JPH06102669B2 - 置換チアゾリン−ジオキセタン基質、その製造方法およびその使用 - Google Patents

置換チアゾリン−ジオキセタン基質、その製造方法およびその使用

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JPH06102669B2
JPH06102669B2 JP5517071A JP51707193A JPH06102669B2 JP H06102669 B2 JPH06102669 B2 JP H06102669B2 JP 5517071 A JP5517071 A JP 5517071A JP 51707193 A JP51707193 A JP 51707193A JP H06102669 B2 JPH06102669 B2 JP H06102669B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、チアゾリン−ジオキセタン基質、その製造方
法、および酵素分析法におけるその使用に関する。
ルシフェリン（式Ｉ）のルシフェラーゼ、酸素およびAT
Pとの反応によって、オキシルフェリンが形成される。
この反応では、ケミルミネッセンスとして光（最大波長
562nm）が発光する。この方法では、おそらく、式IIで
示されるジオキセタンが高エネルギー中間体として形成
される［エフ・マクカプラ（F.McCapra）,Chem.Commun.
155（1968）］。多くの化学発光性1,2−ジオキセタン化
合物が、この前提に基づいて開発された。アダマンチル
残基が、不安定な1,2−ジオキセタンの安定化のために
記載されている［EP−A 0254051、EP−A 0352713、WO 9
1/03479、WO 90/07511、およびそれらに挙げられている
文献］。しかしながら、親物質として式IIで示されるル
シフェリンの活性中間体段階、すなわち、チアゾリン誘
導体に基づいている公知化合物は全くない。
本発明の目的は、安定であり、かつ、活性化剤と反応さ
せた場合にだけケミルミネッセンスの形成ととも分解す
る、チアゾリンの、好ましくはルシフェリンの、活性中
間体段階に基づく1,2−ジオキセタンを提供することで
ある。この目的は、一般式III: ［式中、Ｒは または のいずれかであり、R1およびR2は、同一であっても異な
っていてもよく、水素または直鎖状もしくは分枝鎖状の
低級（C1〜C6）アルキルを表し、Ｘは、活性化剤によっ
て脱離することができる脱離しうる基であり、基R4また
はR5のうち少なくとも１個は、ジオキセタン構造を安定
化する基を表し、基R4またはR5のうちの多くとも１個
は、水素を表す］ で示される化合物によって達成される。
活性化剤として、酸、塩基、塩、酵素、無機もしくは有
機触媒、および電子供与体を使用するのが好ましい。
基−Ｏ−Ｘは、フェニル環上のいずれの位置にあっても
よい。しかしながら、Ｒがベンゾチアゾール基である場
合、基−Ｏ−Ｘは、５位にあるのが好ましい。Ｒがフェ
ニル基である場合、基−Ｏ−Ｘは、３位にあるのが好ま
しい。これは、−Ｏ−Ｘ基を形成する−OR3基について
も同様である。
−Ｏ−Ｘは、オキシ酸のヒドロキシ塩、ホスフェート、
アリール−もしくはアルキルカルボキシエステル、アル
キルオキシまたはアリールシリルオキシ、スルフェ−
ト、オキシピラノシドであるが好ましい。
アリールおよびアルキル残基の組成は決定的ではない。
当業者は、難無くＸについて好適な残基を選択すること
ができる。それは、単に可溶性でなければならないだけ
であり、活性化剤によってＸを脱離させることが可能で
なければならない。
R1およびR2は、水素、メチル基またはエチル基であるの
が好ましい。例えば、−Ｏ−Ｘとしてホスフェートを使
用する場合は、アルカリホスファターゼの添加によって
ケミルミネッセンス反応を生起させることができる。ガ
ラクトシドを使用する場合は、β−ガラクトシダーゼに
よってケミルミネッセンスを生起させることができる。
−Ｏ−Ｘとしてシリルオキシ残基を使用する場合は、フ
ッ化物の添加によってケミルミネッセンスを生起させる
ことができる。
基R4および／またはR5は、ジオキセタン構造を安定化す
るのに好適であり、ジオキセタン基を反応から保護する
ものである。この安定化は、この基の立体スクリーニン
グによって行うのが好ましい。例えば、置換および非置
換形態のアダマンタニル、フェニル、シクロヘキシル、
第二および第三脂肪族アルキル基（例えば、ｔ−ブチル
基など）が好適である。これに関して、R4およびR5は、
同一であっても異なっていてもよい。アダマンチル残基
の場合、これは、R4およびR5が環構造の部分を示し、し
たがって、架橋されるような方法で結合されるのが好ま
しい（式IIIa）： 一般式IIIで示される化合物は、新規である。これらの
化合物の合成方法は、従前に知られていなかった。
したがって、本発明は、式IVまたはIVa: ［式中、R3は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状また
は分枝鎖状のアルキル基を表し、好ましくは、メチルま
たはエチルである］ で示される化合物を、式V: ［式中、R1およびR2は、前記定義と同じである］ で示される化合物と反応させ、それを、水および空気を
排除しつつ、アルキルリチウム化合物の存在下でアルデ
ヒドまたはケトンと反応させ、該反応生成物を脱カルボ
キシルし、アルコキシ基を脱アルキルし、当業者に周知
の方法に従って、化学的に不安定な−Ｏ−Ｘ基をこの位
置に導入し、それをジオキセタンに光酸化することを特
徴とする、式IIIで示される化合物の製造方法にも関す
る。
式IVで示される化合物（アルコキシベンゾチアゾール−
２−カルボン酸ニトリル）またはVIaで示される化合物
の、式Ｖで示される化合物（好ましくは、ペニシラミン
またはシステイン）との反応は、光の不在下、室温で、
水または水−アルコール混合物などの極性溶媒中で行う
のが好ましい。
アルデヒドおよびケトンとして好適な化合物は、残基R4
および／またはR5として、式IIIで示される化合物のジ
オキセタン構造を安定するものである。かかる安定化
は、ジオキセタン構造の立体スクリーニングによって行
うことができる。好適なケトンおよびアルデヒドは、例
えば、アダマンタノン、ベンズアルデヒド、シクロヘキ
サン、第二および第三脂肪族アデヒドおよびケトン、例
えば、ジ−ｔ−ブチルケトンである。
R3の導入は、空気を排除し、かつ、冷却しつつ、このよ
うにして得たチアゾリン−カルボン酸のアルデヒドまた
はケトンとの反応によって、THFなどの非プロトン性有
機溶媒中で水を排除して行うのが好ましい。これは、−
50〜−100℃の温度で行うのが特に好ましい。アルキル
リチウム化合物は、炭化水素（ペンタン、ヘキサン）中
溶液として添加するのが好ましい。ブチルリチウムを使
用するのが特に好ましい。反応が終了した後、好ましく
は、室温で塩水溶液の添加によって、得られた化合物を
反応混合物から沈殿させる。
このようにして形成したβ−ヒドロキシカルボン酸の脱
カルボキシルは、二重結合を導入するために、脱水条件
で、例えば、アゾジカルボン酸エチルエステルおよびト
リフェニルホスフィンを用いて行うのが好ましい。
例えば、トリメチルヨードシランなどの脱アルキル化剤
の添加によって、６′位で脱アルキルを行うのが好都合
である。当該方法は、水を排除して行うのが好ましい。
チアゾリン−カルボン酸は、好ましくは、同様に、中間
体アミンおよびアルコール段階を経て、チアゾリン−４
−オンに変換し、次いで、スルフィドとの反応によって
チアゾリン−４−チオンに変換することができる。この
チアゾリン−４−チオンを、アルデヒドまたはケトンの
ヒドラゾンと、好ましくは、脱離しうる基を含有するこ
とができるアダマンタノン−２−ヒドラゾンまたはベン
ズアルデヒドラゾン（アダマンタノントシルヒドラゾン
またはベンズアルデヒドトシルヒドラゾン）と反応させ
て、式IIIで示される本発明の化合物を形成する。
R4および／またはR5がフェニル残基、脂肪族残基または
シクロアルキル残基である式IIIで示される化合物を製
造するために、置換２−フェニル−5,5−ジアルキル−
チアゾリン−４−オンは、グリニヤル反応でチアゾリン
の４位の二重結合の次なる導入によって４−置換誘導体
に変換することもできる。次いで、以下に記載のとお
り、ジオキセタン基を導入する。
化学的に不安定な基Ｘの導入は、当業者に周知の方法に
従って行われる。かかる方法は、例えば、ヒューベン−
ウェイル（Houben-Weyl）XII/2に開示されている。
−100〜50℃の温度で、塩化メチレンまたはクロロホル
ムなどの極性有機溶媒に溶解するのが好ましいアルケン
誘導体を反応させ（チアゾリンの２位の二重結合）、感
光剤を使用して可視光を照射することによってジオキセ
タン基を導入することが好都合である［例えば、ローズ
・ベンガル（Rose Bengal）、メチレンブルー、テトラ
ヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）（1988）3
137-3140を参照］。
精製のために、例えば、濾過する。上清は、式IIIで示
される所望の化合物を含有する。
本発明は、さらに、酸、塩基、塩、酵素、無機または有
機触媒および電子供与体を一般式IIIで示される化合物
と反応させ、測定すべき化合物の量の尺度として発光を
測定することによる、酸、塩基、塩、酵素、無機または
有機触媒および電子供与体の測定方法に関する。
この方法は、酵素、特に免疫系中のマーカー酵素測定の
ために、または、標識DNAブローブによるDNA診断のため
に使用されるのが好ましい。化学的に不安定な基Ｘがホ
スフェートである場合にアルカリホフファターゼを測定
するのが好ましく、Ｘがガラクトシドである場合にβ−
ガラクトシダーゼを測定するのが好ましい。
本発明を、以下の実施例によって説明する。
実施例１ ２−（６′−メトキシ−２′−ベンゾトリアゾリル）−
5,5−ジメチル−Δ２チアゾリン−４−カルボン酸
（１）の合成： メタノール約100mlに６−メトキシベンゾチアゾール−
２−カルボン酸ニトリル2gを溶解し、ペニシラミン1.62
gのH2O 50ml中溶液を添加する。光の不在下、室温で３
時間攪拌し、次いで、該溶液を酸性化し、濾過する。
収量:1.3g TLC:Rf（クロロホルム：メタノール：酢酸9:1:0.1）0.7
4。
実施例２ ２−（６′−メトキシ−２′−ベンゾトリアゾリル）−
5,5−ジメチル−４−（２′−ヒドロキシ−２′−アダ
マンチルΔ２チアゾリン−４−カルボン酸（２）の合
成： −78℃で、窒素下、乾燥THF約100mlに溶解した化合物
（１）1gに、２倍モル過剰のブチルリチウム−ヘキサン
溶液を滴下し、次いで、１時間攪拌する。次いで、−78
℃で、これに、THFに溶解した対応する量の２−アダマ
ンタノンを添加し、−78℃で３時間攪拌し、次いで、該
反応混合物を、HCl20mmolを含有する塩化ナトリウム飽
和水溶液100mlに添加する。
残留物をクロロホルム／エーテルから再結晶する。
収量:0.5g。
実施例３ ２−（６′−メトキシ−２′−ベンゾトリアゾリル）−
5,5−ジメチル−４−（２′−アダマンタニリデン）Δ
２チアゾリン（３）の合成： 室温で、THF中、等モル量のP(CC6H5)3およびアゾジカル
ボン酸−ジエチルエステルとの反応によって、ベータ−
ヒドロキシカルボン酸の脱カルボキシルおよび二重結合
の導入を行う［例えば、ムルザー（Mulzer）、アンゲヴ
ァンテ・ヘミー（Angew.Chemie）1977を参照］。
２−（６′−ヒドロキシ−２−ベンチアゾリル）−5,5
−ジメチル−４−（２′−アダマンタニリデン）Δ２チ
アゾリン（４）の合成： 乾燥CHCl3 10mlに化合物（３）1gを溶解し、50％過剰量
のトリメチルヨードシランを添加する。約70℃に48時間
加熱し、該反応混合物にメタノールを添加し、該溶液を
回転蒸発する。
残留物を酢酸エチル中に取り、５％NaHCO3溶液と一緒に
振盪し、乾燥し、真空濃縮する。
収量:0.25g。
実施例４ ２−（６′−ホスホリル−２′−ベンゾチアゾリル）−
5,5−ジメチル−４−（２′−アダマンタニリデン）Δ
２−チアゾリン（５）の合成： 通常の文献方法を使用して、（４）のホスホリル化を行
う。例えば、ヒューベン−ウェイル（Houben−Weyl）XI
I/2を参照。
実施例５ １−［２′−（６″−ホスホリル−２″−ベンゾチアゾ
リル）−５′,5′−ジメチル−Δ２チアゾリニル−］−
２−（２″−スピロアダマンチル）−ジオキセタン
（６）の合成： （５）を光酸化するため、塩化メチレン10mlに溶解した
アルケン10mgに固定したローズ・ベンガル（ポリサイエ
ンス（Polyscience）を添加し、これに−78℃で１時
間、1000ワットのランプで照射する。反応は、定量的に
進行する。ローズ・ベンガル感光剤は、濾過によって容
易に除去できる。
実施例６ ２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン
−４−カルボン酸それは、Chem,Ztg.1987、111、357と
同様に製造する。
ペニシラミン33.5mmol、アルコキシニトリル33.5mmolお
よび炭酸カリウム16.7mmolを、還流滋賀で12時間、水25
mlを含有するメタノール50mlの混合物中、加熱して沸騰
させた。冷却後、半分に真空蒸発する。該混合物をエー
テル50mlで１回洗浄した。分離した水性相を、濃塩酸で
pH4に調節した。この工程で、薄黄色の沈殿物が形成さ
れ、これを吸引し、少量の水で１回洗浄し、60℃で真空
乾燥した。
収量:50〜60％。
実施例７ ２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン
−４−カルボン酸アミド ０℃で、アルコキシフェニル−チアゾリンカルボン酸4m
molの塩化メチレン10ml中懸濁液に塩化オキサリル4mmol
を添加した。この温度で30分間攪拌した後、−20℃で５
分間、アンモニアの緩流を通した。室温に加熱した後、
該懸濁液を塩化メチレン20mlで稀釈した。該混合物を1N
水酸化ナトリウム溶液10mlで１回洗浄し、次いで、水20
mlで２回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を蒸留によって除去した後、油状物が残存し、
これを、少量の酢酸エチルから再結晶した（収量:60〜8
0％） 実施例８ ４−アミノ−２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル
−チアゾリン ０℃で、3N水酸化ナトリウム8mlに臭素4,8mmolを溶解し
た。０℃で、この混合物に２−アルコキシフェニル−5,
5−ジメチル−チアゾリンカルボン酸アミド4.4mmolを添
加し、この温度で30分間、次いで、70℃で20分間攪拌し
た。水20mlで稀釈した後、酢酸エチル40mlと一緒に振盪
して抽出する。有機相を毎回水15mlで２回洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸留によって除去した
後、油状物が残存し、これをエタノール／水（1:1）か
ら再結晶した（収量:70〜85％）。
実施例９ ４−ヒドロキシ−２−アルコキシフェニル−5,5−ジメ
チル−チアゾリン ０℃で、アミノ−２−アルコキシフェニル−5,5−ジメ
チル−チアゾリン14.5mmolの中濃（half-concentreate
d）塩酸32ml中溶液に亜硫酸ナトリウム15mmolを添加
し、この温度で20分間撹拌した。3N水酸化ナトリウム溶
液で中和した後、毎回酢酸30mlと一緒に２回振盪した。
有機相を水20mlで１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を蒸留によって除去した後、油状物が残存し、
これをカラムクロマトグラフィーによって分離した（シ
リカゲル、酢酸エチル／石油エーテル（1:1）（収量75
〜80％）。
実施例10 ２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリル
−４−オン トルエン160mlに４−ヒドロキシ−２−アルコキシフェ
ニル−5,5−ジメチル−チゾリン11mmolおよびシクロヘ
プタノン34mmolを溶解した。トルエン40mlを蒸留によっ
て除去した後、アルミニウムトリイソプロピラート9mmo
lを添加し、混合物を、還流下で３時間加熱して沸騰さ
せた。室温に冷却した後、酢酸エチル100mlを添加し、
混合物を毎回水50mlで２回洗浄した。合わせた水性相を
酢酸エチル50mlで１回抽出した。合わせた有機相を硫酸
ナトリウムで乾燥した後、溶媒を蒸留によって除去し
た。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチ
ル／石油エーテル（1:4））によって、残存する油状物
からチアゾリノンを分解した。
実施例11 ２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン
−４−チオン ２−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン
−４−オン5mmolおよび2,4−（４−ビス−メトキシフェ
ニル）−1,3−ジチア−2,4−ジホスフェタン−2,4−ジ
スルフィド11mmolを、還流下で８時間、トルエン10ml中
で加熱して沸騰させた、冷却後、該反応混合物をカラム
クロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／石油エ
ーテル（1:6））によって分離した（収量:30〜40％）。
実施例12 アダマンタン−２−トシルヒドラゾン トシルヒドラジド3.4mmolおよびアダマンタノン3.3mmol
および濃硫酸１滴を、還流下で４時間、エタノール10ml
中で加熱して沸騰させた。室温に冷却した後、体積1ml
に真空蒸発した。水20mlで希釈し、2N水酸化ナトリウム
溶液で中和した。該混合物を毎回酢酸エチル20mlと一緒
に２回振盪した。合わせた有機相を水20mlで１回洗浄
し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥した。該溶液を体積
4mlに蒸発濃縮し、４℃で15時間放置した。無色の針状
物が沈殿した（収量:40％）。
実施例13 ４−（２′−アダマンタニリデン−アルコキシフェニル
−5,5−ジメチル−チアゾリン メタノール性0.2Mナトリウムメチラート溶液10mlにアダ
マンタントシルヒドラゾン2mmolを添加し、次いで、こ
れをジグリム20mlで希釈した。メタノールを蒸留によっ
て除去した後、TLCでトシルヒドラゾンがもはや検出さ
れなくなるまで、120℃に加熱した。この温度で２−ア
ルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン−４−
チオン2mmolを添加し、15分間撹拌した。次いで、銅粉
末1gを添加し、該混合物を150℃でさらに20分間撹拌し
た。冷却後、水100mlを添加し、該混合物を毎回酢酸エ
チル50mlで３回抽出した。合わせた有機相を水30mlで１
回洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を
蒸留によって除去した後、油状物が残存し、これをカラ
ムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／石油
エーテル（1:6））によって分離した（収量20％）。
実施例14 ４−ベンジル−４−ヒドロキシ−アルコキシフェニル−
5,5−ジメチル−チアゾリン エーテル性0.2M塩化マグネシウムベンジル溶液50mlに２
−アルコキシフェニル−5,5−ジメチル−チアゾリン−
４−オン（実施例10）5mmolを添加し、該混合物を、還
流下で８時間、加熱して沸騰させた。水20mlを添加した
後、有機相を分離し、水20mlで１回洗浄し、次いで、硫
酸ナトリウムで乾燥した。蒸留によて溶媒を除去した
後、油状物が残存し、これを、カラムクロマトグラフィ
ー（シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル（1:5））
によって分離した（収量30％）。
実施例15 ４−ベンジリデン−アルコキシフェニル−5,5−ジメチ
ル−チアゾリン ４−ベンジル−４−ヒドロキシ−アルコキシフェニル−
5,5−ジメチル−チアゾリン（実施例14）2mmolの酢酸エ
チル20ml中溶液を、中濃塩酸20mlと一緒に５分間振盪し
た。2N水酸化ナトリウム溶液による中和の後、有機相を
分離し、水20mlで１回洗浄し、次いで、硫酸ナトリウム
で乾燥した。蒸留によって溶媒を除去した後、油状物が
残存し、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲ
ル、酢酸エチル／石油エーテル（1:4））によって分離
した（収量60％）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クライン，クリスチアーン ドイツ連邦共和国デー−8120ヴァイルハイ ム、ブリューテンシュトラーセ16番 (72)発明者 ハインドル，ジーテル ドイツ連邦共和国デー−8000ミュンヒェン 90、ホーヘンシュヴァンガウシュトラーセ 37番

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式III: ［式中、Ｒは または を表し、R1およびR2は、同一であっても異なっていても
    よく、水素または直鎖状もしくは分枝鎖状の低級（C1〜
    C6）アルキルを表し、Ｘは脱離しうる基であり、基R4ま
    たはR5の少なくとも１つは、ジオキセタン構造を安定化
    する基を表し、基R4またはR5の多くとも１つは、水素を
    表す］ で示される化合物。
  2. 【請求項２】式IVまたはIVa: ［式中、R3は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状また
    は分枝鎖状のアルキルを表す］ で示される化合物を、式V: ［式中、R1およびR2は、各々、同一であっても異なって
    いてもよく、水素または直鎖状もしくは分枝鎖状の低級
    （C1〜C6）アルキルを表す］ で示される化合物と反応させ、それを、アルキルリチウ
    ム化合物の存在下、アルデヒドまたはケトンと反応さ
    せ、該反応生成物を脱カルボキシルし、アルコキシ残基
    を脱アルキルし、この位置に脱離しうる基−Ｏ−Ｘを導
    入し、それを光酸化することを特徴とする、請求項１記
    載の一般式IIIで示される化合物の製造方法。
  3. 【請求項３】R3が１〜６個の炭素原子を有する直鎖状も
    しくは分枝鎖状のアルキルを表す請求項２記載の式IVま
    たはIVaで示される化合物を、R1およびR2がそれぞれ同
    一であっても異なっていてもよく、水素または直鎖状も
    しくは分枝鎖状のC1〜C6アルキルを表す請求項２記載の
    式Ｖで示される化合物と反応させ、得られたチアゾリン
    カルボン酸を還元してチアゾリン−４−オンを形成し、
    R4および／またはR5残基をグリニヤル反応で導入し、チ
    アゾリン環の４位に二重結合を導入し、アルコキシ残基
    を脱アルキルし、脱離しうる基−Ｏ−Ｘをこの位置で導
    入し、次いで、光酸化し、この方法で請求項１記載の式
    IIIで示される化合物を得ることを特徴とする、R4およ
    び／またはR5がフェニルを表す請求項１記載の式IIIで
    示される化合物の製造方法。
  4. 【請求項４】アナライトを請求項１記載の一般式IIIで
    示される化合物と反応させ、基Ｘを脱離させ、測定すべ
    き化合物の含量についての尺度として発光を測定するこ
    とからなる、酸、塩基、塩、酵素、無機もしくは有機触
    媒または電子供与体の測定方法。
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