JP2880802B2 - インドキシル基質、チオインドキシル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ - Google Patents

インドキシル基質、チオインドキシル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ

Info

Publication number
JP2880802B2
JP2880802B2 JP8506745A JP50674596A JP2880802B2 JP 2880802 B2 JP2880802 B2 JP 2880802B2 JP 8506745 A JP8506745 A JP 8506745A JP 50674596 A JP50674596 A JP 50674596A JP 2880802 B2 JP2880802 B2 JP 2880802B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
chemiluminescence
indoxyl
group
enzyme
ester
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP8506745A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH10506006A (ja
Inventor
マハント，ビジヤイ・ケイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MEDEIRAITO DEIAGUNOSUTEIKA
Original Assignee
MEDEIRAITO DEIAGUNOSUTEIKA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MEDEIRAITO DEIAGUNOSUTEIKA filed Critical MEDEIRAITO DEIAGUNOSUTEIKA
Publication of JPH10506006A publication Critical patent/JPH10506006A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2880802B2 publication Critical patent/JP2880802B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/50—Indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/50—Indoles
    • C12Q2334/52—5-Bromo-4-chloro-3-indolyl, i.e. BCI

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1994年８月４日出願のVijay Mahantの米国
特許出願第08/286,697号、「インドキシル基質に基づく
化学ルミネセンスアッセイ（Chemiluminescence Assay
based on Indoxyl Subtrates）」、の一部継続出願、及
び、1995年３月15日出願のVijay Mahantの米国特許出願
第08/404,545号、「インドキシル基質、チオインドキシ
ル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ
（Chemiluminescence Assay based on Indoxyl Subtrat
es,Thioindoxyl Substrates and Other Substitute
s）」、の一部継続出願である。米国特許出願第08/404,
545は米国特許出願第08/286,697号の一部継続出願であ
る。
米国特許出願第08/286,697号及び米国特許出願第08/4
04,545号の記載内容は参照によって本発明に含まれるも
のとする。
発明の分野 本発明は、インドキシルエステル、チオインドキシル
エステル（即ち、ベンゾ〔ｂ〕チオフェンエステル）ま
たはベンゾ〔ｂ〕フランエステルなどの基質を適当な酵
素によって加水分解し（１種または複数の）化学発光性
中間体またはその代謝産物を生成させる段階から成る化
学ルミネセンスに基づくアッセイに関する。これらの加
水分解反応は、イムノアッセイ、レセプターアッセイ、
プロテアーゼに基づく白血球の定量、核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイ、リポーター遺伝子発現アッセイ及
び核酸配列決定のような、酵素活性を直接または間接に
検出する多様な用途に関連し得る。このようなアッセイ
の用途としては、環境、臨床、医薬、獣医薬、食品及び
腫瘍学のような分野がある。これらのアッセイは極めて
高い感度を提供し、例えば、血清、血液、唾液及び尿な
どの体液を分析するために臨床的に有用である。
発明の背景 生物流体中の物質、並びに、環境及び食品中の化合
物、特に毒素及び汚染物を迅速、正確に且つ定量的また
は定性的に測定することが要望されている。例えば、血
液、尿、唾液、膣分泌物、歯垢、脳脊椎液及びその他の
生物サンプル及び環境サンプル中に存在する薬剤、ホル
モン、ペプチド、タンパク質のようないくつかの化合物
及び感染性生物は正確に且つ迅速に測定する必要があ
る。
このような測定を可能にするために、生物物質及び環
境物質を検出及び／または定量し、また、必要に応じて
単離し得る種々のアッセイが開発されてきた。このよう
な方法は一般には、関与する物質とこの物質に特異的に
反応する化合物との間で生じる特異的結合反応に依存し
ている。生じた反応または複合体を様々な公知の方法に
よって測定または検出する。最も頻用の方法では、複合
体の一方の化合物に予め結合しており以後の反応によっ
て複合体の一部を構成するかまたは複合体と反応して検
出可能な生成物を生成するある種のシグナル増幅試薬ま
たはシグナル増幅成分（moiety）を使用している。例え
ば、核酸プローブをビオチンで標識すると、ビオチンは
アビジンまたはストレプトアビジン（strepavidin）に
結合する。ビオチンまたはアビジン／ストレプトアビジ
ンをリポーター酵素またはラジオラベルで標識する。タ
ンパク質は、酵素またはラジオラベルのようなリポータ
ー分子で標識された抗体によって検出されることが多
い。得られた複合体はリポーター分子を検出することに
よって測定される。アルカリ性ホスファターゼのような
酵素ラベルは、比較的安定であること、シグナル増幅が
可能なこと、ラベルが非同位体であること、放射性同位
体の使用及び処分に伴う危険性及び困難がないこと、な
どの理由から有利に使用される。医院、臨床試験所また
は環境研究所で特別な訓練を要せずに迅速に且つ容易に
使用できるように設計された診断検査では、酵素ラベル
とその基質との反応によって生じた比色シグナル、蛍光
シグナルまたは化学発光シグナルを用いてリポーター分
子を検出することが多い。
化学ルミネセンス 分子ルミネセンスは、分子が励起状態から低エネルギ
ー状態、通常は基底状態に復帰するときに分子から放出
される紫外線（UV）、可視光線及び赤外線（IR）のよう
な電磁（EM）線である。ルミネセンスには、放射線ルミ
ネセンス、化学ルミネセンスがあり、後者にバイオルミ
ネセンス及びホトルミネセンスがあり、ホトルミネセン
スには蛍光及び燐光が含まれる。イムノアッセイのよう
なアッセイに発光ラベルまたは発光反応を組み合わせる
ことによって簡便で感度のよいアッセイが提供される。
発熱性化学プロセスの励起産物が光の放出を伴って基
底状態に復帰するときに化学ルミネセンスが発生する。
殆どの化学発光反応では、分子酸素またはその合成等価
物による反応体の酸化段階が必要である。ルミノール、
アクリジニウムエステル、イソルミノール、ルシゲニン
（lucigenin）、ジオキセタン及びオキサレートエステ
ルのような、化学ルミネセンスを発生し得る分子を用い
るかまたはアクセプターとなる適当な発光性分子もしく
は化合物にエネルギーを伝達し得る分子を用いることに
よって、化学ルミネセンスをアッセイに組込んで使用す
る。最もよく知られた化学発光反応は、アクリジニウム
エステル、ジオキセタン、ルミノール／イソルミノール
及びルシゲニンの反応である。例えば、ルミノール及び
イソルミノールの化学発光反応では、基幹となる酸化段
階が、適当な触媒の存在下の過酸化水素とアミノフタル
ヒドラジドとの反応を含む。
化学ルミネセンスアッセイは、標識方法に基づいて分
類される。これらのアッセイには、アクリジニウムエス
テルのような直接ラベルに依存するものと、アルカリ性
ホスファターゼなどの酵素のような間接ラベルに依存す
るものとがある。
酵素に基づくアッセイ 本発明では酵素に基づくアッセイが特に重要である。
酵素に基づくアッセイは高い固有感度を有し、比較的簡
単な標識手順を有し、均質的で経済的である。更に、酵
素はシグナルを増幅でき、その結果として、アッセイの
感度を向上させる。酵素に基づくアッセイは化学発光
法、比色法、蛍光測定法、または電気化学的検出方法と
の併用に好適である。更に、酵素検出方法は、放射性同
位体の使用に伴う諸問題、例えば健康被害及び耐用寿命
の制約などを克服する。酵素活性のアッセイは、エンザ
イムイムノアッセイ（EIA）、非同位体核酸プローブを
使用するアッセイ、アルカリ性ホスファターゼ（AP）の
ような酵素ラベルを使用する核酸配列決定反応を含む多
数の用途を有している。
酵素基質として作用するインドキシルエステル誘導体
は、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
及びβ−グルコシダーゼ、エステラーゼ及びスルファタ
ーゼのような内在酵素の組織化学検出に使用されている
発色性化合物である。上記のアッセイでは適当なインド
キシル誘導体を基質として使用しており、この基質が、
関与する酵素の存在下で加水分解されて中間体インドキ
シルが生成され、中間体インドキシルが酸素の存在下で
インジゴ染料を形成し過酸化水素が生成される。インジ
ゴ染料が形成されるので従来は分光光度測定によって反
応をモニターしていた（例えば、Cotsonら，（1958）Pr
oc.Royal Soc.（Ser.B） 148:506−519参照）。最近では
（例えば、EP 0,476,930A1;Arakawaら，（1991）Anal.B
iochem．199:238−242参照）、H2O2を測定することによ
って反応を検定するアッセイプロコトルが発表されてい
る。この反応中に形成された過酸化水素の量を、ミクロ
ペルオキシダーゼのような触媒と酸化剤H2O2との存在下
でルミノールまたはイソルミノールのような化学発光成
分を用いて比色法、蛍光測定法、電気化学的方法または
化学発光測定法によって測定する（EP0,476,930A1参
照）。
特に、以下の反応図式に示すように、上記の反応を、
加水分解反応中に生成したH2O2をペルオキシダーゼの存
在下でイソルミノールのような化学発光成分と反応させ
て化学ルミネセンスを発生する反応と組み合わせた（EP
0,476,930A1参照）。
加水分解反応の終了後または加水分解反応の進行中
に、第二段階としてイソルミノールとミクロペルオキシ
ダーゼとを添加し化学ルミネセンスを測定することによ
って過酸化水素の量を測定する。アルカリ性ホスファタ
ーゼ（ALP）、β−ガラクトシダーゼ（β−gal）及びβ
−グルコシダーゼのような酵素はこのアッセイ方法によ
って検定されていた。しかしながらこのアッセイはH2O2
を測定するので、化学ルミネセンスの量が酵素または基
質の量と相関できるように、プロトコルでは化学量論的
量のH2O2が形成される十分なインキュベーションが必要
である。また、H2O2を用いる化学ルミネセンスの発生に
必要な他の試薬、例えばイソルミノールの添加が必要で
ある。更に、形成されたH2O2とルミノールまたはその誘
導体とが反応して化学ルミネセンスが発生する反応部分
に、反応を触媒するペルオキシダーゼ、例えばミクロペ
ルオキシダーゼ（MP）を使用する必要がある。しかしな
がらミクロペルオキシダーゼは安定性に乏しく、最適な
量子効率及び反応速度の促進に必要な反応条件（一般に
pH11−13）では高いバックグラウンドが発生し、このた
め感度が限定される。
また、H2O2を用いて化学ルミネセンスを発生させるた
めにルシゲニン及びその誘導体、例えばアクリジニウム
エステルのような他の化学発光試薬を添加してもよい。
しかしながらこれらの反応においては、H2O2を用いて十
分な化学ルミネセンスを発生させるために、ルシゲニン
の添加後にKOHもしくはNaOHを添加するかまたはルシゲ
ニンをKOH/NaOH溶液として添加することによってpHを上
昇させる必要がある。ルシゲニンとH2O2とを使用すると
きは高いpHが必要である〔例えば、Campbell,Chemiluni
nescence:Principles and Application in Biology and
Medicine,Ellis Horwood,Chichester,England 1988 pp
302−303;Maedaら，（1990）“ルシゲニンを使用するア
ルカリ性ホスファターゼの新規な化学ルミネセンスアッ
セイ及びエンザイムイムノアッセイにおけるその使用
（New Chemiluninescence Assay of Alkaline Phospha
taze Using Lucigenin and its Application to Enzyme
Immunoassay）",Bioluminescence and Chemiluminesce
nce−Current Status,pp.356−360,Proceedings of the
VIth International Symposium on Bioluminescence a
nd Chemiluminescence,Cambridge,September 1990;Maed
aら，（1994）“バイオルミネセンス及び化学ルミネセ
ンス、その原理及び応用（Bioluminescence and Chemil
uminescence,Fundamental and Applied Aspects）",in
Proceedings of the 8th International Symposium on
Bioluminescence and Chemiluminescence,Cambridige,S
ptember 1994,pp.289−292〕。pH条件のこのような変化
は、特に均一系アッセイにおいて抗体、抗原及び酵素の
ようなタンパク質に有害であろう。更に、ルシゲニン及
び／またはそのアクリジニウムエステルは高いブランク
を有しまたH2O2との反応を促進する条件が必要であるた
め、これらを使用してH2O2を測定する方法では優れたア
ッセイを提供することができない（A.Campbell,Chemilu
minescence:Principles and Applications in Biology
and Medicince,Ellis Horwood,Chichester 1988,pp.302
−303）。
また、前立腺特異的抗原（PSA）を測定するためにイ
ンドキシルホスフェート基質とアルカリ性ホスファター
ゼとを用いる同様のアッセイも存在する（例えば、Albr
echtら，（1993），Bioluminescence and Chemilumines
cence,Proceedings of the VIIth International Symp.
on Bioluminescence and Chemiluminescence,Banff,Mar
ch 1993,Eds.Szalayら,John Wiley ＆ Sos,New Yor
k）。基質とアルカリ性ホスファターゼ標識抗原とを20
分間インキュベーション後、反応を停止させ、シュウ
酸、H2O2及びHClと混合して、pHを約１に低下させる。
カルボジイミドを添加して化学発光反応を開始させる。
インドキシルエステルの加水分解は、選択されたイン
ドキシル基質次第で、アルカリ性ホスファターゼのよう
な種々の酵素によって触媒され得る。酵素は多くのアッ
セイでラベルとして使用されてもよくまたは体液中もし
くは他の関与するサンプル中に存在してもよい。このよ
うな酵素測定アッセイは応用範囲が広いので、改良され
た反応評価手段が要望されている。従って、本発明の１
つの目的は、感度、応用範囲、速度及び信頼性が向上し
た化学ルミネセンスに基づく酵素アッセイを提供するこ
とである。
発明の概要 化学ルミネセンスに基づく酵素アッセイがここに提供
される。インドキシルエステル、チオインドキシルエス
テル（即ち、ベンゾ〔ｂ〕チオフェンエステル）または
ベンゾ〔ｂ〕フランエステルの加水分解、特にインドキ
シルエステルの加水分解を触媒する酵素を検出または定
量する化学ルミネセンスに基づくアッセイが提供され
る。関与する酵素は、アルカリ性ホスファターゼのよう
な酵素、またはイムノアッセイもしくは核酸ハイブリダ
イゼーション反応中にラベルとして使用されるかもしく
は体液中に存在するその他の適当な酵素から成り、アッ
セイはこれらの酵素によるインドキシルエステルの加水
分解に基づく。アッセイは、試験サンプルをインドキシ
ルエステルと反応させる段階と、次いで、生じた化学ル
ミネセンスを直ちにまたは短い時間内、一般には約15分
以内に測定する段階とを含む。シグナルを触媒的に増幅
する西洋ワサビペルオキシダーゼのような化学ルミネセ
ンス増強剤を添加するか、または、反応のpHの調整を要
せずに添加されるルシゲニンのようなシグナルを強める
強化試薬を添加することによって、化学ルミネセンスを
増幅してもよい。
本発明のアッセイは、インドキシルエステル、チオイ
ンドキシルエステル（即ち、ベンゾ〔ｂ〕チオフェンエ
ステル）またはベンゾ〔ｂ〕フランエステルと酵素との
間の加水分解反応によって化学ルミネセンスが発生する
という知見に基づく。アッセイの根幹はこれらのエステ
ルの加水分解にあり、インドキシルエステルを用いる従
来のアッセイで行われていたようにH2O2を生成させてそ
の量を測定する必要がない。アッセイは、ルミノールま
たはイソルミノールとペルオキシダーゼ、またはKOH中
のルシゲニンのような、H2O2と反応することが必要な化
学ルミネセンス発生システムの添加を要しない〔Maedq
ら，（1990）“アスコルビン酸二リン酸を基質として用
いるアルカリ性ホスファターゼの化学発光アッセイ及び
化学発光エンザイムイムノアッセイに対するその使用
（Chemiluminescent Assay of Alkaline Phosphatase U
sing Ascorbic Acid 2−Phosphate as Substrate and i
ts Application to Chemiluminescent Enzyme Immunoas
say）",Bioluminescence and Chemiluminesence−Curre
nt status,pp.119−122及びpp.356−360,Proceedings o
f the VIth International Symposium on Bioluminesce
nce and Chemiluminescence,Cambridge,September 199
0〕。
本発明によって提供されるアッセイは従来のアッセイ
と対照的に、加水分解反応中に発生した化学ルミネセン
スを測定する。発生した化学ルミネセンスを増幅するた
めに、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酸化性酵素
もしくは触媒から成る化学ルミネセンス増強試薬もしく
は強化試薬またはルシゲニンのような試薬をpH7−11の
条件下で添加することによってスーパーオキシドアニオ
ン及び他の反応性代謝産物と反応させる。ルミノール／
イソルミノール／ペルオキシダーゼまたはKOHとルシゲ
ニンとの併用のようなH2O2との反応を惹起する化学ルミ
ネセンス発生系の添加または使用は不要である。化学ル
ミネセンス増幅試薬は、反応中に生成されたスーパーオ
キシドアニオン（O2 -）または他の中間体と直接反応す
ることによって、発生した化学ルミネセンスを強化また
は増強する試薬である。反応中に、化学ルミネセンスの
発生と同時に、分光光度計または目視によってモニター
できる変色が生じる。この変色は、反応が生じたことを
示す第二の指標となる。
他の論理を排除する意図はないが、インドキシル（ま
たはチオインドキシルまたはベンゾ〔ｂ〕フリル）の化
学ルミネセンスの発生メカニズム及びペルオキシダーゼ
に触媒されて“増強された”インドキシルの化学ルミネ
センスのメカニズムには、インドキシル中間体または
（１種または複数）の代謝産物のジオキセタン形成が関
与しているであろう。“強化された”化学ルミネセンス
のメカニズムには、加水分解反応（以下の反応図式参
照）中に生成されたスーパーオキシドアニオンとルシゲ
ニンとの反応が関与しており、これによって反応中に発
生した化学ルミネセンスが強化されると考えられる。
反応は以下の反応図式によって表される。
Ｘ、R1、R2、R3、R4、Rb及びその他の置換基を下記に
定義する。
関与する酵素の基質として作用する任意のインドキシ
ルエステル、チオインドキシルエステル（ベンゾ〔ｂ〕
チオフェンエステル）またはベンゾ〔ｂ〕フランエステ
ルを使用し得る。好ましいエステルは、３−Ｏ−インド
キシルエステル、３−Ｏ−チオインドキシルエステルま
たは３−Ｏ−ベンゾ〔ｂ〕フランエステルである。本発
明で使用されるより好ましいエステルは以下の式： で示される。
式中のＸはＯ、Ｓまたは好ましくはNRaを示し、Raは
水素またはRbのアシル基、好ましくは水素を示し、Rbは
関与する酵素によって加水分解され得る任意のアシルオ
キシ基を示す。Raは、アシル基の場合には、Rbを加水分
解する酵素と同じ酵素によって加水分解され得るのが好
ましく、アシル基でない場合には、追加の酵素が必要で
あろう。好ましいアシル基の非限定例は、ホスフェー
ト、アセテート、ガラクトピラノシド、スルフェート、
グルクロネート、グルコピラノシド、フルクトピラノジ
ド及びマンノピラノシドである。また、無機酸もしくは
簡単な有機酸から誘導されたアシル基も好ましいアシル
基である。
同じまたは異なるR1、R2、R3及びR4は、水素、また
は、ハライド、プソイドハライド、ハロアルキル、アル
キルアミノ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシアル
キル、アミノなどから成る小さい求電子基から独立に選
択され、ここに、アルキル基は、好ましくは炭素数１〜
６、より好ましくは炭素原子数１〜３の低級アルキル基
である。より特定的には、R1、R2、R3及びR4は、シア
ノ、アミノ、１個もしくは２個のメチル基もしくはエチ
ル基で置換されたアミノ、トリハロメチル好ましくはト
リフルオロメチル、ヒドロキシル、ハライド、メチル、
エチル、メトキシ及びエトキシから選択される。R1、
R2、R3及びR4は好ましくは水素またはハロゲンであり、
ハロゲンである場合には好ましくはBrまたはClである。
一般に、R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つが水素で
あるのが好ましい。R1、R2、R3及びR4の少なくとも２つ
また３つが水素であり、１つまたは２つがハライドであ
るのがより好ましい。２つのハライドが存在する場合、
一方がClで他方がBrであるのが好ましい。
最も好ましい化合物は４−、５−及び６−置換３−Ｏ
−インドキシルエステルである。R1、R2、R3及びR4の１
つだけが水素でない化合物においては、５位にBrが存在
するか、６位にClが存在するのが好ましい。
Raは好ましくは水素またはRbのアシル基である。
Rbは、関与する酵素によって加水分解されるように選
択される。従って、Rbは実質的に、ホスフェート、アセ
テート、アミド、ガラクトピラノシド、スルフェート、
グルクロネート、グルコピラノシド、フルクトピラノジ
ト、マンノピラノシドまたはRaに関して上記に定義した
基のいずれでもよい。
他の適当なインドキシルエステル、チオインドキシル
エステル（ベンゾ〔ｂ〕チオフェンエステル）またはベ
ンゾ〔ｂ〕フランエステルは、エステルの加水分解を触
媒する既知量の酵素をインドキシルエステルと混合し、
添加直後または添加後約１時間以内、好ましくは数秒後
から約30分後までの範囲、より好ましくは数秒後から約
15分後までの範囲、典型的には約１分後から約５分もし
くは10分後までの範囲の時間に化学ルミネセンスを測定
する試験アッセイに用いることによって同定できる。バ
ックグラウンドを上回る検出可能な化学ルミネセンスが
発生したならば、エステルは本発明のアッセイに適して
いる。従って、「適当なインドキシルエステル」という
用語は、選択されたエステルとその加水分解酵素との反
応が生じたとき、バックグラウンドを上回る化学ルミネ
センスを発生するエステルの能力に関する定義である。
より高度なシグナルまたは感度が望まれる場合には、
反応中に発生した化学ルミネセンスを増幅し得る。例え
ば、シグナルを触媒的に増強するためにはペルオキシダ
ーゼを添加する。生じた化学ルミネセンスを強化するた
めにはpHの調整を全く要せずにルシゲニンを反応に直接
添加する。ペルオキシダーゼのような増幅試薬及びルシ
ゲニンのような強化試薬の双方を使用してもよく、これ
らを同時に、順次にまたは断続的に添加するとよい。
本発明はまた、本発明の化学ルミネセンスアッセイを
行うためのキットを提供する。より特定的には、エステ
ルの加水分解を触媒する酵素を測定するためのキットが
提供される。これらのキットは、インドキシルエステル
を含有する第一試薬と、化学ルミネセンス増幅試薬を含
有する第二試薬とから成り、第二試薬は、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼもしくはルシゲニンであるか、または、
スーパーオキシドアニオン（O2 -）、反応性代謝産物及
び／又は反応中間体と反応するその他の任意の試薬であ
る。
本発明はまた、酵素活性の評価方法を提供し、更に、
本発明のアッセイの適当な基質となるインドキシルエス
テル、チオインドキシルエステル（ベンゾ〔ｂ〕チオフ
ェンエステル）またはベンゾ〔ｂ〕フランエステルの同
定方法を提供する。
好ましい実施態様の詳細な説明 定義 特に注釈がない限り、本文中に使用した技術用語及び
科学用語はすべて、本発明の所属分野の当業者によって
普遍的に理解される意味と同義である。本文中で参照し
たすべての特許及び刊行物の記載内容は本発明に含まれ
るものとする。
本文中で使用された化学ルミネセンス増幅試薬なる用
語は、スーパーオキシドアニオン（O2 -）と反応する試
薬、または、スーパーオキシドアニオン（O2 -）からH2O
2への化学量論的変換が生じる前に関与する酵素とイン
ドキシルエステルとの加水分解反応によって生成される
反応性代謝産物もしくは中間生成物と反応する試薬を意
味する。これらの試薬の非限定例としては、加水分解反
応中に生成される生成物と反応する西洋ワサビペルオキ
シダーゼ；ホラシン（pholasin）；該反応中に発光する
条件下〔例えば、米国特許5,294,541号;Campbell（198
8）Chemiluminescence:Principles and Applications i
n Biology and Medicine,Ellis Horwood,Chichester,En
gland,p.336参照〕でスーパーオキシドと反応するかま
たはスーパーオキシドを検出するルシゲニン（ジメチル
ジアクリジニウムニトレート）；ジオキセタン中間体ま
たは代謝産物；及び／または当業界で公知であるかもし
くは実験的に同定されたこの種の他の試薬がある。この
種の他の試薬は、スーパーオキシドアニオン（O2 -）ま
たは反応性代謝産物と反応するいかなる試薬でもよい。
これらの試薬は、スーパーオキシドアニオン〔O2 -;例え
ば、実施例参照〕と反応する試薬の能力を証明する本文
中に記載のようなアッセイによって同定され得る。西洋
ワサビペルオキシダーゼのように化学ルミネセンスを増
幅するために触媒的に反応する任意の試薬、または、化
学ルミネセンスを強化するためにスーパーオキシドアニ
オン（O2 -）もしくは反応性代謝産物と反応する任意の
試薬を使用し得る。
より特定的には、増幅された化学ルミネセンスなる用
語は、“増強された”または“強化された”化学ルミネ
センスを意味する。例えば、本文中で使用されたペルオ
キシダーゼに触媒された“増強された”インドキシル化
学ルミネセンスなる用語は、本発明による加水分解反応
中の（１種または複数の）インドキシル代謝産物または
中間体に対する西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペ
ルオキシダーゼの触媒作用または酸化の結果として得ら
れるインドキシル化学ルミネセンスの増加を意味する。
また、ルシゲニンのような試薬の存在下で発生する化学
ルミネセンスは、ルシゲニンまたは同種の試薬とスーパ
ーオキシドアニオンまたは他の反応性代謝産物との反応
によるものであるから、本文中では強化された化学ルミ
ネセンスと呼ぶ。
従って、本文中で使用された増幅された化学ルミネセ
ンスという用語は、１種または複数の増強剤または強化
剤と反応中に生成される１種または複数の代謝産物また
は中間体との化学反応、例えばスーパーオキシドアニオ
ン（ラジカル）とルシゲニンのような強化剤との化学反
応の結果として得られる化学ルミネセンスの増幅を意味
する。スーパーオキシドアニオン及びスーパーオキシド
アニオンラジカルなる用語は互換的に使用されている。
本文中で使用された化学量論的なH2O2の生成なる用語
は、H2O2生成中に中間体の実質的に全部がH2O2に変換し
た時点またはH2O2の量が酵素濃度の指標となる時点にイ
ンドリルエステル加水分解によって生成しているH2O2の
量を意味する。本発明の反応はH2O2の生成に依存しない
ので、このような時点よりも早い時期に測定できる。
本文中で使用されたルミネセンスなる用語は、発熱性
化学プロセスの励起産物が光の放出を伴って基底状態に
復帰するときに発生する検出可能なEM線、一般に、UV
線、IR線または可視EM線を意味する。化学ルミネセンス
は、化学反応によって生じるルミネセンスである。バイ
オルミネセンスは生物分子を基質及び／または酵素とし
て用いる化学反応によって生じる化学ルミネセンスであ
る。
本文中で使用された化学発光成分なる用語は、適正条
件下の化学反応中に光を発生する分子または化合物を意
味する。
本文中で使用された反応性代謝産物なる用語は、エス
テルと酵素との加水分解反応中に存在し得る種であって
H2O2以外の種を意味する。このような種の非限定例とし
ては、中間体、スーパーオキシドアニオン及びラジカル
種がある。
本文中で使用された分析物なる用語は、関連する反応
中に分析または検定される任意の物質を意味する。
本文中ではインドリルをインドキシルと互換的に使用
している。同様にチオインドリルをチオインドキシルと
互換的に使用している。チオインドリルはまた、ベンゾ
〔ｂ〕チオフェンまたはベンゾ〔ｂ〕チオフェニルと互
換的に使用している。
本文中で使用されたリガンドなる用語は、アビジンま
たはストレプトアビジンのような特異的結合タンパク質
から成るアンチリガンドに可逆的に且つ非共有的に結合
する任意の化合物、例えばビオチンを意味する。このよ
うなリガンドとしては、成長因子、抗体またはそのフラ
グメント、ホルモン、ビタミン及び他の種類のタンパク
質がある。アンチリガンドはこのようなリガンドに結合
する分子である。
アッセイ 本発明によって提供されるアッセイは、インドキシル
エステル、チオインドキシルエステル（ベンゾ〔ｂ〕チ
オフェンエステル）またはベンゾ〔ｂ〕フランエステル
と加水分解触媒酵素との間の加水分解反応の中間生成物
が化学ルミネセンスを発生し、この化学ルミネセンスは
直接測定することもできまたはシグナルの増強もしくは
シグナルの強化によって増幅できるという知見に基づい
ている。本発明によって得られるアッセイは従来のアッ
セイに比較して以下のごとき利点を有している： （１）O2 -からH2O2へのジスムテーションを生じさせる
二次インキュベーションが不要である； （２）化学ルミネセンス強化試薬を加水分解反応に実質
的に直ちにまたは同時に添加し得る。
より特定的にはこれらのアッセイは以下の利点を有し
ている： （１）（ａ）インドキシル化学ルミネセンス；（ｂ）ペ
ルオキシダーゼに触媒されてH2O2/イソルミノールを要
せずに“増強された”インドキシル化学ルミネセンス；
及び／または、（ｃ）反応のpHの変更またはH2O2の測定
もしくはH2O2への依存を要せずに増幅された化学ルミネ
センスを用いて測定し得るのでアッセイが多用適正を有
している； （２）化学ルミネセンス増幅試薬を実質的に加水分解反
応直後にまたは反応と同時に添加できる； （３）インキュベーション期間を短縮できる（15分未
満）； （４）H2O2の定量に基づく方法に比べて感度が向上して
いる（実施例参照）。
他の理論を排除する意図はないが、本発明のアッセイ
においては、実施例で証明されるようにスーパーオキシ
ドジスムターゼが化学ルミネセンスをクエンチするの
で、H2O2でなくスーパーオキシドアニオン（O2 -）また
は他の中間体が化学ルミネセンスに関与すると考えられ
ている。化学ルミネセンスは、スーパーオキシドアニオ
ンを用いるかまたは他の反応性中間体を用いるかまたは
反応性代謝産物を用いることによってエステルの反応か
ら発生し得る。従って、化学ルミネセンスを増強または
強化するために、スーパーオキシドアニオン（O2 -）と
反応する任意の化学ルミネセンス増幅試薬または中間も
しくは反応性代謝産物またはスーパーオキシドアニオン
と触媒的に反応する任意の化学ルミネセンス増幅試薬を
本発明のアッセイに使用し得る。対照的に、従来のイン
ドキシルに基づく化学ルミネセンスアッセイ（例えば、
EP0,476,930A1）はH2O2へのジスムテーションに依存し
ている。
アッセイの構成成分 試料及び基質 1.インドキシル、チオインドキシル（ベンゾ〔ｂ〕チオ
フェン）及びベンゾ〔ｂ〕フランエステル基質 好ましいエステルは、３−Ｏ−インドキシルエステ
ル、３−Ｏ−ベンゾ〔ｂ〕フランエステル及び３−Ｏ−
チオインドキシルエステルである。本発明で使用される
より好ましい３−Ｏ−インドキシル、３−Ｏ−ベンゾ
〔ｂ〕フラン及び３−Ｏ−チオインドキシルのエステル
は、式： で示される。
式中、ＸはＳ、Ｏまたは好ましくはNRaを示してお
り、Raは、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
ルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオ
キシ、ヒドロキシル、カルボキシ、カルボキシ低級アル
コキシ、アリールオキシカルボニル（arylkoxycarbony
l）、アリールオキシカルボニル低級アルコキシ、ニト
ロ、アシルまたは低級アシルアミノ基を示し、ここに低
級アルキル基は炭素数１〜約６、好ましくは炭素数１〜
３であり、アリール基は好ましくは約４〜７員、好まし
くは５または６員であり、Rbは関与する酵素によって加
水分解され得るアミノ基に結合した任意のアシルオキシ
基またはアミド基を示し、Raは水素またはRbのアシル基
を示し、好ましくは水素を示す。Raがアシル基のとき、
RaはRbを加水分解する酵素と同じ酵素によって加水分解
可能であるのが好ましく、そうでないときは追加の酵素
が必要であろう。Raは好ましくは水素またはRbのアシル
基である。Rbはまた、式（Ｏ−Ａ−Ｂ）〔式中、Ａはア
ミノ酸、ペプチド残基を示し、Ｂは窒素保護基を示す〕
を有していてもよい。
Rbは関与する酵素によって加水分解されるように選択
される。従ってこのような基であればRbは実質的にいか
なる基でもよく、例えば、ホスフェート、アセテート、
ガラクトピラノシド、スルフェート、グルクロネート、
グルコピラノシド、フルクトピラノシド、マンノピラノ
シドまたはRaに関して定義した基のいずれかから選択さ
れ得る。
好ましいアシル基の非限定例は、ホスフェート、アセ
テート、ガラクトピラノシド、スルフェート、グルクロ
ネート、グルコピラノシド、フルクトピラノシド及びマ
ンノピラノシドである。好ましいアシル基はまた、無機
酸または簡単な有機酸から誘導される。このような場
合、アシル基は好ましくはリン酸、ホスホン酸、硫酸、
スルホン酸または炭酸から誘導される。
同じまたは異なるR1、R2、R3及びR4は、水素及び小さ
い求電子成分、例えばハライド、ハロアルキル、アルキ
ルアミノ、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシアルキ
ル、アミノ、アリールアルコキシ、アラルコキシカルボ
ニルアルコキシ、ニトロ、アシルアミノなどから独立に
選択される。この場合、好ましいアルキル基は炭素数１
〜６、より好ましくは炭素原子数１〜３の低級アルキル
であり、好ましいアリール基は炭素数３〜16、より好ま
しくは炭素数３〜10、さらに好ましくは炭素数４〜７の
アリール基である。
より特定的には、R1、R2、R3及びR4は、シアノ、アミ
ノ、１つまたは２つのメチルまたはエチル基によって置
換されたアミノ、トリハロメチル好ましくはトリフルオ
ロメチル、ヒドロキシル、ハライド、メチル、エチル、
メトキシ及びエトキシから選択される。R1、R2、R3及び
R4は好ましくは水素またはハロゲンであり、ハロゲンの
場合にはBrまたはClが好ましい。
一般には、R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つが水素
であるのが好ましい。R1、R2、R3及びR4の少なくとも２
つまたは３つが水素であり、１つまたは２つがハライド
であるのがより好ましい。２つのハライドが存在する場
合、一方がClで他方がBrであるのが好ましい。１つのハ
ライドが存在する場合、ハライドはBrまたはClであるの
が好ましい。より好ましい化合物は、３−Ｏ−インドキ
シルエステルであり、４−、５−または６−置換３−Ｏ
−インドキシルが最も好ましい。R1、R2、R3及びR4の１
つだけが水素でない化合物の場合、５−位がBrまたは６
−位がClであるのが好ましい。
他の好ましいインドリル化合物は例えば米国特許第4,
278,763号（英国特許第1,128,371号参照）に記載されて
いる。
インドキシル基質、チオインドキシル（ベンゾ〔ｂ〕
チオフェン）基質の非限定例としては、インドキシルア
セテート、Ｎ−メチルインドキシルアセテート、インド
キシル−β−Ｄ−グルコシド、インドキシルホスフェー
ト、Ｎ−メチルインドキシルアセテート、Ｎ−メチルイ
ンドキシルミリステート、３−インドキシルホスフェー
ト及び３−インドキシルスルフェート及びその置換誘導
体、例えば対応するチオインドキシルエステル及びベン
ゾ〔ｂ〕フラニルエステルがある。
好ましいインドキシルエステルとしては、３−インド
キシルホスフェート、６−クロロ−３−インドキシルホ
スフェート、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリルホスフェート（BCIP）（例えばLearyら，（198
3）Proc.Natl.Acad.Sci.，80:4045参照）;5−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルガラクトシド（Ｘ−Gal）;
X−galと同様のいくつかの他の“Ｘ−グリコシド”（例
えばWolfら，（1966）Lab.Invest.15:1132参照）；ホス
ファターゼに対する５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリルホスフェート；ガラクトシダーゼに対する５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルガラクトシド（Ｘ−
gal）；スルファターゼに対する５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルスルフェート;3−インドキシルホス
フェート；アセテートエステラーゼに対する５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドキシルアセテート；及びＮ−
アセチルグリコサミニダーゼに対する５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−２−アセトアミド−２−デオ
キシ−β−Ｄ−グリコピラノシドがある。他の適当なイ
ンドリル基質としては、インドキシルアミノエステル、
チオインドリルアミノエステル、ベンゾ〔ｂ〕フランア
ミノエステルまたはそのペプチド誘導体がある。
ホスファターゼ、スルファターゼ、ガラクトシダーゼ
及びいくつかのグリコシダーゼ酵素の基質となるインド
キシル基質は公知であり、市販のものを使用してもよく
または標準化した方法によって合成してもよい〔例え
ば、米国特許第5,316,906号及び第5,206,139号参照〕。
チオインドキシルエステル（ベンゾ〔ｂ〕チオフェンエ
ステル）及びベンゾ〔ｂ〕フランエステルも公知である
〔例えば米国特許第4,278,763号参照〕。
2.酵素 インドキシルエステル、好ましくは３−Ｏ−インドキ
シルエステルの加水分解を触媒する任意の酵素を本発明
に使用し得る。インドキシルエステルを選び、選択され
た酵素のエステル加水分解能を測定することによって酵
素を実験的に同定するとよい。特に、当該インドキシル
エステルを加水分解する限り、任意のエステラーゼを使
用し得る。このような酵素の非限定例は、アルカリ性ホ
スファターゼ、スルファターゼ、プロテアーゼ及びガル
クトシダーゼである。より特定的に、これらの酵素とし
ては、細菌性また腸管のアルカリ性ホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセ
チルグリコサミニダーゼがある。これらの酵素は公知で
あり、入手容易な細菌ソースもしくは組織培養ソースか
ら単離してもよくまたは市販製品を購入してもよい。
3.化学ルミネセンス増幅試薬 本発明で好適に使用される化学ルミネセンス増幅試薬
は、スーパーオキシドアニオン（O2 -）と反応する任意
の試薬、または、インドキシルエステルと関与する酵素
との間の加水分解反応中にH2O2以外にまたはH2O2に加え
て生成された反応性代謝産物または中間体と反応する任
意の試薬である。これらの試薬の非限定例としては、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシゲニン（ジメチルジア
クリジニウムニトレート）及び他の同様の試薬があり、
ルシゲニンは、反応のpHの調整を要せずに本発明の反応
のpH（pH約７〜11）で添加されスーパーオキシドアニオ
ン（例えば米国特許第5,294,541号参照）、中間体また
は反応性代謝産物を主として及び／または特異的に検出
する。他の同様の試薬は、スーパーオキシドアニオン
（O2 -）と反応する試薬でもよく、または、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼのように加水分解反応中に生成される
中間体と反応する試薬でもよい。これらの試薬は中間体
と反応するかまたは中間体の反応を触媒することによっ
て化学ルミネセンスを増強または強化する。適当な化学
ルミネセンス増幅試薬は、当業者に公知の試薬でもよ
く、または、公知の試薬を本文中のアッセイで関与する
酵素と同時もしくは直後に添加するかまたは酵素を後で
添加し、化学ルミネセンス発生能力を試験することによ
って実験的に同定してもよい。また、本文中のアッセイ
のようなアッセイによって、このような試薬がスーパー
オキシドアニオン（O2 -）または中間体または他の反応
性代謝産物との間で生じる反応能力を証明するによって
このような試薬を同定することも可能である〔例えば実
施例参照〕。
現状では、西洋ワサビペルオキシダーゼまたは加水分
解反応のpHの調整を要せずに添加されるルシゲニンが好
ましいとされている。本文中に示したように、pHを調整
することなく加水分解反応に添加されたルシゲニンは化
学発光シグナルを強化する。しかしながらこの強化は、
スーパーオキシドアニオンからH2O2への変換またはジム
ステーションを促すスーパーオキシドジスムターゼ（SO
D）の添加によってクエンチされる。これは、ルシゲニ
ンは反応中に発生した化学ルミネセンスを強化してお
り、化学ルミネセンスがルシゲニンとH2O2との反応によ
って発生するのではないことを証明している。対照的
に、実施例に示すように、従来のアッセイ法（例えばEP
0,476,930A1参照）に従って実施されるアッセイはH2O2
の測定に基づいている。この種の化学ルミネセンスはSO
Dの添加によってクエンチされない。また、化学量論的H
2O2の生成後にルシゲニンを添加する従来のアッセイに
おいて、反応に対するSODの添加が化学ルミネセンスを
クエンチさせるとは予想できない。
他の適当な試薬の非限定例は、７−ジメチルアミノ−
ナフタレン−1,2−二炭酸ヒドラジド及び鯉ルシフェリ
ンの類縁体、例えば、２−メチル−６−（ｐ−メトキシ
フェニル）−3,7−ジヒドロイミダゾ〔1,2−α〕−ピラ
ジン−３−オン、２−メチル−６−フェニル−3,7−ジ
ヒドロイミダゾ〔1,2−α〕ピラジン−３−オン、２−
メチル６−（ｐ−｛２−〔ナトリウム−３−カルボキシ
ラト−４−（６−ヒドロキシ−３−キサンテノン−９−
イル）フェニルチオウレイレン〕エチレンオキシ｝フェ
ニル）−3,7−ジヒドロイミダゾ〔1,2−α〕ピラジン−
３−オン及び金属キレートである。
アッセイの応用 本発明のアッセイは、ヒトの臨床診断、獣医学的診断
及び農業的診断、食品産業、飲食物の無菌及び汚染試
験、並びにその他の多くの用途に使用され得る。本発明
のアッセイは、インドキシル、チオインドキシル（ベン
ゾ〔ｂ〕チオフェン）またはベンゾ〔ｂ〕フランのエス
テルを加水分解する酵素の活性を利用する任意の方法で
使用され得る。
本発明の方法は、分光光度測定アッセイの基質として
インドキシルエステル及びその誘導体が使用されている
任意の用途に使用され得る。例えば、細胞性酵素の所在
を検出するための細胞化学的染色方法は、インドキシル
及び置換インドキシルの転化によって対応するインジゴ
染料が形成されることに基づいている〔Holtら，（195
8）Pro.Roy.Soc.B 148:481〕；インドキシル及びその
誘導体はアルカリ性ホスファターゼ活性を同定する組織
染色剤の製造に使用されている〔例えばCotsonら，（19
58）Proc.Roy.Soc.B. 148:506参照）；ブロモ−クロロ
−インドキシルホスフェートはイムノブロットにおいて
アルカリ性ホスファターゼとコンジュゲートした抗免疫
のグロブリン中のタンパク質混合物に対するモノクロー
ナル抗体の特異性を決定するために基質として使用され
ている。〔Elyら，（1986）Methods Enzymol．121:49
7〕；ブロモ−クロロ−インドキシルホスフェートはニ
トロセルロースに固定化したDNAまたはRNAにハイブリダ
イズしたビオチン標識DNAプローブを可視化するために
使用されている〔例えばLearyら，（1983）Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 80:4045〕；多くの他のアッセイでも使用
されている。インドキシル化合物からイジゴ染料への転
化を利用する他の発色性用途としては、ディスク電気泳
動におけるアルカリ性及び酸性ホスファターゼを組織化
学的に証明するためのインジゴ生成反応（Epsteinら，
（1967）Am.J.Clin.Pathol．48;530）；同時的アゾ染料
カップリング法及びポリアクリルアミドディスクゲル中
のアルカリ性ホスファターゼに対するインジゴ発生反応
の比較〔Savageら，（1972）Stain Technol. 47:77〕；
タンパク質ブロッティングの理論と応用〔Gershoniら，
（1983）Anal.Biochem. 131:1〕；ニトロセルロースシー
トに転移したタンパク質の染色方法〔Wojtkowiakら，
（1983）Anal.Biochem. 129:486〕；ウエスタンブロット
上の抗原性タンパク質の可視化〔D.A.Knecht,R.L.Dimon
d in Anal.Biochem.1984,136（１）,180〕；ウエスタン
ブロット上のアルカリ性ホスァターゼにコンジュゲート
した抗抗体の検出方法〔Blakeら，（1984）Anal.Bioche
m. 136:175〕；固相イムノアッセイ〔Valkirsら，（198
5）Clin.Chem. 31:1427〕;ELISAスポットアッセイ〔Fran
ciら，（1988）J.Immunol.Methods 107:239〕；及び他
の多くの用途がある。
上記に引用の方法はいずれも、ブロモ−クロロ−イン
ドキシルホスフェートのスペクトル特性だけを比色基質
として利用している。しかしながら本発明方法で使用す
る場合には、酵素に触媒されるインドキシルエステルか
らインジゴ染料への加水分解をモニターする代わりに、
本文中に記載されたように加水分解反応中に生成される
中間体または反応性代謝産物の化学ルミネセンスを検出
することによって酵素に触媒される加水分解をモニター
する。
本発明方法の応用範囲を以下に例示する。インドキシ
ルエステルと反応する酵素またはこのような酵素によっ
て標識され得る化合物が下記以外の広い応用範囲を有す
ることは当業者に公知である。インドキシルエステルと
反応する酵素を反応原系物質（reactant product）とし
て用いる場合、あるいは、該酵素が付加的な１つまたは
複数の反応を介して結合できるような任意の場合に対し
て本発明方法を実際に応用することが可能である。
1.リガンド結合アッセイを用いるヒト診断、獣医学的診
断及び農業的診断 本発明方法は診断用リガンド結合アッセイに使用され
得る。アルカリ性ホスファターゼ（AP）、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、スルファターゼまたはβ−Ｄ−グルクロ
ニダーゼなどを非限定例とする酵素によってリガンドま
たはアンチリガンドを直接または間接に標識する。適正
なインキュベーション及び分離の後で適当な基質を加
え、酵素の活性を本発明方法によって測定する。標準用
量−応答曲線から未知のサンプルの濃度を決定する。リ
ガンド結合アッセイの例としては、イムノアッセイ、タ
ンパク質結合アッセイ及び核酸ハイブリダイゼーション
アッセイがある。
（ａ）標識抗原または標識抗体を使用するイムノアッセ
イ 多くのイムノアッセイでは酵素ラベルが使用される。
例えば、アルカリ性ホスファターゼを使用する不均一系
イムノアッセイが多数報告されている〔例えばBronstei
nら，（1989）Clin.Chem.35:1441−1446及びSchaapら，
（1989）Clin.Chem.35:1863−1864参照〕。また、β−
ガラクトシダーゼを使用する均一系アッセイもよく知ら
れている〔例えば、米国特許第4,708,929号参照〕。
関与する抗原を同定する他のイムノアッセイとして
は、A6B4細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗
体を用いる異常上皮組織の存在の診断方法〔例えば、米
国特許第5,320,942号参照〕；胎児性フィブロネクチン
の検出方法〔例えば、米国特許第5,281,522号参照〕が
ある。これらの反応は、ビオチンにコンジュゲートした
ヤギ抗ヒト免疫がグロブリン特異的抗体及びアルカリ性
ホスファターゼにコンジュゲートしたウサギ抗ビオチン
特異的抗体のような試薬を使用する（例えば、米国特許
第5,322,769号参照）。本発明方法では５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルホスフェートのような基質を
使用でき、アルカリ性ホスファターゼの活性を測定でき
る〔例えば実施例参照〕。
（ｂ）標識リガンドまたは標識レセプターを用いるレセ
プターアッセイ 酵素で標識された分析物を用いるレセプターアッセイ
は公知である。例えば、ステロイドをアルカリ性ホスフ
ァターゼで標識し、適当なレセプターをアンチリガンド
として使用する。インキュベーション及び分離の後、基
質を加え、化学ルミネセンスを測定する（例えば、Hami
ltonら，（1987）Immunoassay A Pracatical Guide,2
章,22−48頁,Chanら,Eds,Academic Press,Inc.New York
参照）。
（ｃ）標識リガンドまたは標識アンチリガンドを用いる
タンパク質結合アッセイ タンパク質結合アッセイ（例えば、Hamiltonら，（19
87）Immunoassay A Pracatical Guide,2章,22−48頁,Ch
anら,eds,Academic Press,Inc.New York参照）を本発明
方法によって実施し得る。このようなアッセイの非限定
例としては、（ｉ）チロシン結合グロブリン、トランス
コルチン、固有因子（胃粘膜ビタミンB12輸送タンパク
質）及び性ホルモン結合ブロブリンなどを非限定例とす
る血清結合タンパク質を用いるアッセイ；（ii）細胞表
面レセプター及び組織レセプターが関与するアッセイ、
がある。結合タンパク質もしくはレセプターに対するリ
ガンドまたは結合タンパク質もしくはレセプター（即
ち、アンチリガンド）をアルカリ性ホスファターゼのよ
うな適当な酵素によって標識し、次いで本発明方法によ
って定量し得る。
（ｄ）核酸ハイブリダイゼーションアッセイ 核酸（即ち、DNA、RNAまたはその類縁体）を、アルカ
リ性ホスファターゼのようなインドキシルエステルと反
応する酵素によって標識し得る。また、核酸及びその類
縁体を、アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートし
たアビジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチ
ンによって標識してもよい。次いで、プローブとして使
用し得る標識核酸を同定し定量する（例えば、オリゴヌ
クレオチドプローブをアルカリ性ホスファターゼで標識
するかまたはアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲー
トしたアビジンもしくはストレプトアビジンに結合する
ビオチンのようなリガンドによって標識することを記載
したBronsteinら，（1989）Clin.Chem.35（９）:1856−
1857参照；また、例えば米国特許第5,316,906号及び第
5,274,087号参照）。ハイブリダイゼーション後にアル
カリ性ホスファターゼを本発明方法によって定量する。
また、β−ガラクトシターゼの発現はプラークアッセ
イの検出マーカーである（例えば、米国特許第5,281,52
2号及び第5,273,901号参照）。５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシドのような基
質を本発明方法で使用し、β−ガラクトシダーゼを検出
及び／または定量し得る。
2.環境的用途及び化学的アッセイ 本発明のアッセイは、アルカリ性ホスファターゼで標
識した抗原または抗体を用いてパラチオン、トルエン、
スルファメタジン、メラチオン及びヘプタクロルのよう
な環境化合物を測定するために使用し得る（例えば米国
特許第5,266,700号参照）。水サンプル中のアトラジン
を測定するためにエンザイムイムノアッセイも使用され
ている〔例えば、Sherryら，（1993）Chemosphere 22
6:273−2184〕。
3.医薬的及び毒物学的用途 アッセイは、アルカリ性ホスファターゼのような酵素
に対する薬剤の効果を評価することによって薬剤設計に
使用し得る。例えば、特定形態のアルカリ性ホスファタ
ーゼ〔即ち、腎臓、肝臓、腫瘍または胎盤形態のアルカ
リ性ホスファターゼ；例えば、Biochemicals,Organic C
ompounds for Research and Diagnostic Reagents,SIGM
A Chemical Company 1994カタログ〕を阻害するレバミ
ソール類似体のような化合物を本発明のアッセイによっ
て同定し得る。
アッセイは、微生物及び微生物汚染をスクリーニング
するために使用し得る。アッセイは、遺伝子操作された
かまたは遺伝子産生されたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの
ような酵素の純度を測定するために使用し得る。純粋な
培養単離物の懸濁液に対して同定試験及び抗菌剤感受性
試験を実施し得る。これらの純粋培養物試験に適当な基
質及びその他の試薬は当業者に公知である〔例えば、欧
州特許出願EP091,837A;Snyderら，（1985）“誘導基質
蛍光による微生物の迅速なキャラクタリゼーション：概
論（Rapid Characterizatio of Microorganisms by Ind
uced Substrat Fluorescence:A Review）",Biotechnolo
gy Progress 1:226−230;Snyderら，“微生物の検出及
び同定におけるin vivo酵素基質蛍光速度に関するパタ
ーン認識分析（Pattern Recognition Analysis on In V
ivo Enzyme Substrate Fluorescence Velocities in Mi
croorganism Detection and Identification）",Appl.E
nviron.Microbiol.51:969−977〕。微生物同定のために
は、各々が異なる基質を含む溶液に培養物懸濁液を加
え、適当な温度でインキュベートする。多数酵素試験を
実施するための試験パネルを作成し得る。微生物の種類
次第では、いくつかの基質は、微生物によって産生され
る特殊な酵素によって開裂されるであろう。例えば、大
腸菌型の細菌は酵素β−ガラクトシダーゼを産生し、大
腸菌（E.coli）は酵素β−グルクロニダーゼを産生す
る。特定の微生物が産生する特殊な酵素の認識によって
単純培養単離物を同定し得る。ある種の抗菌性化合物の
存在下で純粋培養単離物によって産生される酵素の量の
減少を測定することによって抗菌剤感受性パターンが得
られる。純粋培養単離物によって産生される酵素の量の
減少は、抗菌剤に対する微生物の感受性に直接的な関係
を有している。
大腸菌のβ−ガラクトシダーゼは硝酸銀、ｐ−クロロ
−安息香酸水銀及びジメチルベンジルアルキルアンモニ
ウムクロリドによって阻害される〔例えば、Toyobo Enz
ymes（catalog）,Toyobo Co.LTD.参照〕。本発明方法
は、β−ガラクトシダーゼ阻害をモニターし、その結果
としてこのような阻害物質または毒物学的化合物の存在
を検出するアッセイに使用され得る。
4.DNA配列決定 化学ルミネセンスに基づくDNA配列決定はジデオキシ
法を用いて実施し得る（例えば、Martinら，（1991）Im
proved Chemiluminescent DNA Sequencing Biotechniqu
es 11:110−113）。また、DNA配列決定反応を化学ルミ
ネセンスによって検出するために、ナイロン膜を使用
し、アルカリ性ホスファターゼによって標識したプロー
ブまたはビオチンのようなリガンドによって標識し次い
でストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコン
ジュゲートを加えたプローブのハイブリダイゼーション
を実施してもよい。洗浄後、アルカリ性ホスファターゼ
の活性を本発明方法によって測定する。
5.リポーター遺伝子アッセイ リポーター遺伝子アッセイは、誘電プロモーターに作
動的に結合した遺伝子の発現レベルを測定するアッセイ
であり、多くの用途を有している。最も頻用のリポータ
ー遺伝子アッセイは、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ及び分泌アルカリ性ホスフ
ァターゼを使用する（Alamら，（1990）Anal.Biochem．
188:245−254）。本発明方法は、β−ガラクトシダーゼ
またはアルカリ性ホスファターゼのような酵素を発現さ
せるアッセイに特に有利である。本発明方法はこのよう
な酵素を検出及び／または定量するために使用される。
6.歯周病の診断 アリールジオキセタンホスフェートを用いてヒト歯周
病を診断するアルカリ性ホスファターゼの化学ルミネセ
ンスアッセイは公知である（例えば、Lanら，（1993）L
uminescence and Chemiluminescence Proceedings of t
he VIIth International Symposium on Bioluminescenc
e and Chemiluminescence,Banff,March 1993,Szalayら,
ed.）。アルカリ性ホスファターゼ活性の増加は歯周病
と相関関係を有している。従って、本発明方法は、唾
液、歯肉頚液及びその他の口内流体または組織中のアル
カリ性ホスファターゼ活性を測定するために使用され得
る。
7.臨床的化学診断 アルカリ性ホスファターゼのレベル上昇は肝臓疾患及
び骨疾患と関連している（例えばCohnら，（1966）Bloo
d Chemistry in a Textbook of Clinical Pathology,7t
h Edition,S.E.Miller,Ed.,Williams ＆ Wikins,Baltim
ore,MD,316頁）。肝障害及びパジェット病では血清アル
カリ性ホスファターゼ活性が正常値の上限の約10〜12倍
から25倍にも達するものであろう。骨軟化症、くる病、
うっ血性心不全、ファンコーニ症候群、甲状腺機能亢進
症、腸疾患及び腹内細菌感染症の場合には血清アルカリ
性ホスファターゼがある程度増加する。
従って、血清サンプルを採取し、本発明方法によって
アルカリ性ホスファターゼを試験するとよい。
8.飲食物の無菌試験 本発明方法は飲食物中の分析物を試験するために使用
され得る。例えば、ビタミンB12または抗生物質に特異
的な抗原または抗体をアルカリ性ホスファターゼで標識
し、この標識した抗原または抗体を用いてイムノアッセ
イでビタミンB12または抗生物質を試験し得る。
アルカリ性ホスファターゼ及び他の細菌性酵素（上記
参照）は、例えば医薬品及び食物中の無菌性または汚染
度を検査するためのマーカーとして使用され得る。細菌
は本発明方法によって定量され得るβ−ガラクトシダー
ゼのような酵素を産生する。上述のように、大腸菌型細
菌は酵素β−ガラクトシダーゼを産生し、大腸菌E.coli
は酵素グルクロニダーゼを産生する。
9.白血球の検出 本発明方法は、白血球特異的プロテアーゼを検出し、
これによって体液中の白血球を検出するために使用し得
る。液体中の白血球の検出は、腎検査及び腎障害検査の
ような重要な用途を有している。これらの方法はチオイ
ンドキシル基質を用いて実施し得る〔例えば、米国特許
第4,278,763号参照〕。
キット及び診断システム 本発明のアッセイシステムは、食物、体液または組織
のようなサンプル中の酵素、補因子、基質、生成物、中
間体または反応性代謝産生物を検出するために有用なキ
ットの形態で提供され得る。これらのキットはすべてア
ッセイを実施するための使用説明書付きである。
特に、本発明の化学ルミネセンスアッセイを実施する
ためのキットが提供される。より特定的には、インドキ
シルエステルの加水分解を触媒する酵素を測定するキッ
トが提供される。これらのキットは、インドキシルエス
テルから成る第一試薬と、西洋ワサビペルオキシダーゼ
のような化学ルミネセンス増幅試薬（西洋ワサビペルオ
キシダーゼとルミノール／イソルミノールとの双方は含
まない）、または、pHの調整を要せずに添加されるルシ
ゲニンもしくは他の同様の試薬のような化学ルミネセン
ス増幅試薬から成る第二試薬とから構成されている。キ
ットは更に、反応に適したpHのジエタノールアミン及び
ホウ酸塩のような適当なバッファから成る適当な補助試
薬を含んでもよい。反応に適したpHは一般には約７〜約
11または11を多少上回る値であり、好ましくは酵素次第
で７〜11または７〜10.5または7.5〜10である。キット
は更に、マイクロタイタープレート、バイアル、標識リ
ガンド、標識アンチリガンド、標準溶液、対照、洗浄
液、固相支持体、などの適当な補助医薬品を含み得る。
上述のような診断システム用パッケージは、診断シス
テムにおいて慣用のパッケージである。このようなパッ
ケージは、ガラス製またはポリエチレン、ポリプロピレ
ン及びポリカーボネートのようなプラスチック製でよ
く、瓶及びバイアル、プラスチック袋及び積層プラスチ
ック袋、などの形態を有している。パッケージはまた、
オートアナライザーで使用するための適当なコンテナー
を有していてもよい。パッケージは一般にはアッセイを
実施するための使用説明書を含んでいる。
アッセイの実施 本発明によって提供される診断試験は、インドキシル
エステルの加水分解を触媒する酵素のアッセイを含む。
酵素は、種々のイムノアッセイ、DNAハイブリダイゼー
ションアッセイまたはDNA配列決定反応でラベルとして
使用され得る。酵素が体液サンプル中に存在することも
あり、この場合には、本発明のアッセイは、病気の指標
となるアルカリ性ホスファターゼのような酵素の検出及
び／または定量に使用され得る。
本発明のアッセイを実施する場合、関与する酵素が試
験サンプル中に存在すると予想され、該酵素によって加
水分解される能力に基づいてインドキシルエステルを選
択し、試験サンプルとインドキシルエステルとを混合す
る。次に、通常は直ちにまたは数分（１分から約15分、
好ましくは１分から約５分乃至10分）以内に化学ルミネ
センスを測定する。あるいは、化学発光シグナルの増幅
が望まれる場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼまた
はルシゲニンのような化学ルミネセンス増幅試薬を反応
混合物に添加し得る。化学ルミネセンス増幅試薬の添加
は、試薬サンプルもしくは他の試薬の添加と同時でもよ
く、また、少し遅らせて、一般には１分〜１時間、好ま
しくは約１分〜15分遅らせてもよい。化学ルミネセンス
増幅試薬の好ましい添加時期は、１種または複数の試薬
の添加後10分以内であり、添加後約５分以内、約１分以
内または同時であってもよい。特に試薬がペルオキシダ
ーゼである場合には、加水分解反応の開始から１時間〜
２時間経過するまで添加が可能である。その後直ちに化
学ルミネセンスを測定する。化学ルミネセンス増幅試薬
は、スーパーオキシドアニオン（O2 -）と反応するかま
たは加水分解反応中に生成される（H2O2以外の）反応性
代謝産物とを反応し、これによって反応中に発生する化
学発光シグナルを増加させる任意の試薬である。
以下の実施例は例示の目的で与えられたものであり、
本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例１ アルカリ性ホスファターゼに媒介されるインドキシルホ
スフェートエステルの化学ルミネセンス A.材料 （１）基質溶媒 （ａ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−ｐ−トルイジン塩（DCL,Canada） （ｂ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−（２−アミノ−２−メチル−1,3−プロパン
ジオール塩（JBL,CA） （ｃ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドキシルホスフェート モノ−（ｐ−トルイジ
ニウム）塩（JBL,CA） （ｄ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの６−クロロ−３−インドリ
ルホスフェート ｐ−トルイジン塩（Research Organic
s INC,OH） （２）酵素 （ａ）アルカリ性ホスファターゼ（AP）（Biozyme Labo
ratories International,CA） （ｂ）スーパーオキシドジスムターゼ（Biozyme Labora
tories International,CA） B.方法 （１）10μｌのサンプル溶液（ブランク及びアルカリ性
ホスファターゼ）をプラスチック管に導入した。
（２）50μｌの上記基質溶媒の各々をAccuLyte光度計
（LTI,IL）を用いてサンプル管に注入した。
（３）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを180
秒間測定した。
C.結果 D.結論 これらの結果は、酵素によって触媒されたインドキシ
ルエステルの加水分解が化学ルミネセンスを発生させる
ことを証明する。
実施例２ スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の効果 A.材料 （１）基質溶液 2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノールアミ
ンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェート
ジ−ｐ−トルイジン塩（DCL,Canada） （２）酵素 （ａ）アルカリ性ホスファターゼ（AP）（Biozyme Labo
ratories International,CA） （ｂ）スーパーオキシドジスムターゼ（SOD;Biozyme La
boratories International,CA） B.方法 （１）10μｌのブランク及び6.5×10-15モルのアルカリ
性ホスファターゼ四液をプラスチック管にピペット注入
する。
（２）58mUのSOD含有またはSOD非含有（0mU;ブランク）
の10μｌ溶液をピペット注入する。
（３）3.5mMの３−インドキシルホスフェート，トルイ
ジン塩を含む50μｌの溶液をAccuLyte光度計に注入す
る。
（４）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを180
秒間測定する。
C.結果 D.結論 これらの結果は、SODの添加によってスーパーオキシ
ドアニオンがH2O2に転化されて化学ルミネセンスがクエ
ンチされることを示しており、これによって、インドキ
シル中間体または他の反応性代謝産物による化学ルミネ
センスの発生にスーパーオキシドアニオンが関与するこ
とを示唆している。
実施例３ ペルオキシダーゼに媒介される３−インドキシルホスフ
ェートエステルの化学ルミネンス 材料 （１）2mMの塩化マグネシウム（MgCl2）を含有するpH1
0.0の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中に8.6×10
-15モル/10μｌ、8.6×10-17モル/10μｌ及び8.6×10
-18モル/10μｌの濃度で含まれるアルカリ性ホスファタ
ーゼ（AP）溶液を調製した。
（２）10μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP;0.05
％のウシ血清アルブミンを含有するpH7.8の0.1MのTris
中に2.5単位）を、100μｌの3.5mMの３−インドキシル
ホスフェート ジ−ｐ−トルイジン塩（2mMのMgCl2を含
有するpH10.0の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中）
に添加することによって基質溶液を調製した。
方法 アルカリ性ホスファターゼ溶液（10μｌ）をプラスチ
ック管に導入した。基質溶液（20μｌ）を添加し、OPTO
COMP1（MGM）光度計によって化学ルミネセンスを１期間
20秒で20期間設定した。
実施例４ ペルオキシダーゼに触媒されるインドキシル化学ルミネ
センスの増強に対するスーパーオキシドジスムターゼの
効果 材料 ジエタノールアミンバッファ（70mM;MgCl2（2mM）;pH
10.0）中に３−インドキシルホスフェートトルイジン塩
（2.3mM）を含有する基質溶液 方法 基質溶液を10μｌのアルカリ性ホスファターゼ（8.6
×10-15モル）サンプルに添加し、室温で１分間インキ
ュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（25μl,0.
03単位、0.1MのTris−HCl,pH8.0中）を添加し、スーパ
ーオキシドジスムターゼ（85単位）の存在下（＋）また
は非存在下（−）でOptocomp1（MGM）光度計によって化
学ルミネセンスを１秒間測定した。
結果は、スーパーオキシドジスムターゼが化学ルミネ
センス発生反応をクエンチすることを示しており、本発
明で観察される化学ルミネセンス発生反応に関与する物
質がH2O2でないことをまたも示唆している。
実施例５ APに媒介されるインドキシル化学ルミネセンスのペルオ
キシダーゼに触媒される増強とペルオキシダーゼ／イソ
ルミノール/H2O2によって発生する化学ルミネセンスと
の比較 本発明方法では、酵素を測定するために、酵素で触媒
されるインドキシルエステルの加水分解によって発生す
る化学ルミネセンスを西洋ワサビペルオキシダーゼ（HR
P）によって増強する。この方法を、HRP/イソルミノー
ルまたはミクロペルオキシダーゼ／イソルミノールのよ
うな化学ルミネセンス系を用いた加水分解反応中に形成
されたH2O2の量を測定することによって酵素を測定する
方法（例えばEP0,476,930A1参照）と比較する。ペルオ
キシダーゼ／イソルミノールによって発生した化学ルミ
ネセンスに対してSODを添加したときには影響は全く観
察されないが（実施例６）、本発明方法に従って処理し
た反応に対してSODを添加したときには化学ルミネセン
スが実質的にクエンチされる（例えば実施例２及び10参
照）。
A.材料 （１）基質試薬 （ａ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート，ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA）及び5U/mlのHRP （ｂ）2mMのMgCl2と0.25mMのイソルミノールとを含有す
るpH10の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中の3.5mM
の３−インドキシルホスフェート ジ−（２−アミノ−
２−メチル）−1,3−プロパンジオール塩（JBL,CA）及
び5U/mlのHRP （２）酵素 2mMのMgCl2を含有するpH10.0の0.1Mのジエタノールア
ミンバッファ中でAPを調製した。
B.方法 （ａ）10μｌのサンプル溶液（ブランク及びアルカリ性
ホスファターゼ）をプラスチック管に加えた。
（ｂ）各50μｌの上記基質溶液の各々をAccuLyte光度計
（LTI,IL）によってサンプル管に注入した。
（ｃ）サンプル管を室温で１分間または15分間イキュベ
ートした。
（ｄ）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを５秒
間測定した。
D.結論 結果は、（イソルミノール非使用の）HRPによって増
強した化学ルミネセンスとHRP/イソルミノール/H2O2に
よって発生した化学ルミネセンスとは異なるものである
ことを証明する。HRP/イソルミノール/H2O2を用いて１
分間インキュベーション後にH2O2から発生した化学ルミ
ネセンスは、本発明方法よりも大きいシグナル対ノイズ
比を示し、反応速度論的に異なる化学ルミネセンスであ
る。シグナルの減少は、HRP増強系を用いた場合には32.
7％であり、HRP/イソルミノール/H2O2を用いた場合には
63.5％である。更に、上記に証明されたように、スーパ
ーオキシドアニオンをH2O2に転化させるSODは、本発明
方法によって測定される反応中に発生する化学ルミネセ
ンスをクエンチするが、ペルオキシダーゼ／イソルミノ
ールを用いて測定される化学ルミネセンスは明らかにSO
Dによってクエンチされない（例えば実施例６参照）。
従って、本発明方法は中間生成物を検出する。
実施例６ ペルオキシダーゼ／イソルミノール/H2O2によって発生
する化学ルミネセンスはSODによってクエンチされない A.材料 （ａ）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA） （ｂ）100mMのMgCl2と0.1％のウシ血清アルブミンとを
含有する0.1Mのtrisバッファ（pH9.5）中の0.38mMの５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート
モノ−（ｐ−トルイジニウム）塩（JBL,CA） （ｃ）100mMのMgCl2と0.1％のBSAとを含有するpH9.6の
0.1MのTris中の0.12mMのイソルミノール及び0.5μＭの
ミクロペルオキシダーゼ B.方法 （１）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
溶液をプラスチック管にピペット注入する。
（２）58mUのSOD含有またはSOD非含有（0mU;ブランク）
の10μｌの溶液を適当な管にピペット注入する。
（３）100μｌの基質溶液を添加する（上記の材料
（ｂ）項参照）。
（４）37℃で１時間インキュベートする。
（５）500μｌの化学ルミネセンス試薬（上記の材料
（ｃ）項参照）をAccuLyte光度計に注入する。
（６）500μｌの上記の（ｃ）項の試薬を添加し（段階
５）、15秒後から21秒後までの６秒間の化学ルミネセン
スをAccuLyte光度計を用いて測定する。
D.結論 SODの添加によって化学ルミネセンスがクエンチされ
ない。これはこの系が過酸化水素の測定に基づくことを
示す。
実施例７ 他の試薬を用いる化学ルミネセンス 材料 （１）2mMの塩化マグネシウム（MgCl2）を含有するpH1
0.0の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中の8.6×10
-15モル/10μｌのアルカリ性ホスファターゼ（AP）溶液
を調製した。
（２）基質溶液： I.2mMのMgCl2と1.3mMのルシゲニンとを含有するpH10.0
の70mMのジエタノールアミンバッファ中の2.3mMの３−
インドキシルホスフェート ジ−ｐ−トルイジン塩 II.2mMのMgCl2と1.3mMのルミノールとを含有するHp10.0
の70mMのジエタノールアミンバッファ中の2.3mMの３−
インドキシルホスフェート ジ−ｐ−トルイジン塩 III.2mMのMgCl2と1.3mMの２−メチル−６−（ｐ−｛２
−〔ナトリウム−３−カルボキシラト−４−（６−ヒド
ロキシ−３−キサンテノン−９−イル）フェニル−チオ
ウレイレン〕エチレンオキシ｝フェニル）−3,7−ジヒ
ドロイミダゾ〔1,2−α〕ピラジン−３−オンとを含有
するpH10.0の70mMのジエタノールアミンバッファ中の2.
3mMの３−インドキシルホスフェート ジ−ｐ−トルイ
ジン塩 IV.2mMのMgCl2と1.3mMの２−（メチル−６−フェニル）
−3,7−ジヒドロイミダゾ〔1,2−α〕ピラジン−３−オ
ンと含有するpH10.0の70mMのジエタノールアミンバッフ
ァ中の2.3mMの３−インドキシルホスフェート ジ−ｐ
−トルイジン塩 V.2mMのMgCl2と1.3mMの７−ジメチルアミノ−ナフタレ
ン−1,2−二炭酸ヒドラジドとを含有するpH10.0の70mM
のジエタノールアミンバッファ中の2.3mMの３−インド
キシルホスフェート ジ−ｐ−トルイジン塩 方法 アルカリ性ホスファターゼ溶液（10μｌ）をプラスチ
ック管に導入した。基質溶液（10μｌ）を添加し、化学
ルミネセンスをOPTOCOMP1（MGM）光度計によって１期間
６秒で10期間測定した。
実施例８ ルシゲニンによって強化した化学ルミネセンス 材料 （１）2mMの塩化マグネシウム（MgCl2）を含有するpH1
0.0の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中の8.6×10
-15モル/10μｌ、8.6×10-17モル/10μｌ及び8.6×10
-18モル/10μｌのアルカリ性ホスファターゼ（AP）溶液
を調製した。
（２）基質溶液は2mMのMgCl2と1.3mMのルシゲニンとを
含有するpH10.0の70mMのジエタノールアミンバッファ中
の2.3mMの３−インドキシルホスフェート ジ−ｐ−ト
ルイジン塩であった。
方法 アルカリ性ホスファターゼ溶液（10μｌ）をプラスチ
ック管に導入した。基質溶液（10μｌ）を添加し、OPTO
COMP1（MGM）光度計によって光学ルミネセンスを１期間
20秒で20期間測定した。
実施例９ インドキシル−ルシゲニンによって発生した化学ルミネ
センスに対するスーパーオキシドジスムターゼの効果 材料 ジエタノールアミンバッファ（70mM;MgCl2（2.0mM）:
pH10.0）中に３−インドキシルホスフェートトルイジン
塩（2.3mM）とルシゲニン（1.3mM）とを含む基質溶液を
調製した。
方法 10μｌのアルカリ性ホスファターゼ（8.6×10-15モ
ル）サンプルに基質溶液を加え、室温で１分間インキュ
ベートした。１分間のインキュベーション後、スーパー
オキシドジスムターゼを添加しないか（−）または85単
位添加して（＋）、Optocomp1（MGM）光度計で化学ルミ
ネセンスを１秒間測定した。
結果は、スーパーオキシドジスムターゼが化学ルミネ
センス発生反応をクエンチすることを証明し、これによ
ってこれらの反応で観察される化学ルミネセンスにはH2
O2でなくスーパーオキシドアニオンが関与していること
を示唆する。
実施例10 ルシゲニンで増幅された化学ルミネセンスに対するSOD
の効果 A.材料 2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノールアミ
ンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェート
ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパンジ
オール塩（JBL,CA） B.方法 （１）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
溶液をプラスチック管にピペット注入する。
（２）58mUのSOD含有またはSOD非含有（0mU;ブランク）
の10μｌの溶液（AP用またはブランク用に使用したバッ
ファ中で調製）をピペット注入する。
（３）1.25mMのルシゲニンと2mMのMgCl2とを含有するpH
10の0.1Mのジエタノールアミンバッファ中の3.5mMの３
−インドキシルホスフェート ジ−（２−アミノ−２−
メチル）−1,3−プロパンジオール塩（JBL,CA）を50μ
ｌ量で添加する。（４）１分間インキュベートし、Accu
Lyte光度計を用いて化学ルミネセンスを１秒間測定す
る。
C.結果 D.結論 上記実験は、化学ルミネセンスの約96％がクエンチさ
れることを示す。従って、化学ルミネセンスがSODの添
加によって実質的にクエンチされており、これは本発明
方法がH2O2の定量に基づく方法でないことを示す。
実施例11 増幅試薬を添加する前に加水分解反応を進行させる２段
階アッセイ及び酵素濃度増加の効果 A.方法 （１）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
溶液をプラスチック管にピペット注入する。
（２）2mMのMgCl2を含有するpH10の0.1Mのジエタノール
アミンバッファ中に3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA）を含む35μｌの溶液を添加す
る。
（３）室温で２分間インキュベートする。
（４）0.1Mの２−アミノ−２−メチル−プロパノールバ
ッファ（AMP）中に0.5mMのルシゲニンを含む50μｌの溶
液を混合物に注入する。
（５）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを１秒
間測定する。
C.結果 AP（pg/10μｌ） RLU（１秒） 0 332 1 4,239 10 308,336 100 1.4×106 実施例12 ルシゲニン−インドキシル化学ルミネセンス系（方法
１）と化学ルミネセンスによるH2O2の検出に基づく２段
階ルシゲニン−インドキシル系（方法２）との比較 A.試薬 （１）2mMのMgCl2を含有するpH10の70mMのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA）と1.25mMのルシゲニン （２）100mMのMgCl2と0.1％のBSAとを含有する0.1MのTr
isバッファ（pH9.5）（EP0,476,930A1参照）中の0.38mM
の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェ
ート モノ−（ｐ−トルイジニウム）塩（JBL,CA） （３）0.1MのKOH及び１×10-3MのTriton X−100中の６
×10-4％のルシゲニン（Tsujiら，Proc.J.Internationa
l Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescen
ce,Cambridge,1990,119頁参照）。
（１）方法１（本発明方法） （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
（2mMのMgCl2を含むpH10の0.1MのDEAバッファ中で調
製）をプラスチック管にピペット注入する。
（ｂ）25μｌの試薬（１）を添加し、37℃で４分間イン
キュベートする。
（ｃ）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを１秒
間測定する。
（１）方法２（従来方法） （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
（0.1％のBSA及び100mMのMgCl2を含むpH9.5の0.1MのTri
sバッファ中で調製;EP0,476,930A1参照）をプラスチッ
ク管にピペット注入する。
（ｂ）100μｌの基質溶液（試薬（２））を添加し、37
℃で１時間インキュベートする。
（ｃ）AccuLyte光度計を用いて500μｌの試薬（３）を
添加する。
（ｄ）AccuLyte光度計を用いて15秒後から25秒後までの
10秒間の化学ルミネセンスを測定する（Tsujiら，Proc.
J.International Symposium on Bioluminescence and C
hemiluminescence,Cambridge,1990,119頁参照）。
B.結果 C.結論 従来技術の方法〔例えばEP0,476,930A1及びTsujiら，
Proc.J.International Symposium on Bioluminescence
and Chemiluminescence,Cambridge,1990,119頁参照）は
H2O2を測定しており、従ってルシゲニンを比較的高いpH
で使用する。
本発明方法である方法１はアルカリ性ホスファターゼ
を約0.1pgの濃度で検出するが、H2O2を測定する方法で
ある方法２は約10pgの濃度で検出する。従って、方法１
は、H2O2に基づく方法２の約100倍の高い感度を有して
いる。
実施例13 方法（１）及び方法（２）の検出限度の比較 A.材料 （１）2mMのMgCl2を含有するpH10の70mMのジエタノール
アミンバッファ中の3.5mMの３−インドキシルホスフェ
ート ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA）及び1.25mMのルシゲニン （２）100mMのMgCl2と0.1％のウシ血清アルブミンとを
含有する0.1Mのtrisバッファ（pH9.5）〔EP0,476,930A1
参照〕中の0.38mMの５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドキシルホスフェート モノ−（ｐ−トルイジニウム）
塩（JBL,CA） （３）100mMのMgCl2を含有するpH9.5の10mMのTrisバッ
ファ中の0.12mMのイソルミノール及び0.5μＭのミクロ
ペルオキシダーゼ B.方法 方法（１） （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
溶液をプラスチック管にピペット注入する。
（ｂ）50μｌの試薬（１）を添加する。
（ｃ）室温で３分間インキュベートする。
（ｄ）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを１秒
間測定する。
方法（２） （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
溶液をプラスチック管にピペット注入する。
（ｂ）50μｌの試薬（２）を添加する。
（ｃ）37℃で１時間インキュベートする。
（ｄ）500μｌの化学ルミネセンス試薬（３）をAccuLyt
e光度計に注入し、試薬（３）の添加の15秒後から21秒
後までの６秒間の化学ルミネセンスをAccuLyte光度計を
用いて測定する。
C.結果 方法（１） 方法（２） インキュベーション時間 室温で３分 37℃で１時間 検出限度 0.15pg 1.0pg 10回の重複試験で測定を行った。
２つの標準偏差がブランクの値を上回ることが測定さ
れたアルカリ性ホスファターゼの量を検出限度と定義す
る。
D.結論 本発明方法（方法（１））を用いて得られた検出限度
は、方法（２）（EP0,476,930参照）で得られた検出限
度のほぼ７倍高い値である。方法（２）においては効果
を上げるために温度（37℃）及びインキュベーション時
間の双方を操作したにもかかわらず本発明方法のほうが
上記のような検出限度の向上を達成した。従って、本発
明方法は、より高い感度を与えるという利点に加えて、
（ａ）所要インキュベーション時間が短縮される（1/2
0）、（ｂ）37℃の温度が不要である、（ｄ）より簡便
である（１段階）、という利点を与える。本発明方法を
２段階方法で使用すると感度はさらに顕著に向上する。
実施例14 中間体または反応性代謝産物を測定するルシゲニン−イ
ンドキシル化学ルミネセンス系とH2O2を測定するルシゲ
ニン−インドキシル系との比較 本発明方法では、酵素で触媒されるインドキシルエス
テルの加水分解によって化学ルミネセンスを発生させ、
ルシゲニンによって強化し、強化された化学ルミネセン
スを測定することによって酵素を測定する。この方法
を、ルシゲニンをH2O2との反応が生じる条件下で化学ル
ミネセンス系を使用して加水分解反応中に形成されたH2
O2の量を測定することによって酵素を測定する方法（Ma
edaら，（1990）“アスコルビン酸二リン酸を基質とし
て用いるアルカリ性ホスファターゼの化学発光アッセイ
及び化学発光エンザイムイムノアッセイにおけるその使
用（Chemiluminescent Assay of Alkaline Phosphatase
Using Ascorbic Acid 2−Phosphate as Substrate and
its Application to Chemiluminescent Enzyme Immuno
assays）",Bioluminescence and Chemiluminescence,p
p.119−122参照）と比較する。
A.材料 （１）試薬 （ａ）2mMのMgCl2を含有するpH10の70mMのジエタノール
アミンバッファ中の３−インドキシルホスフェート（2.
5mM） ジ−（２−アミノ−２−メチル）−1,3−プロパ
ンジオール塩（JBL,CA）及び1.25mMのルシゲニン （ｂ）100mMのMgCl2を含有する0.01MのTrisバッファ（p
H9.5）中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル
ホスフェート（0.19mM） モノ−（ｐ−トルイジニウ
ム）塩（JBL,CA） （ｃ）0.1MのKOH及び１×10-3のTriton X−100中のルシ
ゲニン（６×10-4％）〔Tsujiら，Proc.J.Internationa
l Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescen
ce,Cambridge,1990,119頁参照）。
B.方法 （１）ルシゲニンで強化された化学ルミネセンス （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
をプラスチック管にピペット注入する。
（ｂ）50μｌの試薬ａを添加する。
（ｃ）光度計に入れて２分間インキュベートする。
（ｄ）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを１秒
間測定する。
（２）H2O2に基づく化学ルミネセンスアッセイ （ａ）10μｌのブランク及びアルカリ性ホスファターゼ
（0.1％のBSA及び100mMのMgCl2を含む0.1MのTrisバッフ
ァ（pH9.5）中で調製）をプラスチック管にピペット注
入する。
（ｂ）200μｌの基質溶液（試薬ｂ）を添加する。
（ｃ）AccuLyte光度計に500μｌの試薬（３）を注入す
る。
（ｄ）光度計内部で２分間インキュベートする。
（ｅ）AccuLyte光度計を用いて化学ルミネセンスを10秒
間測定する。
C.結果 D.結論 ２つの系を用いて得られる感度は顕著な違いを示す。
方法（１）では1pgのアルカリ性ホスァターゼを添加し
たときのS/N比が1.8であったが、方法（２）では100pg
を添加したときのS/N比が8.7であった。これは方法
（１）のほうが高い感度を有することを示す。
実施例15 前立腺特異的抗原アッセイ 材料： （１）前立腺特異的抗原に対する酵素免疫定量アッセイ
（AIA−PACK PA catalog no.020263 TOSOH）。AIA−PAC
K PAは、マウスの抗前立腺特異的抗原（PSAまたはPAと
略称）を常磁性粒子に固定化し、抗ヒトPAモノクローナ
ル抗体から成る第二抗体を腸管アルカリ性ホスファター
ゼにコンジュゲートしたサンドイッチ法酵素免疫定量ア
ッセイ（two−site immunoenzymmomertic assay）であ
る。
（２）基質 2.0mMの塩化マグネシウムを含むpH10.0の70mMのジエ
タノールアミンバッファ中の2.3mMの３−インドリルホ
スフェート ジ−ｐ−トルイジン塩（Diagnostic Chemi
cal Labs（DCL）,Canada）及び1.3mMのルシゲニン 方法 アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした抗体
とコートした常磁性ビーズとをプラスチック管に導入し
た。100μｌの希釈溶液（キットと共に提供される）を
添加し、得られた混合物を撹拌した。PSA標準溶液（20
μl;キットとして提供）またはBIO−RAD Lyphocheck Im
munoassay対照、レベル１、２及び３（20μl;Bio−Rad,
CA製；夫々、ロット番号92001、92002、92003）を添加
した。管を20分間インキュベートし、0.5mlの洗浄液
（キットとして提供）によってビーズを４回洗浄し、次
いで蒸留水によって２回洗浄した。
次に、基質溶液（100μｌ）を添加し、得られた混合
物を４分間インキュベートした。Berthold光度計モデル
＃952で化学ルミネセンスを測定した。化学発光出力を
１秒間測定した。
結果 標準溶液から得られたデータを用いて標準用量−応答
曲線を作成した。この標準用量−応答曲線から次にBIO
−RADlyphochek対照の濃度を決定した。以下の表に示す
ように、本発明方法を用いて得られた結果は、Bio−Rad
Lyphochek対照中のPSAの濃度を正確に測定した。
実施例16 β−ガラクトシダーゼアッセイ 材料： β−ガラクトシダーゼ（Boehringer Mannheim,German
y）。
AMPSOバッファ〔３−（1,1−ジメチル−２−ヒドロキ
シエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸;SIGMA Chemical Company〕 基質溶液はpH8.9の0.1MのAMPSOバッファ中の1.6mMの
５−ブロモ−４−クロロ−３−Ｏ−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（Diagnostic Chemicals LTD,Can
ada）及び1.3mMのルシゲニンである。
方法 0.1MのAMPSOバッファ及び0.1％のTRITON X−100,pH8.
9中のβ−ガラクトシダーゼ（10μｌ、種々の濃度）を1
00μｌの基質溶液と混合した。得られた混合物を室温で
３分間インキュベートした。MGM OPTOCOMP 1管状光度計
で化学ルミネセンスを直ちに測定した。化学発光出力を
１秒間測定した。
種々の変更は当業者に明らかであると考えられるの
で、本発明は請求の範囲によってのみ限定されることが
理解されよう。

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サンプル中の酵素活性を測定する方法であ
    って、 化学ルミネセンスを発する反応において、インドキシル
    エステル、チオインドキシルエステル及びベンゾフラン
    エステルから選択された基質とサンプルとを合わせて、
    H2O2生成の上流で加水分解産物を生成させる段階と、 生じた化学ルミネセンスを測定する段階と、 測定された化学ルミネセンスをサンプル中の酵素活性に
    相関させる段階とからなる方法。
  2. 【請求項２】インドキシルエステルが、式： 〔式中、 Ｘは、Ｓ、ＯまたはNRaを示し、 Raは、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルコ
    キシアルキル、アリール、アリールオキシ、ヒドロキシ
    ル、カルボキシル、カルボキシル低級アルコキシ、アリ
    ールオキシカルボニル、アリールカルボニル低級アルコ
    キシ、ニトロ、アシルまたは低級アシルアミノ基を示
    し、ここに低級アルキル基は炭素数１〜６であり、アリ
    ール基は４〜７員環であり、 Rbは、酵素によって加水分解され、 R1、R2、R3及びR4は、水素、ハライド、プソイドハライ
    ド、ハロアルキル、アルキルアミノ、ヒドロキシル、ア
    ルキル、アルコキシアルキル及びアミノ基から成るグル
    ープから独立に選択され、ここにアルキル基は炭素数１
    〜６である〕 を有する３−Ｏ−インドキシルエステルであることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つが、シ
    アノ、アミノ、１個または２個のメチルまたはエチル基
    によって置換されたアミノ、トリハロメチル、ヒドロキ
    シル、ハライド、メチル、エチル、メトキシ及びエトキ
    シから成るグループから選択されることを特徴とする請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】R1、R2、R3及びR4の少なくとも２つが水素
    であり、R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つがハライド
    であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】Rbが、ホスフェート、アセテート、ガラク
    トピラノシド、スルフェート、グルクロネート、グルコ
    ピラノシド、フルクトピラノシド及びマンノピラノシド
    から成るグループから選択されることを特徴とする請求
    項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】酵素が、アルカリ性ホスファターゼ、スル
    ファターゼ、プロテアーゼ及びガラクトシダーゼから成
    るグループから選択されることを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】H2O2生成の上流の加水分解産物がスーパー
    オキシドアニオンO2 -及びインドキシルラジカルから成
    るグループから選択されることを特徴とする請求項１か
    ら６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】化学ルミネセンス発生試薬が、西洋ワサビ
    ペルオキシダーゼ、ルシゲニン、７−ジメチルアミノ−
    ナフタレン−1,2−二炭酸ヒドラジン、２−メチル−６
    −〔ｐ−メトキシフェニル〕−3,7−ジヒドロイミダゾ
    〔1,2−α〕ピラジン−３−オン、２−メチル−６−フ
    ェニル〕−3,7−ジヒドロイミダゾ〔1,2−α〕ピラジン
    −３−オン、２−メチル−６−〔ｐ−〔２−〔ナトリウ
    ム−３−カルボキシラト−４−（６−ヒドロキシ−３−
    キサンテノン−９−イル）フェニルチオウレイレン〕−
    エチレンオキシ〕フェニル〕−3,7−ジヒドロイミダゾ
    〔1,2−α〕ピラジン−３−オンから成るグループから
    選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか
    一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】更に、H2O2生成の上流の加水分解産物を化
    学ルミネセンス増幅試薬と反応させる段階を含む請求項
    １から６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】更に、H2O2生成の上流の加水分解産物を
    ペルオキシダーゼ及びルシゲニンから成るグループから
    選択された化学ルミネセンス増幅試薬と反応させる段階
    を含む請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】サンプル中の酵素活性を測定する方法で
    あって サンプルとベンゾフランエステルとを合わせて、H2O2以
    外の化学発光性加水分解中間体を生成させる段階と、 H2O2以外の加水分解中間体から発生した化学ルミネセン
    スを測定する段階と、発生した化学ルミネセンスをサン
    プル中の酵素活性に相関させる段階とから成る方法。
  12. 【請求項１２】H2O2以外の加水分解中間体がインジゴ染
    料形成の中間化合物であることを特徴とする請求項11に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】インドキシルエステルが式： 〔式中、 Ｘは、Ｓ、ＯまたはNRaを示し、 Raは、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルコ
    キシアルキル、アリール、アリールオキシ、ヒドロキシ
    ル、カルボキシル、カルボキシル低級アルコキシ、アリ
    ールオキシカルボニル、アリールカルボニル低級アルコ
    キシ、ニトロ、アシルまたは低級アシルアミノ基を示
    し、ここに低級アルキル基は炭素数１〜６であり、アリ
    ール基は４〜７員環であり、Rbは、酵素によって加水分
    解され、R1、R2、R3及びR4は、水素、ハライド、プソイ
    ドハライド、ハロアルキル、アルキルアミノ、ヒドロキ
    シル、アルキル、アルコキシアルキル及びアミノ基から
    成るグループから独立に選択され、ここにアルキル基は
    炭素数１〜６である〕 を有する３−Ｏ−インドキシルエステルであることを特
    徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つが、
    シアノ、アミノ、１個または２個のメチルまたはエチル
    基によって置換されたアミノ、トリハロメチル、ヒドロ
    キシル、ハライド、メチル、エチル、メトキシ及びエト
    キシから成るグループから選択されることを特徴とする
    請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】R1、R2、R3及びR4の少なくとも２つが水
    素であり、R1、R2、R3及びR4の少なくとも１つがハライ
    ドであることを特徴とする請求項13に記載の方法。
  16. 【請求項１６】Rbが、ホスフェート、アセテート、ガラ
    クトピラノシド、スルフェート、グルクロネート、グル
    コピラノシド、フルクトピラノシド及びマンノピラノシ
    ドから成るグループから選択されることを特徴とする請
    求項13に記載の方法。
  17. 【請求項１７】酵素が、アルカリ性ホスファターゼ、ス
    ルファターゼ、プロテアーゼ及びガラクトシダーゼから
    成るグループから選択されることを特徴とする請求項11
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】更に、H2O2以外の加水分解中間体を化学
    ルミネセンス増幅試薬と反応させる段階を含む請求項11
    から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】更に、H2O2以外の加水分解中間体をペル
    オキシダーゼ及びルシゲニンから成るグループから選択
    された化学ルミネセンス増幅試薬と反応させる段階を含
    む請求項11から17のいずれか一項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】サンプル中の酵素活性の測定方法であっ
    て、 実質的に過酸化水素非依存性化学ルミネセンスを発する
    反応において、インドキシルエステル、チオインドキシ
    ルエステル及びベンゾフランエステルから選択された基
    質とサンプルとを合わせてH2O2以外の加水分解産物を生
    成させる段階と、発生した実質的に過酸化水素非依存性
    化学ルミネセンスを測定する段階と、発生した実質的に
    過酸化水素非依存性化学ルミネセンスをサンプル中の酵
    素活性に相関させる段階とから成る方法。
JP8506745A 1994-08-04 1995-08-01 インドキシル基質、チオインドキシル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ Expired - Lifetime JP2880802B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28669794A 1994-08-04 1994-08-04
US286,697 1994-08-04
US08/404,545 US5589328A (en) 1994-08-04 1995-03-15 Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates
US404,545 1995-03-15
PCT/US1995/009817 WO1996004400A1 (en) 1994-08-04 1995-08-01 Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH10506006A JPH10506006A (ja) 1998-06-16
JP2880802B2 true JP2880802B2 (ja) 1999-04-12

Family

ID=26964017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8506745A Expired - Lifetime JP2880802B2 (ja) 1994-08-04 1995-08-01 インドキシル基質、チオインドキシル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5589328A (ja)
EP (1) EP0775215B1 (ja)
JP (1) JP2880802B2 (ja)
AU (1) AU3757895A (ja)
DE (1) DE69524769D1 (ja)
WO (1) WO1996004400A1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6063588A (en) 1996-11-14 2000-05-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of diagnosing periodontal disease
US6080383A (en) * 1997-01-13 2000-06-27 Rose; Samuel Method and composition for the treatment of cancer by the enzymatic conversion of soluble radioactive toxic agents into radioactive toxic precipitates in the cancer
US5772926A (en) * 1997-05-13 1998-06-30 Lumigen, Inc. Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates
EP1595951A1 (en) * 1997-07-21 2005-11-16 Arpi Matossian-Rogers Diagnosis and treatment of diseases using peptides which are bound by specific anti-anti-t-cell receptor vbeta antibodies
US5972639A (en) * 1997-07-24 1999-10-26 Irori Fluorescence-based assays for measuring cell proliferation
FR2767535B1 (fr) * 1997-08-20 2000-02-04 Bio Merieux Milieux de culture et d'identification specifique de differentes especes de candida et procedes d'analyse
US6783948B1 (en) 1999-07-30 2004-08-31 Bayer Corporation Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes
US20020031788A1 (en) * 2000-02-18 2002-03-14 Rosenberg E. William Characterization of microbial deposition and immune response at the basement membrane and methods relating thereto
US20040248225A1 (en) * 2001-06-01 2004-12-09 Dieter Heindl Luciferin hydrazides
AU2002310743A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-16 Roche Diagnostics Gmbh Novel compounds for chemiluminescense procedures
FR2826867B1 (fr) * 2001-07-06 2003-10-17 Oreal Precurseurs de colorants phosphates et leur application pour la teinture des fibres keratiniques
EP1281966A3 (en) * 2001-07-30 2003-06-18 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method and apparatus for conducting a receptor-ligand reaction
JP3721334B2 (ja) * 2002-02-01 2005-11-30 富士写真フイルム株式会社 リセプター・リガンド会合反応方法およびそれに用いるリアクタ
JP3836379B2 (ja) * 2002-02-01 2006-10-25 富士写真フイルム株式会社 リセプター・リガンド会合反応方法
EP1496050A1 (en) * 2003-07-08 2005-01-12 Roche Diagnostics GmbH Novel chemiluminescent compounds and their use
ATE471513T1 (de) * 2003-07-30 2010-07-15 Hoffmann La Roche Neue chemilumineszenzverbindungen und ihre verwendung
WO2005015214A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Novel chemiluminescent compounds and their use
ES2289927B1 (es) * 2006-05-17 2008-12-16 Vitro, S.A. Sustrato enzimatico que comprende un compuesto indoxilico y una fuente de plata.
US20090081717A1 (en) * 2007-09-18 2009-03-26 Mahant Vijay K Compositions and Methods For Signal Generation

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1128371A (en) * 1965-10-04 1968-09-25 Miles Lab Diagnostic composition
US3867366A (en) * 1972-11-06 1975-02-18 Synvar Associates A K A Syva C Opiate imidates and protein conjugates thereof
US4065354A (en) * 1974-10-10 1977-12-27 Syva Company Lysozyme conjugates for enzyme immunoassays
DE2854987A1 (de) * 1978-12-20 1980-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene
DE3000292A1 (de) * 1980-01-05 1981-07-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Indoxylmaltodextrine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4423143A (en) * 1980-12-30 1983-12-27 Syva Company β-D-Galactosidase conjugate for enzyme immunoassays
WO1983003624A1 (en) * 1982-04-14 1983-10-27 Plc Unilever Microbiological test processes and apparatus
US4708929A (en) * 1984-10-29 1987-11-24 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation assays
US5273901A (en) * 1984-07-05 1993-12-28 Enzon Corp. Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b
FR2594955B1 (fr) * 1986-02-21 1989-05-26 Arley Guillaubey Laboratoires Agent de diagnostic, son procede de preparation et sa methode d'emploi
EP0243126B1 (en) * 1986-04-19 1992-08-12 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Method of measuring hydrogen peroxide or of measuring an enzyme or biochemical substrate liberating the peroxide
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
DE3788203T2 (de) * 1986-07-24 1994-03-31 Tropix Inc Verfahren zum nachweis einer verbindung unter verwendung des enzymatisch induzierten zerfalls von dioxethanen.
US5274087A (en) * 1986-08-13 1993-12-28 Molecular Diagnostics, Inc. cDNA coding for carcinoembryonic antigen (CEA)
US4835099A (en) * 1986-11-20 1989-05-30 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in immunoassay by modulation of enzymatic catalysis
US5320942A (en) * 1987-02-19 1994-06-14 Vito Quaranta Method of diagnosing the presence of abnormal epithelial tissue using monoclonal antibodies to the A6 B4 cell surface protein
US5322769A (en) * 1988-03-11 1994-06-21 Abbott Laboratories Methods for using CKS fusion proteins
US4999284A (en) * 1988-04-06 1991-03-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzymatically amplified piezoelectric specific binding assay
US4942127A (en) * 1988-05-06 1990-07-17 Molecular Devices Corporation Polyredox couples in analyte determinations
US5281522A (en) * 1988-09-15 1994-01-25 Adeza Biomedical Corporation Reagents and kits for determination of fetal fibronectin in a vaginal sample
DE3921025A1 (de) * 1989-06-27 1991-01-03 Langhals Heinz Ein neues syntheseverfahren zur darstellung von bipyridylen durch arylkopplung und neue bipyridyle
GB2233451B (en) * 1989-06-27 1993-09-15 Tropix Inc Chemiluminescence enhancement
JPH04507194A (ja) * 1989-07-13 1992-12-17 エヌ・ブイ・インノジェネティクス・ソシエテ・アノニム 化学発光組成物、化学発光法、及び分析的検定におけるその使用
US5294541A (en) * 1989-09-21 1994-03-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Real-time monitoring of oxidative products from in vitro cell-biomaterial interaction using chemiluminescence
CA2051144A1 (en) * 1990-09-12 1992-03-13 Akio Tsuji Enzyme assays
US5316906A (en) * 1991-08-23 1994-05-31 Molecular Probes, Inc. Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates

Also Published As

Publication number Publication date
AU3757895A (en) 1996-03-04
EP0775215B1 (en) 2001-12-19
EP0775215A1 (en) 1997-05-28
DE69524769D1 (de) 2002-01-31
JPH10506006A (ja) 1998-06-16
US5589328A (en) 1996-12-31
WO1996004400A1 (en) 1996-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2880802B2 (ja) インドキシル基質、チオインドキシル基質及び他の基質に基づく化学ルミネセンスアッセイ
US7052864B2 (en) Bioanalytical measuring method using oxidases and lanthanoid-ligand complexes
JP4274291B2 (ja) マルチレポータ遺伝子検定
JP4668418B2 (ja) 多種酵素アッセイ
US5306621A (en) Enhanced chemiluminescent assay
US5772926A (en) Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates
US6162610A (en) Xanthan-ester and acridan substrates for horseradish peroxidase
US5624813A (en) NAD(P)+ /NAD(P)H based chemiluminescent diagnostics
US5998128A (en) Use of porphyrins in instrumental detection methods
US4812393A (en) Fluorescent dyes and biological and analytical uses thereof
EP1054933B1 (en) Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates
JPH04356200A (ja) インドキシル誘導体を基質とする酵素活性測定法
WO1991001002A1 (en) Chemiluminescent compositions, chemiluminescent processes and their uses in analytical assays
US4927927A (en) Fluorescent dyes and biological and analytical uses thereof
Josel et al. Luminescence Systems
JPH0739393A (ja) ペルオキシダーゼ及びそれと同等な触媒作用を有する物質の定量方法