JP2003520017A - 多種酵素アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素の活性を計測する多酵素アッセイ及びサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素の少なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する方法を開示する。本発明の一つの実施態様では、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素の活性を定量し、第二の基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量する。本発明の方法では、両方の定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。本発明の異なる実施態様は、２種以上の内在性酵素の検出ならびに少なくとも１種のレポーター酵素及び少なくとも１種の内在性酵素の検出を考慮する。本発明はまた、多種の酵素の活性を検出するためのキットを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、細胞のサンプル又は集団の一つのアリコート中の少なくとも１種の
内在性酵素及びサンプルの１つのアリコート中の多種の酵素（ただし、酵素の少
なくとも１種は内在性酵素である）の活性を計測する多酵素アッセイを開示する
。本発明はまた、多種の酵素の活性を検出する方法及びキットを開示する。

【０００２】 従来技術の背景 多様なレポーター遺伝子アッセイが、生体医学的及び薬学的研究で、遺伝子調
節及び細胞因子の同定ならびに遺伝子発現に影響する化合物の研究のために使用
されている。Alam and Cook, Anal Biochem, 1990; 188:245-54; Bronstein, et
al., Anal Biochem., 1994; 219:169-81。レポーター遺伝子活性、すなわちレ
ポータータンパク質の産生は遺伝子の調節要素の転写活性に正比例するため、レ
ポーター遺伝子アッセイは遺伝子調節要素の研究に有用である。これらのアッセ
イで使用するためのレポーター遺伝子構築物は、重要な１種以上の遺伝子調節要
素、機能的ｍＲＮＡの転写のための最小シーケンス要件及びレポータータンパク
質のためのコード化シーケンスを含む。Alam, et al., Anal. Biochem., 188:24
5-254, 1990。調節領域内に種々の欠失を含む構築物の分析は、転写及び細胞特
異的発現に必要な調節シーケンスのマッピングを可能にする。

【０００３】 レポーター遺伝子構築物を細胞に導入したのち、発現したタンパク質又はその
活性を定量すると、遺伝子発現の間接的な計測が得られる。たとえば、レポータ
ー遺伝子産物の高感度な定量は、遺伝子発現、信号伝達経路、タンパク質相互作
用の同定及び薬物発見に重要である。さらには、レポーター遺伝子の定量は、遺
伝子プロモーター及びエンハンサー領域のマッピング、遺伝子発現機構の分析な
らびに遺伝子発現のエファクタを求めての化学物質及び天然物質ライブラリのス
クリーニングを可能にする。

【０００４】 化学発光レポーター遺伝子アッセイは、高い感度を、一般には６〜７のオーダ
ーの大きさの広いダイナミックレンジと組み合わせる。化学発光１，２−ジオキ
セタン基質が、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、β−グルクロニダーゼ及
びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含むいくつかのレポーター酵素のための、
高感度アッセイに使用されている。これらの化学発光アッセイは、従来の比色的
、蛍光的及びアジオアイソトープ的検出方法に対する優れた代替を提供する。１
，２−ジオキセタン化学発光基質はまた、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダ
ーゼレポーター酵素のための二重アッセイで使用されてきた。各化学発光基質の
酵素的開裂が、不安定化したジオキセタンアニオンを作り出し、それが断片化し
、光を放出する。

【０００５】 ジオキセタン基質を使用する、レポーター遺伝子アッセイに限定されない高感
度化学発光アッセイが記載されている。引用例として本明細書に取り込むBronst
einの米国特許第４，９７８，６１４号。これらのジオキセタン基質は、酵素誘
発分解ののち、可視光を放出する。疎水性領域を有する特定の水溶性分子、たと
えば球状タンパク質又は合成ポリマーを含むエンハンサー基質による、１，２−
ジオキセタン類の化学発光分解の増強が記載されている。引用例として本明細書
に取り込むVoytaらの米国特許第５，１４５，７７２号。これらのジオキセタン
基質はまた、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロ
ニダーゼのレポーター遺伝子アッセイに使用される。たとえばBronstein et al.
, Anal. Biochem., 219:169-181, 1994及びその中で引用されている文献を参照
。レポーター遺伝子アッセイにおけるジオキセタン基質及びエンハンサーの使用
は、引用例として本明細書に取り込む米国特許出願第０８／５７９，７８７号に
記載されている。米国特許出願第０８／５７９，７８７号は、同じ細胞抽出物ア
リコート中で多種のレポーター遺伝子の産物が順次に定量されるアッセイを記載
している。一般に使用されるレポーター遺伝子を検出する、ラジオアイソトープ
を使用せず、外部光源を要しない簡単で高速で高感度な組み合わせ多レポーター
遺伝子アッセイが記載されている。これらのアッセイは、増強されたレベルの光
を発生させ、したがって、アッセイのダイナミックレンジ及び感度を増し、多様
な計器の使用を可能にする。

【０００６】 １，２−ジオキセタン基質は、β−ガラクトシダーゼレポーター酵素活性の定
量のために、Tropix社から市販されているGALACTO-LIGHT（商標）、GALACTO-LIG
HT PLUS（商標）及びGALACTO-STAR（商標）アッセイ系に組み込まれ、哺乳動物
細胞培養物、組織抽出物、マイクロインジェクションしたカエル胚、寄生原生動
物、酵母及びバクテリアで使用されている。Jain et al., Anal Biochem., 1991
, 199:199-24、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: F
undamental and Applied Aspects, (Campbell et al., ed) Chichester: Wiley,
1994, 20-3、Martin et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molec
ular Reporting with Photons, (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley,
1997, 525-8、Bronstein et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6。GUS-LIGHT（
商標）系は、β−グルクロニダーゼレポーター検出に使用される。Bronstein et
al., BioTechniques., 1994, 17:172-7。ＣＳＰＤ（登録商標）基質は、分泌形
態又は非分泌形態のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）レポーター酵
素の定量のためにPHOSPHA-LIGHT（商標）アッセイ系で使用される。Bronstein e
t al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamental and Applied As
pects (Campbell et al., eds.) Chichester: Wiley, 1994, 20-3、Bronstein e
t al., et al., Clin. Chem., 1996, 42:1542-6、Bronstein et al., BioTechni
ques, 1994, 17:172-7。Tropix社によるDUAL-LIGHT（登録商標）系は、β−Ｇａ
ｌ及びルシフェラーゼレポーター酵素の単管アッセイで、１，２−ジオキセタン
をルシフェリンと組み合わせている。Martin et al., BioTechniques, 1996, 21
:520-4、Bronstein et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecul
ar Reporting with Photons (Hastings et al., eds.) Chichester: Wiley, 199
7, 451-7。

【０００７】 現在、多レポーター遺伝子アッセイは一般に、トランスフェクションの効率を
制御するために使用されている。このようなアッセイでは、細胞は、それぞれが
異なるレポーター遺伝子を有する２種の別々のプラスミドの混合物でトランスフ
ェクトされる。一方のレポーター遺伝子の発現が、研究される種々の調節領域に
よって制御され、対照として働く他方のレポーター遺伝子は一般に、標準のプロ
モーター又はエンハンサーによって構造的に発現される。試験用レポーター酵素
の活性は、対照レポーター酵素の活性に対して正規化される。

【０００８】 単一アッセイにおける多種の酵素活性の計測は、いくつかの能力を提供する。
トランスフェクション正規化は、試験用レポーター酵素及び対照レポーター酵素
の定量によって実施することができる。薬学的スクリーニング法は、特異的転写
因子に対する化合物の効果を遺伝子発現に対する非特異的効果から区別するのに
、すなわち、いくつかの薬物標的の多重スクリーニングのために、多種のレポー
ターから恩恵を受ける。これらの利点は、１９９５年１２月２８日出願の同時係
属中の米国特許出願第０８／５７９，７８７号に記載されている。

【０００９】 レポーター遺伝子発現は遺伝子調節を計測するのに有用であるが、また、細胞
数、細胞接着、細胞毒性及び細胞増殖を計測するための機構を有することが望ま
しい。そのようなレポーター遺伝子を制御するための使用される促進物質は、遺
伝子発現を試験するために細胞に加えられる外来性化合物から独立して作用する
ことが好ましいため、レポーター酵素は、これらの計測を実施するには有用性が
限られるかもしれない。当業者は、試験細胞に何が加えられるかにかかわらず、
細胞によって一定レベルで発現される遺伝子構築物を要するであろう。たとえば
、試験化合物によって影響されない強力な促進物質に結合したレポーター酵素を
使用しなければならないであろう。

【００１０】 レポーター酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細
胞タンパク質に対して正規化する、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞
増殖、細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイ
を提供する。細胞数、細胞増殖、細胞接着及び細胞健全性を計測するための、そ
のような計測を実施するのにレポーター酵素の使用を要しない方法を有すること
が望ましい。

【００１１】 細胞増殖、成長阻害、細胞接着又は細胞毒性効果を正規化又は計測するために
細胞数を定量するための技術は現在公知であり、細胞酵素活性、生体染色及び細
胞代謝を計測するための種々の方法を含む。レポーター酵素活性の計測及び細胞
数の計測のためにサンプルの別個の部分を試験する必要性は、アッセイの精度を
下げ、実験誤差を結果に招き入れるおそれがある。したがって、同じ細胞抽出物
アリコートに対して順次に実施される多酵素アッセイは、アッセイ手順を簡素化
し、実験誤差を最小限に抑えるであろう。多種の酵素の使用は、薬物発見のため
の高処理能力スクリーニングの効率及び情報内容を改善することができる。した
がって、二つ以上の単一サンプルアリコートの試験を要することなく、これらの
要因を計測する方法を有することが有用であろう。

【００１２】 Sherfらへの米国特許第５，７４４，３２０号は、２種の異なるレポーター酵
素を同時に発現するように遺伝子操作された細胞によって産生される２種の個別
のレポーター酵素を計測する二酵素レポーター系を記載している。Sherfらは、
２種のルシフェラーゼレポーター酵素の使用及びそれらの酵素の活性を計測する
ための消光活性化試薬の使用を記載している。しかし、Sherfらは、内在性酵素
（endogenous enzyme）を計測する方法を記載していない。

【００１３】 したがって、アッセイにおいてたとえば細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞
毒性を計測するために多種の酵素（少なくとも１種は内在性酵素である）を計測
する方法を開発することは依然として当業者にとって目的である。当業者にとっ
てのさらなる目的は、サンプルの１つのアリコート中の少なくとも１種のレポー
ター酵素及び少なくとも１種の内在性酵素を計測する方法を開発することである
。

【００１４】 発明の概要 本発明の目的は、一つのアリコート中の少なくとも１種の内在性酵素の活性を
計測し、それにより、一つのサンプル中の細胞数の内部正規化を提供する多酵素
アッセイを提供することである。

【００１５】 本発明の別の目的は、多種の酵素の活性を計測するための、多種の酵素が少な
くとも１種の酵素及び少なくとも１種の内在性酵素であり、少なくとも１種のレ
ポーター酵素がジオキセタン類と反応することができる酵素であるアッセイを提
供することである。１，２−ジオキセタン基質の使用は、内在性細胞酵素の定量
のための高感度で融通性で容易な化学発光アッセイ系を提供する。

【００１６】 本発明のさらに別の目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも
１種の酵素は内在性酵素である）の活性を計測する方法を提供することである。
方法は、第一の酵素による第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測す
ることによって第一の酵素の活性を定量することと、次いで、第二の酵素による
第二の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第二の酵素
の活性を定量することなどを含む。すべての定量が同じサンプル抽出物アリコー
トに対して実施される。

【００１７】 単一アッセイにおける多種の酵素の活性の計測は利点を提供する。レポーター
酵素及び内在性細胞酵素の活性の計測は、レポーター酵素活性を細胞タンパク質
に対して正規化するための、すなわち、レポーター活性と、細胞数、細胞増殖、
細胞接着又は細胞毒性との同時定量を潜在的に可能にするためのアッセイを提供
するため、有利である。

【００１８】 本発明のさらなる目的は、サンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１
種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供することである。
キットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素のための基質（基質の少なく
とも１種はジオキセタン類である）と、場合によっては、水溶性ポリマーエンハ
ンサー分子を含む促進物質溶液とを含む。

【００１９】 多種の酵素の活性は、使用する計器又は検出装置に依存して、順次に検出する
こともできるし、同時に検出することもできる。

【００２０】 発明の詳細な説明 上記目的は、１，２−ジオキセタン類の高い感度に頼る化学発光アッセイによ
って満たされる。本発明の譲受人であるTropix社によって開発されたこれらのジ
オキセタン類は、多様な米国特許の主題である。一般に、ジオキセタン類とは、
４個の構成員を有し、それらの２個が隣接する酸素原子である環を有する分子で
ある。ジオキセタン類は、熱的、化学的又は光化学的に分解されてカルボニル生
成物、たとえばエステル、ケトン又はアルデヒドを形成することができる。この
分解がエネルギーを光の形態で放出（すなわち発光）する。具体的には、ジオキ
セタン基質はそれぞれ、対応する酵素によって開裂させることができる酵素開裂
性基を含む。開裂すると、負の電荷を帯びた基（たとえば酸素アニオン）がジオ
キセタンに結合したまま残る。このジオキセタンアニオンがジオキセタンを不安
定化し、するとジオキセタンは分解して発光性物質を形成し、これが光を発生さ
せる。この光信号が酵素の存在及び量の指標として検出される。したがって、過
剰な基質の存在における発光信号の強さを計測することにより、対応する酵素の
濃度を測定することができる。

【００２１】 レポーター酵素の高感度化学発光検出は、研究規模及び自動化可能な高処理能
力薬学的スクリーニングプラットフォームの両方で使いやすいアッセイフォーマ
ットで、１，２−ジオキセタン基質を用いて達成されている。１．２−ジオキセ
タン基質の使用は、多レポーター酵素及びレポーター／内因性酵素アッセイをは
じめとする二重検出アッセイのために、ルシフェラーゼ反応試薬と組み合わされ
ている。たとえば米国特許出願第０８／５７９，７８７号を参照。以前に開発さ
れたDUAL-LIGHT（登録商標）アッセイ系は、ルシフェラーゼ／β−ガラクトシダ
ーゼレポーター活性の二重検出に広く使用されている。

【００２２】 本発明は、多種の酵素、たとえばレポーター酵素活性及び内在性酵素活性、た
とえばルシフェラーゼ／ＡＰ、β−ガラクトシダーゼ／ＡＰ及びルシフェラーゼ
／β−ガラクトシダーゼ／ＡＰの検出を可能にする多酵素検出アッセイに関する
。これらの多酵素アッセイは、両方の酵素素活性の検出感度を最適化し、アッセ
イ実行をさらに簡素化する。内在性酵素の活性は、レポーター酵素活性に影響す
るために操作されるか、細胞に加えられる要因に依存しない。その結果、内因性
酵素の活性は、レポーター酵素に関連しない細胞数のマーカを提供する。この多
重検出能力が、少なくとも１種の促進物質の活性と、レポーター酵素の転写活性
に依存しない細胞数、細胞成長もしくは増殖、細胞接着又は細胞毒性の細胞定量
読み出し正規化との同時計測を提供する。このような計測は、基本的な細胞機能
の実験室研究から薬物スクリーニングに使用される複雑なアッセイに至るまで、
レポーター酵素を使用するいかなるタイプのアッセイにも有用である。

【００２３】 本発明のアッセイは、サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の検出を可能
にする（本明細書で使用する「サンプル」は、ホールセル又は細胞抽出物を含む
ことができ、細胞は、哺乳動物、酵母又はバクテリアからの細胞であってもよい
）。多種の酵素は、少なくとも１種の酵素が内因性酵素である限り、レポーター
酵素と内在性酵素とのいかなる組み合わせからでも選択することができる。たと
えば、本発明の一つの実施態様では、第一の酵素がレポーター酵素であり、第二
の酵素が内在性酵素である。もう一つの実施態様では、すべての酵素が内在性酵
素である。さらに別の実施態様では、第一及び第二の酵素がレポーター酵素であ
り、第三の酵素が内在性酵素である。さらなる実施態様では、第一の酵素が内在
性酵素であり、第二の酵素がレポーター酵素である。当業者にとって自明である
他の組み合わせを、本明細書の教示に準じるアッセイ及び方法で使用することが
できる。

【００２４】 本発明に有用である酵素は、酵素活性を示し、基質を分解させて光信号を発生
させる、遺伝子から産生されるタンパク質を含む。そのような酵素の例は、ルシ
フェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファター
ゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及び他の酵素を含む。好ましい実
施態様では、酵素の少なくとも１種は加水分解酵素である。２種以上のレポータ
ー酵素を使用する実施態様では、第二のレポーター酵素が加水分解酵素であるこ
とが好ましい。他の実施態様では、酵素のすべてが加水分解酵素である。加水分
解酵素の例は、アルカリ及び酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラ
ーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグ
ルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ
−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−
Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダー
ゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリプシンを含む。

【００２５】 アルカリホスファターゼが使用される場合、基質は、ホスフェート含有ジオキ
セタン、たとえば３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３
″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩又は
二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５
′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１^3.7〕デカン〕−４−イル〕フェ
ニルホスフェート又は二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１
．２−ジオキセタン−３,２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．
１^3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート又は二ナトリウム２
−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１．２−ジオキセタン−３，２′−トリ
シクロ〔３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェー
ト（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、CDP-Star（登録商標）及びADP-Star（商標
））を含むことが好ましい。

【００２６】 β−ガラクトシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、ガラクト
シダーゼ開裂性基又はガラクトピラノシド基を含有するジオキセタン類を含むこ
とが好ましい。アッセイにおける発光は、ジオキセタン基質からの糖基の酵素的
開裂の結果として生じる。そのような基質の例は、３−（２′−スピロアダマン
タン）−４−メトキシ−４−（３″−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−
１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジ
オキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕−
デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録
商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１．２−ジオキセタン−３,２
′−（５′−クロロ）トリシクロ｛３．３．１^3.7〕デカン−４−イル−フェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））及び２−クロ
ロ−５−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロ
ロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１^3.7〕デカン〕−４−イル）フェニルβ−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star（登録商標））及びＡＭＰＧＤを含む
。

【００２７】 β−グルクロニダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グル
クロニダーゼ開裂性基、たとえばグルクロニド含むジオキセタン、たとえばナト
リウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−
クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−
β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラー
ゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。
プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタ
ンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。

【００２８】 β−グルコシダーゼを酵素として使用するアッセイでは、基質は、β−グルコ
シダーゼ開裂性基、たとえばグルコシダーゼを含むジオキセタン、たとえばナト
リウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−
クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−
β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））を含む。カルボキシルエステラー
ゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタンのエステル基を開裂させる。
プロテアーゼ及びホスホリパーゼを使用するアッセイでは、酵素は、ジオキセタ
ンに結合した適当な酵素開裂性基を開裂させる。

【００２９】 レポーター酵素が使用されるとき、それは、好ましくは、ルシフェラーゼ、ガ
ラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエ
ステラーゼ、酸ホスファターゼ及びグルコシダーゼからなる群より選択される。
より好ましいアッセイでは、レポーター酵素はルシフェラーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ又はアルカリホスファターゼである。

【００３０】 好ましくは、検出される内在性酵素は、細胞により、使用される特定の化学発
光系及び計器によって検出可能な量で産生される。当業者は、適切な内在性酵素
を容易に選択することができる。有用な内在性酵素の例は、アルカリホスファタ
ーゼ、酸ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダー
ゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼを含む。好ましい内在性酵素は、アルカリホ
スファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ及びガラクトシダーゼである
。もっとも好ましい内在性酵素はグルコシダーゼである。

【００３１】 サンプルの単一のアリコート中の２種以上の内在性酵素の活性を計測すること
が望ましいかもしれない。本発明は、そのような計測を実施するために容易に使
用することができる。計測される酵素のすべてが内在性酵素であるアッセイの例
は、アルカリホスファターゼ及びエステラーゼ、酸ホスファターゼ及びアルカリ
ホスファターゼ、プロテアーゼ及びアルカリホスファターゼならびにホスホリパ
ーゼ及びアルカリホスファターゼを含む。

【００３２】 本発明において、酵素、すなわちレポーター酵素及び内在性酵素の基質は、光
信号を発することができる発光基質を含む。好ましくは、酵素ごとに基質は異な
り、少なくとも１種の基質は、置換又は非置換のアダマンチル基、置換されてい
てもよいし非置換であってもよいＹ基及び酵素開裂性基を含むジオキセタン類で
ある。好ましいジオキセタン類の例は、３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジ
オキセタン−３，２′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕−
デカン〕−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton（登録
商標））、５−クロロ−３−（メトキシスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２
′−（５′−クロロ）トリシクロ〔３．３．１^3.7〕デカン−４−イル−フェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Plus（登録商標））、二ナトリウ
ム６−（４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ
〔３．３．１．１^3.7〕デカン〕−４−イル）−２−フェニルベンゾチアゾリル
−４−ホスフェート、二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１
，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ｛３．３．１．
１^3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（CDP-Star（登録商
標））、ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２
′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル
）フェニル−β−Ｄ−グルクロネート（Glucuron（商標））、３−（４−メトキ
シスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−（５′−クロロ）−トリシクロ〔
３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（Glucon（商標））、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオ
キセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１^3.7〕デ
カン）−４−イル）フェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Galacton-Star
）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２′
（５′−クロロ）−トリシクロ−〔３．３．１．１^3.7〕デカン）−４−イル）
フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）、二ナトリウム３−クロロ−５−（４−メト
キシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′（５′−クロロ）−トリシクロ−
〔３．３．１．１^3.7〕デカン）−４−イル）−１−フェニルホスフェート（Ｃ
ＤＰ）、二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，
２′−トリシクロ〔３．３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）フェニルホスフ
ェート（ＡＭＰＰＤ）、CDP-Star（登録商標）及び二ナトリウム２−クロロ−５
−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ〔３．
３．１．１^3.7〕デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（ADP-Star
）を含む。これらの基質は、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。

【００３３】 好ましくは、ジオキセタン含有基質は、式Ｉ

【００３４】

【化３】

【００３５】 （式中、 Ｔは、炭素原子６〜１２個を環中に有する置換又は非置換のシクロアルキル環
又は２個以上の縮合環を有し、各環が、独立して、炭素原子５〜１２個を有する
ポリシクロアルキル基であり、Ｔは、スピロ結合（たとえばクロロアダマンチル
又はアダマンチル基）によって４員ジオキセタン環に結合しており、 Ｙは、蛍光クロモフォアであり、 Ｘは、水素、炭素原子１〜７個を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしく
はヘテロアルキル基（たとえばメトキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシエ
チル、トリフルオロエトキシ又はヒドロキシプロピル）、少なくとも１個の環を
有するアリール基（たとえばフェニル）、少なくとも１個の環を有するヘテロア
リール基（たとえばピロリル又はピラゾリル）、炭素原子２〜７個を環中に有す
るヘテロアルキル基（たとえばジオキセタン）、少なくとも１個の環を有するア
ラルキル基（たとえばベンジル）、少なくとも１個の環を有するアルカリール基
（たとえばトリル）又は酵素開裂性基（すなわち、酵素によって開裂されると、
ジオキセタンに結合した電子リッチな基を生じることができる部分を有する基、
たとえば、リン−酸素結合を酵素、たとえば酸ホスファターゼもしくはアルカリ
ホスファターゼによって開裂させて、ジオキセタン又はＯＲに結合した負の電荷
を帯びた酸素を生じることができるホスフェート）であり、 Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基（上記のとおり）である。 ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、負の電
荷を帯びた基が基Ｙを含む） を有する。発光信号は、対応する酵素の活性の指標として検出される。発光の強
さを計測することにより、対応する酵素の活性を測定することができる。

【００３６】 ＸがＯＲであるとき、基Ｒは、炭素原子１〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のア
ルキル、アリール、シクロアルキル又はアリールアルキルである。Ｒは、Ｐ、Ｎ
、Ｓ又はＯであることができる１又は２個のヘテロ原子を含むことができる。置
換基Ｒはハロゲン化されている。ハロゲン化の程度は、アダマンチル基、アリー
ル基上の置換基の選択及び想定される特定の用途に望まれる酵素反応速度に応じ
て異なる。もっとも好ましくは、Ｒはトリハロアルキル基である。好ましい基は
、トリハロ低級アルキル基、たとえばトリフルオロエチル、トリフルオロプロピ
ル、ヘプタフルオロブチロール、ヘキサフルオロ−２−プロピル、α−トリフル
オロメチルベンジル、α−トリフルオロメチルエチル及びジフルオロクロロブチ
ル基を含む。置換基Ｒの炭素原子は、ハロゲンによって部分的又は完全に置換さ
れていてもよい。Ｒがアリールであるとき、好ましい基は、１個以上のクロロ、
フルオロ又はトリフルオロメチル基によって置換されているフェニル環、たとえ
ば２，５−ジクロロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３，５−トリ
フルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル又は３−トリフルオロメ
チルフェニルを含む。フッ素及び塩素が特に好ましい置換基であるが、特殊な状
況では臭素及びヨウ素を用いてもよい。

【００３７】 基Ｙは、酵素開裂性基Ｚに結合した蛍光クロモフォア又はフルオロフォアであ
る。Ｙは、基Ｚの酵素開裂によって生じるジオキセタン分解によって発光する。
Ｚが開裂すると、電子リッチな基が形成し、それがジオキセタンを不安定化して
、その分解を招く。この分解は、２種の別個のカルボニル化合物を生じさせ、そ
の一方が基Ｔを含み、その他方が基Ｘ及びＹを含む。分解から放出されるエネル
ギーが、Ｘ及びＹ基を含む化合物をして発光させる（基Ｘが水素であるならば、
アルデヒドが生成される）。Ｙは、好ましくはフェニル又はアリールである。ア
リール基は、式Ｉにおけるように基Ｚを有し、さらに、米国特許第５，５８２，
９８０号に記載のように１〜３個の電子活性基、たとえば塩素又はメトキシを有
する。

【００３８】 いかなるクロモフォアをＹとして使用してもよい。一般に、感度を増すため、
量子収率を最大限にするクロモフォアを使用することが望ましい。したがって、
Ｙは普通、芳香族基を含む。適当なクロモフォアの例は、米国特許第４，９７８
，６１４号でさらに記載されている。

【００３９】 結合した基Ｚは、酵素開裂性基である。酵素との接触すると、基Ｚは開裂し、
それにより、クロモフォアＹに結合した電子リッチな基を生じさせる。この電子
リッチな基が、ジオキセタンを２種の別個のカルボニル含有化合物、たとえば、
基Ｘが水素である場合には、ケトン又はエステルとアルデヒドとに分解させる。
電子リッチな基の例は、酸素、硫黄及びアミンもしくはアミノアニオンを含む。
もっとも好ましい基は酸素アニオンである。適当なＺ基の例及びそれらの基に特
異的な酵素は、引用例として本明細書に取り込む米国特許第４，９７８，６１４
号の表１に掲載されている。このような酵素は、アルカリ及び酸ホスファターゼ
、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼ、Ｄ，β−キシロシダー
ゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ
、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダー
ゼ、β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ及びトリ
プシンを含む。

【００４０】 本発明のジオキセタン類はまた、基Ｔ、Ｙ及びＸのいずれかに付いた１個以上
の可溶化置換基を含むことができる。可溶化置換基とは、水溶液へのジオキセタ
ンの溶解性を高める置換基である。可溶化置換基の例は、カルボン酸、たとえば
酢酸、スルホン酸、たとえばメタンスルホン酸及び第四級アミノ塩、たとえば臭
化アンモニウムを含む。もっとも好ましい可溶化置換基は、メタン又はエタンス
ルホン酸である。

【００４１】 本発明の実施で有用である他のジオキセタン類は、すべて引用例として本明細
書の取り込む米国特許第５，０８９，６３０号、米国特許第５，１１２，９６０
号、米国特許第５，５３８，８４７号及び米国特許第５，５８２，９８０号に記
載され、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。

【００４２】 本発明のアッセイの基質を加える順序は、使用される酵素に依存して異なる。
特定の実施態様では、第一のレポーター酵素基質と内在性酵素の基質とを同時に
加える。他の実施態様では、第一のレポーター基質ののち、内在性酵素の基質を
加える。

【００４３】 好ましくは、計測される第二の酵素の活性を定量する前に、計測される第一の
酵素の活性を低下させる。第一の酵素の活性を低下させることは、第一の酵素を
実質的に不活性化するか、第一の酵素基質の量を減らすことを含む。

【００４４】 正確なアッセイを得るためには、第一の酵素基質の分解によって生じる光信号
が、第二の酵素による第二の酵素基質の分解によって生じる光信号の定量を妨害
してはならない。これは、第一の基質の分解によって生じる光信号を計測したの
ち、第二の酵素の活性を定量する前に、第一の酵素の基質によって生じる信号を
減らすことによって達成される。

【００４５】 他の実施態様では、第一の酵素の活性を低下させることにより、たとえば第一
の酵素とその基質の反応を、第一の酵素の基質が実質的に分解するまで進行させ
ることにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。すなわち、第二の酵
素、たとえば内在性酵素の活性化又は増強の前に、第一の基質の分解によって生
じる光信号を減衰させる。

【００４６】 他の実施態様では、第一の基質の量を減らすことによって第一の酵素の基質に
よって生じる信号を減らす。適切な方法は、当業者が、使用される具体的な酵素
及び基質に基づいて選択することができる。しかし、一つのそのような実施態様
では、好ましくは、第一のレポーター酵素の定量後に残留する第一の基質を分解
させるの十分な量の第一の酵素をさらに加えることにより、基質濃度を低下させ
る。たとえば、第一の酵素、たとえばアルカリホスファターゼによる第一の基質
の分解から生じる光信号を計測したのち、残留する基質を分解させ、潜在的に妨
害性の光信号を防ぐのに十分な量のアルカリホスファターゼをアリコートに加え
る。第二の基質は第二の酵素に対して特異的であるため、過剰な第一の酵素の存
在が第二の光信号の検出を妨害することはない。すべての酵素のためにジオキセ
タン基質が使用されるとき、これは有用である。

【００４７】 異なる実施態様では、第一の基質の量を減らすことは、アリコートを加熱して
第一の基質を分解させることを含む。熱不活性化は、第一の基質の不活性化に続
いて第二の基質を加える実施態様で使用することが好ましい。

【００４８】 さらに好ましい実施態様では、適切な計器、たとえば、米国特許出願第６０／
１４４，８９１号に開示されている、本譲受人のNorthStar（商標）計器を使用
して信号の同時計測を実施することができる。同出願を引用例として本明細書に
取り込む。

【００４９】 レポーター酵素、たとえばルシフェラーゼ及び内在性酵素、たとえばアルカリ
ホスファターゼを計測する本発明の一つの実施態様では、基質ルシフェリン（Du
al-Light（登録商標）試薬）の添加ののち、まずルシフェラーゼ信号を計測する
。ルシフェラーゼ信号の減衰ののち、内在性酵素（ＡＰ）の基質及び適切なエン
ハンサーを含む内在性酵素（ＡＰ）検出バッファ（CDP-Star（登録商標）基質／
Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液）を加え、内在性ＡＰ触媒光放出を計測
する。試薬添加から１５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達する。この
アッセイの結果を図１に示す。あるいはまた、望むならば、ルシフェラーゼ信号
を減らすため、ＡＰ検出バッファを早めに、たとえばルシフェラーゼを計測した
直後に加えることもできる（図示せず）。

【００５０】 レポーター酵素、たとえばβ−ガラクトシダーゼ及び内在性酵素、たとえばア
ルカリホスファターゼを計測する本発明のもう一つの好ましい実施態様では、レ
ポーター酵素の基質（Galacton（登録商標）基質）を各ウェルに加え、１５分間
インキュベートする。次に、エンハンサー（Sapphire-II（商標））含有促進物
質を各ウェルに注入し、β−ガラクトシダーゼ触媒光放出を計測する。β−ガラ
クトシダーゼ信号の減衰ののち、ＡＰの基質（CDP-Star（登録商標））を加え、
内在性ＡＰ触媒光放出を計測する。このアッセイの結果を図２に示す。

【００５１】 ２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素及び１種の内在性
酵素の活性を計測する発明のアッセイの特定の実施態様では、第一のレポーター
酵素の活性の定量の間に第一及び第二のレポーター基質がいずれもアリコート中
に存在する。これらの実施態様では、第二のレポーター酵素及びその基質の存在
が、第一のレポーター酵素の活性又は第一のレポーター酵素による第一の基質の
分解によって生じる光信号の計測を妨害することはない。一つの好ましい実施態
様では、第一の基質の分解によって生じる光は、第二の基質の分解の産物が光を
生じさせないpHで起こる。このような実施態様では、アリコートの環境がこの第
二の酵素反応の産物による発光を阻害するため、第一の定量の間に第二の基質と
の酵素反応の産物が計測可能な信号を発することはない。たとえば、第一の基質
の分解による発光の計測は、中性pHで起こることが好ましい。第一のレポーター
酵素がその基質に作用する間に、第二のレポーター酵素はその基質に作用する。
しかし、このpHでは、第二のレポーター酵素とその基質との反応から有意な発光
は起こらない。pHを上げ、第二の酵素反応の発光を計測する前に所定の期間を経
過させて、その反応の産物を蓄積させ、それにより、さらに強い光信号を生じさ
せることが好ましい。

【００５２】 他の実施態様では、第二の酵素の存在が、第一の酵素反応からの光信号の計測
を妨害しない。理由は、第二の酵素の基質がこの計測中にアリコート中に存在し
ないからである。そのような実施態様では、第二の酵素は活性であるが、それが
作用することができる基質が存在しない。一つの好ましい実施態様では、第一の
レポーター酵素の活性を低下させたのち又は第一の酵素反応によって生じる信号
を減少させたのち、第二の基質を加えることにより、第二の酵素の活性を誘発す
る。たとえば、β−ガラクトシダーゼを第一の酵素として使用し、アルカリホス
ファターゼを第二の酵素として使用するアッセイでは、β−ガラクトシダーゼ反
応の結果として起こる発光は、中性よりも高いpHで最適化される。上げられたpH
は、第二の酵素、アルカリホスファターゼを同時に活性化し、それが光を生じさ
せ、その光が第一の酵素の活性の定量を妨害することになる。したがって、その
ようなアッセイでは、第一の定量に続いて第二の基質を加える、もっとも好まし
くは、光信号が減衰した後で第二の基質を加えることが好ましい。この添加は容
易に達成され、当該技術で一般に知られる検出装置を使用する場合、特に簡単で
ある。

【００５３】 ２種以上のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する好ましい実
施態様では、第二のレポーター酵素基質からの光放出の減衰ののち、内在性酵素
の基質を加える。好ましくは、内在性酵素の基質が光放出を開始させる。あるい
はまた、第二のレポーター酵素の計測の前の時点で内在性酵素の基質を加え、先
に述べた方法、たとえばpHを変化させることによって内在性酵素の活性を高める
。

【００５４】 本発明の特定の好ましい実施態様では、水溶性ポリマー性エンハンサー分子を
、基質の酵素的分解によって生じる光信号に加える。好ましいポリマーエンハン
サーは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン及びポリマー第四級オニウム
塩を含む。好ましいポリマー第四級オニウム塩の例は、ポリビニルベンジルトリ
メチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアン
モニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベ
ンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））、ポ
リビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド及びポリビニルトリブチルス
ルホニウムクロリドを含む。他のポリマーエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメ
チルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Em
erald（登録商標））、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及び
ナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標））を含む。これらのエンハ
ンサーは、Tropix社（Bedford, MA）から市販されている。

【００５５】 他の実施態様では、第二の酵素の活性を定量する前に促進物質溶液を加える。
好ましい促進物質溶液は、酵素による基質の分解からの信号発生を活性化するこ
とができる、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。１
種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素しか使用しない実施態様では、促進物
質溶液が、内在性酵素による内在性基質の分解によって生じる信号を活性化し、
第一のレポーター酵素を不活性化する。２種以上のレポーター酵素を有する実施
態様では、第二のレポーター酵素の定量の前に促進物質溶液を加えると、それが
、第二のレポーター酵素基質の分解によって生じる信号を活性化し、第一のレポ
ーター酵素を不活性化する。

【００５６】 特定の内在性酵素を計測するとき、細胞をさらに処理することが必要になるか
もしれない。たとえば、細胞又は血清中に多量に存在する内在性酵素を計測する
とき、バックグラウンドレベルが高すぎて正確な読みを出すことができないおそ
れがある。そのような場合、アッセイの前に細胞を洗浄することが好ましい。当
業者は、どの内在性酵素が洗浄を要するのかを容易に決定することができ、適切
な洗浄溶液、たとえばＰＢＳを決定することができるであろう。たとえば、ＡＰ
を計測するアッセイでは、アッセイの直前に細胞をＰＢＳで一度洗浄する。

【００５７】 本発明の特定の実施態様では、第一の基質の存在が、第二のレポーター酵素又
は内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を増強する。この増強した信号
が、より高感度なアッセイを提供する。本発明者は理論によって拘束されること
を意図しないが、第二の基質の分解によって生じるエネルギーが残りの第一の基
質に伝達され、それにより、生じる光信号の強さを増強すると考えられる。この
方法の一つの好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンである。この実
施態様では、第二の酵素の基質は、好ましくはジオキセタン基質である。ルシフ
ェリンは非常に効率的なエネルギー受容体であり、ジオキセタン分解から発生す
る励起状態からのエネルギー伝達の結果として光信号を放出すると考えられる。
これが、より大きな信号強さを生じさせる。

【００５８】 本発明の特定の好ましい実施態様はさらに、レポーター酵素又は内在性酵素に
よるジオキセタン基質の酵素的分解から生じる光信号を増強する水溶性エンハン
サー分子を加えることを含む。

【００５９】 一般に高分子性である特定の水溶性天然及び合成物質が、一部には疎水性環境
を提供することにより、化学発光信号の強さを増強する。これらの物質、たとえ
ば、疎水性領域を含む水溶性球状タンパク質、哺乳動物血清アルブミン、たとえ
ばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は水溶性
ポリマー性第四級オニウム塩、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロ
リド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ
）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウ
ムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire-I（商標））ならびにポリビニルベンジルト
リブチルホスホニウムクロリドは、水溶液中の酵素的に開裂可能な１，２−ジオ
キセタン類の分解によって生じる化学発光信号の強さを増大させる。コポリマー
、たとえば水溶性第四級アンモニウム−ホスホニウム、アンモニウム−スルホニ
ウム及びスルホニウム−ホスホニウムポリマーがエンハンサー分子として有用で
ある。他の好ましいエンハンサーは、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）
アンモニウムクロリド、フルオレセインナトリウム（Emerald（登録商標））、
ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及びフルオレセインナトリウ
ム（Emerald II（商標））を含む。

【００６０】 有効量のエンハンサー物質の存在のおかげで、水性媒体中で放出される光の強
さは、そのようなエンハンサーの不在で放出される光の強さに比べて有意に増大
する。これらの化合物は、１，２−ジオキセタン類からの化学発光信号の強さを
少なくとも１０％、普通は少なくとも１０倍、しばしば少なくとも１０〜１，０
００倍に増強する。

【００６１】 そのようなエンハンサー物質に含まれるものは、疎水性領域を含む高分子球状
タンパク質、一般には、ＳＤＳゲル電気泳動による測定で約１０００〜約６００
，０００ダルトンの範囲の分子量を有するものである。そのような物質は、哺乳
動物血清アルブミン、たとえばＢＳＡ、ＨＳＡなど、球状タンパク質、たとえば
哺乳動物ＩｇＧ、ＩｇＥ、タンパク質Ａ、アビジンなど及び血清リポタンパク質
、アポリポタンパク質などを含む。

【００６２】 本発明を実施する際に使用することができる合成オリゴマー又はポリマーエン
ハンサー物質は、一般式II

【００６３】

【化４】

【００６４】 （式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができる） を有する水溶性ポリビニルアリール第四級オニウム塩、たとえばポリビニルベン
ジル第四級アンモニウム、スルホニウム及びホスホニウム塩を含む。

【００６５】 この式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃それぞれは、炭素原子１〜２０個を有する直鎖状
又は分岐鎖状の非置換アルキル基、たとえばベンジル、メチル、エチル、ｎ−ブ
チル、ｔ−ブチル、セチルなど、１個以上のヒドロキシ、アルコキシ、たとえば
メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ、アリ
ールオキシ、たとえばフェノキシで置換されている、炭素原子１〜２０個を有す
る直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、アミノもしくは置換アミノ、たとえばメチ
ルアミノ、アミノ、たとえばアセトアミドもしくはコレステリルオキシカルボニ
ルアミド、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール、たとえばヘプタフ
ルオロブチル基、環炭素原子３〜１２個を有する非置換モノシクロアルキル基、
たとえばシクロヘキシルもしくはシクロオクチル、１個以上のアルキル、アルコ
キシ又は縮合ベンゾ基で置換されている、環炭素原子３〜１２個を有する置換モ
ノシクロアルキル基、たとえばメトキシシクロヘキシルもしくは１，２，３，４
−テトラヒドロナフチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アルコキシ又
はアリール基で置換されている、それぞれが炭素原子５〜１２個を有する２個以
上の縮合環を有するポリシクロアルキル基、たとえば１−アダマンチルもしくは
３−フェニル−１−アダマンチル、非置換であるか、１個以上のアルキル、アリ
ール、又はフルオロアルカンもしくはフルオロアリール基で置換されている、少
なくとも１個の環及び全部で６〜２０個の炭素原子を有するアリール、アルカリ
ールもしくはアラルキル基、たとえばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェ
ニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもし
くはデヒドロアビエチルであり、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃の少なくとも二つが、それら
が結合する第四級原子といっしょになって、炭素原子３〜５個及びヘテロ原子１
〜３個を有し、ベンゾアニル化されていてもよい、飽和又は不飽和の、非置換又
は置換されている窒素含有環、窒素及び酸素含有環又は窒素及び硫黄含有環、た
とえば１−ピリジル、１−（３アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、
モルホリノ、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾール、ベン
ズチアゾール又はベンゾアミダゾールを形成することができる。

【００６６】 記号Ｘ^-は、ハライド、すなわちフルオリド、クロリド、ブロミドもしくはヨ
ージド、スルフェート、アルキルスルホネート、たとえばメチルスルホネート、
アリールスルホネート、たとえばｐ−トルエンスルホネート、置換アリールスル
ホネート、たとえばアニリノナフチレンスルホネート（種々の異性体）、ルシフ
ァーイエローＣＨ及びジフェニルアントラセンスルホネート、ペルクロレート、
アルカノエート、たとえばアセテート、アリールカルボキシレート、たとえばフ
ルオレセインもしくはフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環式アリールカルボキ
シレート、たとえば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボキシ
レートもしくは置換モノアリールオキシホスフェート、たとえば３−（２′−ス
ピロアダマンタン）−４−メトキシ−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１
，２−ジオキセタンジアニオンもしくは上記式Ｉで示す他のジアニオンのような
基を単独で又は組み合わせて含むことができる対イオンを表す。

【００６７】 記号ｎは、そのようなポリビニルベンジル第四級オニウム塩の分子量が、固有
粘度又はＬＡＬＬＳ技術による測定で、約８００〜約２００，０００、好ましく
は約２０，０００〜約７０，０００の範囲になるような数を表す。

【００６８】 そのような水溶性ポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）の代表例は、
ＴＭＱ、ＢＤＭＱなどである。

【００６９】 Bronstein-Bonteらの米国特許第４，１２４，３８８号に開示され、特許請求
されている、式III

【００７０】

【化５】

【００７１】 （式中、Ｅ＋は、Ｐ、Ｎ又はＳであることができ、各Ｒ₄は、同じ又は異なる脂
環式置換基であり、Ｘ^-は、アニオンである） を有する、ポリビニルアセタールとホルミルベンジル第四級オニウム塩との水溶
性アセタール。また、上記式IIのポリビニルベンジル第四級オニウム塩を調製す
るために使用される個々のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマーを、ポリマ
ーが式IIIに示されている他のビニルベンジル第四級オニウム塩モノマー又は第
四級オニウム官能基を有しない他のエチレン性不飽和モノマーとで共重合させて
、Landらの米国特許第４，３２２，４８９号、Bronstein-Bonteらの米国特許第
４，３４０，５２２号、Landらの米国特許第４，４２４，３２６号、Bronstein-
Bonteらの米国特許第４，５０３，１３８号及びBronstein-Bonteの米国特許第４
，５６３，４１１号に開示され、特許請求されているポリマーを得ることもでき
る。これらのポリマーすべては、本発明を実施する際にエンハンサー物質として
使用することもできる。好ましくは、これらの第四級化ポリマーは、式IIIのポ
リビニルベンジル第四級アンモニウム塩に関して上記した範囲内の分子量を有す
る。

【００７２】 他の水溶性オリゴマー、ホモポリマー及びコポリマー物質は、前記ポリマーに
加えて、又はその代わりにエンハンサー物質として使用することができ、米国特
許第５，１４５，７７２号にさらに記載され、Tropix社（Bedford, MA）から市
販されている。

【００７３】 使用されるエンハンサー物質の量は、選択される特定のエンハンサー物質なら
びに存在する化学発光化合物の量及びタイプに応じて異なる。必要な量は、当業
者が本教示に基づいて容易に決定することができる。さらには、米国特許第５，
１４５，７７２号に含まれる開示が、本発明を実施する際に当業者を支援するで
あろう。

【００７４】 エンハンサー分子は、本発明のいかなる時点で加えることもできる。第二の基
質ではなく第一の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、第一の
酵素の定量の前又はそれと同時に加えることが好ましい。第一の基質ではなく第
二の基質がジオキセタン類であるならば、エンハンサーは、いつ加えてもよいが
、好ましくは、第一の酵素の定量ののち、第二の酵素の定量の前又はそれと同時
に加える。第一及び第二の基質がいずれもジオキセタン類であるならば、エンハ
ンサー分子は、定量の前又は第一の定量と同時に加えることが好ましい。この最
後の実施態様では、一つのエンハンサーを使用して、両方の酵素基質の分解によ
って生じる光信号を増強することができる。あるいはまた、酵素基質ごとに異な
るエンハンサーが使用される。

【００７５】 本発明のいくつかの実施態様では、第一の酵素の基質によって生じる光信号の
定量ののち、一部には、第一の基質によって生じる光信号を減衰させるためのイ
ンキュベーション期間がある。インキュベーション期間の長さは、第一のレポー
ター酵素の濃度及び基質によって生じる光信号の半減期に依存して異なる。第一
の酵素が高濃度で存在するならば、それが、後続の低レベルの酵素の定量を妨害
するおそれがある。長めのインキュベーション期間は、第一のレポーター酵素の
基質から残留する光信号を低下させる。本発明の教示を考慮すると、適切なイン
キュベーション期間の長さは、当業者が容易に決定することができる。

【００７６】 本発明の方法は、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素の活性を順次に検
出するための高速で高感度の非アイソトープ的方法を提供する。具体的には、本
発明はまた、一つのサンプルアリコート中の多種の酵素（少なくとも１種は内在
性酵素である）の活性を計測する方法に関する。この方法は、第一の酵素による
第一の酵素基質の分解によって生じる光信号を計測することによって第一の酵素
の活性を定量することと、次いで、内在性酵素による第二の基質の分解によって
生じる光信号を計測することによって第二の酵素の活性を定量することとを含み
、両定量が同じサンプル抽出物アリコートに対して実施される。基質から生じる
発光信号の強さは、酵素の活性、すなわち、その基質を分解させる能力に換算し
た酵素の有効性及び／又は存在する酵素の量の関数である。

【００７７】 好ましい実施態様では、サンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、
少なくとも１種のレポーター遺伝子産物及び少なくとも１種の内在性酵素である
）の活性を計測する方法は、第一のレポーター酵素の基質である第一基質及び内
在性酵素の基質である第二の基質を細胞抽出物アリコートに加えることを含む。
この好ましい実施態様では、第一の基質はルシフェリンであり、第二の基質はジ
オキセタン類を含み、内在性酵素は加水分解酵素である。まず、第一のレポータ
ー酵素の活性を計測する。次に、エンハンサー分子を含む促進物質溶液を加える
。促進物質溶液は、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化し、同時に、内在
性酵素の基質の化学発光信号を増大させる。次に、内在性酵素の基質を加え、内
在性酵素の活性を計測する。好ましくは、第一のレポーター酵素はルシフェラー
ゼであり、内在性酵素は、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ガラク
トシダーゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ及びエステラー
ゼからなる群より選択される。より好ましい内在性酵素はアルカリホスファター
ゼである。

【００７８】 本発明の方法は、少なくとも１種のレポーター遺伝子でトランスフェクトされ
た細胞の転写活性を計測し、細胞にとって内在性の少なくとも１種の酵素を計測
することによって細胞数、細胞増殖、細胞接着又は細胞毒性の計測を可能にする
のに特に有用である。

【００７９】 細胞のトランスフェクションは、当該技術で公知の方法によって達成される。
たとえば、Alam, J. and Cook, J. K., Anal. Bioch. 188:245-254(1990)を参照
。少なくとも３種の酵素、すなわち少なくとも２種のレポーター酵素及び内在性
酵素を計測する本発明の実施態様では、細胞を、それぞれが異なるレポーター遺
伝子を有する２種の別々のプラスミドのＤＮＡ混合物で同時にトランスフェクト
する。一方のプラスミドは、既知の制御プロモーターによって調節されるレポー
ター遺伝子を有する。このレポーター遺伝子が対照として働く。第二のプラスミ
ドは、研究される調節領域によって制御される第二のレポーター遺伝子を有する
。各レポーター遺伝子のトランスフェクションは、その産物、すなわち「レポー
ター酵素」の活性を計測することによって分析される。第二のレポーター酵素の
活性は通常、第一のレポーター酵素の活性に対して正規化される。同上２４９を
参照。

【００８０】 本発明の特定の方法では、第二の酵素の活性を、その基質の分解によって生じ
る光信号を計測する前に変調させる。第二の酵素の活性は、内在性酵素の基質を
加えるか、内在性酵素を活性化することによって変調させる。特定の実施態様で
は、第二の酵素の活性は、上記で論じたように、アリコートのpHを上げることに
よって変調させる。

【００８１】 特定の好ましい実施態様では、多種の酵素の活性を計測する方法は、第一のレ
ポーター酵素の定量ののち、酵素検出バッファを添加することをさらに含む。好
ましくは、酵素検出バッファは、第二の酵素の基質及びエンハンサーを含む。酵
素検出バッファはまた、以下さらに記載するように、促進物質溶液、すなわち高
pHバッファ中のエンハンサーを含むことができる。

【００８２】 加えて、本発明は、同じサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素は、
３種以上のレポーター遺伝子産物及び内在性酵素を含む）の活性を計測する方法
を提供する。多数の要因、たとえばサンプルの入手性、計器及び試薬の入手性が
、使用される細胞抽出物のアリコートの量を決定する。好ましくは、細胞抽出物
アリコートの量は、抽出物を保持するために使用される装置又はプレートの大き
さ、信号を測定するための装置、環境条件ならびに当業者には周知である他のパ
ラメータに基づいて決定される。

【００８３】 本発明の方法は、いかなるルミノメータで実施することもできるが、自動イン
ジェクタを有するルミノメータ又は光放出の計測を可能にする他の計器で実施す
ることが好ましい。本方法はまた、一つのインジェクタを備えたルミノメータで
実施することもできる。試薬をサンプルに添加したのちほぼ同じ時間間隔をおい
た後で各サンプルの光信号を計測するならば、本方法は、手動注入を使用して実
施することもできる。前記のように、酵素の活性は、使用される計器に依存して
、順次に検出することもできるし、同時に検出することもできる。

【００８４】 一つの好ましい実施態様では、本方法は、まず、第一の基質の分解によって生
じる光信号を計測することによって細胞抽出物アリコート中の第一のレポーター
酵素の活性を定量することと、次いで、第一のレポーター酵素の活性を低下させ
ることとを含む。次に、第二の基質の分解によって生じる光信号を計測すること
により、細胞抽出物アリコート中の第二のレポーター酵素の活性を定量する。好
ましくは、第二の酵素は、ジオキセタン類と反応することができる加水分解酵素
である。第二の酵素は、いかなる酵素であることもできるが、好ましくは、以下
の酵素、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ及びカルボキシルエステラーゼから選択される。もっとも好ましい
実施態様は、第二の酵素がβ−ガラクトシダーゼを含む実施態様である。そして
、内在性酵素の基質の分解によって生じる光信号を計測することにより、同じ細
胞抽出物アリコート中の内在性酵素の活性を定量する。すべての定量が同じサン
プル抽出物アリコートに対して順次に実施される。

【００８５】 もう一つの実施態様で、第一及び第二のレポーター基質及び内在性酵素基質は
異なり、基質の少なくとも１種がジオキセタン類である。本発明は、第二のレポ
ーター酵素による第二のレポーター基質の分解によって生じる信号を誘発するこ
とと、次いで、内在性酵素の活性を誘発することとをさらに含む方法を含む。

【００８６】 ２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素の活性を計測する方法の一つの実
施態様では、第一のレポーター酵素の基質及び第二のレポーター酵素の基質であ
る第二の基質を細胞抽出物アリコートに加える。好ましい実施態様では、第一の
酵素はルシフェラーゼであり、第二の酵素は加水分解酵素であり、第一の基質は
ルシフェリンであり、第二の基質はジオキセタン類である。レポーター酵素は、
好ましくは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、カルボキシルエステラーゼ及びルシフェラーゼから選択される。より好
ましいレポーター酵素はルシフェラーゼである。

【００８７】 この好ましい実施態様では、第一の酵素の基質を第二の酵素の基質と同時に加
え、第二の酵素の基質を同時に加える間にルシフェラーゼ−ルシフェリン反応か
ら生じる光信号を計測することにより、第一のレポーター酵素の基質によって生
じる化学発光信号を計測する。次いで、アリコートのpHを上げることによって第
一のレポーター酵素を実質的に不活性化する促進物質溶液を加える。すると、ア
リコートのpHの上昇が、第二のレポーター酵素−第二の基質反応の蓄積生成物か
らの発光を活性化する。促進物質溶液は、上述したように第二のレポーター酵素
のジオキセタン基質の分解によって生じる光信号を増強するエンハンサー、たと
えばポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドを含む。そして、同じ
細胞抽出物アリコート中で化学発光信号の強さを読むことにより、第二のレポー
ター酵素の活性を計測する。ルシフェリンが第一の基質として使用される実施態
様では、この基質の存在が、第二の基質によって生じる光信号をさらに増強する
。好ましい実施態様では、第二のレポーター酵素からの光放出の減衰ののち、１
，２−ジオキセタン基質を加えて内在性酵素、たとえばアルカリホスファターゼ
からの光放出を開始させる。この例では、基質はCDP-Star（登録商標）１，２−
ジオキセタンである。この順次検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプルの
単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含む３
種の酵素の活性の検出を可能にする。

【００８８】 図３は、ルシフェリン、Galacton（登録商標）及びCDP-Star（登録商標）をそ
れぞれ用いるルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファター
ゼの活性の順次検出を示す。アッセイは、以下、例３で記載するように、β−ガ
ラクトシダーゼレポーター酵素及び内在性アルカリホスファターゼ活性を含み、
精製ルシフェラーゼを添加されているΨ２ＢＡＧα及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞抽出
物の混合物を用いて実施した。抽出物混合物及びルシフェラーゼ添加量を調節し
て、酵素ごとに類似した光の強さを生成した。まず、ルシフェリン基質及びGala
cton（商標）基質の添加ののち、ルシフェラーゼ触媒光放出を計測した。ルシフ
ェラーゼ信号の減衰中にGalacton（登録商標）基質のβ−ガラクトシダーゼ触媒
開裂が進行し、促進物質、エンハンサーを含有する高pH溶液の添加によってGala
cton（登録商標）アニオン中間体の分解からの光放出を誘発した。β−ガラクト
シダーゼ信号の十分な減衰ののち、CDP-Star（登録商標）を加えると、それが、
アルカリホスファターゼによって触媒されるグロー光放出反応を誘発する。また
、内在性アルカリホスファターゼの直前にルシフェラーゼの検出を実行した（図
１）。

【００８９】 ２種以上のレポーター酵素、たとえば２種のレポーター酵素を使用する本発明
の実施態様では、アリコート中の第二のレポーター酵素の存在が第一のレポータ
ー酵素の活性又はその第一の酵素によって生じる光信号の計測を妨害してはなら
ない。これらの実施態様では、本方法はさらに、第一の酵素の活性を定量したの
ち第二のレポーター酵素の酵素活性を高めることを含む。これは、酵素活性を活
性化する当該技術で公知の方法によって達成することができる。特に好ましい実
施態様では、アリコートのpHを調節して、第二の定量の前に第二の酵素が活性に
なる環境を創り出す。たとえば、アルカリホスファターゼを第二のレポーター酵
素として使用する実施態様では、アルカリホスファターゼの活性はアルカリ性pH
で高まるため、アリコートのpHを上げる。

【００９０】 いくつかの好ましい実施態様では、第一のレポーター酵素を実質的に不活性化
することにより、第一の酵素の基質から生じる信号を減らす。第一の酵素を実質
的に不活性化する方法は当該技術で公知である。しかし、これらの方法は、第二
の酵素の活性の計測を妨害してはならない。たとえば、一つの実施態様では、ア
リコートのpHを変化させることにより、第一の酵素を実質的に不活性化する。酵
素に依存して酸又は塩基をアリコートに加えることによってpHを変化させて、第
一の酵素にとって厳しい環境を提供することができる。好ましくは、アリコート
のpHを上げる。この上げられたpHが第一の酵素を不活性化し、それにより、第一
の酵素がその基質をさらに分解し、光信号を発することを防ぐ。もう一つの実施
態様では、アリコートを加熱して第一の酵素を分解させる。あるいはまた、特定
の阻害剤を加えて第一の酵素を不活性化することもできる。阻害剤の例は、アル
コール、たとえばイソプロパノールもしくはエタノール、界面活性剤、たとえば
セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）又は酵素に結合し、酵素を
不活性化する基質類似物を含む。

【００９１】 上述したように、本発明の方法は、内在性酵素の活性を計測する。本方法は、
サンプル中に存在するレポーター酵素の活性から独立して細胞数の計測を提供す
ることにより、アッセイにおける細胞の正規化を可能にする。本方法はまた、同
じくレポーター酵素の活性から独立して、試験条件によって影響されるおそれの
ある細胞増殖の観察を可能にする。たとえば、非特異的効果を生じさせる特定の
化合物、たとえば成長因子を細胞に加える場合、レポーター構築物を制御する機
能とは違って、正常な細胞機能が生じることを確認することが望ましい。本発明
の方法はこの確認を可能にする。

【００９２】 最後に、試験条件、すなわち潜在的薬物、温度又はpHの変化などの細胞毒性効
果を本発明の方法によって評価することができる。細胞毒性の一つの測定は、細
胞から培地の中に解放される内在性酵素の活性の量又は変化を計測することによ
って得ることができる。加えて、存在する生きた細胞の指標として酵素活性を計
測することにより、細胞毒性を潜在的に測定することができる。これは、細胞毒
性の一つの計測値である細胞溶菌の測定を提供する。そのようなアッセイは、培
地中に存在する細胞とで本発明の方法を使用して実施することができる。

【００９３】 本発明はまた、一つのサンプル抽出物アリコート中の多種の酵素（酵素の少な
くとも１種は内在性酵素である）の活性を検出するためのキットを提供する。こ
のようなキットは、各酵素を定量するための試薬と、各酵素の基質（基質の少な
くとも１種はジオキセタン類である）とを含む。キットはまた、水溶性ポリマー
性エンハンサー分子を含む促進物質溶液を含むことができる。場合によっては、
促進物質溶液は、pHを上げ、第一の酵素の活性を低下させ、第二の酵素による第
二の基質の酵素的分解から生じる信号を増大させるか（たとえば三酵素アッセイ
の場合）、第一のレポーター酵素の活性を低下させ、内在性酵素の基質の分解に
よって生じる信号を増大させる（たとえばレポーター／内在性酵素アッセイの場
合）ため、約８〜約１４のpHの水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む。

【００９４】 ポリマー性エンハンサーは、好ましくは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミン又はポリマー第四級オニウム塩を含む。ポリマー第四級オニウム塩は、ポ
リビニルベンジルトリメチル−アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベ
ンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、
ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapp
hire（商標））もしくはポリビニルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド、
ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド及びナトリウム
フルオレセイン（Emerald（登録商標））ならびにポリ（ベンジルトリブチル）
アンモニウムクロリド及びナトリウムフルオレセイン（Emerald II（登録商標）
）を含む。好ましいポリマーエンハンサーは、ポリビニルベンジルトリメチル−
アンモニウムクロリド（ＴＭＱ）、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウム
クロリド（ＴＢＱ）（Sapphire-II（商標））、ポリビニルベンジルベンジルジ
メチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）（Sapphire（商標））又はポリビニル
ベンジルトリブチルホスホニウムクロリドを含む。

【００９５】 以下の例は、本発明を例示するために提供するが、本発明の範囲をいかなるふ
うにも限定することを意図しない。

【００９６】 例 試薬、セルライン及び計器 溶菌溶液、CDP-Star（登録商標）、Galacton（登録商標）及びSapphire-II（
商標）及びポリマー性エンハンサー、Phospha-Light（商標）アッセイバッファ
、Dual LightバッファＡ及びＢならびにプラスミドｐＣＭＶ／β−Ｇａｌを含む
アッセイ試薬がTropix社（Bedford, MA）から市販されている。

【００９７】 セルラインは、Ψ２ＢＡＧα（CRL-9560、ATCC、Rockville, MD）、ＤＭＥＭ
／１０％仔ウシ血清中で培養された安定に挿入されたレトロウイルス構築物から
バクテリアβ−ガラクトシダーゼを構成的に発現するＮＩＨ／３Ｔ３誘導体及び
ＡＰ３Ｔ３ｂ（O' Connor, K. L., et al., Biotechniques, 1994; 17: 502-9）
、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養されたＮＩＨ／３Ｔ３（CRL-1658、ATCC
）マウス胚繊維芽細胞、ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清中で培養された非分泌胎盤
アルカリホスファターゼを構成的に発現する安定にトランスフェクトされたＢａ
ｌｂｃ／３Ｔ３誘導体を含む。すべての培地及び血清は、Sigma（St. Louis, MO
）から得た。プラスミドｐＧＬ３は、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーから
ルシフェラーゼレポーターを構成的に発現する。SuperFect（商標）トランスフ
ェクション試薬は、QIAGEN（Valencia, CA）から得た。供給されたプロトコルに
したがってトランスフェクションを実施した。

【００９８】 組織培養処理した、底が透明で不透明白色の９６ウェル型マイクロプレート（
カタログ番号３６１０、Corning Costar社 Action, MA）でアッセイを実施した
。TR717（商標）マイクロプレートルミノメータ（Tropix）又はTurnerモデル２
０ｅ単管ルミノメータ（Turner Designs, Mountain View, CA）のいずれかで光
放出を計測した。

【００９９】 例１：ルシフェラーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル ｐＧＬ−３でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウェル型マイ
クロタイタプレートに播種し、アッセイの前にＰＢＳで一度洗浄した。まず、Du
al-Light（登録商標）試薬を使用してルシフェラーゼ信号を計測した。次に、０
．１％Triton X-100を含有するDual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを各
ウェルに加え、Dual-Light（登録商標）バッファＢ７５μl／ウェルを注入した
。そして、TR717ルミノメータで光放出を計測した。ルシフェラーゼ信号の減衰
ののち、CDP-Star（登録商標）基質／Sapphire-II（商標）エンハンサー溶液１
００μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。試薬の添加から１
５分以内にＡＰ反応からの光放出が最大値に達した。アッセイの結果を図１に示
す。ＡＰ検出バッファを早め（たとえばルシフェラーゼを計測した直後）に添加
すると、ルシフェラーゼ信号が減少することが注目された（この効果は図示せず
）。

【０１００】 例２：β−ガラクトシダーゼ（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコ
ル ｐＣＭＶ／β−ＧａｌでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を９６ウ
ェル型マイクプレートに２×１０⁴個／ウェルで播種し、アッセイの前にＰＢＳ
で一度洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ、ＭｇＣｌ₂、Triton X-100及びGalacton基
質を含む反応バッファ１００μlを各ウェルに加え、１５分間インキュベートし
た。そして、Sapphire-II（商標）エンハンサー含有促進物質５０μlを各ウェル
に注入し、β−ガラクトシダーゼで触媒された光放出をTR717ルミノメータで計
測した。β−ガラクトシダーゼ信号の減衰ののち、希釈CDP-Star（登録商標）基
質５０μlを加え、内在性ＡＰで触媒された光放出を計測した。アッセイの結果
を図２に示す。

【０１０１】 例３：三酵素アッセイ：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−ガラクトシダーゼ
（レポーター）／ＡＰ（内在性）アッセイプロトコル Dual-Light（登録商標）バッファＡ２５μlを溶解物１０μlに加え、３０秒間
インキュベートした。次に、１：１００Galacton（登録商標）を含むDual-Light
（登録商標）バッファＢ１００μlを加えた。４．５分後、０．３mol/Lジエタノ
ールアミン／２０％エンハンサーを含むバッファＣの１００μlを加えた。最後
に、１０分で、バッファＣ中１．２mmol/L CDP-Star（登録商標）１００μlを加
えた。アッセイを通じてTurnerモデル２０ｅルミノメータで光放出を連続的に計
測した。

【０１０２】 抽出物を、ルシフェラーゼレポーター、β−Ｇａｌレポーター及び最後に内在
性アルカリホスファターゼ酵素の活性に関して順次に試験した。β−ＧａｌのGa
lacton（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を改質促進物質製剤とともに使用
して、改質Dual-Light（登録商標）アッセイ試薬でルシフェラーゼ及びβ−Ｇａ
ｌ活性を計測した。エンハンサー含有促進物質の添加が、Galacton（登録商標）
基質とのβ−Ｇａｌ触媒分解反応からの光放出を開始させ、ルシフェラーゼ触媒
光放出を消光した。Galacton（登録商標）基質からの光放出の減衰ののち、CDP-
Star（登録商標）１，２−ジオキセタン基質を加えてアルカリホスファターゼか
らの光放出を開始させた。この連続検出プロトコルは、一つの細胞抽出物サンプ
ルの単管／ウェルアッセイで、２種のレポーター酵素及び１種の内在性酵素を含
む３種の酵素の活性の検出を可能にする。

【０１０３】 例４：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイ
の反応速度 ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構
成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３
Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（５×１０⁴個／ウェル）中
、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種
した。アッセイの前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで
一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton
X-100及びGlucon（商標）基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（
２５μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。このインキュベ
ーション中、Gluconのβ−グルコシダーゼ触媒脱グリコシル化が、蓄積する中間
体を生成することがわかった。このpHでは、認められるβ−グルコシダーゼ活性
はなかった。次に、プレートをTR717マイクロプレートルミノメータに配置し、
ルシフェリンを含有するバッファ７５μl／ウェルを注入した。注入の直後、ル
シフェラーゼ触媒光放出を１秒間計測した。ルシフェラーゼ信号は「閃光」とし
て現れ、急速に減衰した。約１５分後、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含
む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰り返し計測した（
１秒／ウェル）。高pH促進物質溶液が、蓄積したGlucon（商標）反応生成物の分
解からの光放出を誘発した。アッセイの結果を図４に示す。促進物質の添加が残
留ルシフェラーゼ信号の消光を生じさせ（図示せず）、したがって、ルシフェラ
ーゼ信号が完全に減衰するのを待つ必要はないことがわかった。

【０１０４】 例５：ルシフェラーゼ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイ
の検出範囲 ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーからルシフェラーゼレポーター酵素を構
成的に発現する、ｐＧＬ３−コントロールでトランスフェクトされたＮＩＨ／３
Ｔ３マウス胚繊維芽細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ中、底が透明で側壁が白い組
織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイの前に、培
地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのア
ッセイインキュベーションを室温で実施した。Triton X-100及びGlucon（商標）
基質を含む改質ルシフェラーゼ反応バッファを加え（２５μl／ウェル）、プレ
ートを１５分間インキュベートした。次に、プレートをTR717マイクロプレート
ルミノメータに配置し、ルシフェリンを含むバッファ７５μl／ウェルを注入し
た。注入の直後、光放出を１秒間計測した。約１５分後、Sapphire-II（商標）
エンハンサーを含む促進物質溶液を注入し（１００μl／ウェル）、光放出を繰
り返し計測した（１秒／ウェル）。ルシフェラーゼレポーター酵素及び内在性β
−グルコシダーゼ活性の定量を、トランスフェクトされた細胞１００個未満から
５０，０００個までの細胞数の大きさの３のオーダーに及ぶダイナミックレンジ
で達成した。このアッセイの結果を図５に示す。

【０１０５】 例６：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの反応
速度 ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安
定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ
（１．２×１０⁴個／ウェル）中、底が透明で側壁が白い、組織培養処理した９
６ウェル型マイクロプレートに播種した。アッセイを実施する前に、培地をウェ
ルから取り除き、細胞をＰＢＳ２００μlで一度洗浄した。すべてのインキュベ
ーションを室温で実施した。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ₄、Ｌ−ホ
モアルギニン、Triton X-100及びGlucon（商標）を含むβグルコシダーゼ反応バ
ッファを加え（５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。
次に、Sapphire-II（商標）エンハンサーを含有する促進物質溶液（１００μl／
ウェル）に注入した直後、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミ
ノメータで計測した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）を加え（５
０μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を繰り返し計測した（１秒／ウェル）。
まず、内在性β−グルコシダーゼ触媒反応からの光信号を計測した。この反応で
は、１，２−ジオキセタン基質の酵素的脱グリコシル化が、最初１５分のインキ
ュベーション中に蓄積するアニオン中間体を生成することがわかった。促進物質
溶液の添加がアニオンの分解からの光放出を誘発し、β−グルコシダーゼ酵素活
性を不活性化した。β−グルコシダーゼ触媒光放出は数分以内に減衰した。CDP-
Star（登録商標）なしの反応で見られるように、促進物質の添加後４０分で光信
号はほぼ完全に減衰した。最後に、CDP-Star（登録商標）を加えて胎盤アルカリ
ホスファターゼ触媒光放出を開始させた。基質添加後約２０分で最大強さのグロ
ー光放出反応速度を得た。アッセイの結果を図６に示す。

【０１０６】 例７：ＰＬＡＰ（レポーター）／β−グルコシダーゼ（内在性）アッセイの検出
範囲 ＡＰ３Ｔ３ｂ細胞、非分泌胎盤アルカリホスファターゼを構成的に発現する安
定にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／３Ｔ３誘導体を、ＤＭＥＭ／１０％ＣＳ
中、底が透明で側壁が白い組織培養処理した９６ウェル型マイクロプレートに播
種した。アッセイを実施する前に、培地をウェルから取り除き、細胞をＰＢＳ２
００μlで一度洗浄した。すべてのアッセイインキュベーションを室温で実施し
た。リン酸ナトリウム、pH５．５、ＭｇＳＯ₄、Ｌ−ホモアルギニン、Triton X-
100及びGlucon（登録商標）基質を含むβグルコシダーゼ反応バッファを加え（
５０μl／ウェル）、プレートを１５分間インキュベートした。次に、Sapphire-
II（商標）エンハンサーを含む促進物質溶液（１００μl／ウェル）を注入し、
ただちに、光放出を１秒／ウェルでTR717マイクロプレートルミノメータで計測
した。約１５分の遅延ののち、CDP-Star（登録商標）基質の希釈物を加え（５０
μl／ウェル）、ＰＬＡＰ触媒光放出を計測した（１秒／ウェル）。ＰＬＡＰレ
ポーター酵素及び内在性β−グルコシダーゼ活性の定量を、２倍の大きさの線形
範囲で、すなわち約３００〜５０，０００個／ウェルの範囲で達成した。アッセ
イの結果を図７に示す。二重プロトコルで得られた各酵素の検出感度は、それぞ
れを単独で計測した場合（アッセイプロトコルに１種の基質しか含めないことに
よる）に得られる感度と同一であった。したがって、ＰＬＡＰ検出の感度は、Gl
ucon（商標）からの残留信号によって影響されなかった。

【０１０７】 本明細書で言及するすべての引用例を全体として取り込む。

【０１０８】 本発明を一般的に、また、その好ましい実施態様及び具体例を参照して詳細に
説明した。しかし、本開示を考慮すると、本発明の本質及び範囲に該当する変形
及び改良を当業者が加えうることが理解されよう。請求の範囲の詳説によって除
外されない限り、これらの変形は本発明の範囲に入る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイ
のグラフ表示を提供する。

【図２】 β−Ｇａｌ（レポーター酵素）及びＡＰ（内在性酵素）の二酵素アッセイのグ
ラフ表示を提供する。

【図３】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）、β−ガラクトシダーゼ（レポーター）及
びアルカリホスファターゼ（内在性酵素）の多酵素アッセイのグラフ表示を提供
する。

【図４】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）
の二酵素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。

【図５】 ルシフェラーゼ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）
の二酵素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。

【図６】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵
素アッセイの反応速度のグラフ表示を提供する。

【図７】 ＰＬＡＰ（レポーター酵素）及びβ−ガラクトシダーゼ（内在性酵素）の二酵
素アッセイの検出範囲のグラフ表示を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マーチン，クリストファー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01730、ベッドフォード、ノース・ロード 81エー (72)発明者 オルセン，コリーン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01730、ベッドフォード、ノース・ロード 81エー (72)発明者 ヴォイタ，ジョン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01776、サッドベリー、メイナード・ファ ラム・ロード 99 (72)発明者 ヤン・ユ−シン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01803、バーリントン、ガンレイ・ドライ ブ 17 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ08 QQ21 QQ30 QQ33 QQ35 QQ61 QR41 QR51 QR58 QR67 QR77 QS36 QX02

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の活性を計測する
   ためのアッセイであって、 （ａ）ある酵素に対して特異的な酵素基質の、該酵素による分解によって生じ
   る光信号を計測することによって酵素の活性を定量する工程と、 （ｂ）計測される該アリコート中に存在する酵素ごとに工程（ａ）を繰り返す
   工程とを含み、 該酵素が、レポーター酵素及び内在性酵素からなる群より選択され、 該酵素の少なくとも１種が内在性酵素であるアッセイ。
2. 【請求項２】 少なくとも１種の酵素基質がジオキセタンである、請求項１
   記載のアッセイ。
3. 【請求項３】 該ジオキセタンが、式Ｉ： 【化１】 （式中、 Ｔは、炭素原子６〜１２個を有する置換又は非置換のシクロアルキル環又はス
   ピロ結合によって４員ジオキセタン環に結合したポリシクロアルキル基であり、 Ｙは、蛍光クロモフォアであり、 Ｘは、水素、直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしくはヘテロアルキル基、アリ
   ール基、ヘテロアリール基、ヘテロアルキル基、アラルキル基、アルカリール基
   又は酵素開裂性基であり、 Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基であるが、 ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、 該酵素開裂性基が、酵素によって開裂されると、ジオキセタンに結合した負の
   電荷を帯びた基を形成し、それが分解して発光物質を形成し、 該負の電荷を帯びた基が基Ｙを含む） を有する、請求項２記載のアッセイ。
4. 【請求項４】 少なくとも１種の酵素が加水分解酵素である、請求項１記載
   のアッセイ。
5. 【請求項５】 第二の酵素の活性を定量する前に第一の酵素の活性を低下さ
   せる、請求項１記載のアッセイ。
6. 【請求項６】 該アリコートのpHを変化させることによって該第一の酵素の
   活性を低下させる、請求項５記載のアッセイ。
7. 【請求項７】 該アリコートを加熱することによって該第一の酵素の活性を
   低下させる、請求項５記載のアッセイ。
8. 【請求項８】 阻害剤を加えることによって該第一の酵素を不活性化するこ
   とによって該第一の酵素の活性を低下させる、請求項５記載のアッセイ。
9. 【請求項９】 該第一の酵素と第一の酵素基質との反応を、該第一の酵素基
   質が実質的に分解されるまで進行させることによって該第一の酵素の活性を低下
   させる、請求項５記載のアッセイ。
10. 【請求項１０】 第一の酵素基質の量を減らすことによって該第一の酵素の
    活性を低下させる、請求項５記載のアッセイ。
11. 【請求項１１】 促進物質溶液を加えることによって該第一の酵素の活性を
    低下させる、請求項５記載のアッセイ。
12. 【請求項１２】 内在性酵素が、アルカリホスファターゼ、酸ホスファター
    ゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ及び
    エステラーゼからなる群より選択される、請求項１記載のアッセイ。
13. 【請求項１３】 レポーター酵素が存在し、ルシフェラーゼ、ガラクトシダ
    ーゼ、グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシルエステラーゼ
    、酸ホスファターゼ及びグルコシダーゼからなる群より選択される、請求項１記
    載のアッセイ。
14. 【請求項１４】 該レポーター酵素がβ−ガラクトシダーゼ又はアルカリホ
    スファターゼである、請求項１３記載のアッセイ。
15. 【請求項１５】 エンハンサーを加えて該光信号を増強する、請求項１記載
    のアッセイ。
16. 【請求項１６】 該エンハンサーが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブ
    ミン及びポリマー性第四級オニウム塩からなる群より選択される、請求項１５記
    載のアッセイ。
17. 【請求項１７】 該ポリマー性第四級オニウム塩が、ポリビニルベンジルト
    リメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムク
    ロリド、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニ
    ルベンジルトリブチルホスホニウムクロリド、ポリビニルトリブチルスルホニウ
    ムクロリド、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）アンモニウムクロリド、
    ナトリウムフルオレセイン、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド
    、フルオレセインナトリウム、第四級アンモニウム−ホスホニウムポリマー、ア
    ンモニウム−スルホニウムポリマー及びスルホニウム−ホスホニウムポリマーか
    らなる群より選択される、請求項１６記載のアッセイ。
18. 【請求項１８】 レポーター酵素及び内在性酵素だけが、測定される酵素で
    ある、請求項１記載のアッセイ。
19. 【請求項１９】 レポーター酵素基質及び内在性酵素基質を同時に該アリコ
    ートに加える、請求項１８記載のアッセイ。
20. 【請求項２０】 レポーター酵素基質の前に内在性酵素基質を該アリコート
    に加える、請求項１８記載のアッセイ。
21. 【請求項２１】 レポーター酵素の定量の後、内在性酵素基質及びエンハン
    サーを含む酵素検出バッファーを該アリコートに加える、請求項１８記載のアッ
    セイ。
22. 【請求項２２】 第一のレポーター酵素、第二のレポーター酵素及び内在性
    酵素だけが、測定される酵素であり、該第一のレポーター酵素の定量の間、第一
    のレポーター酵素基質及び第二のレポーター酵素基質が該アリコート中に存在す
    る、請求項１記載のアッセイ。
23. 【請求項２３】 該第一のレポーター酵素の活性の定量の後、該第二のレポ
    ーター酵素の酵素活性を高める、請求項２２記載のアッセイ。
24. 【請求項２４】 該第二のレポーター酵素基質の分解の産物が光を生じない
    pHで、該第一のレポーター酵素基質の分解によって光が生じる、請求項２２記載
    のアッセイ。
25. 【請求項２５】 第一のレポーター酵素、第二のレポーター酵素及び内在性
    酵素だけが、測定される酵素であり、該第一のレポーター酵素の定量の間、第二
    のレポーター酵素基質が該アリコートに存在せず、第二のレポーター酵素基質の
    添加によって該第二のレポーター酵素の活性を誘発する、請求項１記載のアッセ
    イ。
26. 【請求項２６】 該第二のレポーター酵素の定量の後、内在性酵素基質を加
    える、請求項２５記載の方法。
27. 【請求項２７】 サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の活性を検出す
    るためのキットであって、 各酵素を定量するための試薬と、 該酵素のそれぞれのための基質と、 水溶性ポリマー性エンハンサー分子を含む促進物質溶液とを含み、 該多種の酵素の少なくとも１種が内在性酵素であるキット。
28. 【請求項２８】 該基質の少なくとも１種がジオキセタンである、請求項２
    ７記載のキット。
29. 【請求項２９】 該ジオキセタンが、式Ｉ： 【化２】 （式中、 Ｔは、炭素原子６〜１２個を有する置換又は非置換のシクロアルキル環又はス
    ピロ結合によって４員ジオキセタン環に結合したポリシクロアルキル基であり、 Ｙは、蛍光クロモフォアであり、 Ｘは、水素、直鎖状又は分岐鎖状のアルキルもしくはヘテロアルキル基、アリ
    ール基、ヘテロアリール基、ヘテロアルキル基、アラルキル基、アルカリール基
    又は酵素開裂性基であり、 Ｚは、水素、ヒドロキシル又は酵素開裂性基である。 ただし、Ｘ又はＺの少なくとも一方が酵素開裂性基でなければならず、 該酵素開裂性基が、酵素によって開裂されると、ジオキセタンに結合した負の
    電荷を帯びた基を形成し、それが分解して発光物質を形成し、 該負の電荷を帯びた基が基Ｙを含む） を有する、請求項２８記載のキット。
30. 【請求項３０】 該ポリマー性エンハンサーが、ウシ血清アルブミン、ヒト
    血清アルブミン及び第四級オニウム塩からなる群より選択される、請求項２７記
    載のキット。
31. 【請求項３１】 該第四級オニウム塩が、ポリビニルベンジルトリメチル−
    アンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、
    ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジ
    ルトリブチルホスホニウムクロリド、ポリ（ベンジルジメチルビニルベンジル）
    アンモニウムクロリド、ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド及び
    フルオレセインナトリウムからなる群より選択される、請求項３０記載のキット
    。
32. 【請求項３２】 該ポリマー性エンハンサーが約８〜約１４のｐＨを有する
    、請求項２７記載のキット。
33. 【請求項３３】 該サンプルが細胞溶解物の標品である、請求項１記載のア
    ッセイ。
34. 【請求項３４】 該サンプルが培地中のホールセルを含む、請求項１記載の
    アッセイ。
35. 【請求項３５】 アッセイの前に該ホールセルを洗浄する、請求項３５記載
    のアッセイ。
36. 【請求項３６】 該サンプルが培地なしのホールセルを含む、請求項１記載
    のアッセイ。
37. 【請求項３７】 アッセイの前に該サンプルを洗浄する、請求項３６記載の
    アッセイ。
38. 【請求項３８】 計測される各酵素の活性を同時に定量する、請求項１記載
    のアッセイ。
39. 【請求項３９】 計測される各酵素の活性を定量する工程を、計測される酵
    素ごとに順次に実施する、請求項１記載のアッセイ。
40. 【請求項４０】 サンプルの単一アリコート中の多種の酵素の活性を検出す
    るためのキットであって、 該多種の酵素のそれぞれを定量するための試薬と、 該多種の酵素のそれぞれのための基質とを含み、 該多種の酵素の少なくとも１種が内在性酵素であるキット。