含有する Buchner 漏斗に移した。この固形物を、存在する無機重炭酸塩（二酸化炭素は放出された）を中和するために、ＮａＨ2ＰＯ4の０．５M水溶液５×１００mlにより洗浄した。固形物をすすぎ洗いの度に砕いた。次に白色の生成物を水で十分に洗浄し、真空下に乾燥した。無水生成物は２１．８ｇの重量であった。同様の合成生成物から得られた分析データは、上記の標記構造と一致した。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 3.92 (s, 3H), 6.98 (d, 1H), 7.31 (d, 1H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3020, 2970, 2940, 2030(br), 1575, 1555, 1470, 1400, 1040, 935, 870, 840.
【００５７】
実施例１２：２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール〔１ポット方法〕
前記実施例のイソチオシアナート１５．５ｇ（４８mmol）を、無水ＴＨＦ ５０mlにアルゴン下で溶解した。溶液を氷浴中で撹拌しながら０℃に冷却した。フェニルマグネシウムブロミド（Aldrich 社製、ＴＨＦ中１．０M）５０ml（５０mmol）を、シリンジにより稀薄流で加えた。冷却中に１０分間撹拌した後、溶液を徐々に室温に温めた。この時点で僅かに発熱しながら沈殿物が発生し始めた。薄橙−茶色の懸濁液は２時間で濃厚となった。溶媒を３０℃でロータリーエバポレーターにより除去して、ガラスを被覆する湿った桃色の固形物を得た。篩乾燥ＤＭＦ ５０mlを加えて、この材料を空気から保護した。固形物は僅かに発熱しながら溶解した。フラスコを１２５℃で油浴に配置した。４５分間で、あらゆる残留ＴＨＦを、短路蒸留ヘッドを使用してフラスコから留去した。混合物はこの間に暗色化し、懸濁固形物が発生した。室温に冷却すると、フラスコの内容物は固形化した。水性１M ＨＣｌ １００mlを加え、固形物を砕いた。続いて水１００mlを加えた。混合物を冷浸して、あらゆる対応するマグネシウムイオンを除去した。次に混合物を濾過し、水で十分に洗浄した。湿った固形物を温酢酸エチル２×２５０mlに取り、不溶フロックから上澄みを分離した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ストリッピングして、薄茶色の固形物１３．２７ｇを得た。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４７で主な青色螢光生成物の点を示し、微量のＵＶ吸収不純物が、より高いＲｆで存在した（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）。少量の着色原点を、シリカゲルのプラグクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により除去した。適切な画分を合わせて、生成物（実施例３と実質的に同一）１２．２９ｇを得たが、高いＲｆで微量の不純物をまだ含有した。本実施例の反応は、また、フェニルマグネシウムブロミドをイソチオチアナートと反応させて、実施例２のチオアミド生成物を得た後の、酸性化及び作用であり得る。
【００５８】
下記も上記の一般的な合成方法論に従って合成した。当業者は、必要に応じて些細な修正を容易に行うことができる。ベンゾチアゾール系へのあらゆる他の経路も同様に適用され得る。
【００５９】
実施例１３：２−（ｐ−ベンジルオキシベンズアミド）−３，５−ジブロモアニソール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.79 (s, 3H), 5.21 (2H), 7.11-7.14 (d, 2H), 7.34-7.52 (m, 7H), 7.93-7.96 (d, 2H), 9.70 (s, 1H).
【００６０】
実施例１４：Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）−ｐ−ベンジルオキシフェニルチオベンズアミド
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.80 (s, 3H), 5.22 (2H), 7.08-7.11 (d, 2H), 7.32-7.55 (m, 7H), 7.95-7.98 (d, 2H), 11.12 (s, 1H).
【００６１】
実施例１５：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 4.00 (s, 3H), 5.21 (2H), 7.17-7.22 (m, 3H), 7.34-7.50 (m, 5H), 7.98-8.01 (m, 3H).
【００６２】
実施例１６：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 4.05 (s, 3H), 5.23 (2H), 7.20-7.23 (d, 2H), 7.33-7.50 (m, 6H), 8.05-8.08 (d, 2H), 8.31-8.32 (d, 1H), 10.04 (s, 1H).
【００６３】
実施例１７：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
IR (CHCl3/cm-1): 3000, 2940, 2840, 1611, 1580, 1530, 1490, 1470, 1355, 1180, 1155, 1060, 1020, 980, 838, 700.
【００６４】
実施例１８：ジエチル−１−メトキシ−１−〔２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル〕メタンホスホナート
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.19-1.37 (m, 6H), 3.43 (s, 3H), 3.86-4.18 (m, 7H), 4.51-4.75 (m, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.02-7.03 (m, 2H), 7.30-7.52 (m, 7H), 8.02-8.06 (m, 2H).
【００６５】
実施例１９：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.78-2.1 (m, 14H), 2.74 (s, 1H), 3.30 (s, 1H), 3.35 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 6.85-6.96 (m, 1H), 6.99-7.12 (m, 2H), 7.29-7.50 (m, 6H), 7.99-8.14 (m, 2H).
【００６６】
【表１】
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 縮環（ヘテロアリール）ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェートを示す。
【図２】 （省略）
【図３】 本発明の式Ｉのジオキセタンの合成を示す。
【図４】 本発明の式Ｉのジオキセタンの合成を示す。
【図５】 本発明の式Ｉのジオキセタンの中間体の合成を示す。
【図６】 （省略）
【図７】 エネルギー移動を用いた赤色発光ジオキセタン系の合成および構造を示す。
【図８】 エネルギー移動を用いた赤色発光ジオキセタン系の合成および構造を示す。
【図９】 本発明のジオキセタンの発光スペクトルを示す。
【図１０】 本発明のジオキセタンの発光スペクトルを示す。
【図１１Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１１Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１２Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１２Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１３Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１３Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１４Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１４Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
この出願は、１９９８年７月２８日に出願された米国出願番号６０／０９４,３３６号の仮出願を優先権主張してなされた、正規の国内出願である。この仮出願の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、改良された化学発光性１，２−ジオキセタン化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、改良された酵素的に除去しうる不安定性基を含む、酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン化合物に関する。この不安定性基は、不安定性基を除去するために適当な酵素が添加されるまで、分子が光、すなわち可視光または適当な機器で検出可能な光を発生して分解するのを防止する。
【０００３】
１個の酵素分子が、触媒サイクルを経て、数千の酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン分子からその優れた不安定性基の除去を行うことができる。このことは、各々のジオキセタン分子からその優れた不安定性基を除去するのに１分子の化学的な開裂剤が必要である、化学的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類とは、極めて対照的である。
【０００４】
酵素的に開裂可能な発光性の１，２−ジオキセタン化合物は、通常、ジオキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合した、例えばアダマンチリデン基のような安定化基をも有しており、それは、酵素的に開裂しうる不安定性基が残りの分子に結合している結合を意図的に開裂する前に、ジオキセタン化合物が室温（約２５℃）で自発的な分解を生起するのを防止することを助けている。(Wiervngaら、Tetrahedron Letters, 169 (1972) および McCapra ら、J. Chem. Soc., Chem. Comm., 944 (1977)）。このように、これらの安定化基により、そのようなジオキセタン類を使用前に極めて長期間、実質的な分解を生起することなく、例えば約４℃から約３０℃の温度範囲で約１２ヶ月から約１２年程にわたって貯蔵することが可能となる。
【０００５】
本発明は、さらに、そのジオキセタン分子を従来公知のイムノアッセイ、化学アッセイ、および核酸プローブアッセイに組み込むこと、ならびに、化学的または生物学的物質の存在、量、もしくは構造を同定あるいは定量する分析を可能とする、種々のミクロ分子、合成ポリマー、タンパク質、核酸、触媒的抗体などの分子構造やミクロ構造研究用の直接的な化学的／物理的プローブとしてのそれらの使用に関する。
【０００６】
発明の背景
発明者として本願中の発明者の一名以上の名が挙げられ、そしてトロピックス社（Tropix, Inc.）に譲渡された出願には、化学発光性化合物として１，２−ジオキセタン類が明確に記載されており、それらは、種々の生物学的材料の検出用に、外的条件や手の込んだ装置に依存することなく、迅速に行うことができる超高感度アッセイにおけるレポーターや標識として用いることができる。これらには、米国特許第４，９３１，２２３；４，９３１，５６９；４，９５２，７０７；４，９５６，４７７；４，９７８，６１４；５，０３２，３８１；５，１４５，７７２；５，２２０，００５；５，２２５，５８４；５，３２６，８８２；５，３３０，９００；５，３３６，５９６；および５，８７１，９３８号がある。前述のもの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。本願と共通して譲渡された他の特許は発行されており、他の出願は出願係属中である。この多くの特許文献は共に、ジオキセタン環の炭素の１つに結合した典型的にはスピロアダマンタンのような多環基および電子感受性であるジオキセタン環の残りの炭素に結合した基で安定化された、１，２−ジオキセタン類を取り扱っており、電子感受性基の保護、典型的にはアリール基は、アニオン、通常はオキシアニオンに導き、それは不安定であって、そして分解する。分解により、Ｏ−Ｏ結合は切断され、光子が発生する。この電子感受性基が結合している同一の炭素原子はアルコキシまたは他の電子活性基を有する。
【０００７】
最初に市販されたこのクラスのジオキセタン類は、３−(４−メトキシ−スピロ（１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ(３．３．１．１3,7)デカン）−４−イル）フェニルホスフェート、とくにその二ナトリウム塩であり、一般にＡＭＰＰＤ（登録商標）として知られている。この化合物は、ミシガン州、デトロイトのルミジェン社（Lumigen, Inc.）と共に、本願の譲受人、すなわちトロピックス社により市販されている。上記化合物の優れた性能は、スピロアダマンタン環上の選択的な置換によって得ることができる。いずれかの橋頭位炭素を塩素のような電子活性種で置換すると、反応速度およびシグナル／ノイズ比（ｓ/n）が改善される。ＡＭＰＰＤ（登録商標）の塩素置換体であるＣＳＰＤ（登録商標）は、マサチューセッツ州、ベッドフォードのトロピックス社により広く市販されている。アリール基が同じく塩素のような電子活性置換基を有する、同様構造の「第三世代」ジオキセタン化合物では、性能がさらに改善されており、トロピックス社が市販している。そのホスフェートは、ＣＤＰ（登録商標）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の商標で入手できる。
【０００８】
しかしながら、水溶液中でさらに化学発光向増強剤、例えばポリ〔ビニルベンゾチアゾール（ベンゾチアゾールジメチルアンモニウムクロリド）〕（「ＢＤＭＱ」）のようなポリマー状アンモニウム、ホスホニウムまたはスルホニウム塩および他のヘテロ極性ポリマーの存在下でのＡＭＰＰＤ（登録商標）は、一定の発光特性（「ｔ1/2」、一定の定常状態の発光レベルでの最大化学発光強度の半分を得るのに要する時間として定義される；この発光半減期は種々の環境において、ジオキセタンオキシアニオンの安定性の関数として変動する）に到達する最適時間がより長くなることが認められた。
【０００９】
統計的には、およそ７（ｔ1/2）の時間が、定常的な発光キネティックスに到達するのに必要とされる。ＢＤＭＱの存在下ｐＨ９.５の水溶液中２×１０-5Ｍより上の濃度でのＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2 は７.５分であることが見出された。ＢＤＭＱの不存在下４×１０-3Ｍでは、ｔ1/2 はおよそ３０〜６０分であることが見出され、一方、水溶液中２×１０-5Ｍでは、ＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2 は２.５分であることが見出された。
【００１０】
酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタンをレポーター分子として用いる迅速バイオアッセイにおいて、アッセイで「終点」を検出するように、できるだけ早く定常状態の発光キネティックスに到達することが望ましい。化学発光強度は定常状態のキネティックスが得られる前に測定することができるが、定常状態での発光キネティックス以前に正確なデータを得ようとすれば、精巧で、熱的に制御された発光測定機器を用いる必要がある。
【００１１】
さらに、ＡＭＰＰＤ（登録商標）は、水性緩衝液中、ＢＤＭＱ等の化学発光増強剤の存在下あるいは非存在下で、望ましい熱的かつ非酵素的に活性化された発光、あるいは「ノイズ」よりも強い値を示す。このようなノイズは、励起状態のアダマンタノンからの、およびＡＭＰＰＤ（登録商標）分子の芳香族部分に由来するｍ−オキシ安息香酸メチルアニオンの発光によるものである。測定されたＡＭＰＰＤ（登録商標）のノイズレベルは標準的な発光測定器における暗電流より約２オーダー以上であるため、このノイズは検出レベルを制限し、ひいては本来の感度の実現を妨害する。
【００１２】
重要なことには、ＣＣＤカメラ等の化学発光検出用の種々の機器は、緑色波長および赤色の波長においてより大きな検出感度を有している。
【００１３】
ＡＭＰＰＤ（登録商標）および類縁のジオキセタン類は、典型的には可視スペクトルの青色波長で発光する。従来は、発光波長を「シフト」させるために、ポリマー型エンハンサーを用いる必要があった。検出感度を高めるために、可視スペクトルの「赤色または緑色端」に近接した波長で発光するジオキセタン類を得ることが望ましい。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、レポーター分子として酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を用いるアッセイ、とくにバイオアッセイを行うのに要する時間を減少させることである。
【００１５】
また、アッセイ、とくにバイオアッセイにおいてレポーター分子として用いる際に、アッセイを完了するのに要する時間を減少させる、新規で改良された酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を提供することも本発明の目的である。
【００１６】
本発明の他の目的は、改良されたシグナル／バックグラウンド挙動をもたらし、したがって改良された検出レベルをもたらす、酵素ベースのアッセイ、とくにバイオアッセイ用の基質として用いるための新規で改良された酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、その発光波長が緑色および赤色側へシフトしたジオキセタンを提供することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、これらの改良された酵素的に開裂しうる１，２−ジオキセタン類の合成に有用な新規中間体を提供することである。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、これらの酵素的に開裂しうる化学発光性１，２−ジオキセタン類およびそれらの中間体の製造方法を提供することである。
【００２０】
これらおよび他の目的は、本発明の性質、範囲、用途と共に、以下の記載および添付の請求の範囲から、当業者に容易に明らかなものとなる。
【００２１】
発明の概要
上記の目的およびその他のことは、下記一般式の新規な一群のジオキセタン類：
【００２２】
【化３】
【００２３】
（式中、Ｔは、
【００２４】
【化４】
【００２５】
であり、かつＲは独立してジオキセタンに安定性を付与する任意の分枝状のアルキルもしくはシクロアルキル基であっても、または両者のＲが一体となってジオキセタン環にスピロ結合したシクロアルキルもしくはポリシクロアルキル基を形成してもよく、１以上のＲ基は非置換、あるいはハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性有機基で置換されてもよく、Ｒ1は、１以上のハロゲン原子で任意に置換されてもよい、アリール基または炭素数１〜２０のアルキル基であり、ＹはＨまたは電子供与性基もしくは電子吸引性基、または（１）助蛍光団（ancillary fluorophore）もしくは（２）任意の生物学的基に結合する有機リンカー基であってもよく、Ｘは化学的又は酵素的手段で除去される任意の保護基であってもよく、Ｒ2〜Ｒ6は、独立してＨ、アルキル、分岐状アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであり、Ｒ3とＲ4はスピロ縮環したシクロアルキル基として一体化されてもよい）
によって達成される。
【００２６】
上記のジオキセタン類は、縮環ベンゾチアゾールアルデヒドまたはトルエン誘導体より過マンガン酸酸化を用いてカルボン酸を得ることで合成することができる。この酸のエステルが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,７３１，４４５号明細書に記載された方法に従って、上記化合物のジオキセタン前駆体を製造するために用いられる。
【００２７】
詳細な説明
本発明の構造、合成、使用の好ましい態様について記述する。
【００２８】
構造
本発明は、下記一般式を有するジオキセタン類を使用する。
【００２９】
【化５】
【００３０】
（式中、Ｔは、
【００３１】
【化６】
であり、かつＲは独立してジオキセタンに安定性を付与する任意の分枝状のアルキルもしくはシクロアルキル基であっても、または両者のＲが一体となってジオキセタン環にスピロ結合したシクロアルキルもしくはポリシクロアルキル基を形成してもよく、各々のＲ基もしくはスピロ結合した環式基は非置換、あるいはハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性基で置換されてもよく、Ｒ1は、１以上のハロゲン原子で任意に置換されてもよい、アリール基または炭素数１〜２０のアルキル基であり、ＹはＨまたは電子供与性基もしくは電子吸引性基、または助蛍光団もしくは任意の生物学的基に結合していてもよい有機リンカー基であってもよく、Ｘは化学的にあるいは酵素的手段で除去される任意の保護基であってもよく、Ｒ2〜Ｒ6は各々、独立してＨ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールであり、Ｒ3とＲ4はスピロ縮環したシクロアルキル基として一体化されてもよい）
【００３２】
式Ｉおよび式IIの置換基の各々についての代表的なものは、本明細書中および参照により本明細書に組み込まれる先のトロピックス社の特許に新規な化学式が与えられており、当業者がよく知っているものである。また。Ｒの好ましいものとして、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルキル、とくに好ましくは分枝状のアルキル基が挙げられる。各々のアルキル基は、１以上の電子吸引性基もしくは電子供与性基で置換されていてもよく、および／または各々のアルキル基Ｒは、全体としてのジオキセタンの溶解度を高める、通常はかなり疎水性である、１以上の基で置換されていてもよい。好ましい可溶化基として、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。
【００３３】
好ましい態様において、両者のＲ基は、一緒になってスピロアダマンチル基を形成し、その基は非置換であっても、あるいは、いずれかの橋頭位もしくは両方の橋頭位が、炭素数１〜７のアルコキシ、ハロ、アルキル等のような電子活性（電子吸引性もしくは電子供与性）基で置換されていてもよい。アダマンチル基上の置換基の例は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５,１１２,９６０号明細書に記載されている。スピロアダマンチル基以外では、各々のＲ基として、時期尚早の分解を防止するために、ジオキセタンを立体的に安定化するように選択される。
【００３４】
Ｒ2〜Ｒ6は各々独立に、Ｒ3とＲ4が一緒になってスピロ縮環したシクロアルキル基を形成することを除いて、Ｒ基について上記したと同様に選択される。その他、Ｒ2〜Ｒ6は独立に、水素、非置換あるいは炭素数１〜６のトリフルオロアルキルのような１以上のハロゲン、とくにフッ素で置換されたアルキル、ヒドロキシ、フェニル、ナフチル等から選択される。Ｒ2〜Ｒ6の各々、および／またはすべてあるいはどのような組合せも、上記のように、ジオキセタンの水溶性を向上させるように計算された基でさらに置換されていてもよい。Ｒ2〜Ｒ6の各々の基は、１又は２の水溶性を向上させる基を有していてもよい。アルキルの代わりに、Ｒ2〜Ｒ6の各々、および／またはすべてがアリール、好ましくはフェニルであってもよい。
【００３５】
置換基Ｙは、１以上の機能を果たしてもよい。Ｙは水素であってもよく、あるいは、保護されていないジオキセタンの分解キネティックスをもたらすために（下記のＸについての項参照)、Ｙは電子吸引性基（例えば、任意のヘテロアリール基）であってもよい。Ｙは電子供与性基（例えば、任意のアルキル基）であってもよい。さらに、ジオキセタンのアリール基上に置換する置換基として、広汎な他の電子活性置換基が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,５３８,８４７号明細書に置換基「Ｚ」として記載されている。その中に記載されているように、メトキシ基のような電子供与性基は、アニオン分解プロセスを促進し、一方、塩素のような電子吸引性基はその分解反応を遅らせる。驚くべきことに、アリール環上の置換基の影響は、アダマンチルまたは他の立体的に安定化させる基上の置換基とは全く反対である。その他に、Ｙは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８００，９９９号明細書に記載されているように、本発明のジオキセタンと検討されるべき生物学的な基との間での共有結合をもたらす、炭素数１〜２０の有機リンカー基であってもよい。この態様において、ジオキセタンあるいはその前駆体は、間接的というよりはむしろ、直接的な標識の役目を果たし、酵素以外の、例えばｐＨ、熱等が有効な引き金となるようになる。これらの態様において、（下記の）Ｘとしては、酵素標識基以外のものである。
【００３６】
その他の変形例において、ＹはＯＸ′であってもよい。以下で記述するように、Ｘは引き金となる基、すなわち、その活性化または除去が環のＣ−Ｃ結合およびＯ−Ｏ結合の開裂を経てジオキセタンを分解に導く基である。ベンゾチアゾール基がジオキセタンに結合している部位に関してメタ位にあるＯＸ基は、第一の引き金として作用するものである。ＹをＯＸ′に設定することにより、引き金を追加したり、減少させたりすることができる。この選択がなされる場合には、Ｘ′は独立に、Ｘを特徴づけるかもしれない同一のセットの種々のものから選択される。
【００３７】
古典的な態様においては、Ｘは酵素不安定性基である。好ましい基としてホスフェート基やガラクトシド基が挙げられるが、本質的には、開裂によってオキシアニオンを生じさせる任意の酵素開裂性基が本発明で使用するのに適している。多くの種類の酵素開裂性基が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９５号明細書に明示されている。一般にリン酸エステルに加えて、基Ｘは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９５号明細書に基Ｚとして特定されているいかなる基であってもよく、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスフォリパーゼ、α−またはβ−キシロシダーゼ、フコシダーゼ、グルコシダーゼおよびチオグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、フルクトフラノシダーゼ、グルコシドウロナーゼ、トリプシン等に対する基質が挙げられる。さらに、ＯＸ基は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，５９１号明細書に記載されているように、タンパク質分解酵素により開裂され得る広汎なペプチドのいずれかによって置き換えることができる。
【００３８】
前述のように、酵素的な引き金に対して、非酵素的で化学的な引き金の方が好ましいと思われる状況が存在する。このような例において、Ｘは好ましくはＨ、トリアルキルシリル等である。種々の化学的な引き金およびＸの例が、例えば、これも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５,６５２,３４５号明細書に記載されている。
【００３９】
化学発光のモニターおよび測定（定量）において、広汎な装置が開発されている。最も高感度で、とくにスループットの高いスクリーニング用途等に適したものとして、ＣＣＤカメラがある。ジオキセタンからの典型的な化学発光は、可視スペクトルの青色波長において生じる。ＣＣＤカメラは青色発光を「見る」、すなわち自動計測することが困難である。典型的には、カメラは青色発色の長波長側の「端」のみを観測する。ジオキセタン上に縮環ベンゾチアゾール共鳴基を用いると、光は緑色側にシフト、つまり、発光が可視スペクトルの緑色端へシフトする。従来のジオキセタンは、通常、増強剤と共に用いられ、水の存在下で観察されうる化学発光の消光を避けるために、ジオキセタンを疎水性領域に隔離するように構成される。これらの増強分子は、好ましくは、例えばホスホニウム、スルホニウム、およびアンモニウムポリマーのような四級オニウムポリマーである。代表的なポリマーとそれらの効果は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３０，９００号明細書に記載されている。これらのポリマーは、単独で用いてもよく、また、さらに増強効果を向上させるために、参照により本明細書に同じく組み込まれる米国特許第５，５４７，８３６号明細書に記載されているように、界面活性剤添加物と共に用いてもよい。ジオキセタンの発光が緑色側にシフトし、また縮環ベンゾチアゾールの存在によりジオキセタンの疎水性が高くなっているため、より少量の増強剤と、要すれば、必要とされる添加剤が用いられる。前述のように、ジオキセタンのＹ基は、種々の機能に用いられうる。１つの機能は、結合手としての機能である。対象の生物学的基とのリンカーであることに加えて、Ｙは、分解におけるジオキセタンのエネルギー発生を吸収し、これに応答して蛍光を発する蛍光基である、エネルギー伝達型発蛍光基に結合する有機結合基（通常はアルキルまたはアルコキシ）であってもよい。エネルギー伝達型蛍光は、よく研究されており、図７および図８に示されている。
【００４０】
本出願の図面についてより詳細に言及すると、図１は本発明の好ましい態様の化学構造である、ベンゾチアゾールジオキセタンホスフェートを示している。この分子は、本明細書中で、ＢＺＰＤと称する。このジオキセタンの合成は、図３および図４に示されており、合成に必要な反応は以下に記されている。慣用の原料が本発明のジオキセタンの合成に使用され得るが、新規なイソチオシアネート類が本発明の１様相として記載されており、図５に示されている。
【００４１】
図９は、５５０nmより上のピーク波長を示しており、増強剤不存在下でのＢＺＰＤの発光波長の「グリーンシフト（緑色側へのシフト）」を示している。図１０に示すように、増強剤｛Sapphire-II（商標）｝の存在下で、長波長強度がさらに増大している。ＢＺＰＤの相対的な化学発光性能は、図１１〜１４において、他の商業的に成功を収めているジオキセタン類と比較されている。すなわち、ＣＳＰＤ（登録商標）（アダマンチル基上に塩素置換基を有するフェニルジオキセタン）およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（さらにフェニル基上に塩素を有するもの）と比較して、ＢＺＰＤの相対的に「迅速な」あるいは短いＴ1/2が図１１−Ａに示されている。本発明のジオキセタンは、図１１−Ｂに示されているように、優れたＳ／Ｎ性能をも有している。もしバックグランドのノイズがあまりにも高い（低いＳ／Ｎ）と、ピーク強度の発現がいかに迅速であろうと、アッセイは相対的に感度の低いものとなるので、Ｓ／Ｎ値は重要である。
【００４２】
図１２−Ａおよび図１２−Ｂは２４分後に同様の性能を示すものであり、ＢＺＰＤの継続的に高い感度と発光プロフィールを示している。
感度はジオキセタン検出剤に必須の特性である。図１３−Ａおよび図１４−Ａにおいて、アルカリホスファターゼの様々な濃度でのＢＺＰＤについての４分後および２４分後のそれぞれの感度を測定した。明らかに示されているように、ＢＺＰＤはきわめて低い酵素濃度（１０-17モル以下)においてさえ、優れた検出感度（より大きなシグナル）を与える。図１３−Ｂおよび図１４−Ｂに示されているように、ＢＺＰＤのＳ／Ｎ比は、これまでに開発されたジオキセタンに匹敵するものであるので、高められた感度はごく少量の物質を検出するのに用いることができる。
【００４３】
ＢＺＰＤの直接合成法を下記する。
上記のジオキセタン類は、縮環型ベンゾチアゾールアルデヒドまたはトルエン誘導体より過マンガン酸酸化を用いて合成しうる。参照により本明細書に同じく組み込まれる米国特許第５，７３１，４４５号明細書に記載の方法に従って上記化合物のジオキセタン前駆体を製造するために、この酸のエステルが用いられる。
【００４４】
ベンゾチアゾールジオキセタン基質の合成
以下の例は、ベンゾチアゾールジオキセタン基質およびそれらの前駆体の代表的な合成であり、特許請求の範囲を一切限定するものではない。４，6-ジブロモ−ｏ−アニシジンは次の文献に従って得られた：Fuchs, Monatshefte fur Chemie, 36, 130, 1915。
【００４５】
バリアンユニティー（Varian Unity）３００ＮＭＲスペクトロメーターを使用した。全てのＮＭＲデータは、プロトン（ 1 Ｈ）ＮＭＲである。
【００４６】
実施例１：２−ベンズアミド−３，５−ジブロモアニソール
４，５−ジブロモ−ｏ−アニシジン（１１．３ｇ；４０．２mmol）を、ジクロロメタン７５ml及びピリジン６．７mlに溶解した。混合物をアルゴン下に室温で撹拌した。塩化ベンゾイル（４．８ml；１．０３当量）をシリンジにより滴下して加えた。混合物を８時間撹拌して、橙−茶色の懸濁液を得た。次に反応混合物をロータリーエバポレーターで１/３の容量に濃縮した。濃厚のスラリーを Buchner 漏斗で濾過し、フラスコ及び固形物をジクロロメタン／ヘキサン５０：５０で洗浄した。次に得られた白色の固形物を水で十分に洗浄して、あらゆるピリジン塩酸塩を除去した。固形生成物を真空下に乾燥して、上記の標記生成物１３．５６ｇを得た。２相の濾液を漏斗中に水で洗浄し、有機層を分離し、次にロータリーエバポレーターに付して、紫茶色の固形物を得た。ジクロロメタン／ヘキサン５０：５０によりこね、酢酸エチルの最小量から再結晶して、第２の産物を１．４３ｇの重量で得た。
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.81 (s, 3H), 7.36 (1H), 7.44-7.71 (m, 4H), 7.88-8.11 (m, 2H), 9.88 (s, 1H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3420, 2980, 2940, 1691, 1585, 1487, 1400, 1041, 875, 837.
【００４７】
実施例２：Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）フェニルチオベンズアミド
前記実施例の生成物（１４．４ｇ；３７．４mmol）を、無水ピリジン３５mlに僅かに温めながら溶解した。五硫化リン（１１ｇ；４９．５mmol）をアルゴン下に一部づつ加えた。濃厚で薄黄色の錯体が発熱して形成した。この混合物を油浴に９０℃で２時間撹拌して、稀薄で暗黄色の懸濁液を得た。次に混合物を１５分間還流し、室温に冷却した。混合物を酢酸エチル１２５mlで処理して、ガムを沈殿させた。次に水１mlを渦巻きながら加え、ガムを凝集させ、その後上澄みをデカントした。次にガムを酢酸エチル２×２５mlでこねた。合わせた有機物をロータリーエバポレーターに付して、ピリジンを含有する橙色の油状物を得た。水中の水酸化ナトリウムの７％水溶液を、２０分間激しく撹拌しながら油状物に加えた。溶液を濾過して不溶物を除去し、水酸化物溶液の最小量ですすぎ洗いした。次に濾液を３M ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、フロック状で薄黄色の固形物を沈殿させ、ジクロロメタンの最小量に溶解した。有機層を分離し、ロータリーエバポレーターに付して、レモンイエロー色の固形物として上記の標記生成物１２．６ｇを得た。エタノールからの再結晶により分析試料を得て、ＴＬＣ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン；Ｒｆ＝０．５６）で１点材料を得た。
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.81 (s, 3H), 7.40-7.59 (m, 6H), 7.90-7.93 (m, 2H), 11.36 (s, 1H).
IR (CHCl3/cm-1): 3380, 2990, 1584, 1490, 1400, 1345, 1040, 878, 838, 695.
【００４８】
実施例３：２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
前記実施例のチオアミド１２．６ｇ（３１．４mmol）を、メタノール３０ml中で温めた。メタノール中の４．３M ナトリウムメトキシド７．３５ml（３１．６mmol）を加えながら、懸濁液を渦巻いた。添加の間に固形物は溶解し、黄色は薄琥珀色に退色した。溶媒をロータリーエバポレーターに付し、真空に排出して、ガラスを被覆する琥珀色でガラス状の固形物を得た。Ｎ−メチルピロリドン２０mlを加える間、このチオアミド塩をアルゴン下に保持した。フラスコを隔膜で蓋をし、泡立て器に接続して、１１０〜１２０℃の油浴に配置した。３０分間撹拌して固形物を発生させ、色が緑茶色になった。次にフラスコを室温に冷却し、その後水１００mlを加えて、オフホワイトの固形物を生成した。混合物を濾過し、固形物を水で十分に洗浄した。真空下に乾燥し、固形物を酢酸エチル：ヘキサン５０：５０から再結晶して、白色で毛髪様の針状物７．０５ｇを得た。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４７で青色螢光生成物の点を示し、微量のＵＶ吸収不純物が、より高いＲｆ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）において存在した。不純物をシリカゲルクロマトグラフィーにより除去して、分析試料を得た。ＮＭＲ及びＩＲデータは、上記の標記生成物の構造と一致していた。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 4.10 (s, 3H), 7.07 (d, 1H), 7.49-7.52 (m, 3H), 7.66 (d, 1H), 8.11-8.14 (m, 2H).
IR (CHCl3/cm-1): 3003, 2940, 1590, 1562, 1517, 1440, 1400, 1387, 1322, 1260, 1055, 978, 830, 690.
【００４９】
実施例４：２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
前記実施例のクロマトグラフィーに付した生成物３ｇ（９．３７mmol）を、無水ＴＨＦ ７０mlにアルゴン下で溶解した。別のフラスコで無水ＴＨＦ ６０mlを冷却し、アルゴン下に−７８℃で撹拌した。このフラスコに２．５M ｎ−ブチルリチウム５．６ml（１４．１mmol）をシリンジにより加えた。次にブロモベンゾチアゾール出発物質の溶液を、添加漏斗からアルゴン下に２５分かけて滴下して加えた。添加の終了時にＴＨＦ ７mlを使用して、漏斗をすすぎ洗いした。赤茶色の溶液を低温度で更に１０分間撹拌した。次に無水ＤＭＦ １．８mlをシリンジにより滴下して加えた。１０分後、溶液を１時間かけて徐々に室温に温めた。反応を１M塩化アンモニウム水溶液２０mlの急速な添加によりクエンチした。ＴＨＦを Rotovap により除去し、生成物を酢酸エチルと残留水に分配した。酢酸エチル層を水で４回洗浄して、あらゆるＤＭＦを除去した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を除去して、半固形ペーストを得た。これをヘキサン中の２０％ジクロロメタン２０mlでこね、その後デカントし、真空に排気して、無水固形物を得た。得られた桃色生成物は１．８１ｇの重量であった。ＴＬＣは、実質的にＲｆ値０．６２（Kieselgel ６０−１０％酢酸エチル／ヘキサン）での１点を示した。同様にして得られた生成物のスペクトルデータは同一であり、上記の標記化合物に予想されるものと一致していた。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 4.18 (s, 3H), 7.48-7.56 (m, 4H), 8.04 (d, 1H), 8.17-8.20 (m, 2H), 10.08 (s, 1H).
IR (CHCl3/cm-1): 3010, 2840, 2740, 1695, 1595, 1572, 1480, 1470, 1395, 1290, 1270, 1145, 1057, 983, 850, 690.
【００５０】
実施例５：２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
アルゴン下に前記の実施例のアルデヒド１．８ｇ（６．７mmol）を、ジクロロメタン１１ml、トリメチルオルトホルマート０．９ml及び無水メタノール０．７mlにより処理した。懸濁液を撹拌して、トルエンスルホン酸一水和物１０５mgを一度に加えた。フラスコをアルゴンでパージした後、隔膜で閉じた。固形物は速やかに溶解して、黄−橙色の溶液を得た。室温で一晩撹拌を続けた。反応混合物を、過剰トリエチルアミン（０．１５ml）によりシリンジを使用して中和した。混合物から全ての揮発物をストリッピングし、混合物をジクロロメタンの最小量に溶解して、アルミナの２cm×１．５インチカラムのプラグクロマトグラフィーに付した。溶離剤をロータリーエバポレーターに付し、油状物を排気して徐々に凝固した。試料を直ぐにＩＲ分析し、カルボニル吸収の不在を示した。これは、アセタール形成が完了したことを示し、粗生成物は直ぐに次の反応に使用した。IR (CH2Cl2/cm-1): 2940, 2840, 1602, 1580, 1468, 1410, 1355, 1198, 1155, 1060, 996, 837.
【００５１】
実施例６：ジエチル−１−メトキシ−１−（２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル）メタンホスホナート
前記工程で得られた粗生成物を、篩−乾燥ジクロロメタン１１ml及びトリエチルホスファイト１．５mlにアルゴン下で溶解した。フラスコを隔膜で密閉し、撹拌された溶液をドライアイス／アセトン浴で−７８℃に冷却した。アルゴン風船によりこの温度で圧力を平衡させた。次に懸濁液となった混合物を、三フッ化ホウ素エテラート１．０mlを滴下して処理した。内容物を徐々に約−２０℃に温めると、懸濁固形物は溶解した。溶液を冷蔵庫に１時間保存し、次に一晩撹拌しながら徐々に室温に温めた。翌朝、固形重炭酸ナトリウム０．７ｇ、続いて飽和重炭酸ナトリウム水溶液１５mlを加えた。２相を激しく撹拌して二酸化炭素を放出させた。必要に応じて水を３時間かけて加え、あらゆる無機物を溶解した。ジクロロメタン層を分離し、水性層を同じ溶媒１５mlで逆抽出した。合わせた有機物をＴＬＣ（Kieselgel ６０−酢酸エチル）に付して、ほぼＲｆ＝０．１５に単一のＵＶ／青色螢光の点を示し、原点にテーリングしている。溶液を蒸発させ、４０℃で真空に排気した。次に粘性で黄色の油状物を、ジクロロメタン／酢酸エチル５０/５０の最小量に溶解し、非常に短いプラグのシリカゲルに通した。溶離剤を、ジクロロメタン／ヘキサンの混合物により数回ストリッピング及びチェーシングをした。油状生成物は２．７ｇの重量であった。ＮＭＲ及びＩＲ分光分析法は、実質的に純粋な生成物を示したが、水分の存在が示された。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.21-1.36 (m, 6H), 3.46 (s, 3H), 3.93-4.21 (m, 7H), 4.59-4.64 (d, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.47-7.52 (m, 3H), 7.57 (s, 1H), 8.11-8.14 (m, 2H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3660 & 3460 (H2O), 2980, 2935, 2860, 1597, 1570, 1510, 1480, 1460, 1445, 1408, 1342, 1245-1285(br), 1100, 1040(br), 965(br), 865, 840, 610.
【００５２】
実施例７：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
前記工程の排気されたホスホナートエステル２．７ｇ（６．４mmol）を、無水ＴＨＦ ２５mlにアルゴン下で溶解した。溶液を、隔膜及びアルゴン風船を装備したフラスコで、撹拌しながら−７８℃に冷却した。溶液を、ヘキサン中の２．５M ｎ−ＢｕＬｉの十分量により滴下して処理して、ほぼパーマネントレッドパープル色を達成した。この方法で、水分及びプロトン性不純物の全てを滴定した。続いて、同じｎ−ＢｕＬｉ溶液２．７ml（６．７５mmol）を滴下して加えて、バーガンディ色の溶液を得た。低温で１０分間撹拌した後、２−アダマンタノン（０．９５ｇ、６．３３mmol）を、水分を除外するためにアルゴンの強流下で、固形物として加えた。固形物を１０分かけて溶解した。次に溶液を徐々に室温に温めた。アルゴン雰囲気を維持しながら、還流冷却器を装着した。混合物を１．５時間還流して、薄橙色の溶液を得た。次にＴＨＦを、注意深く発泡を避けながら、ロータリーエバポレーターでストリッピングした。生成物を、酢酸エチル２５mlと飽和重炭酸ナトリウム／水１：１ ５０mlに分配した。次に有機層を水２５mlで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ストリッピングして、薄黄色のガムを得た。ガムを、微量の極性汚染物を除去するためにクロロメタンにより溶離して、短いカラムのシリカゲルのプラグクロマトグラフィーに付した。適切な画分を排気して、ジクロロメタン−ヘキサンによりチェーシングした。排気された生成物は２．１４ｇの重量であり、冷凍庫で保管すると半固形物になった。ＩＲ分光分析法では、小さい２−アダマンタノンカルボニルバンドを表し、それは微量の汚染を示し、次の工程で除去された。
IR (CH2Cl2/cm-1): 2920, 2850, 1597, 1567, 1450, 1402, 1330, 1320, 1310, 1252, 1165, 1100, 1057, 978, 865, 640, 620. トレースＡＤ＝1720 及び 1710で０。
【００５３】
実施例８：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−ヒドロキシベンゾチアゾール
ＤＭＦ中のナトリウムエタンチオラートを６０％水素化ナトリウム及びエタンチオールから調製した（６０％水素化ナトリウム２４０mg（６mmol）を、アルゴン雰囲気下にヘキサンで３回洗浄して鉱油を除去した）。ＤＭＦ １１mlを加えた。エタンチオール（０．４５ml、６mmol）を滴下して加え、撹拌しながら、得られた懸濁液を０℃に冷却した。水素の発生が停止した後、溶液を室温に温め、別個のフラスコ中のメトキシ〔２−フェニル−４−メトキシ（ベンゾチアゾール−６−イル）メチリデンアダマンタン１．６４ｇ（３．９mmol）にアルゴン下でピペットにより加えた。得られた溶液を油浴中に１３０℃で撹拌した。１時間後、溶液は濃橙色になり、懸濁固形物を含有した。反応混合物を冷却し、１Ｍ塩化アンモニウム及び７５％酢酸エチル／ヘキサンの各５０mlに分配した。有機層を水２５mlで３回洗浄した。合わせた水性層を同じ溶媒混合物で逆抽出し、次に水で数回洗浄した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥した。ＴＬＣ（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）は、Ｒｆ＝０．２３で生成物を示したが、Ｒｆ＝０．３９で出発物質を示した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル：５０％ジクロロメタン−ヘキサン〜純粋ジクロロメタン）は、低Ｒｆ生成物の純粋な画分１個を単離した。混合画分を繰返しクロマトグラフィーに付して、更なる生成物を単離した。溶媒をストリッピングした後、上記の標記生成物の合計２４５mgを得た。
NMR (300 MHz/CD2Cl2): δ 1.74-2.07 (m, 14H), 2.71 (s, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.32 (s, 3H), 6.76 (s, 1H), 6.94 (d, 1H), 7.38 (d, 1H), 7.44-7.59 (m, 3H), 7.99-8.16 (m, 2H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3520, 2910, 2850, 1612, 1575, 1480, 1445, 1302, 1284, 1175, 1080, 980, 860.
【００５４】
実施例９：二ナトリウム６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスファート
分子篩乾燥ピリジン４．０mlをフラスコにアルゴン下で配置した。フラスコは、電磁撹拌棒を備え、氷浴に配置された。蒸留オキシ塩化リン０．１１２ml（１．２mmol）をシリンジにより滴下して加えた。他のフラスコで前記実施例のヒドロキシベンゾチアゾール誘導体２４５mgを、無水ＴＨＦ １５mlにアルゴン下で溶解した。次にＴＨＦ溶液を、リン酸化剤の撹拌した溶液に徐々に滴下して加えた。添加の間、沈殿物が発生した。添加の終了時に、フラスコ及びシリンジをＴＨＦ ２mlですすぎ洗いし、また、そのＴＨＦを反応フラスコに徐々に加えた。次に反応混合物を室温に温め、３時間撹拌した。先端に綿の付いたシリンジ２０mlを使用して上澄みを吸い取り、ピリジン塩酸塩を残した。この上澄みを、０．５M水酸化ナトリウム溶液１５mlに滴下して加え、氷浴温度で撹拌しながら、水で７５mlの容量に稀釈した。僅かに曇った溶液を室温に温めて透明にした。溶液を、注意深く排出してＴＨＦを除去し、容量を、アセトニトリル５．０ml及び水により１１０mlに調整した。この溶液を、Polymer Laboratories 社製２インチポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２分割して注入した。勾配５％〜１０％アセトニトリルを使用して、２７０nmにおいて最大ピーク吸収で分離させた。この勾配は、あらゆる特定の装置において最適化を必要とする。適切な画分を収集し、凍結乾燥して、薄黄色の固形物２９４mgを得た。分光データは上記の標記構造と一致した。同様の支持を有し、０．１％水性重炭酸ナトリウムに対するアセトニトリル勾配を使用した分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、１３．２分で溶離する単一生成物を示した（約５０％アセトニトリル）。
NMR (300 MHz/D2O): δ 1.38-2.02 (m, 14H), 2.51 (s, 1H), 3.00 (s, 3H), 7.26-7.53 (m, 5H), 7.75-8.04 (m, 2H).
【００５５】
実施例１０：二ナトリウム６−（メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．３．１．１3,7〕デカン〕−４−イル）２−フェニルベンゾチアゾリル−４−ホスファート
前工程のエノールエーテルホスファート２８５mgを管に配置した。固形物をメタノール１．０mlで湿潤し、次にジクロロメタン２５mlを加えて溶解した。次に溶液を５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＣＨＣｌ3中２mg/ml）の溶液０．５mlで処理した。溶液に酸素ガスを噴霧しながら管の内容物を０℃に冷却した。５分後、酸素が溶液から泡立ち続けている間、温度を５℃に維持しながら、冷却した４００ワットのナトリウムランプにより管を照射した。ランプと管の間に Kapton ポリイミドフィルムの５mm 厚切片を配置して、不要なＵＶ放射線を取り除いた。照射を１７分間続けた。分析ＨＰＬＣ〔０．１％ＮａＨＣＯ3（Ｈ2Ｏ）−アセトニトリル勾配〕は、出発物質（１３．２分で溶離）の１，２−ジオキセタン（１２．９４分で溶離）への変換が実質的に完了したことを示した。反応混合物から溶媒をストリッピングして、赤色のガムを得た。アセトニトリル５ml及び０．０５M水性水酸化ナトリウム２０mlを、渦巻き及び随時冷却しながら加えてガムを溶解した。次にＤＩ水を加えて総容量を７０mlにした。この溶液を高い保持力を有する紙フィルタを通して濾過し、少量づつ水で注意深く洗浄して、１１０mlの容量の濾液を得た。この溶液を、Polymer Laboratories 社製１インチポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２分割して注入した。勾配５％〜１００％アセトニトリル（水に対して）を使用して、２７０nmにおいて最大ピーク吸収で分離させた。この勾配は、あらゆる特定の装置において最適化を必要とする。同様の支持を有し、０．１％水性重炭酸ナトリウムに対するアセトニトリル勾配を使用した、合わせた生成物の分析ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、１２．９６分で溶離する単一生成物を示した（約５０％アセトニトリル）。適切な画分を収集し、凍結乾燥して、薄黄色の固形物２８７mgを得た。生成物１，２−ジオキセタンは、ｐＨ８．５で水性緩衝液中においてアルカリ性ホスファターゼによりトリガーされたとき、５５８nmで緑色光を発生した。UV: 213, 260.5 及び 50/50 CH3CN/H2Oにおける304 nm
【００５６】
実施例１１：２−メトキシ−４，６−ジブロモフェニルイソチオシアナート
４，６−ジブロモ−ｏ−アニシジン１９．７５ｇ（７０mmol）及び固形重炭酸塩２０ｇを、フラスコにアルゴン下で配置した。大型で強力な電磁撹拌棒を適用し、続いてアセトニトリル１２０ml及びジクロロメタン５０mlを加えた。チオホスゲン６．０mlをシリンジにより急速に加えながら、懸濁液を０℃で撹拌した。直後に濃厚な沈殿物が発生した。フラスコの内容物を徐々に室温に温めながら、激しく撹拌した。発生した二酸化炭素を、ニードルベントを有する泡立て器に導いた。混合物は温まると僅かに稀薄になり、より容易に撹拌された。激しい撹拌を２時間続けた。次に懸濁液を０℃に再冷却した。固形物を Buchner 漏斗で濾取し、フラスコをすすぎ洗いし、あらゆる残留固形物を冷却アセトニトリル３０mlによって移した。濾液をロータリーエバポレーターに付して、橙色の変色領域を含む固形物にした。この固形物をヘキサンでこね、排気乾燥し、白色の元のフィルターケークを含有する Buchner 漏斗に移した。この固形物を、存在する無機重炭酸塩（二酸化炭素は放出された）を中和するために、ＮａＨ2ＰＯ4の０．５M水溶液５×１００mlにより洗浄した。固形物をすすぎ洗いの度に砕いた。次に白色の生成物を水で十分に洗浄し、真空下に乾燥した。無水生成物は２１．８ｇの重量であった。同様の合成生成物から得られた分析データは、上記の標記構造と一致した。
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 3.92 (s, 3H), 6.98 (d, 1H), 7.31 (d, 1H).
IR (CH2Cl2/cm-1): 3020, 2970, 2940, 2030(br), 1575, 1555, 1470, 1400, 1040, 935, 870, 840.
【００５７】
実施例１２：２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール〔１ポット方法〕
前記実施例のイソチオシアナート１５．５ｇ（４８mmol）を、無水ＴＨＦ ５０mlにアルゴン下で溶解した。溶液を氷浴中で撹拌しながら０℃に冷却した。フェニルマグネシウムブロミド（Aldrich 社製、ＴＨＦ中１．０M）５０ml（５０mmol）を、シリンジにより稀薄流で加えた。冷却中に１０分間撹拌した後、溶液を徐々に室温に温めた。この時点で僅かに発熱しながら沈殿物が発生し始めた。薄橙−茶色の懸濁液は２時間で濃厚となった。溶媒を３０℃でロータリーエバポレーターにより除去して、ガラスを被覆する湿った桃色の固形物を得た。篩乾燥ＤＭＦ ５０mlを加えて、この材料を空気から保護した。固形物は僅かに発熱しながら溶解した。フラスコを１２５℃で油浴に配置した。４５分間で、あらゆる残留ＴＨＦを、短路蒸留ヘッドを使用してフラスコから留去した。混合物はこの間に暗色化し、懸濁固形物が発生した。室温に冷却すると、フラスコの内容物は固形化した。水性１M ＨＣｌ １００mlを加え、固形物を砕いた。続いて水１００mlを加えた。混合物を冷浸して、あらゆる対応するマグネシウムイオンを除去した。次に混合物を濾過し、水で十分に洗浄した。湿った固形物を温酢酸エチル２×２５０mlに取り、不溶フロックから上澄みを分離した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、ストリッピングして、薄茶色の固形物１３．２７ｇを得た。ＴＬＣは、Ｒｆ＝０．４７で主な青色螢光生成物の点を示し、微量のＵＶ吸収不純物が、より高いＲｆで存在した（Kieselgel ６０−ジクロロメタン）。少量の着色原点を、シリカゲルのプラグクロマトグラフィー（ジクロロメタン）により除去した。適切な画分を合わせて、生成物（実施例３と実質的に同一）１２．２９ｇを得たが、高いＲｆで微量の不純物をまだ含有した。本実施例の反応は、また、フェニルマグネシウムブロミドをイソチオチアナートと反応させて、実施例２のチオアミド生成物を得た後の、酸性化及び作用であり得る。
【００５８】
下記も上記の一般的な合成方法論に従って合成した。当業者は、必要に応じて些細な修正を容易に行うことができる。ベンゾチアゾール系へのあらゆる他の経路も同様に適用され得る。
【００５９】
実施例１３：２−（ｐ−ベンジルオキシベンズアミド）−３，５−ジブロモアニソール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.79 (s, 3H), 5.21 (2H), 7.11-7.14 (d, 2H), 7.34-7.52 (m, 7H), 7.93-7.96 (d, 2H), 9.70 (s, 1H).
【００６０】
実施例１４：Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）−ｐ−ベンジルオキシフェニルチオベンズアミド
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 3.80 (s, 3H), 5.22 (2H), 7.08-7.11 (d, 2H), 7.32-7.55 (m, 7H), 7.95-7.98 (d, 2H), 11.12 (s, 1H).
【００６１】
実施例１５：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 4.00 (s, 3H), 5.21 (2H), 7.17-7.22 (m, 3H), 7.34-7.50 (m, 5H), 7.98-8.01 (m, 3H).
【００６２】
実施例１６：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/DMSO-d6): δ 4.05 (s, 3H), 5.23 (2H), 7.20-7.23 (d, 2H), 7.33-7.50 (m, 6H), 8.05-8.08 (d, 2H), 8.31-8.32 (d, 1H), 10.04 (s, 1H).
【００６３】
実施例１７：２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
IR (CHCl3/cm-1): 3000, 2940, 2840, 1611, 1580, 1530, 1490, 1470, 1355, 1180, 1155, 1060, 1020, 980, 838, 700.
【００６４】
実施例１８：ジエチル−１−メトキシ−１−〔２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル〕メタンホスホナート
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.19-1.37 (m, 6H), 3.43 (s, 3H), 3.86-4.18 (m, 7H), 4.51-4.75 (m, 1H), 5.12 (s, 2H), 7.02-7.03 (m, 2H), 7.30-7.52 (m, 7H), 8.02-8.06 (m, 2H).
【００６５】
実施例１９：６−（メトキシトリシクロ〔３．３．１．１3.7〕デシ−２−イリデンメチル）−２−（ｐ−ベンジルオキシ)フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
NMR (300 MHz/CDCl3): δ 1.78-2.1 (m, 14H), 2.74 (s, 1H), 3.30 (s, 1H), 3.35 (s, 3H), 4.06 (s, 3H), 5.12 (s, 2H), 6.85-6.96 (m, 1H), 6.99-7.12 (m, 2H), 7.29-7.50 (m, 6H), 7.99-8.14 (m, 2H).
【００６６】
【表１】
【００６７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 縮環（ヘテロアリール）ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェートを示す。
【図２】 （省略）
【図３】 本発明の式Ｉのジオキセタンの合成を示す。
【図４】 本発明の式Ｉのジオキセタンの合成を示す。
【図５】 本発明の式Ｉのジオキセタンの中間体の合成を示す。
【図６】 （省略）
【図７】 エネルギー移動を用いた赤色発光ジオキセタン系の合成および構造を示す。
【図８】 エネルギー移動を用いた赤色発光ジオキセタン系の合成および構造を示す。
【図９】 本発明のジオキセタンの発光スペクトルを示す。
【図１０】 本発明のジオキセタンの発光スペクトルを示す。
【図１１Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１１Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１２Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１２Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１３Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１３Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１４Ａ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
【図１４Ｂ】 市販の従来技術のジオキセタンと比較した、本発明のジオキセタンの、化学発光キネティックスの速度、および感度を示す。
Claims (11)
- 式
両者のＲは一体となってジオキセタン環にスピロ結合したスピロアダマンチル基を形成し、
Ｒ1は、メチル基であり、
ＹはＨであり、
Ｘはホスフェートである）で表される、１，２−ジオキセタン化合物。 - 請求項１記載の化合物を含有する、試料中の第一物質の検出用キット。
- 上記ジオキセタンの存在下、上記ジオキセタンを分解させる酵素をさらに含有する、請求項２記載のキット。
- 四級オニウムポリマーである水溶性増強物質をさらに含有する、請求項２又は３記載のキット。
- 上記キットが、界面活性剤である増強添加剤をさらに含有する、請求項２〜４のいずれか１項記載のキット。
- 試料に請求項１記載の化合物（ただし、ホスフェートは第一物質によって除去されるものである）を添加する工程、上記試料をインキュベートする工程及び光の発生について上記試料を調べる工程を含み、そのように発生する光が上記第一物質の存在を示し、検出される光の量がその量を示すものである、上記試料中の第一物質を検出する方法。
- 上記方法が、検出される光の量を増強させるために、上記試料に四級オニウムポリマーである増強剤を添加する工程をさらに含むものである、請求項６記載の方法。
- その光がＣＣＤカメラによって検出される、請求項６又は７記載の方法。
- 上記四級オニウムポリマーがホスホニウム、スルホニウムおよびアンモニウム四級オニウムポリマーからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
- 上記方法が、界面活性剤である増強添加剤を添加する工程をさらに含むものである、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
- 上記物質が酵素である、請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9433698P | 1998-07-28 | 1998-07-28 | |
| US60/094,336 | 1998-07-28 | ||
| PCT/US1999/017094 WO2000006164A1 (en) | 1998-07-28 | 1999-07-28 | Benzothiazole dioxetanes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002521447A JP2002521447A (ja) | 2002-07-16 |
| JP2002521447A5 JP2002521447A5 (ja) | 2006-08-24 |
| JP4519320B2 true JP4519320B2 (ja) | 2010-08-04 |
Family
ID=22244574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000562018A Expired - Fee Related JP4519320B2 (ja) | 1998-07-28 | 1999-07-28 | ベンゾチアゾールジオキセタン類 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6355441B1 (ja) |
| EP (1) | EP1115400A4 (ja) |
| JP (1) | JP4519320B2 (ja) |
| AU (1) | AU5237699A (ja) |
| CA (1) | CA2338883A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000006164A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6660529B2 (en) * | 1998-07-28 | 2003-12-09 | Pe Corporation | Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes |
| US20060024762A1 (en) * | 1998-07-28 | 2006-02-02 | Brooks Edwards | Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes |
| US6783948B1 (en) | 1999-07-30 | 2004-08-31 | Bayer Corporation | Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes |
| US7166478B2 (en) * | 2002-03-12 | 2007-01-23 | Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. | Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses |
| US7390670B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-06-24 | Lumigen, Inc. | Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide |
| US20050106577A1 (en) * | 2003-11-17 | 2005-05-19 | Hashem Akhavan-Tafti | Cleavable solid phases for isolating nucleic acids |
| US20050106576A1 (en) * | 2003-11-17 | 2005-05-19 | Hashem Akhavan-Tafti | Methods of using cleavable solid phases for isolating nucleic acids |
| WO2006029302A2 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Applera Corporation | Dioxetane-nanoparticle assemblies for energy transfer detection systems, methods of making the assemblies, and methods of using the assemblies in bioassays |
| CA2689525A1 (en) * | 2007-06-20 | 2008-12-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cetp inhibitors derived from benzoxazole arylamides |
| CN101462316A (zh) * | 2007-12-19 | 2009-06-24 | 维斯塔斯风力系统有限公司 | 预成型件的制备方法 |
| EP2403843B1 (en) | 2009-03-02 | 2018-11-07 | Life Technologies Corporation | Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes |
| US10031142B2 (en) | 2010-07-08 | 2018-07-24 | Life Technologies Corporation | In situ chemiluminescent substrates and assays |
| US20140154675A1 (en) * | 2011-05-03 | 2014-06-05 | Life Technologies Corporation | Flash and Glow 1,2-Dioxetanes |
| CN107174883A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-09-19 | 苏州宏久航空防热材料科技有限公司 | 一种具有表层网状分布碳化硅纳米线过滤结构 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5616729A (en) * | 1986-07-17 | 1997-04-01 | Board Of Governors Of Wayne State University | Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers |
| US4931223A (en) * | 1986-07-24 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| CA1340590C (en) | 1986-07-24 | 1999-06-08 | John C. Voyta | Chemiluminescence enhancement |
| US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
| US5605795A (en) * | 1986-07-24 | 1997-02-25 | Tropix, Inc. | Assays using chemiluminescent, enzymatically cleavable substituted 1,2-dioxetanes and kits therefor |
| US5112960A (en) * | 1989-07-17 | 1992-05-12 | Bronstein Irena Y | Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes |
| US4956477A (en) | 1987-12-31 | 1990-09-11 | Tropix, Inc. | Synthesis of 1,2-dioxetanes |
| US5220005A (en) | 1986-07-24 | 1993-06-15 | Tropix, Inc. | Substituted adamantyl dioxetanes |
| US5582980A (en) * | 1989-07-17 | 1996-12-10 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| US5330900A (en) * | 1987-12-31 | 1994-07-19 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes |
| US5538847A (en) * | 1989-07-17 | 1996-07-23 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| US5679802A (en) * | 1989-07-17 | 1997-10-21 | Tropix, Inc. | 1,2-dioxetanes useful in chemiluminescent immunoassays |
| JPH0731201B2 (ja) * | 1987-12-31 | 1995-04-10 | トロピックス・インコーポレーテッド | 化学発光による測定法 |
| US4868267A (en) * | 1988-01-11 | 1989-09-19 | Owens-Corning Fiberglas Corporation | Aminated hydroxylated polyester polyol resin and molding compositions comprised thereof |
| US4952707A (en) * | 1988-06-30 | 1990-08-28 | Tropix, Inc. | Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes |
| US4931569A (en) * | 1988-09-14 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Purification of stable water-soluble dioxetanes |
| US5326882A (en) * | 1989-07-17 | 1994-07-05 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes |
| US5225584A (en) | 1989-09-06 | 1993-07-06 | Tropix, Inc. | Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor |
| US5547836A (en) * | 1990-08-30 | 1996-08-20 | Tropix, Inc. | Enhancement of chemiluminescent assays |
| US5336596A (en) | 1991-12-23 | 1994-08-09 | Tropix, Inc. | Membrane for chemiluminescent blotting applications |
| DK0629195T3 (da) * | 1992-03-05 | 1999-11-08 | Tropix Inc | Syntese af stabile, vandopløselige kemolumininescerende 1,2-dioxetaner og mellemprodukter dertil |
| US5320882A (en) | 1992-04-22 | 1994-06-14 | General Electric Company | Laser ablative particulate composite |
| CA2179726A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | Brooks Edwards | Chemiluminescent energy transfer assays |
| US5591591A (en) * | 1995-02-09 | 1997-01-07 | Tropix, Inc. | Dioxetane compounds for the chemiluminescent detection of proteases, methods of use and kits therefore |
| AU704940B2 (en) * | 1995-02-13 | 1999-05-06 | Applied Biosystems, Llc | Chemiluminescent energy transfer assays |
| US5679803A (en) * | 1995-10-25 | 1997-10-21 | Tropix, Inc. | 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance |
| US5731445A (en) * | 1995-12-04 | 1998-03-24 | Fujirebio Inc. | 1,2- Dioxetane derivatives |
| US6602657B1 (en) * | 1995-12-28 | 2003-08-05 | Tropix, Inc. | Multiple reporter gene assay |
| US5800999A (en) | 1996-12-16 | 1998-09-01 | Tropix, Inc. | Dioxetane-precursor-labeled probes and detection assays employing the same |
| EP0943618B1 (en) | 1998-03-13 | 2003-08-27 | Masakatsu Matsumoto | 1,2-dioxetane derivative |
-
1999
- 1999-07-28 WO PCT/US1999/017094 patent/WO2000006164A1/en active Application Filing
- 1999-07-28 CA CA002338883A patent/CA2338883A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-28 AU AU52376/99A patent/AU5237699A/en not_active Abandoned
- 1999-07-28 US US09/362,047 patent/US6355441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-28 EP EP99937571A patent/EP1115400A4/en not_active Withdrawn
- 1999-07-28 JP JP2000562018A patent/JP4519320B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-05 US US09/945,661 patent/US6852548B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1115400A4 (en) | 2003-02-12 |
| WO2000006164A1 (en) | 2000-02-10 |
| JP2002521447A (ja) | 2002-07-16 |
| AU5237699A (en) | 2000-02-21 |
| US20020042085A1 (en) | 2002-04-11 |
| CA2338883A1 (en) | 2000-02-10 |
| US6355441B1 (en) | 2002-03-12 |
| EP1115400A1 (en) | 2001-07-18 |
| US6852548B2 (en) | 2005-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4519320B2 (ja) | ベンゾチアゾールジオキセタン類 | |
| JP2837276B2 (ja) | 改良された化学発光性１，２−ジオキセタン類 | |
| JP6351511B2 (ja) | 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成 | |
| JP4727569B2 (ja) | 過酸化水素検出方法に用いるシグナリング化合物 | |
| US6124478A (en) | Methods of using 1,2-dioxetanes and kits therefore | |
| JP3280342B2 (ja) | １，２−ジオキセタン類の中間体の合成 | |
| AU767757B2 (en) | Compositions and methods for generating red chemiluminescence | |
| US7459284B2 (en) | Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes | |
| US5177241A (en) | Synthesis of 1,2-dioxetanes and intermediates therefor | |
| EP1203091B1 (en) | Chemiluminescent substrates of hydrolytic enzymes such as phosphatases | |
| JP4520740B2 (ja) | ヘテロアリール置換ベンゾチアゾールジオキセタン | |
| EP0348494B1 (en) | Dioxetanes for use in assays | |
| JPH06102669B2 (ja) | 置換チアゾリン−ジオキセタン基質、その製造方法およびその使用 | |
| US5679802A (en) | 1,2-dioxetanes useful in chemiluminescent immunoassays | |
| US5639907A (en) | Synthesis of 1,2-dioxetanes and intermediates therefor | |
| US20060024762A1 (en) | Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes | |
| US6228653B1 (en) | 1,2-dioxetane derivative fused to pyran ring and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20040525 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040531 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060704 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060704 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090317 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090608 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090615 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20090618 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090708 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090715 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090806 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090813 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090917 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20091019 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20091106 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100319 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100412 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100427 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100519 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |