JPH05503714A

JPH05503714A - 化学発光性３―（置換アダマント―２′―イリデン）１，２―ジオキセタン

Info

Publication number: JPH05503714A
Application number: JP3518245A
Authority: JP
Inventors: ブロンスタイン，イレーナ; エドワーズ，ブルックス; ジュオ，ロー―ロン
Original assignee: トロピックス・インコーポレーテッド
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1991-08-30
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: BR9105888A; WO1992004341A1; JP2552413B2; NO921682L; FI102751B1; OA09659A; AU656927B2; DK0497972T3; CA2069957A1; ES2128326T3; DE69130668T2; FI102751B; EP0497972B1; CA2069957C; DE69130668D1; NO302120B1; EP0497972A1; FI921925A0; ATE174914T1; FI921925A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】化学発光性３−（置換アダマント−２′−イリデン）１．２−ジオキセタン本出願は、１９９０年７月２４日付けの同時係属米国特許出願第５５９．１５２号の一部継続出願であり、つまり１９８９年７月１７日付は同時係属米国特許出Ｂ第３６７．７７２号（１９８８年７月２５日付は日本特許出１１第１８５３１９／８８及び現在放棄されている１９８７年１２月３１日付は米国特許出願第１４０．１９７号に基づいて、米国受理官庁に１９８９年１月３日に提出されたＰＣＴ出！１ｉＰＣＴ１０５８９１０００１６号に基づく）の分割出願である。

技術分野本発明は、改良された化学発光性の１，２−ジオキセタン化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、酵素によって除去可能な不安定基を含有する、改良された、酵素によって開裂か可能な化学発光性１．２−ジオキセタン化合物に関する。そのような不安定基は、適当な酵素を添加して不安定基を除くまで、分子が分解して光、すなわち可視光又は適当な器具によって検知しつる光を生じるのを防ぐ。

１つの酵素分子は触媒回路によって、その補足的不安定基を、酵素によって開裂可能な何千という化学発光性１．２−ジオキセタン分子から除去する。これは、補足的不安定基を各ジオキセタン分子から除くのに化学開裂剤１分子を必要とする化学的に開裂可能な化学発光性１．２−ジオキセタンの場合とは、著しく対照的である。例えば１．３−　（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４ −（３″−ヒドロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンのフェニル基上のヒドロキシル置換基から１モルの水素イオンを開裂するのに、水酸化ナトリウムが１モル必要であり、一方、１秒当たりり、０００−５．０００モルの３−　（２’ 　−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキソ）フェニル−１゜２−ジオキセタン　二ナトリウム塩のホスホリルオキシ基を開裂するのに、わずか１モルのアルカリホスファターゼ（ＡＰ″）が必要なだけである。ジャブロンスキー（ＪａｂＬｏｎｓｋｉ）の「伝染病の場合のＤＮＡプローブ（ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｆ。

ｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）　Ｊ　（Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌａ、　：ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１９８９　）　、ｐ２２参照。

酵素によって開裂可能な、光を生しる１、２−ジオキセタン化合物は通常、安定化基、例えばンオキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合したアダマンチリデン基も含有し、これは、酵素によって開裂可能な不安定基か分子の残分に結合している結合を意図的に開裂する前は、ジオキセタン化合物か室温（約２５℃）で実質的に分解するのを妨げる手助けをする。安定化のためにスピロアダマンタンって、これらの安定化基は、そのようなジオキセタンを、実質的な分解を生じることなく、約４ないし約３０℃もの温度で、使用前の許容される長期間、例えば約１２カ月ないし約１２年間もの間、の貯蔵を可能にする。

本発明はさらに、ジオキセタン分子を、当業界で認められている免疫学的アッセイ、化学的アッセイ及び核酸ブローブアプセイに用いることに関し、そして様々な高分子、合成重合体、タンパク質、核酸、触媒性抗体等の分子構造及び顕微鏡組織の研究にこれらを直接的な化学的／物理的プローブとして用いて、アナライト□存在、量又は構造を１１定する化学又は生物物質−の確認又は定量を可能にすることに関する。

発明の背景近年、特にブロンスタイン（Ｂｒｏｏｓｔｅｉｎ）の１９８６年７月２４日付は米国特許出願第８８９．８２３号（’８２３出願）、ブロンスタイン等の１９８７年１２月３１日付は米国特許出願第１４０．０３５号、エドヮーズ（Ｅｄｖａｒｄｓ）の１９８７年１２月３１日付は米国特許出ａ第１４０．１９７号（’１９７出Ｂ）及びエドワーズ等の１９８８年６月３０日付は米国特許出願第２１３．６７２号（′６７２出願）に記載の、酵素によって開裂可能な化学発光性１．２−ジオキセタンか出現してから、化学発光性１．２−ジオキセタンはますます重要な化合物になってきた。

酵素によって開裂可能な１，２−ジオキセタンとは著しく対照的に、これまでの公知の様々な化学的に開裂しうる１、２−ジオキセタンは、何かの分析法のリポータ−分子としての用途があったとしてもそれはほんの少しであり、バイオアッセイでは用いられていなかったのは確かである。その理由は、公知の化学的に開裂しうる化合物は、大部分か水不溶性−−−水並びに有機溶媒にいくらか可溶性である特定のアセトキシ−置換１．２−ジオキセタン以外−−−であり、従って、抗体のような生物成分と結合できる基又は置換基をこれらに加えることによって何とか変性して、そのような結合した化学的に開裂可能な１．２−ジオキセタンを化学的に活性化した化学発光性標識として用いることができるようにしなければ、生物学的アッセイには有用ではないからである。

適当な酵素の存在下、発光を伴って分解する、酵素によって開裂可能な代表的な化学発光性１．２−シオキセタンーーー例えば、アダマンチルを付加した、酵素によって開裂可能な１．２−ジオキセタン、　例えば３−（４−メトキシスピロ１１．２−ジオキセタン−３，２’　−４リシクロ［３，３，１，１”］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート及び及びその塩（例えば、ナトリウム塩）は、水溶性であるので、水性媒体中で行われる各種の分析法、特に生物学的アッセイにおけるリポータ−として用いるのに大変適している。これらの化合物は以後、次のように略Ｓ己する　アダマンチリデンメトキンフニノキシホスホリル化シオキセタノ（’　ＡＭＰＰＤ’　）並びに３−（４−メトキシスピロ［１，２ −ジオキセタン−”３．２′　−トリシクロ［３，３，１，１３７］デカン］− ４−イル）フェニルオキソ−３’−３−Ｄ−ガラクトピラノシド及びその塩（’ 　ＡＭＰＧＤ’　）。

、ＡＭＰＰＤは、水溶液中、及びまた化学発光促進剤、例えばポリ　［ビニルヘンシル（ヘンシルジメチルアンモニウムクロリド）（ＢＤＭＱ“）及び他のへテロ極性重合体［ボイツ（Ｖｏｙｔａ、）等の１９８８年６月１日付は米国特許出ａ第２０３．２６３号参照］のような重合体アンモニウム、ホスホニウム又はスルホニウム塩の存在下で、一定の発光特性に達した最適時間がより長いことか観察された（’ｊ１ｚｚ″は、一定の定常状態の発光レベルにおける最高化学発光強度の１／２に達するのに要する時間と定義する。この発光半減期は、様々な環境におけるンオキセタノオキシアニオンの安定性によって変わる）。

統計学的には、定常状態の発光特性に達するのに、約７　ｊ　ｌ／２の時間が必要である。ＢＤＭＱの存在下、ｐＨ９，５の水溶液中、２　Ｘ　１０−”Ｍを越える濃度のＡ、　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄのｔｌ／□は７５分であることが分かった。ＢＤＭＱの不在下、４×１０−’Ｍテ！；ｔ、ｔ、、２は約３０−６０分であり、一方、水溶液中、２Ｘ１０−５で、ＡＭＰＰＤのｔｌ／□は２５分であることが分かった。

酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタンをリポータ−分子として用いる急速生物学的アッセイでは、アッセイにおける″エンドポイント″を検出するためにできるだけ速く定常状態の発光特性に達するのが好ましい。また、化学発光強度は定常状態に達する前に測定することかできるが、定常状態の発光特性の前に正確なデータを得ることを望むのならば、最新の熱制御発光測定装！を使用しなければならない。

さらに、ＢＤＭＱは、化学発光促進剤の存在下及び不在下の、緩衝剤を加えた水溶液中で、より強い熱的な及び他のものによる非酵素活性化発光すなわち″ノイズ″発光を示す。そのようなノイズは、アダマンタノンの励起状態がらの発光、及びＡＭＰＰＤ分子の芳香族部分から誘導されたメチル　ｍ−オキシヘンシェードアニオンの発光によるものである。ＡＭＰＰＤの測定ノイズレベルは、標準ルミノメータ−における暗流より約２桁大きいので、このノイズは検出レベルを制限し、従って最終的な感度を表すことを妨げる。

アルカリホスファターゼを用いたＡＭＰＰＤの酵素による開裂を行うと、アニオン性脱燐駿化ＡＭＰＰＤ−アダマンチリデンメトキシメチルフエル−トシオキセタノ、すなわち’　ＡＭＰ−Ｄ’□も生じる。このフェルレートアニオンはまた、加水分解によって少量形成されることもあり、バックグラウンド化学発光シグナルを引き起こす。これは、組織化された分子集合体、例えば、ミセル、リボゾーム、石板状層、薄膜、指貫二重層、リポソーム小胞、逆ミセル、ミクロエマルンジン、ミクロゲル、ラテックス、膜又は重合体表面において、及びＢＤＭＱのような化学発光促進剤によって生じた疎水性環境において、強力な増強されたレベルの発光を生じ、このため、高いバックグラウンドシグナルか生じ、ＡＭＰＰＤの酵素による加水分解から生じるシグナルの動的範囲をかなり低下させることになる。

上Ｓ己の旺察に基づき、我々は以下のメカニズムを仮定した。

ＢＤＭＱのような促進重合体の存在下では１、　酵素による経路（ＡＰ存在）ＡＰ　徐々に［、Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ　］　、−−ラ［Ａ　Ｍ　ＰつＤ］　、　−〉４７７　ｎ　ｍでのＣＬ’（ｔ１７□−７，５分）２　熱による経路（ＡＰ不在）１１　ＣＬ″は化学発光を表す。

”　ＡＭＰＰＤの、緩衝剤を加えた水溶液には、脱燐酸化及び加水分解を行った１、２−ジオキセタン（“ＡＭＰＨＤ’　）が少量含まれる。溶液のｐＨか十分に高い（約９゜５より上）と、脱燐酸化ジオキセタンはＡＭＰ　Ｄとしてアニオン状態で存在しうる。

３１　ＣＬ１″及び’ＣＬ２’はバックグラウンド化学発光を表す。

０　Ａ＊′は励起二不ルギー状態のアダマンタノンを表す。

促進重合体の不在下でも、ＡＭＰＰＤはａｉ集体として水溶液中に存在する３、　酵素による経路ＡＰ　より速い［ＡＭＰＰＤ］＝→　［ＡＭＰ−Ｄコ−−〉　４７７ｎｍでのＣＬ（ｔ＝２．５分）４、　熱及び加水分解による経路上記のメカニズムでは、ｎ＞＞＞ｍである１ｎ及びｍは促進重合体の存在下又は不在下及びＡＭＰＰＤ濃度によって変わる。

凝実体の形のアダマンタノンー重項の励起状態（ｎ又はｍ〉１）は、凝集していないアダマンタノンの励起二不ルギー状態よりも、シグナルをより多く発し、またここでは特に、ＢＤＭＱのような化学発光促進剤を存在させるようなことによって［安定化］しても、より多くの光を放出する。これはおそらく、前者の一重項状態か後者より低いため、項間交差の生じるのがより少ないか、又は項間交差の速度がより遅いためであるか、あるいはまだ知られていない他のファクターによるためであろう。ルミノメータ−は一般に、これらのエネルギーすなわちこれらの波長に関係なく、放出される全ての光子を検出するように設計されているので、４１５ｎｍ及び４７７ｎｍの化学発光は共にバックグラウンドノイズ発光として検出される。同様に、写真又はＸ線フィルムを用いて化学発光を記録するとき、異なる波長の発光間の識別は容易に行うことかできず、従って、検出感度はバックグラウンドノイズによって制限される。

最後に、上記の条件下で観察されるＡＭＰＰＤの凝集は、ＡＭＰＰＤ又はそのフ二ル−トアニオン及び以下のような分子の両親媒性の性質による。

従って、本発明の目的は、分析、特に、酵素によって開裂可能な化学発光性の１．２−ジオキセタンをレポーター分子として用いる生物学的アッセイに要する時間を減少させることである。

また、本発明の目的は、アッセイ、特に生物学的アッセイにおけるレポーター分子として用いたとき、検定を完了するのに要する時間か少ない、新規で改良された酵素によって開裂可能な化学発光性の１．２−ジオキセタンを提供することである。

別の本発明の目的は、酵素に基づいたアッセイ、特に生物学的アッセイの基質として用いる、新規で改良された、酵素によって開裂可能な化学発光性の１．２− ジオキセタンを提供することであり、この化合物は、バックグラウンドに対して改良されたシグナルを提供し、そして従って、改良された検出レベルを提供する。

さらに別の本発明の目的は、これらの改良された酵素によって開裂可能な１゜２ −ジオキセタンの合成に有用な新規な中間体を提供することである。

さらに別の本発明の目的は、これらの酵素によって開裂可能な化学発光性の１゜２−ジオキセタン及びこれらの中間体の製造法を提供するものである。

本発明のこれらのそして他の目的並びに性質、範囲及び用途は、以下の記載及び請求の範囲から、当業者には容易に明らかになるであろう。

本発明は、水性媒体中、例えば溶液に生物液を加えた試料中で、又は固体表面上、例えばナイロン膜のような膜表面上で、酵素又は特定の結合対で変性した酵素と反応して、光学的に検出しうるエネルギーを放出することができる、新しい種類の安定で、酵素によって開裂可能な化学発光性の３−（置換アダマント−２′ −イリデン）−１，２−ジオキセタン化合物を提供するものである。

水性媒体中で、これらの変性アダマンチリデンジオキセタンは分析を行うことができ、分析ではこれらの化合物はリポータ−分子として用いられ、ＡＭＰＰＤを用いてこれまで行ってきた分析よりも速くかつよりすぐれた感度で行うことかできる。

我々はいかなるメカニズム又は理論をも結び付けてこの予想外に優れた様子を説明することは望まないか、アダマンチリデン部分上又は中の上記種類の置換基の存在が、ジオキセタン分子が効率的に詰め込まれるのを妨げ、従って、これらか、ミセル状の又は他の凝集状態の「安定化した」組織化集合体が形成されるのを妨げるのかもしれない。これらの置換基のあるものはまた、水目体を含めた水性環境中で、他の物質に水素結合し、これによってさらに凝集体が形成するのを妨げている。また、ｔ、７２がより短Ｘなったり、バックグラウンドノイズがより小さくなることから分かるように、電子的及び双極子効果がこの現象に寄与している可能性もある。

図面の簡単な説明図１−５は、以下の実施例層のようにしてそれぞれ得たＡＭＰＰＤ並びにそのブロモ−１Ｂ−ヒドロキシ−１Ａ−ヒドロキシ−及びクロロアダマント−２′−イリデン類似物のそれぞれのＴＳＨ，ＲＬＶ対ＴＳＨを示す図である。

図６−１０は、以下の実施例ＸＩＵのようにしてそれぞれ得たＡＭＰＰＤ並びにそのブロモ−１Ｂ−ヒドロキシ−１Ａ−ヒドロキシ−及びクロロアダマント−２ ′−イリデン類似物から得た全ルミネッセンス発光を比較した図である。

図１１は、核酸アッセイにおいてリポータ−分子として、ＡＭＰＰＤ自体と比較して、ＡＭＰＰＰのクロロアダマント−２′−イリデン類似物を用いて得た改良された化学発光強度を示す図である。以下の実施例ＸｒＶを参照。

図１２は、核酸アッセイにおけるリポータ−分子として、ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２′　−イリデン類似物及びＡＭＰＰＤ自体を用いて得た、発光速度を示す図である。以下の実施例Ｘ■を参照。

図１３は、ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２′−イリデン類似物及びポリ　［ビニル（ヘンンルンメチルアンモニウムクロリト）］　（’　ＢＤＭＱ’　）を含むアルカリホスファターゼ希釈溶液の５分後における投与反応曲線を、ＡＭＰＰＤ自体及びＢＤＭＱの場合の５分後における投与反応曲線と比較した図である。以下の実施例Ｘ■を参照。

図１４は、図１３の投与反応曲線を示す同じ物質の２０分後における投与反応曲線である。

図１５は１．ＡＭＰＰＤのクロロアダマント−２′−イリデン類似物及びＢＤＭＱ−フルオレセイン（″エメラルト″）を含むアルカリホスファターゼ希釈溶液の５分後における投与反応曲線を、ＡＭＰＰＤ自体及びエメラルドの場合の５分後における投与反応曲線と比較した図である、再び以下の実施例ＸＩＸをｉ、［。

図１６は、図１５の投与反応曲線を示す同し物質の２０分後における投与反応曲線である。

図１７は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）ＡＭＰＰＤのクロロアダマット−２′− イリデン類似物を用いて、以下の実施例ＸＸのようにして得たＴＰＡ配列のイメーンを示す図である。

図１８は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）本発明の置換類似物を用いて、以下の実施例ＸＸ■のようにして得たシグナルを示す図である。

図１９は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）ＣＩ−ＡＭＰＰＤについて得た、実施例ＸＸ■に従って得た化学発光シグナルをプロブトした図である。

図２０は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）Ｃｌ−ＡＭＰＰＤの両者を用いて、ｐＢＲ３２２プラス：　トＬ）ＮＡｆ検出するｒこめに実兄例ＸＸＩＸに従って得た露光図である。

図２１は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）ＣＩ−ＡＭＰＰＤ及び（３）Ｂｒ−ＡＭＰＰＤを用いて、実施例ＸＸＸに従って行った、ｐＢＲ３２２プラスミドを検出するための露光図である。

図２２は、（１）ＡＭＰＰＤ及び（２）Ｃｌ−ＡＭＰＰＤの両者についての、時間の関数としてプロ！トした実施例ｘｘｘｒに従って得た化学発光シグナル図である。

図２３及び３０は、ＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤの場合のヒトのトランスフニリンの検出において、実施例ＸＸＸＩ及びＸＸＸＩＶに従って得た露光図である。

図２４は、ＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ、Ｂｒ−ＡＭＰＰＤ及びＬｗｉＰｈｏｓ　５３０を較へた、実施例ｘｘｘｖに従って得たシグナルの比較を示す図である。

図２５及び２６は、ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤを用いて実施例ｘｘｘｖｒに従って得たイメージを比較した図である。

図２７及び２８は、ＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを用いて実施例ＸＸＸ■及びＸＸＸ■に従って得た露光図を較べたものである。

図２９は、ＡＭＰＰＤ、Ｃｌ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを較べた、実施例４０に従うヒトのトランスフェリンの化学発光による検出を示す図である。

本発明の新規な化学発光性３−（置換アダマント−２′−イリデン）１．２−ジオキセタンは一般式％式％式Ｉにおいて、Ｘ及びＸｌはそれぞれ個々にアダマント−２′−イリデン買換基土の５′及び７′位！における置換基であり、水素、ヒドロキシル基（水に水素結合しているとき、少し電子吸引性の基）、ハロ置換基、すなわちフルオロもしくはクロロ（電子吸引基）又はブロモもしくはヨード（分極性、共鳴基）、非置換直鎖又は分枝鎖低級アルキル基、好ましくはメチル、モノ置換あるいは同じでも異なっていてもよい２個以上の置換基を有する、置換直鎖又は分枝鎖低次アルキル基、例えばヒドロキシメチル基のようなヒドロキシアルキル基、トリフルオロメチルのような・・ロアルキル基等、アルコキシ基、特にＣ１−７アルコキシ（メトキン、エトキシ、プロポキシ等）、非互換アリール基、好ましくはフェニル基、置換アリール基、好ましくはアリール環かモノ置換されたあるいは同じでも異なっていてもよい２個以上の置換基を有する６個の炭素原子を含有する互換アリール基、置換基としては例えば、ハロ置換基、この場合はｐ−プロモフェニル又はｐ−クロロフェニル、アルコキシ互換基、この場合はｐ−メトキンフェニル（電子供与基）、ヒドロキノアルコキシ置換基、この場合はヒドロキシエトキシ又はヒドロキシプロポキシ、シアノ基、又はアミド基、この場合はホルムアミド又はアセトアミド基、カルボキシル又は互換カルボキシル基等かあり、但し、Ｘ及びＸＩの少なくとも１つは水素以外である。

アダマンチリデン基か水素以外の前記１換基の１つでモノ互換されているとき、合成時にノン及びアンチ異性体か得られるであろう。ある場合には、例えばモノヨード置換アダマシチリデジンオキセタンの場合には、一方の異性体の分解時の化学発光強度は他方のものより強い。別の場合には、例えばモノヒドロキシ互換アダマンチリデンジオキセタンの場合には、２つの異性体は化学発光特性、例えば強度は、同等又はほぼ同じである。いずれの場合にも、異性体は、例えば、生物学的アッセイにおＣブるリポータ−分子として使用する前に、エトワーズ等の１９８８年９月１４日付は米国特許出願第２４４．００６号に記載のような方法によって分離しても、あるいは分離せずにクロマトグラフィーを行った異性体混合物として使用してもよい。

アダマンチリデン置換基が水素以外の前記互換基の２つでさらに置換されているジオキセタン（Ｘ及びＸ′　≠水素）は、ノン／アンチ異性体を示さないが、もちろん、２つの異なる互換基か存在するとき、例えば、５′−ヒドロキシ−７′ −クロロー及び５′−クロロ−７′−ヒドロキシ置換アダマンチリデンシオキセタシのとき、位置異性体は可能である。

記号Ｒ１及びＲ２は、前記ブロンスタイン、ブロンスタイン等、エドワーズ、エドワーズ等及びボイタ等の出願に記載のジオキセタン環の４−炭素原子上の互換基を表し、Ｒ１及びＲ２が個々の互換基を表すとき、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族、又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つ又はＲ，及びＲ２は一緒になって、酵素によって除去可能な不安的な１換基が酵素によって除去されたとき、化学発光性物質を生じる、酵素によって開裂しうる不安的な基で互換された化学発光性発色団基である。

従って、例えば、記号Ｒ，は、水素であるか、あるいはＲ２か置換基を表すとき、スピロ結合によってジオキセタン環に結合した結合であるか、あるいは光か生じるのを妨げないかつ結合しているジオキセタン環炭素の原子価を満たして４価のジオキセタン環炭素原子を形成する有機基、例えば、アルキル、アリール、アルアルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル又はシクロヘテロアルキル基、例えば炭素原子数１−７の直鎖又は分枝鎖アルキル基、炭素原子数１−７の直鎖又は分枝鎖ヒドロキシアルキル基、ＲがＣＩ　Ｃ２０の直鎖又は分枝鎖、非置換又は互換、不飽和又は飽和アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、アルアルキル又はアルケニル基であり、これらはさらに発光フラグメントがラクトン環又はＮ、０もしくはＳヘテロ原子含有基を含有するようにＲ２と一緒になってもよく、又はジオキセタン環の４位の炭素原子に直接結合した酵素によって開裂しうる基、又は酵素によって開裂しうる結合を含み、直接又はその後のｐＨＦｌ整によって、ジオキセタン環に結合した電子に富んだ部分、例えば酸素アニオン、硫黄アニオン又は窒素アニオン（後者は、例えばスルホンアミドアニオンのようなオキシム又はアミドアニオン）を生じる他の上記Ｒ５基の１つである。Ｒ２がジオキセタンの４位の炭素原子に単結合しているとき、Ｒ，はアルコキシ基、特にメトキシ基であるのが好ましい。

記号Ｒ２はまた、光か生じるのを妨げないかつ結合しているジオキセタン環炭素の原子価を満たす有機基であってもよい。Ｒ２は、光を放出するいくつかの発蛍光団形成蛍光性発色基であり、相当するジオキセタン分解フラグメントによって、エネルギーを吸収しそして励起状態を形成し、この状態から光学的に検出可能なエネルギーを放出して、ジオキセタン環に結合した、直接又はその後のｐＨ調整によって電子に富んだ部分、例えば酸素アニオン、硫黄アニオン又は窒素アニオンを含む酵素によって開裂しうる結合を含有する酵素開裂性基で互換された、基底状態に戻る。

従って、記号Ｒ２は単独で（又は記号Ｒ，と一緒になってジオキセタン環の４位の炭素原子にスピロ結合した置換基となる）蛍光発色団基となりうる。該基の例を以下に記すフェニル及びフェニル誘４体ナフタレン及びナフタレン誘導体、例えば５−ジメチルアミノナフタレン−１− スルホン酸及びヒドロキシナフタレン。

アントラセン及びアントラセン誘導体、例えば９．１０−ジフェニルアントラセン、９−メチルアントラセン、９−アントラセンカルボキシアルデヒド、アントリルアルコール及び９−フェニルアントラセン。

ローダミン及びローダミン誘導体、例えばロードール類化合物、テトラメチルローダミン、テトラエチルローダミン、ジフェニルジメチルローダミン、ジフェニルジメチルローダミン及びジナフチルローダミン。

フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えば５−ヨードアセタミドフル第１ノセイン、６−ヨードアセタミドフルオレセイン及びフルオレセイン−５−マレイミド。

クマリン及びクマリン誘導体、例えば７−ンアルキルアミノー４−メチルクマリン、４−ブロモメチル−７−メドキシクマリン及び４−ブロモメチル−７−ヒトロキシクマリン：エリスロシン及びエリスロシン誘導体、例えばヒドロキシエリスロシン、エリスロシン−５−ヨードアセタミド及びエリスロシン−５−マレイミド。

アクリジン及びアクリジン誘導体、例えばヒドロキシアクリジン及び９−メチルアクリジン。

ピレノ及びピレン誘導体、例えばＮ−（１−ピレン）ヨードアセタミド、ヒドロキシピレン及び１−ピレンメチルヨードアセテート：スチルベン及びスチルヘン誘導体、例えば６．６′−ジブロモスチルベン及びヒドロキシスチルヘン。

二トロヘンゾオキサシアゾール及びニトロベンゾオキサジアゾール誘導体、例えばヒドロキシニトロヘンゾオキサシアヅール、４−クロロ−７−ニドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール、２−（７−ニドロヘンズー２−オキサ−１゜３−ジアゾール−４−イル）メチルアミノアセトアルデヒド及び６−（７’−二トロヘンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミンへキサン酸。

キノリン及びキノリン誘導体、例えば６−ヒドロキシキノリン及び６−アミノキノリン。

アクリジン及びアクリジン誘導体、例えばＮ−メチルアクリジン及びＮ−フェニルアクリジン。

アシドアクリジン及びアシドアクリジン誘導体、例えば９−メチルアシドアクリジン及びヒドロキシ−９−メチルアシドアクリジン：カルバゾール及びカルバゾール誘導体、例えばＮ−メチルカルバゾール及びヒドロキシ−Ｎ−メチル力ルバヅール：蛍光性シアニン、例えばＤＣＭ　（レーザー染料）、ヒドロキシシアニン、１゜６−シフエニルー１．　３．　５−ヘキサトリエン、１−（４−ジメチルアミノフェニル）−６−フェニルヘキサトリエン及び相当する１、３−ブタジエン：カルボシアニン及びカルボシアニン誘導体、例えばフェニル力ルポシアニン及びヒドロキシカルボシアニン：ピリジニウム塩、例えば４−（４−ジアルキルジアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨウ素酸塩及びヒドロキシ置換ピリジニウム塩：オキソノール：そしてレゾロフィン及びヒドロキシレゾロフィン。

記号Ｒ２は記号Ｒ，と共に、一般式：を有する、スピロ結合によってジオキセタン環の４位の炭素原子に結合した縮合蛍光発色団基を表すこともできる。

Ｒ６は個々に、水素、炭素原子数１−２０の分枝鎖又は直鎖アルキル基、例えばメチル、ｎ−ブチル又はデンル、炭素原子数１−７の分枝鎖又は直鎖ヘテロアルキル基、例えばメトキシ、ヒドロキシエチル又はヒドロキシプロピル１１−２環のアリール基、例えばフェニル、ナフチル又はアントラニル、１−２環のヘテロアリール基、例えばピロリル又はビラヅリル：環の炭素原子数か３−７のシクロアルキル基、例えばシクロアキル、環の炭素原子数が３−６のへテロシクロアルキル基、例えばジオキサン：１−２環のアルアルキル基、例えばヘンシル、１− ２環のアルカリール基、例えばトシルであり：各Ｒ１は個々に、水素、電子吸引基、例えばトリフルオロメチルのような炭素原子数１−７のペルフルオロアルキル基；ハｏ’ｒ’ン；　Ｃ０２Ｈ，−ＺＣＯ２Ｈ，−ＳＯ３Ｈ，ＺＳＯ！Ｈ１Ｎ　Ｏ２、−ＣミＮ又は−Ｚ、Ｃ＝Ｎ　（Ｚは炭素原子数１−７の分枝鎖又は直鎖アルキル基、例えばメチル）＋１−２環のアリール基、例えばフェニル、電子供与基、例えばメトキシ又はエトキシのような分枝鎖又は直鎖Ｃ，−Ｃ７のアルコキシ基、１−２環のアルアルコキシ基、例えばフェノキシ、分枝鎖又は直ｍｃ、 −Ｃ７ヒドロキシアルキル基、例えばヒドロキシメチル又はヒドロキシエチル：１−２環のヒドロキシアリール基、例えばヒドロキシフェニル：分枝鎖又は直鎖Ｃ，−Ｃ７アルキルエステル基、例えばアセテート；１−２５のアリールエステル基、例えばヘンシェード、あるいは１−２環のへテロアリール基、例えばヘンジオキサゾール、ヘンズチアヅール、ヘノズイミダヅール又はヘンズトリアヅールである。さらに、２つ以上のＲ３基か、それ自体非置換又は置換の縮合環（Ｉ！−の又は複数の環）を形成してもよい。

記号Ｒ２は単独で又は記号Ｒ，と一緒になって同様に、開裂したとき縮合多環状部分を電子で富ませて、つまりジオキセタン化合物を分解性にして発光させる結合を含有する不安定な環置換基を有する発蛍光団部分を含む特定の種類の縮合多環式環を表す。この種のものは、ジオキセタン環に付いている環の位置に関連して（単結合又は、Ｒ１が結合を表すとき、スピロ結合である）、縮合多環式環に付いている不安定な環置換基の位置は、結合位置におけるｓｐ”環炭素原子を含めて、これらの結合位置を分ける環ｓ　ｐ　２原子の全体数が奇数の整数となるものである：エトワーズ等の′　６７２特許出願を参照。

残部をこの発蛍光団部分の形成に用いることかできる縮合多環式環化合物の中には、上記の縮合多環式芳香族炭化水素環発蛍光団化合物、特に環炭素原子数が９ −約３０のもの、例えば以下のようなナフタレンがあり置換基結合は１．６−置換型を示し、例えば６−（４−メトキシスピロ［１，２＝ジオキセタン−３，２ ’　−（５’−ヒドロキシ）トリシクロ［３−３，１，１３７］デカン］−４− イル）−１−ナフタレンｗＪＷ二ナトリウム１、ペンタレン、アズレン、ヘブタレン、ａＳ−インダセン、Ｓ−インダセン、ビフェニレン、ペリレン、アセナフチレン、フェナントレン、アントラセン、アセフエナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン等、並びに１つ以上の非不安定置換基、例えば記号Ｒ５、Ｒ１及びＲ５で示した通りのもので置換された上記誘導体である。

Ｒ２単独で又はＲ１６共に表されるそのような「奇数型置換した」発蛍光団部分の縮合多環式環部分はまた、開裂したとき、縮合不完全芳香族多環式部分を電子で富ませて、つまりジオキセタン化合物を分解性にして発光させる結合を含有する不安定な環置換基を有し、非置換の又は１つ以上の上記非不安定置換基で置換された、１〇−約３０の環炭素原子を含む非芳香族の残基、すなわち不完全芳香族の縮合多環式炭化水素環発蛍光団化合物の残基、例えばフルオレン、３．４− ジヒドロ−３，３−ジメチルナフタレン、シヘンゾスヘレン、９．１０−ンヒトロフエナントレン、インデン、インデノ　［１，２−ａＥインデン、フニナレノ、フルオロアントレン等でもよい。

さらに、Ｒ２単独で又はＲ１と共に表される発蛍光団部分の縮合多環式環部分はまた、縮合多環式へテロ芳香族又は不完全芳香族縮合環ヘテロ環式発蛍光団形成基の残基でもよく、例えばンヘンゾチオフエン、シヘンゾフラン、２．２−ジメチル−２Ｈ−クロメン、キサンチン、ピペリジン、キノリン、インキノリノ、フェナントレン、カルボスチリル、フェノキサジン、フェッチアシン、フェナントロリン、プリン、フタラジン、ナフチリレン、Ｎ−アシリンドール、クロマン、インクロマン、Ｎ−アシリントリン、イソインドリン等、非置換又は１つ以上の上記の非不安定性基で置換され、はとんどか炭素原子である環原子９−約３０を有するものでもよい。

Ｒ９及びＲ２の少なくとも１つが置換される、好ましい酵素によって除去可能な基は、ホスフェート基、特に一般式（式中、Ｍ゛は例えばナトリウム又はカリウムのようなアルカリ金属のような陽イオン、アンモニウム又はＣ，−Ｃ，アルキル、アラルキル又は芳香族４１ｉＩｌアンモニウム陽イオン、Ｎ　（Ｒ７）　４”　（各Ｒ７はアルキル、例えばメチル又はエチル、アラルキル、例えばヘンシル、又は複素環式理系の形成部、例えばピリジニウムである）で表されるホスフェートエステル基である。二ナトリウム塩が特に好ましい。そのようなホスフェートエステル基は、アルカリホスファターゼのような酵素を用いて開裂を行うと、酸素アニオンで置換された基を生じ、つまりジオキセタンを不安定化し、その酸素−酸素結合を切断して発光しうる。そのようなホスフェートエステル基の４級アンモニウムカチオノはまた、それらの４級基の１つによって重合体主鎖、すなわち（ｎは１より大きい）に接続することかできるか、あるいは４級アンモニウム塩重合体、すなわちイオ不ン重合体の一部にもなりつる。

別の好ましい酵素によって除去可能な基は、β−Ｄ−ガラクトシド基であり、これは、酵素β−Ｄ−ガラクトンダーゼで開裂してジオキセタンフェノラートの共役酸を生じ、加圧下で化学発光する。

用い得る酵素によって開裂可能な置換基にはまた、酵素によって開裂しうるアルカノイルオキシ基、例えばアセテートエステル基、酵素によって開裂しうるオキサカルボキシレート基、１−ホスホ−２，３−ジアシルグリセリド基、１−チオー〇−グルコシド基、アデノジントリホスフェート類似基、アデノシンンホスフエート類似基、アデノジンモノホスフエート類似基、アデノシン類似基、α−Ｄ −ガラクトシド基、β−Ｄ−ガラクトンド基、σ−Ｄ−ゲルコント基、β−Ｄ− グルコシド基、ａ−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ−フラクトフラノンド基、β−Ｄ−グルコシトウロネート基、ｐ−トルエンスルホニル− Ｌ−アルギニンエステル基又はｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミン基がある。

Ｒ２が上記のようにフｊ−ニルであるとき、Ｒ１は一〇　（ＣＨ２）−ＣＨ３（ｎ＝０−１９、好ましくはｎ＝０−５）である。そのような化合物では、重要な性質か、さらに分子に付与されるか、あるいはフェニル環上に置換基を加えることによって調整される。安定性、溶解性、ａｉ集、結合力及び分解速度はさらに、以下の構造「Ｚは上記の酵素によって開裂しうる基であり、酸素はオルト、メタ又はバラであり、Ｑは水素、アリール、置換アリール、アルアルキル、ヘテロアリール、炭素原子数２０以下のヘテロアルキル、アリル基、ヒドロキシ（低級）アルキル、低級アルキル０３ｉＲ１（Ｒ’は低級アルキル、アリール、アルコキシｃ＋−ｇ、炭素原子１ｔ１２以下のアルコキンアルキル、ヒドロキシ（低級）アルキル、アミノ（低級）アルキルである）、−ＯＲ″又は−ＳＲ”　（Ｒ’はアルケニル、置換（低１＆）アルケニル、　（低級）アルキル又は炭素原子数２０以下のアルアルキルである）　、５Ｏ２Ｒ’　（Ｒ５はメチル、フェニル又はＮ　ＨＣａ　Ｈｓである）、置換又は非Ｅ換（低級アルキル、ニトロ、ンアノ、ハロゲノ、ヒドロキシ、カルボキシル、トリメチルシリル又はホスホリルオキシ基である）である］の化合物において調整しうる。

上記式■のジオキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合した置換アダマント−２ −イリデン部分は、２つ以上の縮合環を有し、各環の炭素原子数が３−１２である他の同様な置換縮合ポリンクロアルキル基ノ基、例えばビシクロ［３３１］］ノナンー９−イリデスヘキサンクロー［５，５，１，０２）０．３／１０Ｑ、ｆ、ａＱ９．１！］　トリデカン−５−イリデン、ペンタンクロ［５，４，０，０，２・６Ｑ、ｌｌ０Ｑν］ウンデカン−４−イリデン等で置き換えることができる。

ブロンスタインの′　８２３出願に基づ＜　１９８８年１月２８８公開のＰＣＴ出ＩＯｉ第ＷＯ８８１００６９５号には、３−炭素原子か定められた置換基″Ｔ −Ｖ’で、４−炭素原子か定められた置換基″Ｘ′及び’　Ｙ−Ｚ’で置換された酵素によって開裂しうる１、２−ジオキセタンか記載されている。この公開出願には以下の個所に次のような記載がある第３頁、ｉｓ、６−１２には′ 好ましい具体例では、Ｔ、Ｘ又はＹの１つ以上の基は可溶化置換基、例えばカルボン酸、スルホノ酸又は４級アミン塩を含みニジオキセタンの基Ｔはポリンクロアルキル基、好ましくはアダマンチルであり、酵素によって開裂しうる基にはホスフェートかあり、酵素はホスファターゼ活性を有し、第２２頁、１．３３−策２３頁、１．６には。

例えば、酵素によって開裂しうる基Ｚは、基Ｙの代わりに、ジオキセタンの基Ｘと結合することかできる。特定の類似物質は、酵素の代わりに、基Ｘ、Ｙ又はＴ（好ましくは基Ｘ）によってジオキセタンに結合することができる。この場合、特定の類似物質か結合した基は、例えばカルボン酸、アミノ又はマレイミド買換基を有して、結合を容易にし、そして第２３頁ｉｓ、１１−２１にはジオキセタンの基Ｘ、Ｙ又はＴは重合可能な基、例えば重合してホモポリマー又は共重合体を形成しうるビニル基に結合することができる。

ジオキセタンの基ＸＳＹ又はＴは、例えば免疫学的又は核酸アッセイに用いるための膜、フィルム、ビーズ又は重合体に結合させることかできる。これらの基はカルボン酸、アミノ又はマレイミド買換基を有して、結合を容易にする。

ジオキセタンの基Ｘ、Ｙ又はＴは、ジオキセタンの酵素による分解速度を速める置換基、例えば電子に富んだ部分（例えば、メトキシ）を含むことができる。

ジオキセタンの基Ｙ及びＴ、並びに基Ｘは、可溶化置換基を含むことかできる。

本明細書に記載のかつ請求の３−（置換アダマント−２′−イリデン）１゜２− ジオキセタン化合物によって解決される開題は、この公開ＰＣＴで論じられていないばかりでなく、これらの化合物自体もここに又は発明者の知る他の文献１こもｇ己載されていない。

これらの３−（置換アダマント−２′−イリデン）１．２−ジオキセタンの全体にわたる合成は、前記ブロンスタイン及びエトワーズの出願並びにエトワーズ等の１９８９年９月６日付は米国特許出ａ第２７９．１７６号（”１７６″出１］）に記載の方法によって実施することかできる。従って、例えば、上記式■の１囲に入る、Ｘがヒドロキシル基、Ｘｌか水素、Ｒ１かメトキシ基モしてＲ２かホスホリルオキシ基で置換されたフェニル基、好ましくはメタ−ホスホリルオキシ塩で置換されたフェニル基である１、２−ジオキセタンは、′　１７６出願に記載の方法に従って、以下の図に示す反応工程で合成することかできるＰＱ、　− コＦ、つＨＣ−Ｃ−工γ−ＯＲ９＋　ＣＨ，ＯＨメ一〇Ｒ９７オーメート、例えばトリメチルオルトフォーメート、メタノール及びｌ）−トルエノスルホン酸と反応させて、中間体を得ることかできる。この中間体を（Ｒ，○）＋Ｐ及びルイス酸と反応させると、ホスホネートエステル中間体が得られる。

上記の反応工程では、Ｒ８は低級アルキル基、例えばメチル、エチル又はブチルである。Ｒ９は炭素原子数２−１４のアシル基、例えばアセチル、プロピオニル、メシトイル又はピバロイルであり、Ｑはハロゲン、例えばクロロもしくはブロモ、又はＯＲ，であり、モしてＭは個々にプロトン、金属陽イオン、例えばＮａ゛もしくはに゛、又はアンモニウム、置換アンモニウム、４級アンモニウム又は（Ｈ゛）ピリジニウム陽イオンである。エドワーズの′　１９７出願に記載のチオレート開裂は、Ｒ８か低級アルキル、低級アルケニル又はアルアルキル基、例えばメチル、アリル又はヘンシルである、上ｇ占叉応工程５のＯＲ５の塩基開裂の代わりに用いることかできる。塩基又はチオレート開々の生成物は、Ｒ９の代わりに、水素又はアルカリ金属陽イオン、例えばリチウム、ナトリウム又はカリウムを有する。

式（式中、Ｘ及びＸＩのうちの１つだけは水素以外のものである）で表される上記の中間体は公知の化合物であるか、あるいは公知の方法を用いて公知の出発物質から容易に合成される。例えば、モノ置換アダマンタン−２−オン（Ｘ及びＸｌのうちの１つが水素である）の場合。

５−ブロモアダマンタン−２−オン及び５−クロロアダマンタン−２−オンはゲルツク等のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　２４．５３６９　（１９６８）に記載のように製造される。

Ｘ又はＸｌかフルオロ、置換（低級）アルキル、例えばｔ−ブチル、置換（低級）アルキル、例えばトリフルオロメチル、非互換アリール、例えばフェニル、又は置換アリール、例えばｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル又はｐ−０８，１５９８（１９８６）及びつオルポルスキー（Ｙａｌｂｏｒｓｋｙ）等のＪ、　Ａｍ、　Ｃｈ全照。

簡単な単位反応によって、上記Ｘ又はＸ１置換基のいくつかあるいは他の公知のものを、Ｘ又はＸｌかトリアルキルンリルオキシ、ヨード又はノアノ基である５ −Ｘ−又は５−Ｘｌ−アダマノタフ−２−オンに変えることかできる。これらの部分は上ｇ己反応工程４て用いる穏やかな条件下で安定である。例えば、５−ヒドロキシアダマンクン−２−オンを７時間、５７％のヨウ化水素酸で還流すると、５−ヨードアダマンタン−２−オン（融点７ｉ７６℃）か得られる。ランドボーカルボキシアダマノタン−２−オンは、メチルエステルのケン化の後、タブシ等のＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｔ、１旦、３４４７　（１９７３）の３工程手順によって、５−シアノアダマンクン−２−オノに変えることかでき、これはケトアミドの中間体を経て異性体の１−シアノアダマンタン−２−オンの製造に用いられる。５−ヒドロキシアダマンタン−２−オンの保護変種として有用なトリメチルシリルオキシアダマンタン−２−オノ（融点３４−３８℃）の場合、前記反応工程４てわずか１当量の塩基を用いて、相当する二ノールエーテルを製造することかでき、これはその後、Ｐｓ１１１ｍ的な方法で脱シリル化することができる。

当業者には明らかなように、他のＸ及びＸ１基は全反応工程中、不変である必要はなく、どの段階においても他の構造を考慮して、適した反応によって変換してもよい。例えば、Ｘ又はＸｌか塩素又は臭素原子であるとき、前記反応工程４及び５て生成される二ノールエーテル中間体は、モル過剰のジオール又は液体アンモニアの存在下、高温のボンへ中で、容易に加溶媒分解されることか見いだされた。エチレングリコール又はプロピレノグリコールのようなジオールを用いた場合の反応速度は、炭酸カリウムのようなプロトン受容体の存在下、高温（１０５ −１２０℃）でのみ認められる。一般に、この反応は遅いか、クリーンであり、ヒドロキシアルキルエーテルの形成の刺激にしばしば用いられる銀又は重金属塩の使用か避けられる。３−（メトキン−５−（２−ヒドロキシエトキシ）トリシクロ［３，３，Ｌ　Ｌ’／７］デク−２−イリデンメチル）フェノールは塩化トリメチルアセチル及びトリエチルアミンでエステル化すると、相当するジエステルか得られ、次に、これをメタノール中、炭酸カリウムを用いて選択的に開裂すると、フェノール性モノエステルか得られる。次いで行う燐酸化工程では、メタノール中でナトリウムメトキシドを用いたヒンダードエステルの同時β−説離及びケン化を採用して、ヒドロキシエトキシエノールエーテルホスフェートを得る。

３−（メトキン−５−アミノトリシクロ［３，３，１，１’−７コデクー２−イリデンメチル）フェノールを相当する５−ブロモ化合物から得るための加圧下、ジオキサノ中で液体アンモニアを用いた反応は、ハメレン（Ｈｕｍｍｅｌ、ｅｎ）の学位論文、グロニンゲン大学、ザ・ネザーランズ、第６０頁（１９８５）に記載の方法で行う。このようにして得たアミノエノールエステルフェノールを、２当量のホ化アセチル又は酢酸ギ酸無水物及び塩基としての４−ジメチルアミノビリシンを用い、（５−ヒドロキソアダマンチリデン）エタノールのエステル化に用いられるゴーロンスキ（Ｇａｗｒｏｎｓｋｉ）等のＪ、　ｋｍ、　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、、上０９．６７２６　（１９８７）の方法に従って、直ちにアンル化すると、ホルムアミド又はアセトアミドフェノール系エステルか得られ、これは上記の選択的ケン化、次いで下記の燐酸化及び光酸素付加を行うことができる。

４及びその後の適当なホスホネート安定化カルバニオンとの反応の、出発物質としての４−メチレンアダマンタン−２−オン　（上記式ｒのＸ及びＸｌは水素、４′位！にメチレン）へ近づく方法か記載されている。エキソメチレン機能の代わりのエノールエーテルに対する一重項酸素の反応性の差によって、３−　（４ −メトキンスピロ［１，２−ンオキセタン−３，２’　−（４’−メチレン）トリシクロ［３，３，１１’−７］−４−イル）フェニル憐酸二ナトリウムが光酸素付加生成物として確実に得られるようになる。

選択的開裂が可能なピバロイルオキシアリールエノールエーテルが、ホスフェ− １−エステル基のような酵素によって除去可能な基を付加する直前のいづれかの反応で得られるならば、ヒドロキシアリールエノールエーテルの分離を避けるのがより好都合である。これは、ピバロイルエステルをメタノール中にて１当量のナトリウムメトキシドで直接分離し、そしてナトリウムアリールオキシド成分を反応終了時に全揮発成分を除去することによって乾燥固体として分離することにより行うことかできる。そのような場合、前記反応工程６はルイス塩基を用いずに、ジメチルホルムアミドのような乾燥極性非プロトン性溶媒中のこの予備形成塩を用いて行い、無機塩副生成物は工程７又は工程８の処理時に除去する。

工程７の２−ンアノエチルホスフエートシエステル生成物は、ベータ脱離して工程８のホスフニートモノエステルにする。工程８では、Ｘ又はＸｌが塩素又は臭素である誘導体を、アンモニアのような揮発性アミンと又は”ＤＢＵ”　（１゜８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセ−７−エン）のような溶媒に可溶性の有機アミンと、メタノールのようなアルコール溶謀中で反応させるのか好ましい。過剰の塩基は真空中、反応終了時点で簡単に揮発させるので、大気圧以上の圧力及び周囲温度でアンモニアを用いるのか特に有利である。

前記反応工程９のエノールエーテルホスフェートの酸化は、前記のように、ハロゲン化溶媒、例えばクロロホルムのようなハロゲン化炭化水素中での一重項酸素Ｃ○２）との反応によって光化学的に行うことかできる。上記溶媒はまた補助溶媒、例えばメタノールのような低級アルカノールを含有していてもよい。−重項＃素は、重合体か結合したローズヘンガル（ポリサイエンシーズ社）、メチレンブルー又（ま５．１０．１５．２０−テトラフェニル−２ＬＨ，２３Ｈ−ポルフィンじＴＰＰ”）のような光増感剤を用いて発生させることかできる。

あるいは、前記反応工程７で得られた粗２−シアノエチルホスフエートシエステルを一重項酸素でそれらの１．２−ジオキセタンに酸化することもできる。その後、メタノール中、室温でナトリウムイオントと反応させた後、水性処理及び分取逆相高圧液体クロマトグラフィーを行うと、純粋な１．２−ジオキセタンホスフェートモノエステル塩かンノー及びアンチ−異性体混合物として得られる。

トリエチルシリルヒドロトリオキシド、ホスフェートオシニド又はトリアリールアミンラジカル陽イオンによって介されたものの、三重項酸素の存在下での電子酸化を用いた方法を含めた、１．２−ジオキセタンの化学的製法も用いることができる。

式（式中、Ｘ及びＸｌは同じものであり、水素以外のものである）の出発物質、又は公知の方法でそのような出発物質を合成することかできる中間体もまた公知である。例えば、前記反応工程４の対称的に置換された５、７−ヒス−ｘ、ｘ’− アダマンタン−２−オンを用いると、４員のジオキセタン環に対してシン及びアンチ関係にあるＸおよびＸ］！換置換含む対称的な１．２−ジオキセタンか得られる。ステター（Ｓｔｅｔｔｅｒ）等のキノンモノアセタールをベースにした方法では、ビシクロ［３，３，１］ノナン−３，７−シオンー９−エチレンアセタールによって５．７−ンヒドロキシアダマンタンー２−オンへ接近するロキシアダマンタンー２−オンは、ゲルク等の上記文献に記載の条件下で、４７％水性臭化水素酸、塩化チオニル又は５７％水性ヨウ化水素駿を用いて、５，７−ノクロロ及び５，７−ショート類似物に変えることができる。５．７−ジアルキルアダマンタン−２−オン、例えば５．７−ジメチル−アダマンタンー２−オンはキラ（ｌｉｒａ）等のＪ、　Ａｔ　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、、１土１．８２５６　（１９８９）の方法によって合成することができる。上ｊ己モノ置換誘導体への変形ルートに従って、炭酸カリウムの存在下で３−（メトキシ−５，７−ジブロモトリシクロ［３，３゜１、　１３Ｉ７］デク−２−イリデンジメチル）フェノールをエチレングリコール又は１．４−ブタンジオールのようなジオールで加溶媒分解すると、相当する対称ビスヒドロキシアルコキン置換１．２−ジオキセタンが得られる。

水素以外のＸｌ基とは異なる水素以外のＸ基によって得られる共働効果を初層したい場合、特にそのような酵素によって開裂可能な】、２−ジオキセタンを異性体混合物として用いるのか有利である場合、非対称５．　７　（Ｘ、　Ｘ’）アダマンタン−２−オンを上記反応工程４で用いる。５−ブロモ−７−ドリフルオロアダマノタンー２−オンは、ソロチンスキー等のＺｈ、　０ｂｓｈｃｈ、　Ｋｈｉｍ、、１７．２３３９　（１９８１）に記載の方法によって製造しうる。５ −クロロ−７−ヒトロキノアダマンタンー２−オン及び５−メチル−７−ヒトロキシアダマンタンー２−オンについては、ステター等の上記文献に記載されており、そして５−ブロモ−７−ヒトロキシアダマンタンー２−オンは７−メチレンビシクロ［３，３，１］ノナン−３，９−ノネン−９−二チレノアセクールから、ステター等の方法に従って合成することかでき、この方法ではこの化合物を無水エタノールに溶解し、そして溶液を０℃で気体塩化水素の代わりに気体臭化水素を用いて飽和させて、相当するクロロ誘導体を得る。

Ｒ，が低級アルコキシ以外であり、Ｒ２がホスホリルオキシ塩で置換されたフェニル以外である上記式Ｉの化合物の合成のための中間体及び方法については、上記ブロンスティン、ブロンスティン等、エドヮーズ及びエトヮーズ等の（′６７２）出願に記載されている。

上記のように本発明はまた、化学発光性であり、酵素によって開裂可能な置換１．２−ジオキセタンを、試料中の酵素を検出するための分析を含めた当業界で公知のアッセイに用いること、そのようなアッセイに用いるキット、及びそれらの使用方法及び手段に関する。

例えば、本発明を試料中の酵素の検出に用いるとき、試料を、検出する酵素によって開裂可能な基を持っジオキセタンと接触させる。酵素は、ジオキセタンの酵素によって開裂可能な基を開裂して、ジオキセタンに結合した負に荷電した置換基（例えば、酸素アニオン）を形成する。この負に荷電した買換基は次にジオキセタンを不安定化し、ジオキセタンを分解して、光エネルギーを放出する宝器発色団基を形成する。酵素の存在を示すものとして検出されるのは、この発色団基である。発光強度を測定することによって、試料中の酵素の濃度を測定することもできる。

可視的に検出しうる手段を用いて、試料中の特定の物質の存在又は濃度を測定する、上記とは異なる様々な分析法がある。上記のジオキセタンはこれらのどの分析法にも用いることかできる。そのような分析法の例には、抗体又は抗原、例えばδ−又はβ−ｈＣＧを検出する免疫学的アッセイ２酵素アツセイ、例えばカリウム又はナトリウムイオンを検出する、化学アッセイ、例えばウィルス（例えば、ＨＴＬＶ　ＩＩＩもしくはサイトメガロウィルス）、又はバクテリア（例えば、旦工検出物質か抗体、抗原又は核酸であるとき、ジオキセタンの酵素によって開裂可能な基を開裂しつる酵素を、検出物質に対して特異的な親和性を有する物質（すなわち、検出物質に特異的に結合する物質）、例えば抗原、抗体又は核酸プローブ、に結合させるのが好ましい。一般的な方法、例えばカルボジイミドカップリングでは、酵素を特異的に親和性の物質に結合させて用いる。好ましくはアミド結合を通して結合する。

一般に、分析は次のようにして行う。検出物質を含むと思われる試料を、検出物質に対して特異的な親和性を有する物質に結合した酵素を含有する、緩衝剤を加えた溶液と接触させる。得られた溶液をインキュベートして、検出物質を特異的な親和性を有する酵素化合物の特異的な親和性部分に結合する。次に、過剰な、特異的親和性を有する酵素化合物を洗い去り、特異的親和性を有する酵素化合物の酵素部分によって開裂可能な基を有するジオキセタンを加える。酵素は、酵素によって開裂可能な基を開裂して、ジオキセタンを２つのカルボニル化合物（例えば、エステル、ケトン又はアルデヒド）に分解する。酵素によって開裂可能な基か結合した発色団はこれによって励起し、発光する。　発光は（例えばキュベプト、又はカメラルミノメータ−の感光性フィルム、又は光電池又は光電子増倍管を用いて）、試料中の検出物質の存在を示すものとして検出する。発光強度を測定して、物質の濃度を決定する。

具体的な分析例は以下の通りである。

９６穴マイクロタイタープレートにヒツジの抗ヒトＩｇＧ　（Ｆ　（ａｂ）特異フラグメント）を塗布する。次に、ヒトＩｇＧを含む血清試料を穴に加え、室温で１時間インキュベートする。

インキュベーション期間の後、血清試料を穴から取り出し、穴を、０．１５Ｍ− ＮａＣ１，０，０１Ｍ燐酸塩及び０．　１％ウシ血清アルブミンを含有する水性バッファー溶Ｍ（ｐＨ７，４）で４回洗浄する。

抗ヒト■ｇＧに結合したアルカリホスファターゼを各穴に加え、１時間インキュベートする。次に、穴を上記バッファー溶液で４回洗浄し、本発明のホスフェート含有ジオキセタンのバッファー溶液を加える。ジオキセタンの酵素による分解によって得られる発光を、ルミノメータ−１又はカメラルミノメータ−の写真フィルムを用いて検出する。

Ｂ、　ｈＣＧのアッセイウサギの抗−σ−ｈＣＧをナイロン−メツシュ膜上に吸収させる。ｈＣＧを含む試料溶液、例えば妊娠した婦人の尿、を膜を通して吸い取り、その後、膜を０゜１５Ｍ−ＮａＣ１，０，０１Ｍ燐酸塩及びＯ，１％ウシ血清アルブミンを含有するバッファー溶液１社（ｐＨ７，４）で洗浄する。

アルカリホスファターゼ標識抗ｐ−ｈＣＧを膜に加え、膜を再び上記バッファー溶液２厘１で洗浄する。次に、膜をルミノメータ−のキュベツト又はカメラルミノメータ−に入れ、本発明のホスフェート含有ジオキセタンと接触させる。次に、ジオキセタンの酵素による分解から生じる発光を検出する。

Ｃ１血清アルカリホスファターゼのア・セ０．８Ｍの２−メチル−２−アミノプロパツールを含有する水性バッファー溶！２．７ｍｌを１２Ｘ７５ｍｍのパイレックス試験管に入れ、アルカリホスファターゼを含有する血清試料０．　１１Ｉｌを加える。次に、溶液を３０℃の平衡状態にする。

本発明のホスフェート含有ジオキセタン領　２ｍｌを加え、試験管を直ちにルミノメータ−に入れて、生しる発光を記録する。発光レベルはアルカリホスファターゼ活性率に比例する。

サイトメガロウィルスを含むと思われる脳を髄ｆｉ（Ｃ８Ｆ）試料を集め、ナイロン又はニトロセルロース膜のような膜の上に置く。次に、試料を尿素又はグアニジニウムイソチオシアネートで化学処理して、細胞壁を破り、ライスルＤＮＡ以外の全ての細胞成分を分解する。このようにして得たウィルスＤＮＡのストランドを分離し、ニトロセルロースフィルターに結合させる。ウィルスＤＮＡに対して特異的なそしてアルカリホスファターゼで標識したＤＮＡプローブをフィルターに供給し、プローブを相補的ウィルスＤＮＡストランドでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを０．２Ｍ−ＮａＣ１及び０１韻トリス−ＨＣｌを含有する水性バッファー溶液（ｐＨ＝８．１０）で洗浄して、過剰のプローブ分子を除く。本発明のホスフェート含有ジオキセタンを加え、ジオキセタンの酵素による分解から生じる発光をルミノメータ−で測定するか、又は写真フィルムで検出する。

Ｅ、ガラクトシダー七のアッセイ上記のアッセイ及び以下の実施例において、Ｃ−又はβ−ガラクトシダーゼによって開裂可能なａ−Ｄ＝又はβ−Ｄ−ガラクトシド（ガラクトピラノシド）基をそれぞれ含有するジオキセタンを加えてもよく、発色団からの糖部分の酵素による開裂から生じる発光をルミノメータ−で測定するか、又は写真フィルムで検出する。

Ｆ　電気泳動電気泳動は、電界中におけるゲル支持体上のタンパク質と核酸の複合体混合物をそれらの分子の大きさ及び構造に従って分離するものである。この方法はまた、タンパク質の加水分解後のタンパク質フラグメントの、あるいは制限エンドヌクレアーゼによる切断後の核酸フラグメントの分離（Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定におけるような）にも用いられる。ゲル中の成分の電気泳動分解の後、又は分離成分のゲルから膜への移動の後、結合を、リガンドに結合した酵素で調へる。例えば、ペプチドフラグメントは、アルカリホスファターゼに共有結合した抗体で調べる。

別の例の場合、ＤＮＡ配列決定において、アルカリホスファターゼ／アビジンをビオチニル化ヌクレオチド塩基に結合する。その後、本発明のＡＭＰＰＤ類偏物をゲル又は膜フィルターに加える。短時間インキュベートした後、ジオキセタンか酵素によって活性化されて発光成分か形成された結果、発光か生じる。発光をＸ線又はインスタント写真フィルムで検出するか、又はルミノメータ−で調へる。同時に２つ以上のフラグメントを調へる多重アッセイを用いると、さらに改良される。

Ｇ、　固体状態のア、・セイ固体状態のアッセイでは、非特異的結合部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はセラチンのような非特異的タンパク質で予備処理することによって、マトリックスへの非特異的結合をブロックすることか好ましい。ＢＳＡの市販製剤には、ＡＭＰＰＤから好ましくないハックグラウンド化学発光を生じるホスファターゼ活を示す少量の物質を含むものかあることを見いだした。しかしなから、特定の水溶性合成高分子物質かジオキセタンを用いる固体状態のアッセイにおける非特異的結合の十分なプロ１カーであることも見いだした。そのような物質の中で好ましいのは、水溶性重合体四級アンモニウム塩、例えばＢＤＭＱ、ポリ（ビニルへジンルトリメチルアノモニウムクロリド）　（ＴＭＱ）及びポリ　（ビニルヘンシルトリブチルアンモニウムクロリド）　（ＴＢＱ）である。他のそのような物質については、前記ポイタ等の′　２６３出願に記載があり、以下の表■に挙げる。

Ｈｌ　ヌクレオチダーゼのアッセイ酵素ＡＴＰアーセのアッセイを２工程で行う。第１工程では、酵素を最適なｐＨ（一般にｐＨ７，４）で、末端ホスホエステル結合を経て発色団か置換した１゜２−ジオキセタンに共有結合したＡＴＰよりなる物質と反応させて、ホスホリル −発色団置換１．２−ジオキセタンを得る。第２工程では、第１工程の生成物を酸を加えてｐＨを６未満、好ましくは２−４にすることによって分解し、生じる光をルミノメータ−で１１定するか、又はクロマトグラフフィルムで検出する。

同様な２工程法で、ＡＤＰアーセのアッセイを、基質として本発明の発色団で置換された１、２−ジオキセタンのＡＤＰ誘導体を用いて行い、そして５′−ヌクレオチダーゼのアッセイを、基質として本発明の発色団で置換された１、２−ジオキセタンのアデニル酸誘導体を用いて行う。第２工程はまた、酵素アルカリホスファターゼを加えて、ホスホリル−発色団で置換された１、２−ジオキセタンを分解することによって行うことかできる。

■　核酸配列決定、配列決定法で製造したＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントは、本発明の化学発光性１．２−ジオキセタンを用いて電気泳動分離を行った後、検出することかできる。

ＤＮＡ配列決定はジデオキシ連鎖停止反応［サノガー、Ｆ０等、Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７４　：　５４６３　（１９７７）］によって行うことかできる。

簡単に言えば、４つの配列決定反応のそれぞれの場合、−重鎖鋳型ＤＮＡをシデオキシヌクレオチド及びビオチニル化プライマーストランドＤ　Ｎ　Ａと混合する。

アニールの後、フレノウ酵素及びデオキシアデノシントリホスフェートを４つの配列決定反応混合物それぞれでインキュベートし、追跡デオキシヌクレオチドトリホスフェートを加え、インキュベートを続ける。

その後、反応混合物中のＤＮＡフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離する。フラグメントを膜、好ましくはナイロン膜に移し、そして好ましくは短波長の、ＵＶ光を照射することによってフラグメントを膜に架橋させる。

非特異的結合部位を重合体、例えばヘパリン、カセイン又は血清アルブミンでブロックした後、膜上のＤＮＡフラグメントを、用いる本発明の個々の１．２−ンオキセタン基實の酵素によって開裂可能な基に特異的な酵素に共有結合した、アビジン又はストレプトアビジンと接触させる。アビジン又はストレプトアビジンはビオチンに禽欲に結合するので、ビオチニル化ＤＮＡフラグメントは酵素に付加する。例えば、化学発光性基質が３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’−クロロ）トリシクロ［３，３，１，１３−７］デカン］４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムジオキセタン塩（ＣＩ−ＡＭＰＰＤ）であるとき、アビジン又はストレプトアビジンはホスファターゼと結合する。

同様に、化学発光性基質か二ナトリウム　３−（４−メトキンスピロＵ１，２− ジオキセタン−３，２’　−（５’−クロロ）トリシクロ［３，３，１，１３− ７コデカン」　４−イル）フェニル　β−Ｄ−ガラクトビラノーズ（ＣＩ−ＡＭＰＧＤ）であるとき、アビジン又はストレプトアビジンはガラクトシダー七と結合する。

ＤＮＡフラグメント−ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）−酵素の複合体を適当な１，２−ジオキセタンと、アルカリ性のｐＨ値、例えば約ｐＨ８，５で接触させることによって発光させた後、ＤＮＡフラグメントを感光性フィルム、例えばＸ線又はインスタントフィルム上に、あるいは光電ルミノメータ− 装置で可視化する。

することもできる。化学的に開裂し、電気泳動で分離したＤＮＡ　［マキサム、ＡＭ０等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、７４　：　５６０　（１９７７）］を膜、好ましくはナイロン摸に移し、ラダーをＵＶ光で膜に架橋した後、特異的ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのビオチニル化オリゴヌクレオチド、本発明の酵素によって開裂可能な化学発光性１．２−ジオキセタンに対して特異的な酵素に共有結合したアビジン又はストレプトアビジン、及び適当な１．２−ジオキセタンをｊｏ！次加えることによって検出する。（ＰＡＧＥによって製造された）配列ラダーのイメージは上記のようにして得られる。

配列ラダーの連続的リブロービング（ｒｅｐｒｏｂｉｏｇ）は、まず、膜を洗浄剤の加熱溶液、例えば約０５−約５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を約８０−約９０℃の水に加えたもの、と接触させることによって膜からハイブリダイゼーションプローブ及び化学発光性物質をまずストリップし、約５〇−約７０℃ に冷却し、裸のＤＮＡフラグメントを別のビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブでハイ゛ブリダイセーノジンして、異なる配列を得、次に上記のようなイメージ化学発光を生じさせることによって行うことかできる。

同様な検出法を、ＲＮＡ配列決定法によって生じるＲＮＡフラグメントに適用することかできる。

当業者か本発明をさらに詳しく理解できるように、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明のために示したにすぎず、請求の範囲に記載かなければ、本発明を曜定するものではない。ＴＬＣｉ＠媒混合物か容量／容量である以外は、部及びパーセントの全ては断りかなければ重量／容量である。

エノールエーテル中間体についてのこれらの実施例の’ＨＮＭＲデータにおいて、ダッシュ記号（′）は芳香族プロトンを示し、一方、ダッシュの付いていない数字はいづれの場合においても、置換アダマント−２′−イリデン環の位置を示す。すなわち、２００ｇ　（１，６４Ｉｌｏｌ）の３−ヒドロキシベンズアルデヒド及び２７０ｍ１（１゜９３ａ＋ｏｌ）のトリエチルアミンを、水浴中の、塩化メチレン１リツターを含有するフラスコに入れた。得られた褐色の溶液を機械撹拌し、２１２ｍｌ　（１，７２ｍｏＬ）の塩化トリメチルアセチルを１５分間にわたって滴下漏斗から細流状に加えた。

得られたスラリーをさらに１５分間撹拌し、水浴を除き、反応をさらに２時間進めた。ＴＬＣ（Ｋ５Ｆ　１２５％アセトン−ヘキサン）から、出発物質及び単一の高Ｒ７生成物は存在しないことが分かった。反応混合物を分離漏斗に移し、２５０１１１１の１Ｍ塩酸と混合した。次に、有機相を水（２ｘ　４００ＩＩｌ）で抽出し、最後に硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥溶液をシリカゲルプラグに通し、回転蒸発させ、次いで真空下（１、Ｏｍｄｇ）でポンプしたところ、３４８ｇの緑色がかった褐色の油　３−ピバロイルオキシベンズアルデヒドが得られた。これをアルゴン雰囲気下に！いた。

実施例■ ２５１１のメタノールに溶解したｐ−トルエンスルホン酸４００Ｉ１ｇヲ撹拌しながら、実施例■の３−ピバロイルオキシベンズアルデヒドに加えた。次に、トリメチルオルトフォーメート（２２４ｍｌ；２．０５モル）を滴加した。発熱か少しあるがそのまま進め、混合物を１時間撹拌した。１ｌ２ｇの炭酸水素ナトリウムを加え、フラスコを回転蒸発器（浴温４０℃）に入れて、揮発性成分を全て除いた。

得られた油を窒素圧の下で短いシリカケルカラムに通して、オレンジー褐色油を得、これを撹拌しなから真空下（１、Ｏｍｍｍｍ１ｌで吸引したところ４２６ｇのｆｆ１３−ピバロイルオキシヘノズアルデヒドシメチルアセタールか得られた。赤外アッセイではアルデヒドカルボニルの吸収（１６９５ｃｍ−’）は見られなかった。

実施例■ 実施例■のｆｆ１３−ビバロイルオキシヘンズアルデヒドシメチルアセタールを、３リンターのフラスコ中で、アルゴン雰囲気下、Ｐ２Ｏ５から新しく蒸留した１リツターの塩化メチレノに溶解した。次に、３４７ｍｌ　（２，０３ｍｏｌ）のトリエチルホスファイトを全部一度に加えた。フラスコに渡体入りロアダブターを取り付け、少しのアルゴン圧の下でドライアイス／アセトン浴中で冷却した。三弗化硼素エーテル錯化合物（２４９ｍｌ　；　２．　０３ｉｏ１）を、激しく撹拌しながら、注射器で数回に分けて加えた。得られた反応混合物を一５５℃ で２時間撹拌し、次いで一２０℃にて一晩フリーザーに貯蔵した。

次に、フラスコを室温に温め、その内容物を４時間撹拌した。このオレンジ−褐色溶液を、８００耐の水に１７０ｇの炭酸水素ナトリウムを含む激しく撹拌したスラリーに、激しく泡立つことがないような速度で、注意深く注いだ。２相混合物を１時間激しく撹拌した後、分液漏斗で層を分離し、水性層を再び塩化メチレン（２Ｘ　２５０ｍ１）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、′ａ縮し、真空蒸留して、５３５ｇのジエチル　１−メトキシ−１−（３ −ビハロイルオキシフェニル）メタンホスフェートを透明で淡黄色の油（０，２５ｍ＋５１１ｇで沸点１５８−４６１℃）を得た。これは実施例Ｉ−■の全工程に対して９１％の収率であった。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ　：ＣＤＣ１ｄ　δ　１，２１及び１．　２５　（６Ｃ旦２ＣＨ３）　；　４．４６　（ＬＨ，ｄ、　１５．６Ｈｚ、　ＡｒＣ旦ＰＯ）　：６．５ｓ（ＬＨ，ｍ）　；７．　００　（２Ｈ，ｍ）　；７．　２６　（ＬＨ，ｍ）。

ｒＲ，（ニート）：２９７４．１５９６．１５８２．Ｌ４８０．１２５５　（Ｐ −０）、１０９８．１０５０．１０２０．９６５ｃｍ−’。

実施例■ ７５ｍ１のテトラヒドロフランにノイソプロピルアミン（１１，６ａ＋１．８２８ｍｍｏｌ）を含む溶液をドライアイス／アセトン浴中、アルゴン雰囲気下で一７８℃に冷却した。ｎ−ブチルリチウムを含むヘキサン（アルドリッチ、７５．　Ｏｍｍｏｌ）の２．５Ｍ溶液３０ｉ１を注射器で加え、得られたりチウムンイソプロピルアミド溶液を２０分間撹拌した後、２５耐のテトラヒドロフランに１３．　４．７ｇ　（３７６ｍ＋＊ｏｌ）のジエチル　１−メトキシ−１−（３− ビバロイルオキシフェニル）メタンホスホネートを加えたものを、５分間にわたって滴下漏斗から滴加した。得られた赤色溶液を低温でさらに３０分間撹拌して、ホスホネートカルバニオンの形成を確実に完了させた。

次に、２５ｍ１のテトラヒドロフランに４．　９９ｇ　（３０，１ｍｍｏｌ）を含む溶液を４加した。得られた少し曇った混合物を５分間−７８℃で撹拌し、次いで、４０分かけて徐々に室温に温めた。オレンジ色となった溶液を９０分間還流し、冷却し、２００耐の飽和炭酸水素ナトリウム溶液で希釈し、酢酸エチル（３Ｘ　７５＠１）で抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩化すｈｌＪｌニウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで素早く乾燥し、濃縮して、フェノール系エノールエーテルとそのピバロエートエステルとの混合物であるオレンジ色のガムを１２．４９ｇ得た。

’ＨＮＭＲ（ビバロエートエステル、４００　ＭＨｚＳＣＤＣｌ！中）　δ７、　３３　（ＬＨ，ｍ、　Ｈ−５’　）　、７．　Ｌ２　（ＩＨ，ｄ、Ｉ＝７．　７Ｈｚ、　ＡｒＨ）、６．　９５−７．　０２　（２Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、３．　４３　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ。

Ｈ−１）、３．２８　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．７９　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ −３）、２．　２３　（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）、１．　５９−１．８７　（ＩＩＨ，ｒｎ）　。

１、　３４　（９Ｈ，ｓ、ＣＯＣ（ＣＨり　ｓ）。

１７４２　（エステル　Ｃ＝Ｏ）、１６６５．１６０２．１５７８．１４．２６．１２７４．１１５２．１１１８．９１８ｃｍ−’０この混合物を１００■１のメタノールに溶解し、１０．７ｇの無水炭酸カリウムの存在下、３．５時間還流した。次に、メタノールをストリップして除き、残留物を水と酢酸エチルの間で分配した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、回転蒸発した。得られた残留物をクロロホルム／石油エーテルから再結晶すると、６．５ｇの３−（メトキシ−５−ヒドロキシトリシクロ［３，３，１，１’・７］デク−２−イリデンメチル）フェノールか灰色かかった白色の固体（融点１７１−１７２°Ｃ）として得られた。さらに０．８０ｇが母液から得られ、フェノール系エノールエーテルの全体収率は、５−ヒドロキシアダマンクン−２−オンに基づいて、７９％であった。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｉｓ中）　：　６　７．　１８　（ＬＨ，ｄｄ。

Ｊ＝８．　４．、　７．　７Ｈｚ、Ｈ−５′）、　６．　７５−６．　８８　（３Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、６．３６　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ａｒ０Ｈ）、３．４１（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）、　３．２８　（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）、　２．７９　（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−３）。

２、　２２　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）　、１．　５６−１．　９８　（ＩＩＨ，ｍ）。

昼（ＣＨＣ１３中）：　３５８６．３３２０　（ＯＨ）　、３０００．２９２０゜２８４４．１６６５．１５９０．１５７８．１４４５．１２９６．１０９２．８８５ｃｍ−’。

ＨＲＭＳ　ＣＩＩＩＨ２２０３（Ｍ−）に対する理論値２８６．１５７３、実験値２８アルゴンの下で製造した、３５ｉＬのテトラヒドロフランに５．　０４ｇ　（１７゜６　ｍｍｏｌ）の３−（メトキン−５−ヒドロキシトリシフＯ［３，３，１，１３−７］デク−２−イリデンメチノリフェノールを含む溶液を、３．４耐（２４，６１１１ｍｏｌ）のトリエチルアミンに加え、次に、水浴中で０℃ に冷却した。２−クロロ−２＝オキソ−１，３，２−ンオ牛すホスホラ：／　（１，９５ｍ１．２１．　１１ｕｌｏＬ）を撹拌しながら滴加した。５分後、水浴を取り除き、４５分間、室温で撹拌し続けた。

反応混合物を３０耐の無水ジエチルエーテルで希釈し、アルゴンの下で濾過して水分を除いた。次いで、トリエチルアミン塩酸塩をさらに２０ｍ１のジエチルエーテルで洗浄し、濾液を回転蒸発器で濃縮して、ホスフェートトリエステルを粘性で淡オレンジ色の油として得た。

アルゴンの下で３０ｉ１の分子並／乾燥ジメチルホルムアミドに溶解したトリエステルを、１．　０２ｇ　（２０，８＋ｍｏＬ）の乾燥シアン化ナトリウムと、撹拌しながら全部を一度に加えて、３．５時間室温で反応させた。次に、５０℃ に加熱しなから、溶媒を真空（１，Ｏｌｌｉｎｇ）下で除去した。得られたオレンシー褐色の残留物の試料を、水に溶解し、逆相アッセイクロマトグラフィー［０，１％炭酸水素ナトリウム（水）−アセトニトリル勾配コをＰＬＲＰポリスチレンカラム（ポリマー・ラボラトリーズ）行ったところ、中間体シアンエチルホスフェートジエステルナトリウム塩への反応か完了したことが分かった。

次いで、残留物を３５耐のメタノールに溶解し、３０分間室温で、撹拌しながら、メタノールにナトリウムメトキシド（２１，２１１Ｉｌｏｌ）を含む４．３７Ｍ溶液４．８５ｍ１を滴加して処理した。逆相アッセイＨＰＬＣから、ホスフェートモノエステルへのβ−離脱が完了したことが分かった。溶媒を除き、残留物を１０％水／アセトン中で粉砕したところ、ガム状の固体が得られた。さらに３％氷水／アセトン中粉砕したところ、硬くて灰色がかった白色固体が得られた。

これを濾過し、真空（１，０−聯下乾燥して、無機塩の混ざった８　３５ｇの粗３−（メトキシ−５−ヒドロキシトリシクロ［３，３，Ｌ　Ｌ’ｌ’］デク−２ −イリデンメチル）フェニル燐酸二ナトリウムを得た。

ＰＬＲＰポリスチレンカラム（ポリマー・ラボラトリーズ）上で水／アセトニトリル勾配を用いる逆相分取ＨＰＬＣ及び適当な苗分の凍結乾燥を行って、５゜２ｇ（７２％）の精製化合物を、白色で顆粒状固体として得た。これは１２０℃で軟化し、１６３−１６８℃で溶融物して淡褐色のゴム状物質となった。　ＩＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２０中）　６７．　１６　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．　３゜７、　４．Ｈｚ、　Ｈ−５’　）　、７．　０５　（ＬＨ，ｄ、Ｊ−８゜３Ｈｚ、ＡｒＨ）、６゜９３　（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−２’　）、６．　８６　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝７．　４Ｈｚ、　ＡｒＨ）、３．２　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、３．１７　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）。

２．６１　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−３）、２．０６　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）。

Ｌ　４２−１．７３　（ＬＯＨ，ｍ）。

元素分析から、燐酸塩は二本塩として存在することが分かった。　Ｃ，、Ｈ，。

Ｎ　ａ　２０６　Ｐ　・２　Ｈ２Ｏに対する理論値　Ｃ４８，４４、Ｈ５６５、Ｐ６９４゜実験値　Ｃ４８，３７、Ｈ５，９０、Ｐ　６８７゜実施例■ ５．３５Ｘ１０−５Ｍメチレンブルー増感染料を含有する９６ｍ１の２５％無水メタノール／クロロホルムに０８ｇの３−（メトキン−５−ヒドロキシドリンクロ［３，３，１，１３・７コデクー２−イリデンメチル）フェニル燐酸二ナトリウムを含む溶液を、３本のガラス管の中に分けた。次に、径管を水浴中で５℃に冷却し、溶液に酸素ガス流を通過させることによって酸素で飽相した。５分後、酸素を溶液に通して泡立て続け、温度を５℃に保ちながら、冷却した２５０ワツト高圧ナトリウム蒸気ランプから管に光を照射した。厚さ５ミルのカプトン（Ｉａｐｔｏｎ）ポリイミドフィルム片（デュポン）をナトリウム蒸気ランプと管との間に！き、好ましくないＵＶ輻射線をカットした。照射して２０分後、溶液はピンク色になった。ＰＬＲＰポリスチレンカラム（ポリマー・ラボラトリーズ）上での逆相アッセイＨＰＬＣ［０，１％炭酸水素ナトリウム（水）−アセトニトリル勾配コで、２つの生成物ビークか示された　広がった初期溶離ビーク（保持時間３．７９分）及びンヤーブな後期溶離ビーク（保持時間５７７分）。初期溶離生成物（Ａ）対後期溶な生成物（Ｂ）の比率は径管の溶液において１．３：１であった。　溶液を一緒にし、溶媒を真空（２５，ＯｍＪｇ）下、水浴上で除去した。次に、残留物を７０＋＊１の水に溶解し、領　４５Ｂのナイロン膜で濾過した。逆相分取ＨＰＬＣ（水−アセトニトリル勾配）により２つの生成物を簡単に分離した。

適当な分取ＨＰＬＣ留分を一緒にし、次いでアッセイＨＰＬＣを行ったところ、これらは同種のものであることが分かった。凍結乾燥によって、０．３２ｇの生成物（ａ）及び０．２６ｇの別の生成物（Ａ）が得られた。これらは’ＨＮＭＲにより、異性体（シン及びアンチ）１．２−シオキセタスすなわちシン−３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’　−ヒドロキシ）トリシクロ［３，３，１，１’＝７］デカンコー４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。

及びそのアンチ−異性体［アンチ−３−（４−メトキシスピロ−１１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’−ヒドロキシ）トリシクロ［３゜３．　１．　１ｓ）７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム］であることが分かった。

これらの各異性体は、水性バブファー媒体中、ｐＨ１０にてアルカリホスファターゼで開裂を行うと、独特の光射時間及びノイズ分布を有する化学発光を生じた。

’ＨＮＭＲ（Ａ異性体、４００　ＭＨｚ、ＤｚＯ中）−６６，９８−７，６（４Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、３．１１　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．９７　（ＬＨ，ｂｒ。

ｓ、Ｈ−１）、２．３４　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−３）、１．　７９　（１）ｆ、ｂｒ。

ｓ、Ｈ−７）、１゜３−１．　６８　（８Ｈ，ｍ）、１．　０１　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１３゜５Ｈｚ）、領８　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１３　Ｈｚ）。

ＩＨイ　ＮＭＲ（Ｂｉ！性体、４００　ＭＨｚＳＤ２０中）　：ｊ　６．　９４ −７．　６２　（４Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）　、３．　０９　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）　、２．　９１　（ＩＨ，ｂ、ｒ、ｓ、Ｈ−４）、２．２７（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ −３）、１．８４（１，Ｈ，ｂｒ、　ｓ、　Ｉイー　７）、　１．　２１−１．　７５　（８Ｈ，ｒｎ）、　１．　０２　（ＬＨ，ｄ、　Ｊ＝１．２．８　Ｈｚ）、０４８７　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１２．８　Ｈｚ）。

元素分析から、異性体Ｂは二本塩として存在することか分かった。Ｃ＋ｇＨｚ＋ＮａｚｏｇＰ　・２Ｈ２０（異性体Ｂ）に対する理論値　Ｃ４５２、Ｈ５２７、Ｐ　６４７゜実験値　Ｃ４５，５３、Ｈ５，３５、Ｐ６．１１゜得られた２種の異性体のどちらかシン−異性体で、どちらがアンチ−異性体であるか’ＨＮＭＲデータに基づいて特定することはできなかった。

実施例ｖｎ上記実施例■の手１■に大体従って、３５ｍ１のテトラヒドロフランに５．３５ｉ１（３８，２ｍｏＬ）のジイソプロピルアミンを含む溶液を、アルゴン雰囲気下、水浴中で一７８℃に冷却した。ヘキサン（３５、０＠ｍｏ１．．）にｎ−ブチルリチウムを含む２．５Ｈ溶Ｍ１４ｍｌを注射器で加え、２０分間撹拌した後、１０．　８６ｇ　（３０、３ｍｍｏｌ）の１−メトキン−１−（３−ビバロイルオキシフエニノリメタン燐酸ジエチルを含む３０耐のテトラヒドロフランを、１０分間にわたって滴加した。

得られたオレンジ色の溶液を低温で１時間撹拌し、次に、撹拌しなから、７分間にわたって２０ｍ１のテトラヒドロフランに５．２１ｇ　（２２，７５報０１）の５＝ブロモアダマンクン−２−オンを含む溶液と混合した。撹拌をさらに１０分間続け、この後冷浴を除き、反応混合物を１時間にわたって徐々に室温に温めた。

次いで、溶液をさらに１時間還流し、冷却し、１００ｍ１のヘキサンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を含有する分液漏斗に注ぎ入れ、ヘキサン中の１０％酢酸エチル（３Ｘ　５０ｍ１）で抽出した。合わせた有機抽比物を１５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで素早く乾燥し、濃縮したところ、１１．６２ｇの淡いオレンジ色の粘性油か得られた。ｎ−へキサン中の１０％酢酸エチルで溶離する短いシリカゲルカラム上でのプラグ濾過を行い、黄色がかった緑色のゴムを得た。

ＩＨＮＭＲ（ピバロイルエステル、４００　ＭＨｚ、　ＤｌｚＯ中）　６７．３４　（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝７．　８　Ｈｚ、　Ｈ−５’　）、７．　１　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝７．　７Ｈｚ、ＡｒＨ）、６．９５−７．０２　（２Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、３．３９　（ＬＨ。

ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−１）、　３．２８　（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）、　２．７４　（Ｈ（、ｂｒ。

ｓ、Ｈ−３）　、２．　３２−２．　５１　（６Ｈ，ｍ、Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ− ９）　、２゜１７　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）　、１．　６７−１．　９２　（４Ｈ，ｍ、Ｈ−８，Ｈｌｏ）、１．３４　（９Ｈ，ｓ、ＣＯＣ（ＣＨりり。

ＩＲ（ニート）：２９２４．２８５０．１７４５　（エステル　Ｃ−０）、１６５４．１６０２．１５７８．１４７８．１２７４．１１１０．１０１８．８０８゜７５８ｃｍ”。

このゴムを３０ａ＋１のメタノールに取り、２．４ｇの無水炭酸カリウムと共に２時間還流した。次に、メタノールを除去し、残留物を水とへキサン中の３０％酢酸エチルとの間で分配した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮したところ、９．３２ｇの黄色ゴムが得られた。このゴムをシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーを行ったところ、７．０６ｇ（５−ブロモアダマンクン−２−オンに基づく収率が８８％〕の少し黄色がかったゴムが得られ、これは結晶化しなかった。しかしながら、ＩＲ及びＮＭＲから、得られた化合物である３−（メトキシ−５−ブロモトリシクロ［３，３，１，１３、′］デクー２−イリデンメチノリフェノールは、この後の燐酸化反応を確実に行うのに十分に純粋であった。

純粋なフェノール系化合物の試料は、以下のように３−（メトキシ−５−ブロモトリシクロ［３，３，Ｌ　Ｌ’・７］デク−２−イリデンメチノリフェニルアセテートから得られた　純粋でないフェノール化合物（５，５７ｇ　：１５．　９５０１１１０１）を、アルゴン雰囲気下で分子篩−乾燥したピリジン３０１１に溶解した。５０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを触媒として加えた。次に、１．　８ｍｌ　（１９，１５＋ｕ＋ｏｌ）の無水酢酸を注射器で加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。

次に、反応混合物を、２５０ｍ１の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を含有する分液漏斗に移し、ヘキサン中の１０％酢酸エチル（２Ｘ　Ｌ　ＯＯ＋＋＋１）で抽出した。合わせた抽出物を水で数回洗浄し、次いで流駿ナトリウムで素早く乾燥した。乾燥溶液を回転蒸発器で濃縮し、残留物を数滴の酢酸エチルを含むｎ−ヘキサノから再結晶した。このようにして得た灰色かかった白色固体を再び再結晶したところ、５゜２１ｇ（収率８３．５％）のアセテート（融点１０８（１０’ Ｃ’）か得られた。

Ｃ７ｏＨｚｓＢｒＯｓ　（Ｍ”）に対するＨＲＭＳ理論値　３９０．０８３３、実験値３９０．０８３１゜ ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌｓ中）　：Ｊ　７．　３５　（ＬＨ，ｄｄ。

Ｊ−８，７，７Ｈｚ、Ｈ−５’　）、７．１３　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝７．７．１Ｈｚ、ＡｒＨ）、７．０３　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．ＬＨｚ、ＡｒＨ）、６．９９　（ＩＨ。

ｄ、ＩＨｚ、Ｈ−２’　）、３．　３９　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）、３．　２７　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．　７５　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−３）、２．　３２−２．　５１（６Ｈ，ｍ、Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ−９）、２．２９　（３Ｈ，ｓ、０Ａｃ）、２１８　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）１．６９−１．．９２　（４Ｈ，ｍ、Ｈ−８，Ｈ−１０）。

ＩＲ（ＣＨＣＩ３）：　３０００．２９３０．２８５０．１７６０　（エステルＣＯ）、１６６０．１６０２．１５７７．１３６８．１１９２１．１０９５．１０７０．１０１６．８０４ｃｍ−’。

再結晶したアセテートを、炭酸カリウムを含むメタノールで１５時間室温で処理したところ、３−（メトキシ−５−プロモトリンクロ［３，３，１，１！・７］チク−２−イリデンメチル）フェノール（融点４２−４５℃）が白色で脆いフオームが得られ、これをさらに再結晶することはできなかった。

’ＨＮＭＲ，（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＩｊ中）　６７．　２１　（ＩＨ，ｔ、Ｊ −７，２Ｈｚ、Ｈ−５’　）、６．　７３−６．　８５　（３Ｈ，ｍ、　ＡｒＨ）　、５．　１８　（ＬＨ，ｓ、　ＡｒＨ）、　３．３８　（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−１）、　３．２８　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．　７４　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−３）、２．　３２−２．　５２（６Ｈ，ｍ、　Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ− ９）　、　２．１７　（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−７）　。

１．６８−１．９２　（４Ｈ，ｍ、Ｈ−８，Ｈ−１０）。

ＩＲ（ＣＨＣ！３）：３５８４．３３２０　（ＯＨ）、２９２５．２８５０．１６６５．１５８８．１５７８．１４４５．１４３５．１０９２．１０８０．１０１５．８８０．８０８ｃｒ’。

実施例ｖｍ再び上記実施例■の手順にほぼ従って、２１耐のテトラヒドロフランに２．９７ｍ１　（２１，３＋ｍｏｌ）を含む溶液を、アルゴン雰囲気下、ドライアイス− アセトン洛中で一７８℃に冷却し、ヘキサン（２１，３ｍ１ｏｌ）にｎ−ブチルリチウムを含む２．５Ｈ溶Ｍ８．　５Ｉｌｌと混合し、注射器で滴加し、そして２０分間撹拌した。

次に、１−メトキシ−１−（３−ピバロイルオキシフェニル）メタン燐酸ジエチル（７，２６ｊＺ　；　２０．　３ｍｍｏｌ）を含む２０ｍ１のテトラヒドロフランを１０分間にわたって注射器で加え、溶液を低温で１時間撹拌した。

１５ａ＋１のテトラヒドロフランに２．　７９ｇ　（１５，２ｍ＋ｍｏｌ）の５〜クロロアダマンクン−２オンを含む溶液を５分間にわたって加え、低温で１０分間撹拌した後、冷浴を除き、混合物を室温に温めた。次に、混合物を１．５時間還流し、冷却し、５０ｍ１のｎ−ヘキサンで希釈し、そして１５０ｍ１の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を含有する分液漏斗に注ぎ入れた。５％酢績エチル／ｎ−ヘキサンで抽出し、次いで合わせた有機留分を乾燥し、濃縮し、そしてこれらを真空（１０Ｂａｕｇ）にし、残留物を得た。これをシリカゲル上でクロマトグラフィーしたところ、５．１５ｇの高Ｒ７の３−（メトキシ−５−クロロトリシクロＥ３．　３．　１゜３３・７］デク−２−イリデンメチノリフェニルトリメチルアセテートを、無色の油（構造はｒＲ及びＮＭＲで確認した〕として得た。後に溶離した物質０．８６５ｇは、過半量が相当するフェノールであった。この後者の留分を塩化ピバロイル及びトリエチルアミンを含む塩化メチレンで再びアシル化しく上記実施例■を参照）、次いでクロマトグラフィーを行ったところ、さらに０．３５ｇのビバロイルエステル（５−クロロアダマンクン−２−オンに基づく全体収率９３％）が得’ＨＮＭＲ（ピバロイルエステル、４００　ＭＨｚＳＣＤＣ１３中）　δ　７３６　（ＬＨ，ｔ、Ｊ＝７．　８Ｈｚ、　Ｈ−５’ 　）、？、１３　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝７゜７Ｈｚ、　ＡｒＨ）　、６．　９８−７．　０４　（２Ｈ，ｍ、　Ａ、ｒＨ）　、３．　４５　（ＬＨ。

ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−１）、　３．３（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、　２．８（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ。

Ｈ−３）　、２．　１３−２．　３２　（７Ｈ，ｍ、　Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ−７，Ｈ−９）　。

１、　６５−１．　９　（４Ｈ，ｍ、Ｈ−８，Ｈ−１０）　、１．　３６　（９Ｈ，ｓ、Ｃ０Ｃ（ＣＨ３）　り。

ＩＲに−ト）：２９３２．２８３５．１７５０　（ｓ−ステル　Ｃ＝Ｏ）、１６６４．１６０２．１５７８．１４７８．１２７４．１１１２．１０２２．８２７゜７５８ｃｍ”。

一緒にしたピバロイルエステル留分（５，５ｇ、　１４．　１ｍｍｏｌ）を４０ｙ１１のメタノールに取り、５．３７ｇの無水炭酸カリウムと共に４０分間還流した。メタノールをストリップした後の残留物を、水と３０％酢酸エチル／ヘキサンとの間で分配し、有機留分を′ａｍし、短いシリカゲルカラム上でプラグ濾過したところ、４．０７ｇ（５−クロロアダマンクン−２−オンに基づく収率８８％）の３−メトキシ−５−クロロトリシクロ［３，３，１，１”）’］デクー２−イリデンメチル）フェノールか脆い白色フオームとして得られた。これを空気にさらすと少し粘着性となった。

Ｃｌ８Ｈ２１ＣＩＣ）ｚ　（Ｍ”）　に対するＨＲＭＳ理論値　３０４．１２２７、実験値３０４．１２３０゜ ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＩｓ中）　６７．　２３　（ＩＨ，ｄｄ。

Ｊ＝７．　７．　７．　６　Ｈｚ、Ｈ−５’　）、６．　８２　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝７．　６　Ｈｚ、ＡｒＨ）、６．　７７−６、　８３　（２Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、３．　４４　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）、３．　３１　（３Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．　８　（ＩＨ，ｂｒ、ｓ。

Ｈ−３）、２．１−２．３１　（７Ｈ，ｍ、Ｈ−４，Ｈ−６，Ｈ−９，Ｈ−９）。

１、　６５−１　８９　（４Ｈ，ｍ、Ｈ−８，Ｈ−１０）。

ＩＲ（ＣＨＣＬｓ中）：３５９０．３３３０　（ＯＨ）、２９３０，２８５５゜１６５５．１５９０．１５８０，１４４０．１２９５．１０９４．１０８０．１０２２．８８０．８２６ｃｍ−’。

実施例■ ３−（メトキシ−５−ブロモトリシクロ［３，３，１１”Ｊ］デク−２−イリデンメチル）フェノール（１，４９ｇ、　４．　２６ｍｍｏｌ）を８．　５ｍｌの無水エチレングリコールに溶解し、０．２８ｇの炭酸カリウムと共に密封ガラス管に入れた。

管を１１０℃の油浴中で７時間加熱した。次に、管の内容物を加熱しながら真空中（Ｌ、ＯｍｍＨｇ）で濃縮した。残留物を飽和塩化ナトリウム溶液と酢酸エチルとの間で分配した。次に、有機留分を抜き取り、短いシリカゲルカラムでクロマトグラフィーを行って１．３１ｇ（フェノール出発物質に基づく収率９２％）の３−（メトキシ−５−（２−ヒドロキシ）エトキシトリシクロ［３，３，Ｌ　Ｌ’−７］デク−２−イリデンメチル）フェノールを灰色がかった白色フオームとして得た。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、、ＣＤＣＬｓ中）、６７．　１９　（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝７．　６Ｈｚ、　Ｈ−５’　）、６．　８３　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝７．　６Ｈｚ、　ＡｒＨ）。

６、　７３−６．　８０　（２Ｈ，ｍ、　ＡｒＨ）、５．　８３　（ＬＨ，ｓ、　ＡｒＨ）、３゜Ｈ，ｓ、ＯＭｅ）、２．８１（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−３）、２．２４（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−７）　、　１．５５−１．９０　（ＩＯＨ，ｍ）。

Ｉ　Ｒ（ＣＨＣ１１中）：３５８０．３３２０　（ＯＨ）、２９２９．２８４２゜１６６４．１５８６．１５７５．１４４０．１０９２．１０７８．８８５ｃｍ −’。

実施例Ｘ３−（メトキシ−５−クロロトリシクロ［３，３，１，１’１７］デク−２−イリデンメチル）フェノール（１，２３ｇ、　４．、Ｏ＋＊ｍｏｌ）を、メタノール中のアンモニアをβ−説離に用いた他は、上記実施例Ｖの方法で燐酸化した。

得られた粗アンモニウムナトリウム塩をアセトン中で粉砕し、次いで真空（１，０ｍａＨｇ）下で吸引したところ、１．２ｇの灰色かかった白色固体が得られた。逆相分析ＨＰＬＣから、このようにして得た燐酸化エノールエーテル生成物は、相当する１、２−ジオキセタンへの直接光酸素化に十分に純粋であった。

３−（メトキシ−５−クロロトリシクロ［３，３，１，１３−’］デクー２−イリデンメチル）フェニルホスフェート塩（０，６５ｇ）を、増感染料として５．３５ＸＬＯ−５Ｍメチレンブルーも含有する無水１０％メタノール／クロロホルム１００ａ＋１に溶解した。得られた溶液を分けて３つのカラス管に入れ、上記実施例■に記載のように照射した。この場合、処理には、吸引残留物を、２５８ａ＋ｇの炭酸水素ナトリウムを含有する水７０社に溶解することか含まれる。逆相分取ＨＰＬＣを行うと、不純物は含まれずに、ジンー及びアンチ−異性体か共に集められる。

分析ＨＰＬＣ［０，１％Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ　（Ｈ２０）−アセトニトリル勾配コは２つの生成物のピークを示した（保持時間は８０１及び８．３２分）。初めに溶離した異性体対後に溶離した異性体の面積パーセント比（２７０ｎｍ）は０４１であった。’ＨＮＭＲから、得られた凍結乾燥した白色固体はシン−及びアンチ−３−（４−メトキンスピロ−１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’　 −クロロ）トリシクロ［３，３，１，１３２７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムの混合物であることを確認した。

元素分析から、生成物は三水塩の形で存在することか分かった。ＣｌａＨｚｏＣＩＮ　ａ　２０７　Ｐ　・２　Ｈ２Ｏに対する理論値　Ｃ４３，５２：Ｈ４，８７；Ｃｌ７．１４゜実験値　Ｃ４３，２３；Ｈ４，９９；Ｃ１７，６５゜’ＨＮＭＲ（４００Ｄ２０中、２種の異性体）　：Ｊ　６．　９７−７、　６８　（４Ｈ，ｍ、ＡｒＨ）、３．０８及び３．　０９　（３Ｈ，２ｓ、　ＯＭｅ）　、２．　９５　（ＬＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）、０．　７６−２．　３５　（１２Ｈ，ｍ）。

実施例℃ ３−（メトキシ−５−ブロモトリシクロ［３，３，１，１３１’］デク−２−イリデンメチル）フェノールを、上記実施例Ｘのそのクロロ類似物の場合と四種に、燐酸化及び光波素化した。０．３％（ｗ／ｖ）炭屓水素ナトリウム水溶液中で処理して、粗１，２−ンオキセタンホスフエート塩の濾過水溶液を得た。次に、これを逆相分取ＨＰＬＣ（水−アセトニトリル勾配）したところ、シン−及びアンチ−異性体が得られた。これらを集めて凍結乾燥した。凍結乾燥生成物である白色のふわふわした固体を分析ＨＰＬＣすると、２つのピークか得られ、保持時間は８５２及び８．９４分であった。初めに溶離した異性体対後に溶離した異性体の面積パーセント比（２７０ｎｍ）は０．５：１であった。’ＨＮＭＲから、生成物はシン−及びアンチ−３−（４−メトキシスピロ−１，２−ジオキセタン −３，２’　−（５’−ブロモ）トリシクロ［３，３，１，１３＝７］デカン］ −４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムの混合物であることを確認した。

’ＨＮＭＲ（４００ＤｚＯ中、２種の異性体）　：Ｊ　６．　９９−７．　５２　（４Ｈ，ｍ、　ＡｒＨ）　、　３．　０７及び３．０９　（３Ｈ，２ｓ、ＯＭｅ）、２．９１（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−１）　、０．　８２−２．　３２　（１２Ｈ，ｍ）。

実施例店ＴＳＨについての免疫アッセイを、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｔａｏｄｅｍ−Ｅ　Ｔ　Ｓ　Ｈキｙト（カルフォルニア州すンシエゴ、ハイプリチク社）を用い、キット内の製造業者の指示に従って、一連のＴＳＨスタンダードについて行った。但し、抗−ＴＳＨ−アルカリホスファターゼ結合インキュベート工程及び洗浄の完了時に、プラスチックビーズをＯ，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％アシ化ナトリウムバッファー（ｐＨ１０，０）でさらに洗浄し、２００μｍの同じバブファー中で暫時貯蔵した。

ビーズ表面に結合した抗−ＴＳＨ−アルカリホスファターゼ結合物からの化学発光は、ビーズか含まれる管に、３−　（２’−スピロアダマンクン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン二ナトリウム（’　ＡＭＰＰＤ’　）、３−（４−メトキシスピロ−１１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’−ヒドロキシ）トリシクロ［３，３，１，１３＝” ］］デカココ−４−イルフェニル燐酸二ナトリウム（Ａ異性体：“Ａ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ″）、相当する二ナトリウム塩Ｂ異性体（’　Ｂ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ” ）　及Ｕ３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３，２’　−（５’　−クロロ）トリシクロ［３，３，１１３７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム（Ｃ１−ＡＭＰＰＤ“）をそれぞれ含む０．１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％アジ化ナトリウムを含有する、０．６７ｍＭバブファー溶液（ｐＨ１０，０）３００ｍｌを加えることによって開始した。その後、基質を添加した後、ベルシールド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）　Ｌ　Ｂ　９５２　Ｔルミノメータ−（ヘルシールド・インスソルメント社、ドイツ連邦共和国ワイルドパッド）を用いて、発光強度を室温（２５℃）での５秒インテグラルとして、７．１３．１９．２５．３１．４０．５０及び６０分で記録した。（測定したシグナルはシグナル対ノイズのみではない）。

各ＡＭＰＰＤ、Ｂｒ　、Ａ、ＭＰＰＤ、Ｂ　ＯＨ−ＡＭＰＰＤ、Ａ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤについてのＴＳＨ，ＲＬＵ対ＴＳＨをそれぞれ表１．２．３．４及び５に示す。

実施例ｘｍＡＭＰＰＤからの、及びアダマント−２′−イリデン基がヒドロキシ（Ａ及びＢ異性体）、クロロ及びプロ石基でモノ買換されている相当する１、２−ジオキセタンからの全体発光の比較を、これらの化合物それぞれにおける全脱燐酸化実験を行うことによって行った。

１ｍＭ塩化マグネシウムを含有する０、０５Ｍ炭駿ナトリウム／炭酸水素ナトリウムに、１．２−ジオキセタン（４，０耐）を含む水溶液を製造し、次いで３０ ℃で平衡にした。１０μｍの７．６４Ｘ１０Ｍアルカリホスファターゼ（子ウソの腸；　Ｂｉｏｚｙｗｅ）水溶液を加え、得られた溶液からの化学発光をターナ −（Ｔｕｒｎｅｒ）モデル２０Ｅルミノメータ−（ターナ−・インス′ンルメンツ：カル）オルニア州すニーベイル）を用いて記録した。各５種の化合物についての、１分当たりの相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＩｉｇｆＩｔ　ｕｎｉｔｓ、　ＲＬ　Ｕ）で表される化学発光減衰速度を、以下の表に示す。

表ｒ減衰速度（ＲＬＵ）全減衰１．２−ジオキセタン　ｒｎ　貝　時間（分）ＡＭＰＰＤ　Ｏ，Ｌ　Ｏ，３０，８６００Ｈ−アダマント−２′− イリデン（Ａ異性体）　１．３−−９０Ｈ−アダマント−２′− イリデン（Ｂ異性体）　１．５　−　−　１０イリデン　１．２　０．８　−　４０これらの全体化学発光をそれぞれ図６．７．８．９及び１０にグラフで示した。

実施例ＸｒＶ中性のバイオディン（ＢＩＯＤＹＮＥ）　ＡナイロンＩＩ！（ポール・コーポレーション、ニューヨーク州グレンコープ）のストリップに、下記の濃度のビオチニル化ｐＢｒ３２２　３５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブ（シンセテイプク・ジエネテイックス、カルフォルニアすサンジエゴ）を２回（平行して）点状に付けた：ＮＡドツト対番号　濃度（ピコグラム） −ジョン法を実施して、長さが２００−２０００ｂｐｓのビオチニル化−重鎮ポ９　０．３９１リヌクレオチドの混合物を得た。

この混合物を、下記の濃度の平行な５段のドツトとして、乾燥バイオシンＡＨ上に点在させたは０，１％ＢＤＭＱを含む基質用バッファー中で３０分間ブロックした。次に、両方の紐のストリップを５分間基質用バッファー中でインキュベートし、次いで５分間、以下に示す１．２−ジオキセタンの水溶液（０，２５ｍＭ）中で個々にＩ　ＡＭＰＰＤ２　０Ｈ−アダマント−２′−イリデン（Ａ異性体）３　０Ｈ−アダマント−２ ′−イリデン（Ｂ異性体）４　Ｃ１−アダマント−２′−イリデン５　Ｂｒ−アダマント−２′−イリデン６　ＡＭＰＰＤ７　０Ｈ−アダマント−２′−イリデン（Ａ異性体）８　０Ｈ−アダマント−２ ′−イリデン（Ｂ異性体）９　Ｃ１−アダマント−２′−イリデン１０　Ｂｒ− アダマント−２′−イリデン次に、全部のストリップをカメラルミノメータ−に入れ、ポーラロイドタイプ６１２インスタント白黒フイルムを露光した。ＡＭＰＰＤ自体と比べて、３−（置換アダマント−２′−イリデン）−１，２−ジオキセタンを用いて得られた化学発光強度が改良されていることは、以下の表■に示す結果から分かる。

青旦ＢＤＭＱ　（ＤＮＡピコ膜　ブロッキング　検出限界　コグラム）４１　λｆＰＤ　ナシ　２．５００　５．０００２　０ｆｌ−アダマント−２′−イリデン（Ａ異性体）　ナシ　５．０００　１０．０００３　０トアダマント−２′−イリデン（Ａ異性体）　ナシ　５．０００　２０．０００４　Ｃ１−アダマント−２′− イリデン　ナシ　１．２５ＯＬ、２５０５　Ｂｒ−アダマント−２′−イリデン　ナシ　１．２５０　２．５００６　Ａ［ＰＰＤ　”　ＢＤ［Ｑ　Ｏ，６２５’ 　１．２５０７　０Ｈ−アダマント−２′−イリデン（Ａ異性体）　ＢＤＩ［Ｑ　Ｏ，６２５２，５００８０Ｈ−アダマント−２′−イリデン（Ｂ異性体）　ＢＤＩ［Ｑ　１．２５０　’　５．０００９　Ｃ１−アダマント −２′−イリデン　ＢＤＩＱ　Ｏ，３１３０，３１３Ｎ　５分間の露光を、ジオキセタンを添加して４０分後に行った。

２１１分間の露光を、ジオキセタンを添加して７７分後に行った。

実施例ＸＶＩ中性のバイオディンＡナイロン膜のストリップに、１２．５ピコグラムのビオチニル化ｐＢｒ　３２２　３５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブ（バイオゲン（Ｂｉｏｇｅｎ）社マサチューセッツ州ケンブリッジ）を２回（平行して）点状に付け、乾燥し、そしてｔｒｖｐ＝ネラルライトランプから紫外線を５分間照射して、ＤＮＡを膜表面に固定させた。次いで、膜を５ＸＳＳＣ（０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム１０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で湿らせ、そして領　２％カゼイン、０．１％トクイーン２０洗浄剤を加えたＰＢＳ中で１時間ブロックした。

その後、ブロックした膜を、０２％カゼインで１．−１０．０００に希釈したアヒシンーアルカリホスファターゼ結合物（″アヒデックス（Ａｖｉｄｘ）″結合物、トロビノクス社）で３０分間インキュベートした。

次いで、膜を水性０２％カゼイン１０１％トゥイーン２０洗浄剤で２回（各回５分間）、水性０．１％トウィーン２０洗浄剤を加えたＰＢＳで２回（各回５分間）、そして最後に水性１ｍＭ塩化マグネシウムを含有する水性０゜１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ１０，０、アブセイバッファー）中で２回（各回５分間）洗浄した。

洗浄した膜を半分に切断して２つのストリップにし、それぞれに１組のドツトを付けた。ストリップをそれぞれ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含有するＯ、１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ１０）に、ＡＭＰＰＤ及び相当するクロロアダマント− ２′−イリデン化合物を含む０．２５ｍＭ水溶液中で５分間インキュベートし、次にドレインし、プラスチックバックに封じ、これをターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−の窓に張った。各ストリップからの化学発光を２０分間インチグレートした。得られた発光の特徴を図１２に示す。

実施例Ｘ■ さらに以下に挙げた促進剤重合体の存在下で、相当するヒドロキシアダマント− ２′−イリデン（Ａ及びＢ異性体）及びクロロアダマント−２′−イリデン化合物によって得られる化学発光が全て（ＡＭＰＰＤからの発光と比べて）増加することを、下記の方法で証明した。

１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％アシ化ナトリウム及び０．　１％の促進剤重合体を含有する０、１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ１０，０、基質用バッファー）に、比較する４種の１，２−ジオキセタンのうちの１種の０．　４．ｍＭ水溶液４５０１１１をそれぞれ含む３本の管を４組準備し、径管からのバックグラウンドシグナルを、ベルシールドＬＢ　９５２Ｔルミノメータ−（ベルシールド・インスッルメンツ：ドイッ連邦共和国ワイルドパッド）を用いて測定した。

１ｍＭ塩化マグネシウム、０，０２％アシ化ナトリウムを含有する０、１Ｍジェタノールアミン（ｐＨ１０，０）に２．　８３　Ｘ　１０−１２Ｍのアルカリホスファターゼを含む水溶液５０μｌ　（最終酵素濃度２．８３　Ｘ　１０−”Ｍ）を径管に加え、化学発光シグナルを５及び２０分においてルミノメータ−で測定した。促進剤重合体の存在下での４種の１．２−ジオキセタンそれぞれから得られる化学発光シグナルの強度及び信号、ハックグラウンド比を以下の表■に示す。

用いた促進剤重合体及び表■で用いたそのような重合体のシグナルは下記の通ＳＡ、ＰＰＨＩＲＥ　ＢＤＩｉＱＴＭＱ　ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）Ｓ／ＴＩ［Ｏスチレン／Ｔｌ［哄重合体ＤＡＡ、／Ｔｒｉａｌ　ジアセトンアクリルアミド／１Ω共重合体Ｄ［Ｑ／ＴＥＱ　ポリ（ビニルペンシルドデシルシメチルアンモニウムクロリド）ｌＴＥＱ共重合体ＴＥＱ　ポリ（ビニルベンジルトリエチルアンモニウムクロリド）ＴＢＱ　ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）１１ＦＢ　ポリ（ビニルヘンシル−に−メチルピペリジニウムクロリド）ＢＡＥＤＩＩ　ポリ［ビニルベンジル（２−ベンゾイルアミノ）エチルジメチルアンモニウムクロリドコＢＺ　ベンザル媒染剤Ｄ［ＥＢ　ポリ（ビニルベンジルジメチルエチルアンモニウムクロリド）ＤＩＥ（０！ｌ）Ｂ　ポリ（ビニルベンジルシメチル（２−ヒドロキシ）エチルアンモニウムクロリド）ＥＭＥＲＡＬＤ　サファイア及びフルオレセインＴＢＱ／ＦＬ［ＩＯＲＴ園及びフルオレセイン表■ 実施例Ｘ■ ２ＷＩの異なるバフファー中の以下に挙げた１換アダマントー２′−イリデン化合物について得られたバックグラウンドシグナル及びｔｌ／□パラメーター（ＡＭＰＰＤのこれらと比較した）を以下のように測定した。

１ｍＭ塩化マグネシウムを含有する０、０５Ｍ炭酸ナトリウム／炭駿炭素水素ナトリウムなるバッファー溶ｍ　（ｐＨ９，５）に、１．２−ジオキセタンを含む４、ＸＬＯ−’Ｍ水溶液を製造し、同様に１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．０２％アシ化ナトリウムを含有するＯ、１Ｍジェタノールアミンからなるバッファー溶液（ｐＨ１０，０）に、１，２−ジオキセタンを含む４Ｘ１０−’Ｍ水溶液を製造した。前当たり１ｍｌのこれらの各溶液をターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−に入れ、パックグラウッドシグナルを測定した。

次に、ｔｌ／□値を各試料について以下のように測定した。１００ｕｌの試料ジオキセタンを上記バッファー溶液の１つの９００μｍに加えたものを、管にピペットで移しく最終ジオキセタン濃度４Ｘ１０−５Ｍ）　、３０’Ｃで平衡にした。子ウシの腸のアルカリホスファターゼを同じバッファーで１−１．０００に希釈した１０μｌ　（酵素濃度７．　６　Ｘ　１０−”Ｍ）を加え、得られた化学発光強度を、ターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−を用いて、３０分間記録した。次に、ｔ、７２値を減衰曲線から計算した。これらの測定結果を以下の表■に示す。

表■ ０、４ｍｊ［におけるバック　アニオンのＡＭＰＰＤ　１，９６　２．４２Ａ、−ＯＨ−ＡＭＰ　ＰＤ　Ｌ、２０　１．３３Ｂ−ＯＨ−ＡＭＰＰＤ　１．７２　１．４９ＣＩ　−ＡＭＰＰＤ　Ｏ，９３１，０８Ｂｒ−ＡＭＰＰＤ　１．３５　０，９９０、　ｈｌｌにおけるバ１り　アニオンのジオキセタン　グラウンド（ＴＬＵ）　半減期０分）ＡＭＰＰＤ　２．０９　２−２６２−２６Ａ−ＯＨ−Ａ　Ｏ，９５１，０５８−Ｏ５８−０Ｈ−Ａ　１．３２　］、、３１Ｃｌ　−、ＡＭＰ　ＰＤ　ＣＬ７７　０．８６Ｂ　ｒ−、ＡＭＰＰＤ　Ｌ、１３　０．５６実施例ＸＩＸアルカリホスファターゼ（子ウシの腸；　Ｂｉｏｚｙｍｅ）を１−１．０００．０００に希釈して、濃度２．　５４　Ｘ　１０−１２Ｍのストック溶液を製造した。１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．０２％アシ化ナトリウムを含有する０、１Ｍジェタノールアミン水溶液（ｐＨ１０）４５０μＩ及び下記の０．１％促進剤重合体、そして４．４Ｘ１０−Ｍの１．２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ又は相当するクロロアダマント−２′−イリデン化合物）を含む一組の管を重複して製造した。

次に、５０μｌのアルカリホスファターゼスドック溶液を加えて、以下の酵素濃度の試料を得た２、５４Ｘ１０−”Ｍ８．４９ＸＩＯ−”Ｍ２、　８３　Ｘ　１０−”Ｍ９、　４５　Ｘ　１０−１４Ｍ３、　８８　Ｘ　１０−”Ｍｌ、２９Ｘ１０−”Ｍ４．３１Ｘ１０−”Ｍ容管の１．２−ジオキセタンの最終濃度は４Ｘ１０〜４Ｍであり、促進重合体の最終濃度は０．０９％であった。１．２−ジオキセタンを添加して５及び２０分後の５秒インテグラルをＳ８録した。

図１３は、ジオキセタンを添加して５分後における、クロロアダマント−２１− イリデン　１．２−ジオキセタン、促進剤■及び■を含むアルカリホスファターゼ希釈液の用量−反応曲線を、ＲＬＶ対［ＡＰ］及びシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ対［ＡＰ］）として示した同じ促進剤を含むＡＭＰＰＤの用量−反応曲線と比較したものである。図１４は、クロロアダマント−２′−イリデン　１．２−ジオキセタン及びＢＤＭＱ−フルオレセイン（′エメラルドビ）、そしてポリ（ビニルヘンンルトリブチルアンモニウムクロリド）（’ＴＢＱ’）−フルオレセイン（エメラルド■）を含むアルカリホスファターゼ希釈液を、基貫を添加して５及び２０分後に検出したものを、ＡＭＰＰＤ及び同じ促進剤重合体と比較した図である。

害岸例ＸＸＴＰＡ配列を挿入したｐＢＲ３２２プラスミド（バイオゲン社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）をＭＳＰＩ制限酵素で消化した。化学開裂はマクサム（ｌ［ａｘａ謬）等、ＰＮＡＳＳ旦、５６０　（１９７７）に記載のように行って、ルーピン（Ｒｕｂｉｎ）等、韓の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、８．４６１３　（１９８０）に記載のように、Ｇ、ＡＧ、ＡＣ，ＴＣ及びＣ−そして他の１つのＴを得る。

路管の内容物の１／７を、０．４ｉｍＴＢＥ勾配配列決定ゲル（長さ６０ｃｍ）上のレーン毎に載せた。電気泳動を４時間行った後、ＤＮＡをバイオシンＡナイロン膜（０，４５ｎ）に電気移動させ、紫外光で処理してＤＮＡを膜表面に固定した。

次いで、膜を乾燥し、３０分間４５℃にて、１％ＢＳＡ、領　５Ｍ憐酸ナトリウム及び７％ＳＤＳを含有するバッファー水溶液（ｐＨ７，２）中で予備ハイブリダイモーションを行い、そして１０μｌのＮＮＢスナップ直接アルカリホスファターゼ結合プローブ（モレキュラー・パイオンステム社、カルフォルニア州すンンエゴ）を含む４０ｍ１の上記ＢＳＡバッファー溶液で、２時間４５℃にてハイブリッド化した。次に、膜を４５℃の水性５Ｘ　ＳＳＣ／Ｉ％ＳＤＳで２回（各回５１ｆＩ間）、４５℃の水性ＬＸ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳで２回（各回５分間）、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス及び１％トリトンｘ−１００洗浄剤を含有する水溶液（ｐＨ８゜０）で１回、室温の水性ＬＸ　ＳＳＣ／１％ＳＤＳで２回（ｚ口１分間）、そして最後にＯ，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ塩化マグネシウム及び００２％アシ化ナトリウムを含有する水溶Ｍ（ｐＨ１０，０）で２回（各回１分間）洗浄した。

次いで、膜をＡＭＰＰＤ水溶ｅ　（０，２５ｍＭ）で湿らせ、サランラップで包み、コダｌりＸ、ＡＲＸ線フィルムを４０分間露光した。次に、Ａ４ＶＩＰＰＤを添加して１時間債に、５分間露光した。配列イメージを図１７　（１）に示す。

相当するクロロアダマント−２′−イリデン　１．２−ジオキセタン化合物を用いてこの手＋［１を全部繰り返して、図１７（２）に示す配列イメーンを得た。

実施例ＸＸＩ表４にｆｃｙｆｆｉの各ジオキセタンの熱によるバックグラウンドは、Ｏ，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣ１２に０．４ｍＭジオキセタンを含む溶液（ｐＨ１０，０）中で、ターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−（カルフｔルニア州すニーベイル）を用いて測定した。酵素不在下での各試料の平均化学発光強度を、０゜４ｍＭでのバックグラウンドの下でターナ−光単位にて表４に示す。

表４に示したジオキセタンアニオンの半減期は次のように測定した　０．０４ｍＭジオキセタンの１ｍｌ溶液（上記と同じパンファー中の）を、ターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−中で３０℃にて０．７６４ピコモルのアルカリホスファターゼを添加することによって、完全に脱燐酸化した。ジオキセタンアニオンの半減期を化学発光の一次減衰から計算した。

０．４ｍＭでのパック　アニオン本の半減期ＡＭＰＰＤ　１゜８３　２．１０ＣＨ１０ＣＨ３０−Ａ　０．７１　Ｌ、５２ＨＣ）−Ａ、ＭＰＦＤ　０．　８３　１゜１９ＣＩ−ＡＭＰＰＤ　０１８３　０．９６Ｂｒ−ＡＭＰＰＤＯ９７８１，０１゜Ｉ−ＡＭＰＰＤ　Ｏ，４６０，９３ＴＬＵ−ターナ−光単位＊０．７６４ピコモルのアルカリホスファターゼを、４０ナノモルのＡＭＰＰＤ及びＲ−ＡＭＰＰＤを加えた０、１ＭのＤＥＡ、１ｍＭのＭｇＣ１ｚ　（ｐＨ１０，０）に、添加することによって生成されたアニオン実施例ＸＸ■ アルカリホスファターゼの異なる化学発光性１．２−ンオキセタン基質での検出は、次のようにして行う　アルカリホスファターゼの一連の希釈液＜１−３）の二重反復物を、ベルシールドＬＢ９５２Ｔルミノメータ−（ドイツ、ワイルドパッド）で、高分子促進剤１又は促進剤２のいづれがを１ｍｇ／ｍｌ含有する、０゜４ｍＭジオキセタンを含むＯ，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣＩｚ（ｐＨ１０，０）を用いて室温にてインキュベートした。

５又は２０分間、基質でインキュベートした後、化学発光強度を５秒インチグレート相対光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｌｉｇｈ　Ｕｎｉｔ、　ＲＬ　Ｕ）として測定し、図１０のようにプロットした。酵素なしで得られるシグナルの２倍の化学発光シグナルを生しるアルカリホスファターゼ濃度は、図１８のグラフがら外挿した。ハックグラウンドの２倍のアルカｌ／ホスファターゼ濃度を、表５における検出限界として用いた。

嚢」一種々の化学発光性１．２−ノオネセタン基Ｗ／促進剤系を用いたアルカリホスファターゼの検出限界ＡＭＰＰＤ　４．０　１．４　３．５　１．ＩＨＯ−ＡＭＰＰＤ　３．０　０．８　１．０　０．３ＣＩ　−ＡＭＰＰＤ　１．０　０．６　０．８　０．４Ｂｒ −ＡＭＰＰＤ　２．６　０．５　０．４　０．３検出限界はフエントモル／リッターで表シタ。

実Ｍｉ例ｘＸＮアルカリホスファターゼの一連の希釈液（１−３）の二重反復物を、ベルシールドＬＢ９５２Ｔルミノメータ−で、促進剤１又は高分子促進剤２のいづれがをＬｍｇ／ｍｌ含有ｔル、０．４ｍＭ（７）ＡＭＰＰＤ又はＣＩ−ＡＭＰＰＤを含ム。−ＩＭンエタノールアミン、１ｍＭ（７）ＭｇＣ１２（ｐＨＩＯ−０）を用いて室温にてインキュベートした。５分インキュベートした後、化学発光強度を５秒インテグラル相対光単位（ＲＬＵ）として測定し、二重反復物を平均し、図１８の上のグラフでアルカリホスファターゼ濃度に対してプロットした。下のグラフでは、化学発光シグナル対バックグラウンド（酵素なし）化学発光シグナルの比を、酵素濃度の関数として示す。

実施例ＸＸ■ 化学発光シグナル対ノイズレベルは、いくつかの促進剤の存在下で、２８３Ｘ　１０−１３Ｍアルカリホスファターゼ及び種々のＲ４換アダマンチル　１．２− シオキセタンホフフエートを用いて得た。測定は全て、室温でベルシールドＬＢ９５２Ｔルミノメータ−を用いて行った。まず、各試料（三重反復物）のバックグラウンド化学発光レベル（酵素不在下でのシグナル）を測定した。各試料は、Ｌａｇ／ｍｌの表示促進剤を含有する又は含有しない、０．２μｓモルのジオキセタンを含む、０．４５ｍ１の０．１Ｍジェタノールアミン、１ｒｎＭのＭｇＣＩｚ（ｐＨ１０，０）よりなっていた。管をルミノメータ−に挿入し、発光強度を測定した。

次に、管をルミノメータ−から取り出し、アルカリホスファターゼ（１，４１５ｘ　ｌ　０−１ｓモル含有する５０μｌ）を路管に加え、発光強度を基質添加後５及び２０分で測定した。路管のジオキセタンの最終濃度は０．４ｍＭであった。表６は、アルカリホスファターゼの存在下、５及び２０分で得られた化学発光シグナル対バックグラウンドシグナル（酵素不在下で得られた）の比を示す。

表６種々のＲ−５２換ＡＭＰＰＤ化合物の化学発光シグナル対ノイズレベルの比較ナノ　５　２１　５５　８２　７７ＳＡＰＰ■ＩＲＥＩ　５　１５９　２２９　５７７　３８３ＥＩＩＥＲＡＬＤＩ　５　１０９　３０７　５３８　１４９ＳＡＰＰＥＩＩＲＥ２　５　１９２　４６６　１３１９　６８８ＥＫＥ■ＬＤ２　５　１１３　２４７　８３９　３１５促進剤は全てＯ，ＬＭのＤＥＡ　（ｐＨ１０）中１諏ｇ／ｓｌで用いた。

アルカリホスファターゼ濃度＝２．８３Ｘ１０−”Ｍｌり定はベルシールドＬＢ９５２Ｔルミノメータ−で行った。

実施例ＸＸＶ表７は、化学発光強度の読みに使用する装置以外は、表５、実施例ＸＸ■に記載の手順を用いて測定した、Ｒ買換ジオキセタンでのアルカリホスファターゼ検出の検出限界を示す。この実施例で使用するルミノメータ−はＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ　Ｌｕｍ１Ω０５ｋａｎマイクロタイタープレート　リーダーであった。

表７ＡＭＰＰＤ　３．８Ｘ１０　”Ｍ　２．５Ｘ１０−”ＭＣＩ−ＡＭＰＰＤ　１．４ＸＩ０刊’Ｍ　８．０ＸＩＯ−”ＭＢｒ−ＡＭＰＰＤ　２．７Ｘ１０”Ｍ　４．ＯＸＩＯ−１６ＭＨＯ−ＡＭＰＰＤ−Ａ　３．ｌＸｌ０−１５Ｍ　１．４×１０−”ＭＡＭＰＰＤ　１．４ｘＬＯ−”Ｍ　１．１ｘｌＯ−”ＭＣ１−ＡＭＰＰＤ　５．０ＸＩＯ−”Ｍ　４．３Ｘ１０刊６ＭＢｒ−ＡＭＰＰＤ　４．ｏｘｔｏ −”Ｍ　３．９Ｘ１０−”ＭＨＯ−ＡＭＰＰＤ−Ａ　Ｌ　ｌＸｌ０−”Ｍ　３、Ｉ　Ｘ　１０−”Ｍｌ）　バγフｙ−：０．ＩＭジェタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．０２％アシ化ナトリウム、ｐＨ１０，０２）　ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ　Ｌｕｍ１ｎｏｓｋａｎ　マイクロタイター　プレート　リーダー（こおけるシグナルリコーダ− 実施例ＸＸＶＴ表８は、表４からの２０分インキュベートデータ、及び１１１Ｊマイクロタイター　プレトー　ルミノメータ−で行った測定を示す。

る）ＡＭＰＰＤ　Ｌ　４ｘｔｏ川’Ｍ用　１．ＩＸＬＯ−１５ＭＣ１−ＡＭＰＰＤ　５．０ＸＩＯ”Ｍ　４．３Ｘ１０〜”ＭＢｒ　、ＡＭＰＰＤ　４．０×１０−１６Ｍ　３．９×１０−”ＭＨＯ−ＡＭＰＰＤ−Ａ　１．　１ＸＩ（ｌ１５Ｍ　３．ＩＸＩＯ−１６ＭＡＭＰＰＤ　１．９Ｘ１０−１５Ｍ　１．３Ｘ１０−１５ＭＣＩ　−Ａ、ＭＰＰＤ　７．０５Ｘ１０＝’Ｍ　２．ｌＸｌ０−”ＭＢｒ−、ＡＭＰＰＤ　２．　ｌＸｌ０−”Ｍ　７．　４Ｘ１０−”ＭＨＯ−ＡＭＰＰＩ）− Ａ　１．５Ｘ１０−”Ｍ　１．４ＸＩ０月５Ｍ実施例ＸＸＸＩＡ、ＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤのナイロン膜上での性能を次のように比較した　１μｍ中の１２．５ピコグラムのビオチニル化−ｐＢＲ３２２−（３５ｍｅ「）を乾燥ナイロン膜上に点状に付け、Ｕｖ光で膜に架橋させた。その後、膜をｌＸ５ｓｃバブフアーで湿らせ、０．２％カゼイン、０，１％トウイージー２０を含む憐酸塩緩衝剤を含有する塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で１時間、室温にてインキュベートし、０３％トゥイージー２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、　基質用バッファー（０，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣ１゜、ｐＨ１０，０）で２回洗浄し、そして５分間０．２５ｍＭジオキセタンを含む基質用バブファー中でインキュベートした。この方法では、２つのｌ１ｌ（ＬつはＡＭＰＰＤで、もう１つはＣｌ−ＡＭＰＰＤでインキュベートしたちの）を得た。次に、膜をプラスチックに封入し、１２Ｘ７５ｍｍガラス試験管の外側に付け、そして側面に光電子倍増管検出器を備えたターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−に挿入し、３０℃ に平衡にした。次に、化学発光強度を２０−２４時間モニターした。図１９に示すように、化学発光シグナルを、ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤについて、時間の関数とＰＶＤＦ及びナイロン膜上のＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤで得られる最高化学発光強度の半減期を、ナイロン膜については、実施例ＸＸ■のように集めたデータから計算し、ＰＶ、ＤＦｆｆｌについては、手順を変えて、第２の基質用バッファーを洗浄した後、膜を５分間室温にてＴｒｏｐｉｘ　Ｎ１ｔｒｏＢＬｏｃｋ（商標）試薬中でインキュベートし、そしてジオキセタン基質を添加する前に、基質用バッファーで洗浄した。最高化学発光シグナルの半減期を、対数（最大化学発光シグナルマイナス各時点でのシグナル）のプロットから時間の関数として計算した。これを表９に示−最高化学発光の半減期− ＩＩ！！　ＡＭＰＰＤ　Ｃ１−ＡＭＰＰＤＰＶＤＦ＊　４９．５１分　１４．２０分ナイロン　９９゜８３分　４７４８分＊　ＰＶＤＦ膜は基質を添加する前にＮ１ｔｒｏＢＬｏｃｋで処理した。

１２．５ｐｇのビオチニル化ｐＢＲ３２２−３５ｍｅｒを、Ａｖｉｄｉｘ−ＡＰ及び領２４　ｍＭシオキセ９　：／ヲ含む０．１Ｍ　ＤＥＡ　（ｐＨ１０，０）　で検出した。

実施例ＸＸ■ ＰＶＤＦ及ヒナイロン膜上のＡＭＰＰＤ及びｃ　ｌ−ＡＭＰＰＤを用イル、ビオチニル化ｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブでの、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの検圧を以下のように行った：　ｐＢＲ３２２ＤＮＡを、一連の希釈試料を１ｘｓｓｃバツフアー中で（スロット当たりのＤＮＡの最終量はＺ２０に示す）沸騰することによって変性し、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌスロツトプロツト装胃を用いて、　Ｉｎ＋ｍｏｂｉｌｏｎＰ　Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ　Ｉｌｌ、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ａナイロン膜及びＡ＋＋＋ｅｒｓｈａｍ　Ｈｙｂｏｏｄ　Ｎナイロン膜に施した。Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ａ及びＨｙｂｏｎｄ　ＮＩＰ！をＵＶ光で架橋した。ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ膜はまずブロックし、その後Ｕｖ焙処理た。膜をｌＸ５ＳＣバツフアーで湿らせ、ハイブリダイゼーンジンバッファ−（ＬＭ　ＮａＣ１，０，２％ヘパリン、０５％ポリビニルピロリドン、４％ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭエチレンシアミン四酢酸酢酸％デキストランスルフェート、５０ｍＭｈリスーＨＣｌ、ｐＨ７゜５）中、６５℃で予備ハイブリダイセージランを行い、６５℃にて同じバッファー中で１２　ｎ　ｇ／ａｌのｐＢＲ３２２プローブにツクトランスレーション法を用いてビオチニル化した）をハイブリダイゼーションし、デキストランスルフェート、ＥＤＴＡ及びヘパリンを除いた同じバッファー中で６５℃にて１回洗浄し、７５℃＋７）ＩＸＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で１０分間２回、７５℃のｏ、ｌＸ５ＳＣ／１％ＳＤＳ中で１５分間２回、室温のｌＸ５ｓｃ中で５分間２回洗浄し、０．　２％カゼイン、０．１１％トゥイージー２０を加えたＰＢＳ中で１時間ブロックし、０、　２％カゼインを加えたＰＢＳ中で５分間１回洗浄し、ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼの０．２％カセイン／ＰＢＳ中における１−１５，０００希釈液中で３００分間インキュベート、次に、０．　２％カゼイン、トウィーンー２０を加えたＰＢＳで６回洗浄し、基質用バブファー（０，１Ｍシエタノールアミス　１．ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚ、ｐＨ１０，０）中で２回洗浄し、そして０２５ｍＭ　Ａ、ＭＰＰＤ及びＣＩ　−ＡＭＰＰＤ　（２種の異なる膜）を加えた基質用バッファー中で５分間インキュベートした。基質を加える前に、ＰＶＤＦ膜をＮ１ｔｒｏＢｌｏｃｋ　（商ｅ４）中で５分間インキュベートし、基質用バッファー中で２回洗浄した。

次いで、膜をプラスチックで包み、図２０に示すような基質を添加した後の指示時点でポーラロイドタイプ６１２フイルムを露光した。

実施例ＸＸＸＰＶＤＦ、　ナイロン及びニトロセルロース膜上（７）ＡＭＰＰＤ、Ｃｌ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを用いる、ビオチニル化ｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブでのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの検出を、実施例ＸＸ■と同様な手順を用いて行った。但し、ＰＶＤＦ及びニトロセルロース膜の場合、これに対するターゲットＤＮＡは、膜を８０℃で２時間ベータすることによって固定した。やはり、ジオキセタンを加える前に、ＰＶＤＦ及びニトロセルロース膜はＮ１ｔｒｏｂｌｏｃｋで処理した。各種膜支持体上のアルカリホスファター上ＤＮＡプローブ結合物によ、って触媒された各種シオキセタノホスファターゼの分解から生じた化学発光シグナルのポーラロイドタイプ６１２イメーンを図２１に示す。

実施例ＸＸＸ［ニトロセルロース膜上のＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤからのアルカリホスファターゼによる発光の特徴を、以下の手順で比較した゛予めビオチン−１１−ｄＵＴＰで３′−末端標識したｐＢＲ３２２−（３５ｍｅ　ｒ）（１２，５μｇ含有する１μｌ）を、乾燥ニトロセルロース膜上に点状に付けた。次いで、膜を１ｘｓｓｃバツフアーで湿らせ、０．２％カゼイン、０．１％ヒトィーンー２０を含む燐酸塩緩衝剤を加えた塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で１時間室温にてインキュベートし、０、　３％トウィーンー２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、基質用バッファー（０゜１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、ｐＨ１０，０）中で２回洗浄し、Ｎ１ｔｒｏＢＬｏｃｋ　（商Ｓ！り試薬で５分間インキュベートし、基質用バッファー中で２回洗浄し、その後、２枚の膜をそれぞれ５分間、０．２５ｍＭ　ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤを含む基質用バブファー中でインキュベートした。次いで、膜をプラスチックに封じ、１２　Ｘ　７５Ｂガラス試験管の外側に取り付け、サイド光電子増倍管検出器を備えた３０℃に平衡にしたターナ −モデル２０−Ｅルミノメータ−に挿入した。化学発光強度は２０−２４時間モニターした。図２２に示すように、化学発光強度シグナルをＡＭＰＰＤ及びＣＩ −ＡＭＰＰＤについて、時間の関数としてプロブトした。

実施例ｘｘｘｎタンパク質に基づく膜の場合の最高化学発光シグナル強度が半分になるのに）要な時間、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体並びにＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤでの［ｇＧ検出を、以下の手順で評価した。２０％メタノール電気泳動移動バッファーに精製したマウス［ｇＧを含む１μｇ／ｍｌ溶液の１μｌを、乾燥ニトロセルロース及び湿ったＰＶＤＦｍ上に、点状に付けた。その後、膜を０．１％トウィーンー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ中ですすぎ、ブロッキング／（ツファー（領２％２％カゼイン　１％トウイージー２０を含むＰＢＳ）中で１時間ブロックし、ブロッキングバブファー中におけるアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体の１−１０．０００希釈液でインキュベートし、プロブキングバッファーで５分間２回洗浄し、０．　１％トウイージー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ中で５分間２回洗浄し、基質用バッフｙ−（０，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ１０゜０）中で５分間２回洗浄し、２つの試料に分け、それぞれ０．２５ｍＭ　Ａ、ＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤ中で５分間インキュベートした。膜をプラスチック中に封じ、１２Ｘ７５ｍｍガラス試験管の外側に取り付け、サイド光電子増倍管検出器を備えたターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−に挿入し、３０℃に平衡にした。

表１０に示すように、化学発光強度を８−１２時間モニターし、最高シグナルの半減期を実施例ＸＸ■のように計算した。

−最高化学発光の半減期− ＰＶＤＦ＊　３９．２０分　１１．２７分ナイロン　８１．１９分　４１．００分＊　ＰＶＤＦ膜は基質を加える前に、Ｎ１ｔｒｏＢｌｏｃｋで処理した。

ｌｎｇのマウス１ｇＧを、ヤギ抗マウス−ＡＰ及び領　２４ｍＭジオキセタンを含むＯ，ＬＭ　ＤＥＡ、ｐＨ１０，０で検出した。

実施例ｘｘｘｍ化学発光を用いたナイロン膜上でのヒトのトランスフェリンの検出のために。

ウェスターンｆｆｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析を行った。０−５．１．２．４．８．１６．３２．６４．１２８及び２５６ナノグラムの精製したヒトのトランスフェリンの一連の希釈液を、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動によって分離し、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　、Ａ　ナイロン膜に電気的に移動させた。その後、膜を燐酸塩緩衝剤を加えた塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．３％カゼインを加えたＰＢＳで３０分間ブロックし、マウス抗−ヒトのトランスフェリンの０．３％トウイージー２０／ＰＢＳ中における１−１０００希釈液でインキュベートし、０．３％トウィーンー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓで５分間４回洗浄し、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗−マウス抗体の０．３％トウィーンー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ中における１−１０，０００希釈液でインキュベートし、０．３％トウィーンー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ中で５分間４回洗浄し、基質用バーｚ７ｙ　（０，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨｌ０．Ｏ）中で２回洗浄し、５分間、それぞれ０．２５ｍＭ　ＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを含む基質用バッファー中でインキュベートシ、プラスチックに包み、ポーラロイドタイプ６１２インスタント黒白フイルムを５分間露光した。結果を図３０に示す。

実施例ＸＸＸＩＶｒｕ＋ｏｂｉｌｏａ−Ｐ　Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ１ａ上でのヒトのトランスフェリンの化学発光による検出を、以下のように変えた他は、実施例１３の手順に従って行ったニジオキセタンを加える直前に、４枚のＰＶＤＦｌｉのうちの２枚をＮ１ｔｒｏＢ１ｏｃｋ　（商ＷＡ）中で５分間インキュベートし、次に基質用バッファー中で２回洗浄した。Ｎ１ｔｒｏＢＬｏｃｋを用いた及び用いないＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤについて５分間露光した結果を、図２３に示す。

実施例ｘｘｘｖ直接アルカリホスファターゼ標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる、ＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ、Ｂｒ−ＡＭＰＰＤ及びＬｕｍ１Ｐｈｏｓ　５３０でのネズミのインターロイキン−４遺伝子の化学発光による検出。遺伝子又はネズミのインターロイキン−４（ＭＩＬ−４，）遺伝子を含むプラスミドを１ｘｓｓｃで希釈し、乾燥Ｂｉｏｄｖｎｅ　Ａ膜上に１２．８．６４．３２．１．６．０．８．０．４．０６２．０．１．０，０５．０．０２５、領　０１２５．０．００６３及びＯ０Ｏ３１５ナノグラムのＤＮＡで点状に付けた。ＤＮＡをＵＶで膜に固定し、ｌＸ５ＳＣで湿らせ、ハイブリダイゼーション用バッファー（燐酸を含む７％ＳＤＳ、１％カゼイン、Ｃ、２５Ｍ　Ｎ　ａ　２　Ｐ　Ｏ＜、ｐＨ７，２）中で３０分間、５０℃にて予備ハイブリダ（ゼーシジンし、５ｍＭアルカリホスファターゼ標識オリゴヌクレオチドプローブで２時間５０℃にてハイブリダイゼーションし、以下のように洗浄した　室温のンＸ５ＳＣ，１％ＳＤＳ中で５分間２回、５０℃のｌＸ５ＳＣ，１％ＳＤＳ由で１５分間２回、ｌＸ５ＳＣ，室温の１％トリトンＸ−１００中で５分間２回；　ｌＸ５ＳＣ中で５分間２回２そして基質用バッファー（０，１Ｍジェタノールアミン、１　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２、ｐＨ１０）中で５分間２回洗浄した。次に、分けた膜の試料をそれぞれ５分間０−２５ｍＭ　ＡＭＰＰＤ、ＣＩ　−ＡＭＰＰＤ、Ｂ　ｒ−Ａ、ＭＰＰＤ及びＬｗｉＰｈｏｓ　５３０　（ボーリンガ−・マンハイム、米国インジアナポリス）中でインキュベートし、プラスチックに包み、１時間インキュベートした後、コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムを１時間露光した。

この実験の結果を図２４に示す。

実施例ＸＸＸＶＩＣＩ−ＡＭＰＰＤ及びＡＭＰＰＤで得られた化学発光シグナル強度を図９に示すように較べた。一連の反応は、５′−ビオチニル化した一般的なプライマーを有するＭ１３ｍｐ１８　ＤＮＡを用いてＢｉｏＲａｄ　Ｂ　Ｓ　Ｔポリメラーゼで行った。

２組の反応物を７．６７Ｍ尿素イオン性−勾配ポリアクリルアミドゲル上で分け、受動毛管輸送によってナイロン膜へ移した。ＤＮＡを、５時間ＵＶ照射することによって膜に架橋した。次に、膜を室温でブロッキングバッフｙ−（０，２カセイン、０１％トウイーノー２０を加えたＰＢＳ）中で３０分間、ストレプトアビジンｅＬ４アルカリホスファターゼの０．　２％カゼイン、ＰＢＳの１−５０００希釈液で３０分間インキュベートし、ブロッキングバブファー中で５分間洗浄し、０３％トウイーノー２０を含むＰＢＳ中で２回洗浄し、基質用バッファー（０゜１Ｍジェタノールアミン、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２、ｐＨ１０）中で１分間洗浄した。

膜を２片に分け、０．２５ｒｎＭジオキセタン中で５分間インキュベートした（ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤについてそれぞれ１片）。次に、膜をプラスチックに封入し、図２５に示すように基質を加えて５分後に、コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムを７分間露光した。

実施例ＸＸＸ■ Ｃ３ＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤを用いたＤＮＡノくンド分解の比較を一連の反応を用いて行い、転移及び化学発光による検出は、ＡＭＰＰＤ及びＣＩ−ＡＭＰＰＤを用いた実施例ｘｘｘｖｒと同じ条件下で行った。図２６に示す露光は、基質を加えて２４時間後に１分間である。

実施例ＸＸＸ■ ニトロセルロース膜上でＡＭＰＰＤ、ＣＩ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを用いるビオチニル化ｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブでのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの検出。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの一連の希釈液を得、５１２．２５６．１２８．６４．３２．１６．８．４．２及び１ピコグラムのＤＮＡを３片の乾燥ニトロセルロース膜上に点状に付けた。膜片を次に２時間８０℃でベークし、ＵＶ光で５時間処理し、ｌＸ５ＳＣで湿らせ、６０分間ノ−イブリダイゼーショジンッファ−（ＬＭ　ＮａＣ１，０，２％ヘパリン、０．５％ポリビニルピロリドン、４０％ドデシル亜硫酸ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５％デキストランスルフェート、５０ｍＭトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５）中、６５ ℃で予備ハイブリダイゼーションし、ニックトランスレーションによってビオチニル化した１５ｎｇ／ｍｌ　ｐＢＲ３２２プローブで一晩ハイブリダイゼーシランし、６５℃の、ヘパリン、デキストランスルフェート及びＥＤＴＡを除いた／１イブリダイゼーシヨンバツフア−中で５分間洗浄し、７５℃のｌＸ５ＳＣ中１％ＳＤＳで５分間２回洗浄し、７５℃の０．０ＩＸＳＳＣ／１％ＳＤＳで１５分間２回洗浄し、そして室温のｌＸ５ＳＣで５分間１回洗浄した。次いで、膜を、０゜２％カゼインを含むＰＢＳで２回すすくことによって室温での化学発光による検出のための処理を行い、プロプキングバッファー（０，２０％カゼイン、０．　１％トウイーノー２０を含むＰＢＳ）で１時間ブロックし、０２１％カゼインを含むＰＢＳで５分間、０．２％カゼインを含むＰＢＳで５分間洗浄し、膜を、ストレプトアビジンｅ！アルカリホスファターゼの０２％カセイン／ＰＢＳ中における１−１５，０００希釈液で３０分間インキュベートし、Ｎ１ｔｒｏＢ１ｏｃｋ溶液中で５分間２回洗浄し、０．　３％トウイーノー２０／Ｐ　Ｂ　Ｓ中で５分間４回洗浄し、基質用バッファー（０１Ｍノエタノールアミン、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、ｐＨＬＯ）中で５分間２回洗浄し、１片を３種のジオキセタンホスフェート（０，２５ｍＭ）オキセタン濃度でのＡＭＰＰＤ、Ｃｌ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤ）それぞれの中でインキュベートした。様々なインキュベート時間後のポーラロイド６１２フイルムにおける指定時間の露光を図２７に示す。

実施例ｘｘｘ＋ｘストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合を有するビオチニル化ｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブ並びに化学発光性ジオキセタンホスフェート、中性ナイロン膜上のＡＭＰＰＤ、ＣＩ−Ａ、ＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤを用いた、ｐＢＲ３２２ＤＮＡの検出を、５分間のＮ１ｔｒｏＢ１ｏｃｋインキュベーションを省いた他は、実施例ＸＸＸ■の手順に従って行った。結果を図２８に示す。

実施例ＸＬヒトのトランスフェリンの化学発光による検出をＩｍｍｏｂｉ　１ｏｎ−Ｐ　Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ　ｍ上で行った。全てのＰＶＤＦＩｌｉ！をＮ１ｔｒｏＢＬｏｃｋ　（商標〕試藁中で５分間インキュベートした他は、ゲル電気泳動、転移、プロプキング及び検出工程を実施例ＸＸｒＶの手順に従って行った。図２９は、ＰＶＤＦＨ上でのヒトのトランスフニリンの検出の際の、ＡＭＰＰＤＳＣｌ−ＡＭＰＰＤ及びＢｒ−ＡＭＰＰＤの比較結果である。

実施例ＸＬＩ表１１に記載の各ジオキセタンの熱によるノ１ツクグラウンドを、３０℃の、０４ｍＭンオキセタノを含むＯ，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭＭｇＣ１２の溶液（ｐＨＬｏ、Ｏ）中で、ターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−（カすフォルニア州すニーベイル）を用いて測定した。酵素不在下での各試料の平均化学発光強度を、表１１に、０．４ｍＭでの”非特異的ノ１ツクグラウンド”として相対ルミノメータ一単位（ＴＬＵ）で挙げる。

表１に挙げたジオキセタンアニオンの半減期は次のように測定した　０．０４ｍＭシオキセクン（上記と同しバッファー中の）の１】■溶液を、ターナ−モデル２０Ｅルミノメータ−で、０７６４ピコモルのアルカリホスファターゼを３０００にて加えることによって完全に脱燐醸化した。次に、ジオキセタンアニオンの半減期を、化学発光の一次減衰から計算した。

平坦域の半減期（分）ジオキセタン　低濃度孝のアルカリホス　非特異的ノ〈γフグラウンド０、４ｍＭ、　ｐＨ１０，０７アターセ　０．４ｍＭ相対ルミノメータ一単位へＩＰＰＤ　ｉ、９７　１．９５ＦＳＰＤ　Ｏ，７４０，４５Ｃ３ＰＤ　Ｏ，７１０，９６ＢｒＳＰＤ　Ｏ，７００，９３ＩＳＰＤ−八　〇、　６４　０．４７ＩＳＰＤ−Ｂ　Ｏ，７００，３７Ｈ〇−１卯Ｄ−Ａ　０．９３　０．９２ｆｌｏ−Ａｌ［ＰＰＤ−Ｂ　１．０３　Ｌ、　３５ＣＨ３０−Ａｌ［ＰＰＤ−Ａ　Ｏ，８６０，８３Ｃ１１，０−＾Ｉｌ［ＰＰＤ−８−− １−ＰｒＯ−ＡＩＰＰＤ−Ａ　０．９３　０．９８ｉ−ＰｒＯ−ＡＩ［ＰＰＤ− Ｂ　Ｏ，６８１，７４ｎ−ＢｕＯ−Ａｌ［ＰＰＤ　０．７１　０−９１を管には、２．８３Ｘ１０−１３Ｍアルカリホスファターゼを含む０，１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．０２％アシ化ナトリウム（ｐＨ１０゜０）か含まれていた。

以上、主に本発明の好ましい具体例及び実施例について述べた。当業者であれば、請求の範囲に記載の本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を変更することは容易に行うことができる。

ｌＦ３　ＴＣＬＩ　ＤＩ　Ｉ＋　者÷τＣ１−ＩＯ−ｎｌ−１−ｍｍＡ浄１に内容に変更なし）図２Ｔ５Ｈ，ＦＬＬＩ　夕３　Ｔ３Ｈ５８Ｊ！、ＢＲ−ｃｒｎｐｐｄＴＳＨμｌＵ／ｍｌ −’　′　ｌ）Ｍ、ｌ−＜ＬＵメＪ　ｌ’）ｎ　ｅ５−ＩＪｌ？ＱｌｌｌＪＪｕさ口反ｌ／２分アル刀ソホスフ７夕−ＩＺ”＜ｌ’ｌ）０．ｔ　Ｍ　ＤＥＡ、１　ｍＭＭＩＣＩ２．Ｐ）Ｉ　１０．０アルｎツノホスファ７−て゛（間）０、＋　Ｍ　ＤＥＡ、　１ｍＭ　ＭｇＣｆ２．　ｐＨ１０，０１」／９ＲＬＩＪ（ターナーン１図２０１１１１　のＬヒ牢交化掌発尤（注１，２−シ゛オキｔタンて゛のｐＢ尺３２２ＤＮＡ呻餘巴月冥の比４駈２゜ニトロヤルロース゛涯黄よのアノυカリホυアタービ１：よ４茫光）１寸肴欠Ｉ）４　間　（分）図２２５分　′ａ　尤 −、ｗＩＩＩＩＰＱｒｅ　ＩＭｍａｂｉｌｏｎ　Ｐ　ＰＶＤＦ　ＥＸ　ｔ　イ火１＠Ｌｒ：ＤＮＡ　ドットープロットハイフ′リタイドーシジン９−Ｊｒ：、ト：ネス°ミー４−遺イ云子ｒｎｌＬ−４壱夜アラ入３に一ブＣ〜フ゛；アυカリホスファ５’−ｔ−土珊織＃２Ｓ９６　ＳｎＭ４Ｘ／奸聞ジオ午セタン蒸貿て゛１１１１序蘭インキュベートしたイ＆１Ｉｌｙ千肩号１尤回２今図２５ＣＩ−ＡＭＰＰＤＡＭＰＰＤイヒ′字免忙す土１，２−シ才ヤぜクンこのｐＢＲ３２２ｆ）ｌｉＡ（ｂ２会出ニトロ？ルロース月更、３ｃｈｌｅｌｅハｅｒｈｌ）’５ｅ１１ｑｅｊしＢＡ−Ｂ５　ニド［１ｔＪレローｘ　荊ｌεイ欠用した化ｆｅｔｅａ　１．２−シ゛オヤセタ７　ｒのｐＢＫ３２２ＯＮＭ廟軌Ｂ中性アイロンＨ晃・ハイフーリタイｔ；シｉン１ゴ：・ンクトランスレーシジンカ２ｒ形４ｄ＼し斥ヒ牙ナニル化アローフ゛て４テ、た・Ｐα［Ｒ８（αｄｖｎｅ　Ａ　ナイロン門屡とイ実用したジオやセタンのこと較５分露光。

ｊ″１Ｊ３０ナイロ’、　Ｒ＊：Ｌ　Ｌ２庫倫嘴七ヒトトランスフェリン＾ζ掌嘴シ亡１；ｘ各ネ鯰七ジ°オ＋ｔタン０比較５分露党、　阻し　３１ａｄＶｎｅ＃イロンＲＴｌｔイ天ηしｒ；要約書酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に先エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１．２−ジオキセタン化合物が開示されている。

これらの化合物は、式［式中、Ｘ及びＸｌはそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸｌの少なくとも１つは水素以外のものであり、そしてＲ，及びＲ２は個々に又は− 緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しつるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２！換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、モしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される。

また記載の５′又は７′位置で、あるいは５′及び７′位置で置換されているものに代わる、４′メチレン基を含むものに代わる、相当するジオキセタンは、これらの全ての３−置換アダマント−２′−イリデンジオキセタンの中間体であり、それらの用途は、各検定方法のリポータ−分子である。

蚕手続補正書（ハ）平成　５年　３月７０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３基（ｎ＝０−６）、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル碁、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂されるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうろ、酵素によって開裂可能な化学発光性１．２−ジオキセタン化合物。
２．Ｘがヒドロキシルであり、Ｘ１が水素である請求項１の化合物。
３．Ｘがクロロであり、Ｘ１が水素である請求項１の化合物。
４．Ｘがプロモであり、Ｘ１が水素である請求項１の化合物。
５．Ｒ１がメトキシである、請求項２−４のいづれかの化合物。
６．Ｒ２がメタ−ホスフェートで置換されたフェノキシ基である、請求項５の化合物。
７．ホスフェート置換基が二ナトリウム塩として存在する、請求項６の化合物。
８．Ｒ２がメタβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基である、請求項５の化合物。
９．３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−ヒドロキシ）トリシクロ［３，３，１，１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１０．３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３．２′一（５′− クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１１．３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′− プロモ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１２．シン−３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−ヒドロキシ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１３．シン−３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１４．シン−３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−プロモ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１５．アンチ−３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′− （５′−ヒドロキシ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１６．アンチ−３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′− （５′−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウム。
１７．アンチ−３−（４−メトキシスピロ［１．２−ジオキセタン−３，２′− （５′−ブロモ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル〕フェニル燐酸二ナトリウム。
１８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、不飽和低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；Ｙは低級アルキル基であり；そしてＹ′は水素、低級アルキル基、低級アルケニル基、炭素原子数２０以下のアルアルキル基、アルカリ金属カチオン、炭素原子数２−約１４のアシル基、▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼、アルカリ金属カチオン（Ｍは個々にプロトン、アルカリ金属カチオン、アンモニウム、置換アンモニウム、四級アンモニウム又はＨ＋ピリジニウムカチオンである）である］のエノールエーテル。
１９．Ｘがヒドロキシルであり、Ｘ１が水素である請求項１８の化合物。
２０．Ｘがクロロであり、Ｘ１が水素である請求項１８の化合物。
２１．Ｘがブロモであり、Ｘ１が水素である請求項１８の化合物。
２２．Ｙがメチルである、請求項１９−２１のいづれかの化合物。
２３．Ｙ１が ▲数式、化学式、表等があります▼ である、請求項２２の化合物。
２４．各Ｍがナトリウムである、請求項２３の化合物。
２５．３−（４−メトキシ−５−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デク−２−イリデンメチル〕フェニル燐酸二ナトリウム。
２６．３−（４−メトキシ−５−クロロトリシクロ［３．３．１．１３，７］デク−２−イリデンメチル）フェニル燐酸二ナトリウム。
２７．３−（４−メトキシ−５−ブロモトリシクロ［３．３．１．１３，７］デク−２−イリデンメチル）フェニル燐酸二ナトリウム。
２８．特異的結合対の−部を光学的に検出しうる反応によって検出する検定方法において、光学的に検出しうる反応が、酵素と、式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂されるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表し、従って、酵素は、酵素によって開裂可能な不安定な置換基を開裂して、１，２−ジオキセタン化合物に結合した負に荷電した置換基を形成し、この負に荷電した置換基は１，２−ジオキセタン化合物を分解して、上記蛍光発色団基よりなる発光物質を形成する］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物との反応を含んでいることが改良点である、上記の検定方法。
２９．Ｘがヒドロキシルであり、Ｘ１が水素である請求項２８の検定方法。
３０．Ｘがクロロであり、Ｘ１が水素である請求項２８の検定方法。
３１．Ｘがブロモであり、Ｘ１が水素である請求項２８の検定方法。
３２．Ｒ１がメトキシである、請求項２９−３１のいづれかの検定方法。
３３．Ｒ２がメタ−ホスフェートで置換されたフェノキシ基である、請求項３２の検定方法。
３４．ホスフニート置換基が二ナトリウム塩として存在する、請求項３３の検定方法。
３５．Ｒ２がメタβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基である、請求項３２の検定方法。
３６．１，２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−ヒドロキ）トリシクロ［３．３．１．１３７］デカン〕−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムである、請求項２８の検定方法。
３７．１．２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ［３．３，１．１３７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムである、請求項２８の検定方法。
３８．１．２−ジオキセタン化合物が３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−ブロモ）トリシクロ［３．３．１．１３７］デカン］−４−イル）フェニル燐酸二ナトリウムである、請求項２８の検定方法。
３９．特異的結合対が抗原及び抗体よりなる、請求項２８の検定方法。
４０．特異的結合対が、核酸及び該核酸の全体又は一部に結合しうるプローブよりなる、請求項２８の検定方法。
４１．特異的結合対が、酵素及び該酵素によって開裂可能な基を含有する１，２ −ジオキセタン化合物よりなる、請求項２８の検定方法。
４２．該酵素によって開裂可能な基がガラクトピラノシドよりなり、該酵素がガラクトシダーゼよりなる、請求項４１の検定方法。
４３．核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのフラグメントである、請求項４０の検定方法。
４４．プローブが核酸に対して相補的な標識オリゴヌクレオチドである、請求項４０の検定方法。
４５．オリゴヌクレオチドプローブがビオチニル化される、請求項４４の検定方法。
４６．ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのフラグメントを配列決定法によって製造する、請求項４４の検定方法。
４７．（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのフラグメントを、相補的標識オリゴヌクレオチドプローブと接触させて、ハイブリダイジングする対を形成し、（ｂ）ハイプリダイズされた対を、酵素で開裂可能な１，２−ジオキセタンを開裂して光エネルギーを放出することのできる酵素と共有結合したオリゴヌクレオチドの標識に強力に結合しうる分子と接触させ、（ｃ）そのような１，２−ジオキセタン基質を加え、（ｄ）生じた光を検出する、工程よりなる請求項４６の検定方法。
４８．オリゴヌクレオチド標識がビオチン又はビオチン誘導体である、請求項４７の検定方法。
４９．オリゴヌクレオチドの標識と強力に相互作用しうる分子がアビジン又はストレプトアビジンである、請求項４７の検定方法。
５０．酵素が酸又はアルカリホスファターゼであり、Ｒ１がメトキシであり、そしてＲ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基である、請求項４７の検定方法。
５１．酵素がガラクトシダーゼであり、Ｒ１がメトキシであり、そしてＲ２がメタβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基である、請求項４７の検定方法。
５２．光エネルギーを感光性フィルムによって検出する、請求項４７の検定方法。
５３．光エネルギーを光電池によって検出する、請求項４７の検定方法。
５４．オリゴヌクレオチドプローブが、１，２−ジオキセタンを分解して光エネルギーを放出しうる酵素で、共有結合によって標識される、請求項４４の検定方法。
５５．オリゴヌクレオチドプローブ上の標識が、抗体−酵素結合に免疫化学的に結合する共役結合抗原よりなり、該抗体は該抗原に向かい、そして該酵素は１，２−ジオキセタン化合物を分解して光エネルギーを放出することができる、請求項４４の検定方法。
５６．酵素が酸又はアルカリホスファターゼであり、Ｒ１がメトキシであり、そしてＲ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基である、請求項５４又は５５の検定方法。
５７．酵素がガラクトシダーゼであり、Ｒ１がメトキシであり、そしてＲ２がメタβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基である、請求項５４又は５５の検定方法。
５８．プローブの核酸への結合を、ナイロン膜上で行う、請求項４０、４４、５４又は５５のいづれかの検定方法。
５９．ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらのフラグメントと、標識オリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションを、ナイロン膜上で行う、請求項４７− ５３のいづれかの検定方法。
６０．固体マトリックスを用いる検定方法であって、該マトリックスヘの非特異的結合を、該マトリックスを重合体四級アンモニウム塩で予備処理することによってブロックする、請求項２８の検定方法。
６１．さらに、促進物質の不在下で生じる上記特定の光エネルギーの発生を増加させる水溶性促進物質の存在下で行う、請求項２８の検定方法。
６２．該水溶性促進物質が血清アルブミンである、請求項６１の検定方法。
６３．該水溶性促進物質が重合体四級アンモニウム塩である、請求項６１の検定方法。
６４．該重合体四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）］又はポリ［ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）］である、請求項６３の検定方法。
６５．該促進物質が、１，２−ジオキセタン化合物の酵素による分解後に生じる１，２−ジオキセタン化合物の負に荷電した生成物と三成分複合体を形成しうる、正に荷電した重合体四級アンモニウム塩及びフルオレセインよりなり、これによって、該負に荷電した生成物とフルオレセインとの間でエネルギーの転移が生じ、光エネルギーがフルオレセインによって放出される、請求項６１の検定方法。
６６．重合体四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）］又はポリ［ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）］である、請求項６５の検定方法。
６７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開製する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物；及び該１，２−ジオキセタン化合物の酵素によって開裂可能な不安定基を開製しうる酵素よりなる、試料中の第１の物質を検出するためのキット。
６８．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素が酸又はアルカリホスファターゼである、請求項６７のキット。
６９．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項６７のキット。
７０．さらに、光エネルギーを検出するためのイメージを再現する手段よりなる、請求項６７−６９のいづれかのキット。
７１．イメージを再現する手段が写真フィルムである、請求項７０のキット。
７２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物、共有結合によって酵素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ；及び核酸−オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションを上で行うナイロン膜よりなる、核酸又はそのフラグメントの、相補的標識オリゴヌクレオチドプローブヘのハイプリダイゼーションによって、試料中の核酸又はそのフラグメントを検出するためのキット。
７３．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素が酸又はアルカリホスファターゼである、請求項７２のキット。
７４．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項７２のキット。
７５．さらに、光エネルギーを検出するためのイメージを再現する手段よりなる、請求項７２−７４のいづれかのキット。
７６．イメージを再現する手段が写真フィルムである、請求項７５のキット。
７７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒトロキＥシ（低級）アルキル基、ハロ、（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物、ビオチン又はビオチン誘導体で共有結合によって標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ；１，２−ジオキセタン化合物を分解して光エネルギーを放出しうる酵素に共有結合したアビジン又はストレプトアビジン；及びその上で核酸又はそのフラグメントをオリゴヌクレオチドプローブにハイプリダイゼーションする、ナイロン膜よりなる、核酸又はそのフラグメントの、相補的標識オリゴヌクレオチドプローブヘのハイプリダイゼーションによって、試料中の核酸又はそのフラグメントを検出するためのキット。
７８．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素が酸又はアルカリホスファターゼである、請求項７７のキット。
７９．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項７７のキット。
８０．さらに、光エネルギーを検出するためのイメージを再現する手段よりなる、請求項７７−７９のいづれかのキット。
８１．イメージを再現する手段が写真フィルムである、請求項８０のキット。
８２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シァノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物、抗原で共有結合によって標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ；１，２−ジオキセタン化合物を分解して光エネルギーを放出しうる酵素に共有結合した抗原に向かう抗体；及びその上で核酸又はそのフラグメントをオリゴヌクレオチドプローブにハイプリダイゼーションする、ナイロン膜よりなる、核酸又はそのフラグメントの、相補的標識オリゴヌクレオチドプローブヘのハイブリダイゼーションによって、試料中の核酸又はそのフラグメントを検出するためのキット。
８３．酵素が酸又はアルカリホスファターゼであり、Ｒ１がメトキシであり、そしてＲ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基である、請求項８２のキット。
８４．酵素がガラクトシダーゼであり、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ− ガラクトシドで置換されたフェノキシ基である、請求項８２のキット。
８５．さらに、光エネルギーを検出するためのイメージを再現する手段よりなる、請求項８２−８４のいづれかのキット。
８６．イメージを再現する手段が写真フィルムである、請求項８５のキット。
８７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物、１，２−ジオキセタン化合物を分解して光エネルギーを放出しうる酵素に共有結合したタンパク質に向いた抗体；及び上で、タンパク質一抗体結合を行う、膜よりなる、試料中のタンパク質を検出するためのキット。
８８．該膜がナイロン、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜である、請求項８７のキット。
８９．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素か酸又はアルカリホスファターゼである、請求項８７のキット。
９０．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２かβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項８７のキット。
９１．さらに、光エネルギーを検出するためのイメージを再現する手段よりなる、請求項８７−９０のいづれかのキット。
９２．イメージを再現する手段が写真フィルムである、請求項９１のキット。
９３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開製しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物、タンパク質に向いた第１の抗体；及び１，２ −ジオキセタン化合物を分解しうる酵素に共有結合した該第１の抗体に向いた第２の抗体よりなる、試料中のタンパク質を検出するためのキット。
９４．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素が酸又はアルカリホスファターゼである、請求項９３のキット。
９５．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項９３のキット。
９６．さらに、促進物質の不在下で生じる特定の光エネルギーの発生を増加させる水溶性促進物質よりなる、請求項６７、７２、７７、８２、８７又は９３のいづれかのキット。
９７．該水溶性促進物質が血清アルブミンである、請求項９６のキット。
９８．該水溶性促進物質が重合体四級アンモニウム塩である、請求項９６のキット。
９９．該重合体四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）］又はポリ［ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）］である、請求項９７のキット。
１００．該促進物質が、１，２−ジオキセタン化合物の酵素による分解後に生じる１，２−ジオキセタン化合物の負に荷電した生成物と三成分複合体を形成しうる正に荷電した重合体四級アンモニウム塩及びフルオレセインよりなり、これによって、該負に荷電した生成物とフルオレセインとの間でエネルギーの転移が生じ、そして光エネルギーがフルオレセインによって放出される、請求項９６のキット。
１０１．重合体四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）］又はポリ［ビニル（ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）］である、請求項１００のキット。
１０２．試料中の酵素の検出法であって、以下の各工程：（ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘ及びＸ１はそれぞれ個々に水素、ヒドロキシル基、ハロ置換基、非置換低級アルキル基、ヒドロキシ（低級）アルキル基、ハロ（低級）アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基、カルボキシルもしくは置換カルボキシル基又はアミド基であり、Ｘ及びＸ１の少なくとも１つは水素以外のものであり；そしてＲ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物を準備し、（ｂ）１，２−ジオキセタン化合物を、酵素を含む試料と接触させ；このとき、酵素は、１，２−ジオキセタン化合物の、酵素によって開裂可能な不安定置換基を開裂して、該１，２−ジオキセタン化合物に結合した負に荷電した置換基を形成し、該負に荷電した置換基は、該１，２−ジオキセタン化合物を分解して蛍光発色団基を含む発光物質を形成し；そして（ｃ）該発光物質を、該酵素の存在を示すものとして検出する、よりなる、上記の方法。
１０３．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がメタホスフェートで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素が酸又はアルカリホスファターゼである、請求項１０２の方法。
１０４．Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシドで置換されたフェノキシ基であり、そして酵素がガラクトシダーゼである、請求項１０２の方法。
１０５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１及びＲ２は個々に又は一緒になって、ジオキセタン化合物が酵素によって開裂しうるとき発光を妨げないかつジオキセタン化合物の４−炭素原子の原子価を満たす有機置換基であり、但し、Ｒ１及びＲ２が個々の置換基であるなら、Ｒ２置換基は芳香族、ヘテロ芳香族又は芳香族環と共役した不飽和置換基であり、そしてＲ１及びＲ２の少なくとも１つは、又はＲ１とＲ２とは一緒になって、酵素によって開裂可能な不安定基が酵素によって除かれたとき発光物質を生じる、酵素によって開裂可能な不安定基で置換された蛍光発色団基を表す］で表される、酵素によって開裂可能な不安定な置換基が分子の残部に結合している結合を意図的に開裂する前は室温で実質的に安定な、分解時に光エネルギーを生じうる、酵素によって開裂可能な化学発光性１，２−ジオキセタン化合物。
１０６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｚは酵素によって開裂可能な基であり、フェニル環上の酸素はオルト、メタ又はパラであり、Ｑは水素、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロアリール、炭素原子数２０以下のヘテロアルキル、アリル基、ヒドロキシ（低級）アルキル、低段アルキル、−ＯＳｉＲ３［Ｒ３は低級アルキル、アリール、アルコキシＣ１−６、炭素原子数１２以下のアルコキシアルキル、ヒドロキシ（低級）アルキル、アミノ（低級）アルキルである］、−ＯＲ４又は−ＳＲ４［Ｒ４はアルケニル、置換（低級）アルケニル、（低級）アルキル又は炭素原子数２０以下のアラルキルである］、−ＳＯ２Ｒ５（Ｒ５はメチル、フェニル又はＮＨＣ６Ｈ５である）、置換又は非置換（低級）アルキル、ニトロ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、トリメチルシリル又はホスホリルオキシ基である］の化合物。
１０７．ニトロセルロース膜をＢＤＭＱ及びＴＢＱで予備処理することが含まれる、請求項６０の検定方法。
１０８．ＰＶＤＦ膜をＢＤＭＱ及びＴＢＱで予備処理することが含まれる、請求項６０の検定方法。