DE69130668T2

DE69130668T2 - Chemolumineszente 3-(substituierte adamant-2'-ylidene)1,2-dioxetane

Info

Publication number: DE69130668T2
Application number: DE69130668T
Authority: DE
Inventors: Irena Newton Ma 02158 Bronstein; Brooks Cambridge Ma 02138 Edwards; Rouh-Rong Alston Ma 02134 Juo
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1991-08-30
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2011-08-31
Also published as: BR9105888A; WO1992004341A1; JP2552413B2; JPH05503714A; NO921682L; FI102751B1; OA09659A; AU656927B2; DK0497972T3; CA2069957A1; ES2128326T3; FI102751B; EP0497972B1; CA2069957C; DE69130668D1; NO302120B1; EP0497972A1; FI921925A0; ATE174914T1; FI921925A

Description

Die Erfindung betrifft verbesserte chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere verbesserte enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2- Dioxetanverbindungen, welche enzymatisch entfernbare labile Gruppen enthalten. Solche labilen Gruppen verhindern, daß sich das Molekül unter Lichtbildung, beispielsweise sichtbarem Licht oder Licht, das durch geeignete Instrumente nachweisbar ist, zersetzen, bis ein geeignetes Enzym zur Entfernung der labilen Gruppe zugegeben wird.
Ein Enzymmolekül bewirkt die Entfernung durch einen katalytischen Zyklus, seiner komplementären labilen Gruppen von Tausenden von enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetanmolekülen. Dies ist ein ausgeprägter Gegensatz zu der Situation mit chemisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetanen, wo ein Molekül an chemischem Spaltmittel erforderlich ist, um komplementäre labile Gruppen aus jedem Dioxetanmolekül zu entfernen. Beispielsweise ist ein mol Natriumhydroxid erforderlich, um ein mol Wasserstoffionen aus dem Hydroxylsubstituenten der Phenylgruppe in 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3"- hydroxy)phenyl-1,2-dioxetan abzuspalten, während nur ein einziges Mol alkalischer Phosphatase ("AP") erforderlich ist, um die Phosphoryloxygruppe in 1.000-5.000 Mole 3-(2'- Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz pro Sekunde zu spalten; vergleiche Jablonski, "DNA Probes for Infectious Diseases" (Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1989), Seite 22.
Enzymatisch spaltbare lichterzeugende 1,2-Dioxetanverbindungen werden üblicherweise ebenfalls stabilisierende Gruppen, wie eine Adamantylidengruppe spirogebunden an das 3- Kohlenstoffatom des Dioxetanrings enthalten, die verhindert, daß die Dioxetanverbindung eine wesentliche Zersetzung bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) erleidet, bevor die Bindung, durch die die enzymatisch spaltbare labile Gruppe an den Rest des Moleküls gebunden ist, absichtlich gespalten wird. Das Konzept der Verwendung einer Spiroadamantylgruppe für die Stabilität wurde in die 1,2-Dioxetanchemie durch Wierynga, et al., Tetrahedron Letters, 169 (1972) und McCa- pra, et al.; J. Chem. Soc., Chem. Comm.; 944 (1977), eingeführt. Diese stabilisierenden Gruppen erlauben, daß solche Dioxetane während annehmbar langer Zeiten gelagert werden können, bevor sie verwendet werden, beispielsweise von etwa 12 Monaten bis so lange wie etwa 12 Jahre bei Temperaturen im Bereich von etwa 4 bis etwa 30ºC, ohne daß eine wesentliche Zersetzung stattfindet.
Die Erfindung betrifft weiterhin den Einbau der Dioxetanmoleküle in anerkannte Immunoassays, chemische Assays, und Nukleinsäuresondenassays und ihre Verwendung als direkte chemische/physikalische Sonden für die Untersuchung der Molekülstrukturen oder der Mikrostrukturen verschiedener Makromoleküle, synthetischer Polymere, Proteine, Nukleinsäuren, katalytischen Antikörpern und ähnlichen und ermöglicht die Identifizierung oder quantitative Bestimmung eines Analyten - die chemische oder biologische Substanz, deren Anwesenheit, Menge oder Struktur bestimmt werden soll.

Stand der Technik

Chemilumineszierende 1,2-Dioxetane haben bereits zunehmende Bedeutung in den vergangenen Jahren, insbesondere mit dem Fortschreiten der enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetanen gefunden, wie es in WO 88/00695, US 5 089 630, WO 89/06226 und US 4 952 707 beschrieben wird.
In ausgeprägtem Gegensatz zu den enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetanen haben die verschiedenen chemisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetane, die bis heute bekannt sind, wenig, wenn überhaupt, Verwendung als Reportermoleküle bei irgendeiner Art von analytischem Verfahren und mit Sicherheit nicht bei Bioassays gefunden. Dies liegt daran, daß die bekannten chemisch spaltbaren Verbindungen zum größten Teil wasserunlöslich sind - ausgenommen bestimmte Acetoxy-substituierte 1,2-Dioxetane, die etwas wasserlöslich, wie auch löslich in organischen Lösungsmitteln sind, und sie sind daher bei biologischen Assays nicht nützlich, sofern sie nicht etwas durch Zugabe von Gruppen oder Substituenten modifiziert werden, die eine Konjugation zu einer biologischen Spezies, beispielsweise einem Antikörper, erlauben, wodurch solche konjugierte chemisch spaltbare 1,2-Dioxetane als chemisch aktivierte chemiluminogene Markierungen verwendet werden können.
Die Wasserlöslichkeit typischer enzymatisch spaltbarer chemilumineszierender 1,2- Dioxetane, andererseits - beispielsweise Adamantyl-gebundene enzymatisch spaltbare 1,2- Dioxetane, die sich in Anwesenheit eines geeigneten Enzyms unter Lichtemission zersetzen - wie 3-(4-Methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat und seine Salze, beispielsweise Dinatriumsalz, wie im folgenden identifiziert kurz als adamantylidenmethoxyphenoxyphosphoryliertes Dioxetan ("AMPPD") und 3-(4-Methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenyloxy-3"-β-D-galactopyranosid und seine Salze ("AMPGD") - bewirken, daß diese hervorragend geeignet sind für die Verwendung als Reportermoleküle in vielen Typen analytischer Verfahren, die in wässrigen Medien durchgeführt werden und insbesondere bei Bioassays.
Es wurde beobachtet, daß das AMPPD in wässriger Lösung und ebenfalls in Anwesenheit chemilumineszierender Verstärker, beispielsweise eines polymeren Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumsalzes, wie Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] ("BDMQ") und anderer heteropolarer Polymere (vergleiche US 5 145 772) länger benötigt, um die konstanten Lichtemissionscharakteristika zu erreichen als es die optimalen Zeitperioden waren ("t1/2", definiert als die Zeit, die erforderlich ist, die Hälfte der maximalen Chemilumineszenzintensität bei konstanten, stationären Lichtemissionsgehalten zu erreichen; diese Emissionshalbwerrszeit variiert als Funktion der Stabilität des Dioxetanoxyanions in verschiedenen Umgebungen).
Statistisch sind ungefähr sieben t1/2-Perioden erforderlich, um die stationäre Lichtemissionskinetik zu erreichen.
Es wurde gefunden, daß die t1/2 für AMPPD bei Konzentrationen über 2 · 10&supmin;&sup5; M in wässriger Lösung bei pH 9,5 in Abwesenheit von BDMQ 7,5 Minuten beträgt. Es wurde gefunden, daß bei 4 · 10&supmin;³ M in Abwesenheit von BDMQ die t1/2 ungefähr 30-60 Minuten beträgt, während gefunden wurde, daß die t1/2 für AMPPD bei 2 · 10&supmin;&sup5; M in wässriger Lösung 2,5 Minuten beträgt.
In schnellen Bioassays, bei denen enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2- Dioxetane als Reportermoleküle verwendet werden, ist es wünschenswert, den stationären Zustand der Lichtemissionskinetik so schnell wie möglich zu erreichen, um den "Endpunkt" in dem Assay zu bestimmen. Die Chemilumineszenzintensität kann gemessen werden, bevor die stationäre Kinetik erreicht ist. Ausgeklügelte thermisch kontrollierte Luminometrie-Instrumente müssen verwendet werden, um die genauen Werte vor der stationären Emissionskinetik zu erhalten.
AMPPD zeigt in einer wässrigen gepufferten Lösung sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit chemilumineszierender Verstärker, wie BDMQ, eine höhere thermische oder sonstige nichtenzymatische aktivierte Lichtemission oder ein "Geräusch" als es gewünscht wird. Ein solches Geräusch kann Emissionen aus angeregten Zuständen von Adamantanon und des Methyl-m-oxybenzoatanions, das sich von dem aromatischen Teil des AMPPD-Moleküls ableitet, zugeschrieben werden. Dieses Geräusch kann die Nachweiswerte begrenzen und somit die Realisierung einer letzten Empfindlichkeit verhindern, da der gemessene Geräuschgehalt von AMPPD ungefähr zwei Größenordnungen über dem Dunkelstrom in einem Standardluminometer liegt.
Die enzymatische Spaltung von AMPPD mit alkalischer Phosphatase erzeugt ebenfalls anionische dephosphorylierte AMPPD - Adamantylidenmethoxymethylphenolatdioxetan oder "AMP-D". Dieses Phenolatanion kann auch hydrolytisch in kleinen Mengen gebildet werden, wodurch ein Hintergrundchemilumineszenzsignal gebildet wird, welches in einer organisierten molekularen Anordnung, wie in Micellen, Liposomen, lamellaren Phasen, dünnen Schichten, Lipiddoppelschichten, Liposombläschen, umgekehrten Micellen, Mikroemulsion, Mikrogel, Latex, Membran oder Polymeroberfläche und in hydrophober Umgebung, wie sie durch Chemilumineszenzverstärker; beispielsweise BDMQ; gebildet wird; starke verstärkte Gehalte an Lichtemission bewirkt, wodurch hohe Hintergrundsignale erzeugt werden und im wesentlichen der dynamische Bereich des Signals, das durch die enzymatische Hydrolyse von AMPPD gebildet wird, erniedrigt wird.
In Übereinklang mit den oben beschriebenen Beobachtungen wurden von der Anmelderin die folgenden Mechanismen postuliert.
In Anwesenheit von Verstärkungspolymeren, wie BDMQ: 1. Enzymatischer Weg(AP vorhanden): 2. Thermischer Weg (kein AP vorhanden):
1/ "CL" bedeutet Chemilumineszenz.
2/ AMPPD in wässriger gepufferter Lösung enthält eine geringe Menge an dephosphoryliertem hydroxyliertem 1,2-Dioxetan ("AMPHD"). Wenn der Lösungs-pH ausreichend hoch ist (über etwa 9,5) kann das dephosphorylierte Dioxetan in anionischem Zustand, als AMPθD, vorhanden sein.
3/ "CL&sub1;" und "CL&sub2;" bedeuten Hintergrundchemilumineszenz.
4/ "A*" bedeutet Adamantanon in angeregtem Energiezustand.
Selbst in Abwesenheit eines Verstärkungspolymeren kann AMPPD in wässriger Lösung als Aggregat vorliegen: 3. Enzymatischer Weg:
Bei dem obigen Mechanismus sind n> > > m; n und m eine Funktion der Anwesenheit oder Abwesenheit des Verstärkungspolymeren und der AMPPD-Konzentration.
Der angeregte Zustand des Adamantanonsinglets in Aggregatform (n oder m > 1) kann höhere Ausbeuten an Signalemission ergeben, hier erneut insbesondere, wenn "stabilisiert", um mehr Licht zu emittieren, wie durch die Anwesenheit eines Chemilumineszenzverstärkers, wie BDMQ, als es dem angeregten Energiezustand des nichtaggregierten Adamantanons entspricht. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß das erstere niedrigere Singletzustände, niedrigere Ausbeuten von Intersystemkreuzungen oder langsamere Intersystemkreuzungen als das letztere zeigt, oder auf andere noch nicht bekannte Faktoren. Da Luminometer im allgemeinen so ausgebildet sind, daß sie alle Photonen nachweisen, unabhängig von ihrer Energie oder ihrer Wellenlänge, werden 415 nm- und 477 nm-Chemilumineszenz beide als Hintergrundgeräuschemissionen nachgewiesen. Ähnlich, wenn ein photographischer oder Röntgenfilm zur Aufzeichnung der Chemilumineszenz verwendet wird, kann eine Unterscheidung zwischen den unterschiedlichen Wellenlängenemissionen leicht gemacht werden, wodurch die Empfindlichkeit des Nachweises durch das Hintergrundgeräusch begrenzt wird.
Schließlich kann die beobachtete Aggregation von AMPPD bei den oben beschriebenen Bedingungen durch die amphiphile Natur von AMPPD oder seinem Phenolatanion und ähnlichen Molekülen hervorgerufen werden:
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Zeit zu erniedrigen, die erforderlich ist, um Assays und insbesondere Bioassays durchzuführen, bei denen enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetane als Reportermoleküle verwendet werden. Erfindungsgemäß sollen neue und verbesserte enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetane zur Verfügung gestellt werden, die, wenn sie als Reportermoleküle in Assays und insbesondere Bioassays verwendet werden, die Zeit verringern, die erforderlich ist, um den Assay zu Ende zu führen.
Erfindungsgemäß sollen neue und verbesserte enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetane zur Verfügung gestellt werden, die als Substrate für Assays auf Enzymgrundlage und insbesondere Bioassays, verwendet werden können, die ein verbessertes Signal zu Hintergrundsverhalten und somit verbesserte Nachweisgehalte ergeben.
Erfindungsgemäß sollen neue Zwischenprodukte, die für die Synthese dieser verbesserten enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetane nützlich sind, zur Verfügung gestellt werden. Erfindungsgemäß sollen Verfahren zur Herstellung dieser enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetane und ihrer Zwischenprodukte zur Verfügung gestellt werden. Dieses und anderes wird in der folgenden Beschreibung und in den beigefügten Ansprüchen näher erläutert und beschrieben.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine neue Klasse stabiler enzymatisch spaltbarer chemilumineszierender 3-(substituierte Adamant-2'-yliden)-1,2-dioxetanverbindungen, die in wässrigen Medien, beispielsweise in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit in Lösung oder an einer festen Oberfläche, beispielsweise an einer Membranoberfläche, wie einer Nylonmembran, mit einem Enzym oder Enzymmodifizierten spezifischen Bindungspaar reagieren und optisch nachweisbare Energie freisetzen.
Diese modifizierten Adamantylidendioxetane ermöglichen in wässrigen Medien Assays, bei denen sie als Reportermoleküle verwendet werden, wobei die Assays schneller und mit größerer Empfindlichkeit durchgeführt werden können als es in der Vergangenheit unter Verwendung von AMPPD möglich war.
Obgleich die Anmelderin nicht auf irgendeinen Mechanismus oder eine Theorie festgelegt sein möchte, kann dieses unerwartete überlegene Verhalten dadurch erklärt werden, daß die Anwesenheit von Substituenten des hier beschriebenen Typs an oder in der Adamantylidengruppierung verhindert, daß sich die Dioxetanmoleküle wirksam verpacken bzw. wirksam verdichten, und somit verhindert wird; daß sie "stabilisierte" organische Verbundformen bilden, entweder in Form von Micellen oder in Form eines anderen aggregierten Zustands. Bestimmte dieser Substituenten können an andere Substanzen in ihrer wässrigen Umgebung über Wasserstoff gebunden sein, einschließlich Wasser selbst, wodurch weiter die Aggregatbildung verhindert wird. Es ist also möglich, daß elektronische und Dipolwirkungen zu diesem Phänomen beitragen, wie es aus den kürzeren t1/2-Zeiten und niedrigeren Hlntergrundgeräuschen hervorgeht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1-5 zeigen TSH, RLU gegen TSH für AMPPD und seine Brom-, B- Hydroxy-, A-Hydroxy- und Chloradamant-2'-ylidenanalogen, erhalten wie im folgenden Beispiel XII beschrieben.
In den Fig. 6-10 werden die Gesamtlumineszenzemissionen, erhalten von AMPPD und seinen A-Hydroxy-, B-Hydroxy-, Chlor- und Bromadamant-2'-ylidenanalogen, erhalten gemäß Beispiel XIII, verglichen.
In Fig. 11 ist die verbesserte Chemilumineszenzintensität dargestellt, erhalten unter Verwendung von Chloradamant-2'-ylidenanalog von AMPPD, verglichen mit AMPPD selbst als Reportermolekül bei einem Nukleinsäureassay; vergleiche folgendes Beispiel XIV.
In Fig. 12 ist die Kinetik der Lichtemissionen, erhalten unter Verwendung des Chloradamant-2'-ylidenanalogen von AMPPD und AMPPD selbst als Reportermoleküle in einem Nukleinsäureassay, dargestellt; vergleiche folgendes Beispiel XVI.
Fig. 13 ist die Dosisansprechkurve bei fünf Minuten für eine alkalische Phosphataseverdünnung mit Chloradamant-2'-ylidenanalog von -AMPPD plus Poy[vinyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] ("BDMQ"), dargestellt verglichen mit der Dosis-Ansprechkurve für fünf Minuten für AMPPD selbst plus BDMQ; vergleiche Beispiel XIX.
In Fig. 14 sind die Dosisansprechkurven bei 20 Minuten für die gleichen Substanzen dargestellt, deren Dosisansprechkurven in Fig. 13 gezeigt sind.
Fig. 15 ist die Dosisansprechkurve nach 5 Minuten für alkalische Phosphataseverdünnung mit dem Chloradamant-2'-ylidenanalogen von AMPPD plus BDMQ-Fluorescein ("Emerald"), verglichen mit der Dosisansprechkurve bei fünf Minuten für AMPPD selbst plus Emerald; vergleiche das folgende Beispiel XIX.
Fig. 16 zeigt die Dosisansprechkurven bei 20 Minuten für die gleichen Substanzen, deren Dosisansprechkurven in Fig. 15 dargestellt sind.
Fig. 17 zeigt TPA-Sequenzbilder, erhalten wie in dem folgenden Beispiel XX beschrieben, unter Verwendung von (1) AMPPD und (2) AMPPD's Chloradamant-2'-ylidenanalog.
Fig. 18 zeigt die Signale, die wie in Beispiel XII, unter Verwendung von (1) AMPPD und (2) substituierten erfindungsgemäßen Analogen erhalten werden.
Fig. 19 zeigt die graphische Darstellung des Chemilumineszenzsignals, erhalten gemäß Beispiel XXVII, erhalten mit (1) AMPPD und (2) Cl-AMPPD.
Fig. 20 zeigt die Belichtung, erhalten gemäß Beispiel XXVIX für den Nachweis von pBR322 Plasmid DNA, unter Verwendung von sowohl (1) AMPPD als auch (2) Cl-AMPPD.
Fig. 21 gibt die Belichtungen für den Nachweis von pBR322 entsprechend Beispiel XXX unter Verwendung von (1) AMPPD, (2) Cl-AMPPD und (3) Br-AMPPD an.
Fig. 22 ist eine graphische Darstellung des Chemilumineszenzsignals, erhalten gemäß Beispiel!!XXXI, dargestellt als Funktion der Zeit für sowohl (1) AMPPD als auch (2) Cl- AMPPD.
Die Fig. 23 und 30 zeigen die Belichtungen, erhalten gemäß den Beispielen!!XXXII und XXXIV beim Nachweis von humanem Transferrin für AMPPD, Cl-AMPPD und Br- AMPPD.
Fig. 24 ist ein Vergleich in den Signalen, erhalten gemäß Beispiel XXXV, wobei AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD und LumiPhos 530 verglichen werden.
In den Fig. 25 und 26 werden die Bilder verglichen, die gemäß dem Beispiel XXXVI unter Verwendung von AMPPD und Cl-AMPPD erhalten wurden.
In den Fig. 27 und 28 werden die Belichtungen, erhalten gemäß den Beispielen XXXVIII und XXXIX mit den Belichtungen, erhalten gemäß AMPPD, Cl-AMPPD und Br- AMPPD, verglichen.
Fig. 29 zeigt den Chemilumineszenznachweis von humanem Transferrin gemäß Beispiel 40, verglichen mit AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD.

Beste Art zur Durchführung der Erfindung

Die neuen erfindungsgemäßen chemilumineszierenden 3-(substituiertes Adamant-2'- yliden)-1,2-dioxetane können durch die allgemeine Formel:
dargestellt werden,
worin X und X¹ je einen Substituenten in den 5'- und 7'-Stellungen des Adamant-2'- ylidensubstituenten bedeuten, der individuell Wasserstoß eine Hydroxylgruppe, einen Halogensubstituenten, eine -O(CH&sub2;)nCH&sub3;-Gruppe, worin n = 0-19 bedeutet, eine Hydroxy(niedrig)- allcylgruppe, eine Halogen(niedrig)alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine Alkoxyphenylgruppe, eine Hydroxyalkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Amidogruppe bedeutet, wobei mindestens einer der Substituenten X und X¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoffbesitzt; und
R&sub1; und R&sub2; individuell oder zusammen einen organischen Substituenten bedeuten, der die Lichtbildung nicht stört, wenn die Dioxetanverbindung enzymatisch gespalten wird, und der den Wertigkeiten des 4-Kohlenstoffatoms der Dioxetanverbindung genügt, mit den Maßgaben, daß wenn R&sub1; und R&sub2; individuelle Substituenten bedeuten, der R&sub2;-Substituent ein aromatischer, heteroaromatischer, oder ein ungesättigter Substituent in Konjugation mit einem aromatischen Ring ist, und daß mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; oder R&sub1; und R&sub2; zusammen eine fluoreszierende chromophore Gruppe, die mit einer enzymatischen spaltbaren labilen Gruppe substituiert ist, die lumineszent wird, wenn der enzymatisch spaltbare labile Substituent davon durch ein Enzym entfernt wird, bedeuten.
Wenn die Adamantylidengruppe mit einem der zuvor erwähnten Substituenten, ausgenommen Wasserstoff, monosubstituiert ist, wird ein Gemisch der syn- und anti-Isomeren erhalten, wenn diese Verbindungen synthetisiert werden. In bestimmten Fällen, beispielsweise für Monojod-substituierte Adamantylidendioxetane, wird ein Isomeres eine größere Chemilumineszenzintensität bei der Zersetzung zeigen als das andere. In anderen Fällen, beispielsweise bei den Monohydroxy-substituierten Adamantylidendioxetanen, werden die beiden Isomeren äquivalent oder fast so in ihren Chemilumineszenzeigenschaften, wie der Intensität, sein. In jedem Fall können die Isomeren, bevor sie verwendet werden, beispielsweise als Reportermoleküle in Bioassays, verwendet werden durch Verfahren, wie sie in US 5 342 966 beschrieben werden, getrennt werden, oder sie können als chromatographierte isomere Gemische ohne Trennung verwendet werden.
Dioxetane, deren Adamantylidensubstituenten weiter mit zwei der zuvor erwähnten Substituenten ausgenommen Wasserstoff (X plus X¹ ≠ Wasserstoff) substituiert sind, zeigen keine syn-/anti-Isomerie, obgleich natürlich Stellungsisomere möglich sind, wenn zwei unterschiedliche Substituenten vorhanden sind, beispielsweise 5'-Hydroxy-T-chlor- und 5'-Chlor-7me hydroxy-substituierte Adamantylidendioxetane.
Die Symbole R&sub1; und R&sub2; können irgendeinen der Substituenten an dem 4- Kohlenstoffatom des Dioxetanrings bedeuten, wie in WO 88/00695, US 5 089 630, WO 89/06226, US 4 952 707, US 5 145 772 und US 5 342 966, wie oben erwähnt, beschrieben, so lange, wie R&sub1; und R&sub2; individuelle Substituenten bedeuten, der R&sub2;-Substituent ein aromatischer, heteroaromatischer oder ungesättigter Substituent in Konjugation mit dem aromatischen Ring ist, und mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; oder R&sub1; und R&sub2; zusammen eine fluoreszenzchromophore Gruppe mit einer enzymatisch spaltbaren labilen Gruppe substituiert ist bzw. sind, die eine lumineszierende Substanz ergibt bzw. ergeben, wenn der enzymatisch entfernbare labile Substituent davon durch ein Enzym entfernt wird.
So kann beispielsweise das Symbol R&sub1; Wasserstoff bedeuten oder eine Bindung bedeuten, wenn R&sub2; einen Substituent bedeutet, der an den Dioxetanring über eine Spirobindung gebunden ist, oder einen organischen Substituent bedeutet, der nicht die Lichtbildung stört, und der der Wertigkeit des Dioxetanringkohlenstoffatoms an das er gebunden ist, genügt, was ein vierwertiges Dioxetanringkohlenstoffatom ergibt, wie eine Alkyl-, eine Aryl-, Aralkyl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl- oder Cycloheteroalklygruppe ergibt, beispielsweise eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis einschließlich 7 Kohlenstoffatomen; eine geradkettige oder verzweigtkettige Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis einschließlich 7 Kohlenstoffatomen, eine -OR- Gruppe, worin R eine C&sub1;-C&sub2;&sub0; nichtverzweigte oder verzweigte unsubstituierte oder substituierte, gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Aralkenylgruppe bedeutet, wovon jede zusätzlich an R&sub2; kondensiert sein kann, so daß das emittierende Fragment einen Lactonring enthält, oder eine N-, O- oder S-Heteroatom-enthaltende Gruppe, oder eine enzymspaltbare Gruppe, direkt gebunden an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings, oder an eine der anderen zuvor erwähnten R&sub1;-Gruppen, die eine Bindung enthält, die durch ein Enzym spaltbar ist, wobei entweder direkt oder durch nachfolgende Einstellung des pH eine elektronenreiche Gruppierung, beispielsweise ein Sauerstoffanion, ein Schwefelanion oder ein Stickstoffanion (das letztere kann beispielsweise ein Oxim- oder ein Amidoanion, wie ein Sulfonamidoanion sein) gebunden an den Dioxetanring, gebildet wird. Bevorzugt bedeutet R&sub1; eine Alkoxygruppe und insbesondere eine Methoxygruppe, wenn R&sub2; einfach an das 4- Kohlenstoffatom des Dioxetans gebunden ist.
Das Symbol R&sub2; kann ebenfalls irgendeinen organischen Substituenten bedeuten, der die Lichtbildung nicht stört und der der Wertigkeit des 4-Kohlenstoffatoms des Dioxetanrings, an das er gebunden ist, genügt. Bevorzugt wird R&sub2; irgendeine Zahl von lichtemittierenden Fluorophor-bildenden fluoreszierenden chromophoren Gruppen bedeuten, die ermöglichen, daß die entsprechenden Dioxetanzersetzungsfragmente Energie absorbieren, und einen angeregten Zustand bilden, aus dem sie optisch nachweisbare Energie emittieren, und auf ihren Grundzustand zurückkehren, substituiert mit einer enzymspaltbaren Gruppe, die eine Bindung enthält, die durch ein Enzym spaltbar ist, wobei entweder direkt oder durch nachfolgende Einstellung des pH eine elektronenreiche Gruppierung erneut beispielsweise ein Sauerstoffanion, ein Schwefelanion oder ein Stickstoffanion, gebunden an den Dioxetanring, gebildet wird.
So kann beispielsweise das Symbol R&sub2; alleine (oder zusammen mit dem Symbol R&sub1; einen Substituenten, spirogebunden an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings) fluoreszierende chromophore Gruppen bedeuten, wie:
- Phenyl und Phenylderivate;
- Naphthalin und Naphthalinderivate, beispielsweise 5-Dimethylaminonaphthalin-1- sulfonsäure und Hydroxynaphthaline;
- Anthracen und Anthracenderivate, beispielsweise 9, 10-Diphenylanthracen, 9- Methylanthracen, 9-Anthracencarboxaldehyd, Anthrylalkohole und 9-Phenylanthracen;
- Rhodamin und Rhodaminderivate, beispielsweise Rhodole, Tetramethylrhodamin, Tetraethylrhodamin, Diphenylmethylrhodamin, Diphenyldiethykhodamin und Dinaphthylrhodamin
- Fluorescein und Fluoresceinderivate, beispielsweise 5-Iodacetamidofluorescein, 6- Iodacetamidofluorescein und Fluorescein-5-maleimid;
- Cumann und Cumarinderivate, beispielsweise 7-Dialkylamino-4-methylcumann, 4- Brommethyl-7-methoxycumann und 4-Brommethyl-7-hydroxycumann;
- Erythrosin und Erythrosinderivate, beispielsweise Hydroxyerythrosine, Erythrosyn-5- iodacetamid und Erythrosyn-5-maleimid;
- Acridin und Acridinderivate, beispielsweise Hydroxyacridine und 9-Methylacridin;
- Pyren und Pyrenderivate, beispielsweise N-(1-Pyren)iodacetamid, Hydroxypyrene und 1-Pyrenmethyliodacetat;
- Stilben und Stilbenderivate, beispielsweise 6,6'-Dibromstilben und Hydroxystilbene;
- Nitrobenzoxadiazole und Nitrobenzoxadiazolderivate, beispielsweise Hydroxynitrobenzoxadiazole, 4-Chlor-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 2-(7 Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4- yl)methylamino-acetaldehyd und 6-(7'-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminohexansäure;
- Chinolin und Chinolinderiväte, beispielsweise 6-Hydroxychinolin und 6-Aminochinolin;
- Acridin und Acridinderivate, beispielsweise N-Methylacridin und N-Phenylacridin;
- Acidoacridin und Acidoacridinderivate, beispielsweise 9-Methylacidoacridin und Hydroxy-9-methylacidoacridin;
- Carbazol und Carbazolderivate, beispielsweise N-Methylcarbazol und Hydroxy-N- methylcarbazol;
- fluoreszierende Cyanine, beispielsweise DCM (ein Laserfarbstoff), Hydroxycyanine, 1,6-Diphenyl-1,3,5-Hexatrien, 1-(4-Dimethylaminophenyl)-6-phenylhexatrien und die entsprechenden 1,3-Butadiene;
- Carbocyanine und Carbocyaninderivate, beispielsweise Phenylcarbocyanin und Hydroxycarbocyanine;
- Pyridiniumsalze, beispielsweise 4-(4-Dialkyldiaminostyryl)-N-methylpyridiniumiodat und Hydroxy-substituierte Pyridiniumsalze;
- Oxonole; und
Resorofine und Hydroxyresorofine.
Das Symbol R&sub2; kann zusammen mit dem Symbol R&sub1; ebenfalls eine kondensierte fluoreszierende chromophore Gruppe, gebunden an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings, über eine Spirobindung mit der allgemeinen Formel:
der der Substituenten R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; unabhängig Wasserstoff, eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis einschließlich 20 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, n-Butyl oder Decyl, eine verzweigte oder geradkettige Heteroalkylgruppe mit 1 bis einschließlich 7 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methoxy, Hydroxyethyl oder Hydroxypropyl; eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Phenyl, Naphthyl oder Anthryl; eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Pyrrolyl oder Pyrazolyl; eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis einschließlich 7 Kohlenstoffatomen im Ring, beispielsweise Cyclohexyl; eine Heterocycloalkylgruppe mit 3 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen im Ring, beispielsweise Dioxan; eine Aralkylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Benzyl; oder eine Alkarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Tolyl bedeuten; und jedes R&sub3; unabhängig Wasserstoff; eine elektronenabziehende Gruppe, wie eine Perfluoralkylgruppe mit 1 und einschließlich 7 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Trifluormethyl; ein Halogen; CO&sub2;H, -ZCO&sub2;H, -SO&sub3;H, ZSO&sub3;H, NO&sub2;, ZNO&sub2;, -C N, oder -Z&sub1;C N, worin Z eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis einschließlich 7 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, bedeutet; eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Phenyl, bedeutet; eine elektronenliefernde Gruppe, beispielsweise eine verzweigte oder geradkettige C&sub1;-C&sub7;-Alkoxygruppe, beispielsweise Methoxy oder Ethoxy bedeutet; eine Aralkoxygruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Phenoxy; eine verzweigte oder geradkettige C&sub1;-C&sub7;-Hydroxyalkylgruppe, beispielsweise Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl; eine Hydroxyarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Hydroxyphenyl; eine verzweigte oder geradkettige C&sub1;-C&sub7;-Alkylestergruppe, beispielsweise Acetat; eine Arylestergruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Benzoat; oder eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, beispielsweise Benzoxazol, Benzthiazol, Benzimidazol oder Benztriazol bedeutet. Weiterhin können zwei oder mehr der R&sub3;-Gruppen einen kondensierten Ring oder Ringe bilden, die selbst unsubstituiert oder substituiert sein können.
Das Symbol R&sub2;, alleine oder zusammen mit dem Symbol R&sub1;, kann ebenfalls eine besondere Klasse von Fluorophorgruppierungen bedeuten, die einen kondensierten polycyclischen Ring enthalten, mit einem labilen Ringsubstituenten, der eine Bindung enthält, die beim Spalten bewirkt, daß die kondensierte polycyclische Gruppierung elektronenreich wird, und ihrerseits die Dioxetanverbindung zersetzbar macht, um Licht zu emittieren. Die Glieder dieser Klasse sind solche, in denen der Bindungspunkt des labilen Ringsubstituenten an den kondensierten polycyclischen Ring, bezogen auf diesen Teil bzw. Teile der Ringe der Bindung an den Dioxetanring (einfache Bindung, oder wenn R&sub1; eine Bindung bedeutet, eine Spirobindung) so ausgeprägt ist, daß die Gesamtzahl der Ring-sp²-Atome, die diese Bindungspunkte trennen, einschließlich der sp²-Ringkohlenstoffatome an den Bindungsstellen eine ungerade ganze Zahl ist; vergleiche US 4 952 707.
Umfaßt von den kondensierten polycyclischen Ringverbindungen, deren Reste zur Bildung der Fluorophorgruppierung verwendet werden können, sind die kondensierten polycyclischen aromatischen fluorphorischen Kohlenwasserstoffringverbindungen, die oben erwähnt wurden, und insbesondere solche, die 9 bis etwa einschließlich 30 Ringkohlenstoffatome enthalten, wie Naphthalin:
wobei die Substituentenbindungen ein 1,6-Substitutionsmuster anzeigen, wie in Dinatrium-6-(4-methoxyspiro [1,2-dioxetan-3,2'-(5'-hydroxy)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)-1- naphthalenylphosphat, Pentalen, Azulen, Heptalen, as-Indacen; s-Indacen, Biphenylen, Perylen, Acenaphthylen, Phenanthren, Anthracen, Acephenanthrylen, Aceanthrylen, Triphenylen, Pyren, Chrysol, Naphthacen und ähnliche, die auch die Derivate davon, die mit einem oder mehreren nichtlabilen Substituenten, wie sie oben als Beispiele für die Symbole R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; erwähnt wurden, substituiert sind.
Der kondensierte polycyclische Ringteil von solchen mit "ungeraden Mustern substituierte" Fluorphorgruppierungen, dargestellt durch R&sub2; alleine oder zusammen mit R&sub1;, kann ebenfalls der Rest von nichtaromatischen" d. h. weniger vollaromatischen kondensierten polycyclischen Kohlenwasserstoffring-fluorophoren Verbindungen sein mit einem labilen Ringsubstituenten, der eine Bindung enthält, die beim Spalten die kondensierte weniger voll aromatische polycyclische Gruppierung elektronenreich macht, die ihrerseits die Dioxetanverbindung unter Lichtemittierung zersetzbar macht, unsubstituiert oder substituiert mit einem oder mehreren der zuvor erwähnten nichtlabilen Substituenten, und enthaltend 10 bis etwa einschließlich 30 Ringkohlenstoffatomen, wie Fluoren, 3,4-Dihydro-3,3-dimethylnaphthalin, Dibenzosuberen, 9,10- Dihydrophenanthren, Inden, Indeno[1,2-a]inden, Phenalen, Fluoranthren und ähnliche.
Der kondensierte polycyclische Ringteil der Fluorphorgruppierungen, dargestellt durch R&sub2; alleine oder zusammen mit R&sub1;, kann ebenfalls der Rest einer kondensierten polycyclischen heteroaromatischen oder weniger als voll aromatischen-kondensierte-Ring-heterocyclisch-fluorophorbildenden Gruppe sein, beispielsweise Dibenzothiophen, Dibenzofuran, 2,2-Dimethyl-2Hchromen, Xanthen, Piperidin, Chinolin, Isochinolin, Phenanthridin, Carbostyryl, Phenoxazin, Phenothiazin, Phenanthrolin, Purin, Phthalazin, Naphthyridin, N-Acylindol, Chroman, Isochroman, N-Acylindolin, Isoindolin und ähnliche, unsubstituiert oder substituiert mit einem oder mehreren der zuvor erwähnten nichtlabilen Substituenten und enthaltend 9 bis etwa einschließlich 30 Ringatome, wobei die Masse davon Kohlenstoffatome sind.
Eine bevorzugte enzymatisch entfernbare Gruppe mit der mindestens einer von R&sub1; und R&sub2; substituiert ist, ist eine Phosphatgruppe, insbesondere eine Phosphatestergruppe, dargestellt durch die allgemeine Formel:
worin M&spplus; ein Kation, wie ein Alkalimetall, beispielsweise Natrium oder Kalium, Ammonium oder ein C&sub1;-C&sub7;-Alkyl, Aralkyl oder ein aromatisches quaternäres Ammoniumkation, N(R&sub7;)&spplus;&sub4;, wobei R&sub7; Alkyl, beispielsweise Methyl oder Ethyl, Aralkyl, beispielsweise Benzyl, bedeutet, oder den Teil eines heterocyclischen Ringsystems, beispielsweise Pyridinium, bedeutet. Das Dinatriumsalz ist besonders bevorzugt. Solche Phosphatestergruppen können unter Verwendung eines Enzyms, wie alkalischer Phosphatase; unter Bildung von Sauerstoffanionensubstituierten Gruppen, die ihrerseits das Dioxetan destabilisieren, mit Spaltung seiner Sauerstoff Sauerstoff Bindung unter Lichtbildung gespalten werden. Die quaternären Ammoniumkationen in solchen Phosphatgruppen können ebenfalls eine ihrer quaternären Gruppen an ein polymeres Grundgerüst, wie
gebunden sein, worin n größer ist als 1, oder sie können Teil eines polyquaternaren Ammoniumsalzes bilden, beispielsweise ein Ion-enpolymer.
Eine andere bevorzugte enzymatisch entfernbare Gruppe ist die β-D-Galactosidgruppe, die mit dem Enzym β-D-Galactosidase gespalten werden kann, wobei die Konjugatsäure des Dioxetanphenolats gebildet wird, die unter Druck Chemilumineszenz zeigt.
Enzymatisch abspaltbare Substituenten, die ebenfalls verwendet werden können, umfassen enzymspaltbare Alkanoyloxygruppen, beispielsweise eine Acetatestergruppe, oder eine enzymspaltbare Oxacarboxylatgruppe, 1-Phospho-2,3-diacylglyceridgruppe, 1-Thio-Dglucosidgruppe, Adenosintriphosphatanaloggruppe, Adenosindiphosphatanaloggruppe, Adenosinmonophosphatanaloggruppe, Adenosinanaloggruppe, α-D-Galactosidgruppe, β-D- Galactosidgruppe, α-D-Glucosidgruppe, β-D-Glucosidgruppe, α-D-Mannosidgruppe, β-D- Mannosidgruppe, β-D-Fructofuranosidgruppe, β-D-Glucosiduronatgruppe, p-Toluolsulfonyl-Largininestergruppe oder p-Toluolsulfonyl-L = argininamidgruppe.
Wenn R&sub2; Phenyl bedeutet, wie angegeben, kann R&sub1; -O(CH&sub2;)nCH&sub3; bedeuten, wenn n 0- 19, bevorzugt 0-5, bedeutet. In solchen Verbindungen können wichtige Eigenschaften weiter im Molekül verliehen werden oder kontrolliert werden durch zusätzliche Substitution an dem Phenylring. Die Stabilität, Löslichkeit, Aggregation, Bindungsfähigkeit und Zersetzungskinetik kann weiter in Verbindungen der folgenden Struktur
kontrolliert werden, worin Z die oben diskutierte enzymspaltbare Gruppe bedeutet, der Sauerstoff in ortho; meta oder para steht, und Q Wasserstoff, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, Heteroaryl mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, eine Allylgruppe, ein Hydroxy(niedrig)alkyl, eine niedrig-Alkyl-OSiR³ (worin R&sub3; Medrigalkyl, Aryl, Alkoxy-C&sub1;&submin;&sub6;, Alkoxyalkyl mit 12 oder weni ger Kohlenstoffatomen, Hydroxy(niedrig)alkyl, Amino(niedrig)alkyl, -OR&sup4; oder -SR&sup4; (worin R&sub4; Alkenyl, substituiertes (Niedrig)Alkenyl, (Niedrig)alkyl oder Aralkyl mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen bedeutet, -SO&sub2;R&sup5; (worin R&sub5; Methyl, Phenyl oder NHC&sub6;H&sub5; bedeutet), substituiertes oder unsubstituiertes Niedrigalkyl, Nitro, Cyano, Halogen, Hydroxy, Carboxyl, Trimethylsilyl oder eine Phosphoryloxygruppe bedeutet.
In der PCT-Anmeldung Nr. WO88/00695, publiziert am 28. Januar 1988, werden enzymatisch spaltbare 1,2-Dioxetane beschrieben, die an dem 3-Kohlenstoffatom mit einem definierten Substituenten "T-V" und an dem 4-Kohlenstoffatom mit definierten Substituenten "X" und "Y-Z" substituiert sind. In dieser publizierten Anmeldung wird auf Seite 3, Zeilen 6-12, beschrieben:
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen umfassen eine oder mehrere Gruppen T, X oder Y weiterhin einen solubilisierenden Substituenten, beispielsweise eine Carbonsäure, eine Sulfonsäure, ein quaternäres Aminosalz; die Gruppe T des Dioxetans ist eine Polycycloalkylgruppe, bevorzugt Adamantyl; die enzymspaltbare Gruppe umfaßt Phosphat; und das Enzym besitzt Phosphataseaktivität.
auf Seite 22, Zeile 33 bis Seite 23 Zeile 6 wird beschrieben:
Beispielsweise kann die enzymspaltbare Gruppe Z an die Gruppe X des Dioxetan anstelle der Gruppe Y gebunden sein. Die spezifische Affinitätssubstanz kann an das Dioxetan über Gruppen X, Y oder T
(bevorzugt die Gruppe X) anstelle des Enzyms gebunden sein. In diesem Fall umfaßt die Gruppe, an die die spezifische Affinitätssubstanz gebunden ist, beispielsweise einen Carbonsäure-, Amino- oder Maleimidsubstituenten zur Erleichterung der Bindung.
und auf Seite 23 Zeilen 11-21 beschrieben:
Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können an eine polymerisierbare Gruppe, beispielsweise eine Vinylgruppe, gebunden sein, welche unter Bildung eines Homopolymeren oder Copolymeren polymerisiert werden kann.
Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können gebunden sein an beispielsweise Membranen, Filme, Perlen oder Polymere, damit sie in Immuno- oder Nukleinsäureassays verwendet werden können. Die Gruppen enthalten beispielsweise Carbonsäure-, Amino- oder Maleimidsubstituenten zur Erleichterung der Bindung.
Die Gruppen X, Y oder T des Dioxetans können Substituenten enthalten, die die Kinetik des enzymatischen Dioxetanabbaus verstärken, beispielsweise elektronenreiche Gruppierungen (beispielsweise Methoxy).
Die Gruppen Y und T des Dioxetans, wie auch die Gruppe X, können solubilisierende Substituenten enthalten.
Die Aufgabe, die durch die 3-(substituiertes Adamant-2'-yliden)-1,2- dioxetanverbindungen, die hier beschrieben und beansprucht werden, gelöst wird, wird in dieser publizierten PCT-Anmeldung nicht angesprochen, noch werden diese Verbindungen selbst in dieser oder irgendeiner anderen Literaturstelle, die den Erfindern bekannt ist, offenbart.
Die Gesamtsynthese dieser 3-(substituiertes Adamant-2'-yliden)-1,2-dioxetane kann durchgeführt werden unter Verwendung der Verfahren, wie sie beschrieben werden in WO 88/00695, WO 89/06226 und WO 91/03479.
So können beispielsweise 1,2-Dioxetane, die unter den Rahmen der obigen Formel I fallen, worin X eine Hydroxylgruppe, X¹ ein Wasserstoff, R&sub1; eine Methoxygruppe und R&sub2; eine Phosphoryloxysalz-substituierte Phenylgruppe, bevorzugt eine meta-Phosphoryloxysalzsubstituierte Phenylgruppe, bedeuten, gemäß den Verfahren synthetisiert werden, wie sie in der '176-Anmeldung beschrieben werden, durch eine Umsetzungssequenz, die schematisch wie folgt dargestellt werden kann:
Wie beispielhaft im folgenden spezifisch beschrieben, kann das O = φOR&sub9;-Ausgangsmaterial gewünschtenfalls mit einem Orthoformiat, wie mit Trimethylorthoformiat, Methanol, und p- Toluolsulfonsäure, umgesetzt werden, wobei das Zwischenprodukt:
erhalten wird, welches dann mit (R&sub8;O)&sub3;P und einer Lewis-Säure umgesetzt wird, wobei das Phosphonatesterzwischenprodukt:
erhalten wird.
Bei der zuvor erwähnten Reaktionssequenz bedeutet R&sub8; eine Niedrigalkylgruppe, beispielsweise Methyl, Ethyl oder Butyl. R&sub9; bedeutet eine Acylgruppe, die 2 bis etwa einschließlich 14 Kohlenstoffatome enthält, wie Acetyl, Propionyl, Mesitoyl oder Pivaloyl, Q bedeutet ein Halogen, beispielsweise Chlor oder Bromoder ORg, und M bedeutet unabhängig ein Proton, ein Metallkation, beispielsweise Na&spplus; oder K&spplus;, oder ein Ammonium-, substituiertes Ammonium-, quaternäres Ammonium- oder (H&spplus;)-Pyridiniumkation. Die Thiolatspaltung, wie sie in WO 89/06226 beschrieben wird, kann anstelle der Basenspaltung der OR&sub9;-Gruppe bei der Stufe 5 der oben erläuterten Reaktionssequenz verwendet werden, wobei in diesem Fall R&sub9; eine Niedrigalkyl-, Niedrigalkenyl- oder Aralkylgruppe, beispielsweise Methyl, Allyl oder Benzyl, bedeutet. Das Produkt der Basen- oder Thiolatspaltung kann anstelle von R&sub9; ein Wasserstoff oder ein Alkalimetallkation, beispielsweise Lithium, Natrium oder Kalium, enthalten.
Die Zwischenprodukte, die oben durch die Formel
dargestellt werden, worin nur einer von X und X¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoffbesitzt, sind bekannte Verbindungen, oder sie können leicht aus bekannten Ausgangsmaterialien unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise wird im Falle der monosubstituierten Adamantan-2-one (einer von X und X¹ bedeutet Wasserstoff):
- 5-Hydroxyadamantan-2-on, hergestellt wie in Geluk, Synthesis 374 (1972) beschrieben;
- 5-Bromadamantan-2-on und 5-Chloradamantan-2-on, hergestellt, wie in Geluk et al., Tetrahedron 24 5369 (1968) beschrieben.
Wenn X oder X¹ Fluor, unsubstituiertes (Niedrig)Alkyl, beispielsweise t-Butyl, substituiertes (Niedrig)Alkyl, beispielsweise Triffuormethyl, unsubstituiertes Aryl, beispielsweise Phenyl oder substituiertes Aryl, beispielsweise p-Chlorphenyl, p-Methoxyphenyl oder p-Nitrophenyl, bedeuten, vergleiche le Noble et al., J. Am. Chem. Soc. 108 1598 (1986)und Walborsky, et al., J. Am. Chem. Soc., 109 6719 (1987) (X oder X¹ = Hydroxymethyl).
Einfache Einheitsverfahren erlauben die Umwandlung verschiedener der zuvor erwähnten X oder X¹-Substituenten oder anderer bekannter in 5-X- oder 5-X¹-Adamantan-2-one, worin X oder X¹ Trialkylsilyloxy-, Iod- oder Cyanogruppen bedeuten: Diese Gruppierungen sind bei den milden Bedingungen, die bei der Stufe 4 der zuvor erwähnten Reaktionssequenz verwendet werden, stabil. Wenn beispielsweise 5-Hydroxyadamantan-2-on 7 Stunden mit 57%iger Iodwasserstoffsäure unter Rückfluß erhitzt wird, wird 5-Iodadamantan-2-on (Fp. 73-76ºC) erhalten. 5- Carboxyadamantan-2-on, hergestellt wie beschrieben in Lantvoev, J. Obshch. Khim. 2 2361 (1976) oder Le Noble et al., J. Org. Chem., 48 1101 (1983), kann nach Verseifung des Methylesters dieser in 5-Cyanoadamantan-2-on gemäß einem dreistufigen Verfahren von Tabushi et al., J. Org. Chem., 38 3447 (1973) überführt werden, das verwendet wird, um Zugang zu dem isomeren 1-Cyanoadamantan-2-on über das Zwischenprodukt eines Ketoamids zu erhalten. 5- Trimethylsilyloxyadamantan-2-on (Fp. 34-38ºC), welches als geschützte Version von 5- Hydroxyadamantan-2-on nützlich ist, erlaubt die Verwendung von nur einem Äquivalent Base bei der Stufe 4 der vorhergehenden Reaktionssequenz unter Herstellung des entsprechenden Enolethers, der dann unter Verwendung von Standardverfahren entsilylt werden kann.
Wie es dem Fachmann geläufig ist, müssen andere X- und X¹-Gruppen während der gesamten Reaktionssequenz nicht statisch sein, sondern sie können durch Reaktionen umgewandelt werden, die mit anderen Strukturüberlegungen zu irgendeinem Zeitpunkt verträglich sind. Beispielsweise wurde gefunden, daß wenn X oder X¹ ein Chlor- oder ein Bromatom bedeuten, die Enoletherzwischenprodukte, die bei den Stufen 4 und 5 der zuvor erwähnten Reaktionssequenz gebildet werden, leicht in Anwesenheit molekularer Überschüsse von Diolen oder flüssigem Ammoniak in einer Bombe bei hoher Temperatur Solvolyse erleiden. Die Reaktionsgeschwindigkeit mit Diolen, wie Ethylenglykol oder Propylenglykol, wird nur bei erhöhten Temperaturen (105-120ºC) in Anwesenheit eines Protonenakzeptors, wie Kaliumcarbonat, ausgeprägt. Im allgemeinen ist diese Reaktion langsam aber sauber, und es wird die Verwendung von Silber- oder Schwermetallsalzen vermieden, die oft zur Stimulierung der Hydroxyalkyletherbildung verwendet werden. 3-(Methoxy-5-(2-hydroxyethoxy)tricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol kann mit Trimethylacetylchlorid und Triethylamin verestert werden, wobei der entsprechende Diester entsteht, der dann selektiv unter Verwendung von Kaliumcarbonat in Methanol gespalten werden kann, wobei der Phenolmonoester entsteht. Die entsprechende Phosphorylierungsstufe, bei der gleichzeitig eine β Eliminierung und eine Verseifung des gehinderten Esters mit Natriummethoxid in Methanol stattfindet, ergibt das Hydroxyethoxyenoletherphosphat.
Die Reaktion mit flüssigem Ammoniak in Dioxan unter Druck ergibt 3-(Methoxy-5- aminotricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol aus der entsprechenden 5-Bromverbindung und wird durchgeführt, indem das Verfahren, das von Hummelen, Dissertatiozt University of Groningen, Niederlande, S. 60 (1985) beschrieben wird, verwendet wird. Die unmittelbare Acylierung des so erhaltenen Aminoenoletherphenols unter Verwendung von zwei Äquivalenten Acetylchlorid oder Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid und 4-Dimethylaminopyridin als Base gemäß dem Verfahren von Gawronski; et al., J. Am. Chem. Soc., 109 6726 (1987), das für die Veresterung von (5-Hydroxyadamantyliden)ethanol verwendet wird, ergibt die Formamido- oder Acetamidophenolester, die selektiv, wie oben beschrieben, verseiü und dann, wie unten beschrieben, phosphoryliert und photooxygeniert werden können.
Meijer, Dissertation University of Groningen, Niederlande (1982); Numan et al., J. Ora. Chem., 43 2232 (1978); und Faulkner, et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm., 3906 (1971) beschreiben den Zugang zu 4-Methylenadamantan-2-on (X und X¹ Wasserstoff, Methylen in der 4'- Stellung der obigen Formel I) als Ausgangsmaterial für die Stufe 4 der zuvor erwähnten Reaktionssequenz und nachfolgende Reaktion mit einem geeigneten Phosphonat-stabilisierten Carbonion. Der Unterschied in der Reaktivität des Singulett-Sauerstoffs gegenüber dem Enolether anstelle der Exomethylenfunktion stellt sicher, daß Dinatrium-3-(4-methoxyspiro-[1,3-dioxetan- 3,2'-(4'-methylen)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat als Photooxygenierungsprodukt erhalten wird.
Wenn ein selektiv spaltbarer Pivaloyloxyarylenolether bei irgendeiner der Reaktionen erhalten wird, die unmittelbar der Addition der Enzym-entfernbaren Grupp wie der Phosphatestergruppe, vorgehen, ist es zweckdienlicher, eine Isolierung des Hydroxyarylenolethers zu vermeiden. Dies kann erreicht werden, indem der Pivaloylester mit einem Äquivalent Natriummethoxid in Methanol direkt gespalten wird und die Natriumaryloxidspezies als trockener Feststoff isoliert wird, indem alle flüchtigen Stoffe bei Beendigung der Reaktion entfernt werden. In einem solchen Fall wird die Stufe 6 der zuvor beschriebenen Reaktionssequenz unter Verwendung dieses vorgebildeten Salzes in einem trockenen, polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, ohne Verwendung einer Lewis-Base durchgeführt, und die anorganischen Salznebenprodukte werden bei der Aufarbeitungsphase der Stufe 7 oder der Stufe 8 entfernt.
Das 2-Cyanoethylphosphatdiesterprodukt der Stufe 7 erleidet eine β Eliminierung zu dem Phosphatmonoester der Stufe 8. Bei der Stufe 8 werden Derivate, worin X oder X¹ = Chlor oder Brom bedeuten, bevorzugt mit einem flüchtigen Amin, wie Ammoniak, oder mit einem in einem Lösungsmittel löslichen organischen Amin, wie"DBU" (1,8 Diazabicyclo[5.4.0]undec-7- en) in einem Alkohol-Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, umgesetzt. Die Verwendung von Ammoniak bei Atmosphärendruck oder darüber und bei Umgebungstemperaturen ist besonders vorteilhaft, da der Überschuß an Base einfach beim Vakuum am Ende der Reaktion verdampft wird.
Die Oxidation des Enoletherphosphats bei der Stufe 9 der zuvor beschriebenen Reaktionssequenz kann photochemisch wie angegeben durch Umsetzung mit Singulett-Sauerstoff (¹O&sub2;) in einem halogenierten Lösungsmittel, beispielsweise einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, der ebenfalls ein Co-Lösungsmittel enthalten kann, beispielsweise ein niedriges Alkanol, wie Methanol, durchgeführt werden. Singulett-Sauerstoffkann unter Verwendung eines Photosensibilisators, wie Polymer-gebundenem Rose Bengal (Polysciences, Inc.), Methylenblau oder 5-,10-, 15-, 20-Tetraphenyl-21H, 23H-porphin ("TPP") erzeugt werden.
Alternativ können die rohen 2-Cyanoethylphosphatdiester, die bei der Stufe 7 der zuvor erwähnten Reaktionssequenz erhalten wurden, mit Singulett-Sauerstoff in ihre 1,2-Dioxethan- Gegenstücke oxidiert werden. Die darauffolgende Reaktion mit Natriummethoxid in Methanol bei Raumtemperatur erlaubt die wäßrige Aufarbeitung und die präparative Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie, wobei reine 1, 2 Dioxetanphosphatmonoestersalze als Gemische ihrer syn- und anti-Isomere erhalten werden. Chemische Verfahren für die 1,2- Dioxetanbildung umfassen solche unter Verwendung von Triethylsilylhydrotrioxid, Phosphatozoniden, oder es kann eine Ein-Elektronenoxidation von Triarylaminradikalkationen-vermittelt in Anwesenheit von Triplett-Sauerstoff ebenfalls verwendet werden.
Ausgangsmaterialien der Formel:
worin X und X¹ beide gleich sind und eine andere Bedeutung als Wasserstoff besitzen, oder Zwischenprodukte, aus denen solche Ausgangsmaterialien synthetisiert werden können, unter Verwendung an sich bekannter Verfahren sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise ergibt die Verwendung symmetrisch substituierter 5,7-Bis-X,X'-adamantan-2-one bei der Stufe 4 der zuvor erwähnten Reaktionssequenz symmetrische 1,2-Dioxetane, wie X- und X'-Substituenten sowohl in syn- als auch in anti-Beziehung zu dem viergliedrigen Dioxetanring aufweisen. Die Synthesestrategie auf Chinonmonoacetatgrundlage von Stetter et al. ergibt Zugang zu 5,7- Dihydroxyadamantan-2-on über Bicyclo[3.3.1]nonan-3,7-dion-9-ethylenacetal; Steifer, et al., Liebigs Ann. Chem., 1807 (1977); vergleiche ebenfalls Hamill, et al., Tetrahedron, 27 4317 (1971). 5,7-Dihydroxyadamantan-2-on können zu 5,7-Dibromadamantan-2-on oder seine 5,7- Dichlor- und 5,7-Diiodanaloge unter Verwendung von 47%iger wäßriger Bromwasserstoffsäure, Thionylchlorid oder 57%iger wäßriger Iodwasserstoffsäure unter den Bedingungen, wie sie von Geluk, et al. a.a.O., umgewandelt werden. 5,7-Dialkyladamantan-2-one, beispielsweise 5,7- Dimethyladamantan-2-on können gemäß dem Verfahren von Kira, et al., J. Am. Chem. Soc., 111 8256 (1989) synthetisiert werden. Die Solvolyse von 3-(Methoxy-5,7-dibromtricyclo[3.3.3.13,7]dec-2-ylidendimethyl)phenol mit Diolen, wie Ethylenglykol oder 1,4-Butandiol in Anwesenheit von Kaliumcarbonat, ergibt ebenfalls die entsprechenden symmetrischen Bishydroxyalkoxy-substituierten 1,2-Dioxetane, wobei ein modifizierter Weg zu den monosubstituierten Derivaten, wie oben beschrieben, verwendet wird.
Wenn man die Vorteile der gemeinsamen Wirkungen, die eine X-Gruppe, ausgenommen von Wasserstoff, die sich von der X¹-Gruppe, die ebenfalls vorhanden ist und die ebenfalls anders ist als Wasserstoff, ausnutzen will, insbesondere wenn Vorteile erhalten werden können, unter Verwendung solcher enzymatisch spaltbarerl,2-Dioxetane als isomere Gemische, werden unsymmetrische 5,7(X,X¹)Adamantan-2-one bei der Stufe 4 der vorhergehenden Reaktionssequenz verwendet. 5-Brom-7-triffuoradamantan-2-on kann gemäß dem Verfahren hergestellt werden, wie es von Sorochinskii, et al., Zh. Obshch. Khim., 7 2339 (1981) beschrieben wird. 5-Chlor-7-hydroxyadamantan-2-on und 5-Methyl-7-hydroxyadamantan-2-on wurden von Stetter, et al., a.a.O., beschrieben, und 5-Brom-7-hydroxyadamantan-2-on kann aus 7- Methylenbicyclo[3.3.1]nonan-3,9-dion-9-ethylenacetal gemäß dem Verfahren von Stetter, et al., synthetisiert werden, indem diese Verbindung in wasserfreiem Ethanol gelöst, und die Lösung bei 0ºC mit gasförmigem Bromwasserstoff anstelle von gasförmigem Chlorwasserstoff, der zur Herstellung des entsprechenden Chlorderivats verwendet wurde, gesättigt wird.
Zwischenprodukte und Verfahren zur Synthese von Verbindung der obigen Formel I, worin R&sub1; eine andere Bedeutung als Niedrigalkoxy besitzt, und R&sub2; eine andere Bedeutung als Phosphoryloxysalz-substituiertes Phenyl besitzt, werden in den zuvor erwähnten WO 88/00695, U. S. 5 089 630, WO 89/06226 und U. S. 4 952 707 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft, wie oben angegeben, ebenfalls die Verwendung chemilumineszierender, enzymatisch spaltbarer substituierter 1,2-Dioxetane in bekannten Assays, einschließlich von Assays zum Nachweis von Enzymen in Proben. Die Erfindung betrifft weiterhin Kits für die Verwendung bei solchen Assays und ähnliche Verwendungen und Maßnahmen zur Durchführung dieser Verwendungen.
Wenn beispielsweise die vorliegende Erfindung verwendet wird, um ein Enzym in einer Probe nachzuweisen, wird die Probe mit einem Dioxetan behandelt, das eine Gruppe trägt, die durch das nachzuweisende Enzym abspaltbar ist. Das Enzym spaltet die durch das Enzym spaltbare Gruppe des Dioxetans unter Bildung eines negativ geladenen Substituenten (beispielsweise eines Sauerstoffanions), gebunden an das Dioxetan. Dieser negativ geladene Substituent destabilisiert seinereits das Dioxetan und bewirkt, daß sich das Dioxetan unter Bildung einer fluoreszierenden chromophoren Gruppe, die Lichtenergie emittiert, zersetzt. Es ist diese chromophore Gruppe, die als Hinweis auf die Anwesenheit des Enzyms nachgewiesen wird. Durch Messung der Intensität der Lumineszenz kann die Konzentration des Enzyms in der Probe ebenfalls bestimmt werden.
Es existieren eine große Anzahl anderer Assays, bei denen visuell nachweisbare Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration einer besonderen Substanz in einer Probe verwendet werden. Die oben beschriebenen Dioxetane können bei irgendeinem dieser Assays verwendet werden. Beispiele solcher Assays umfassen Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen, beispielsweise α- oder β-hCG, Enzymassays, chemische Assays zum Nachweis von beispielsweise Kalium- oder Natriumionen, und Nukleinsäureassays zum Nachweis von beispielsweise Viren (beispielsweise HTLV III oder Cytomegalievirus oder Bakterien (beispielsweise E. coli) und bestimmten Zellinktionen (beispielsweise Rezeptorbindungsstellen).
Wenn die nachweisbare Substanz ein Antikörper, ein Antigen oder eine Nukleinsäure ist, ist das Enzym, das die Enzym spaltbare Gruppe des Dioxetans spalten kann, bevorzugt gebunden an eine Substanz mit einer spezifischen Aflinität für die nachweisbare Substanz (d. h. eine Substanz, die spezifisch an die nachweisbare Substanz bindet), beispielsweise ein Antigen, ein Antikörper oder eine Nukleinsäuresonde. Bekannte Verfahren, beispielsweise die Carbodiimid- Kupplung, werden zur Bindung des Enzyms an die spezifische Aftinitätssubstanz verwendet, wobei die Bindung bevorzugt über eine Amidverknüpfung erfolgt.
Im allgemeinen werden die Assays wie folgt durchgeführt. Eine Probe, von der vermutet wird, daß sie eine nachweisbare Substanz enthält, wird mit einer gepufferten Lösung, die ein Enzym, gebunden an eine Substanz mit einer spezifischen Affinität für die nachweisbare Substanz enthält, kontaktiert. Die entstehende Lösung wird inkubiert, damit die nachweisbare Substanz an den spezifischen Affnitätsteil der spezifischen Affinitäts-Enzym-Verbindung binden kann. Überschüssige spezifische Affinität-Enzym-Verbindung wird dann weggewaschen, und ein Dioxetan mit einer Gruppe, die durch den Enzymteil der spezifischen Affinität-Enzym- Verbindung spaltbar ist, wird zugegeben. Das Enzym spaltet die Enzym spaltbare Gruppe und bewirkt, daß das Dioxetan sich in zwei Carbonylverbindungen, beispielsweise einen Ester, ein Keton oder ein Aldehyd, zersetzt. Der Chromophor, an den die Enzym spaltbare Gruppe gebunden war, wird so angeregt und luminesziert. Die Lumineszenz wird nachgewiesen (unter Verwendung von beispielsweise einer Küvette oder eines lichtempfindlichen Films in einem Kameraluminometer, oder eine photoelektrische Zelle oder ein Photomultiplier-Rohr als Anzeichen für die Anwesenheit der nachweisbaren Substanz in der Probe. Die Lumineszenzintensität wird zur Bestimmung der Konzentration der Substanz gemessen.
Erfindungsgemäß wird ein Assayverfahren zur Verfügung gestellt, bei dem eine optisch nachweisbare Reaktion zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer besonderen Substanz in der Probe verwendet wird, wobei die optisch nachweisbare Reaktion, die Reaktion mit einem Enzym einer enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1, 2 = Dioxetanverbindung, dargestellt durch die Formel
wobei die Substituenten die oben gegebene Definition besitzen, umfaßt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Substituenten X und X¹ in der Formel Chlor bzw. Wasserstoff. Bevorzugt wird Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- (5'-chlor)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat verwendet.
Als zuvor erwähnte spezifische Bindungspaare werden die folgenden bevorzugt in dem erfindungsgemäßen Assayverfahren verwendet:
(i) ein Antigen und ein Antikörper,
(ii) eine Nukleinsäure und eine Sonde, die einen Teil oder die gesamte Nukleinsäure binden kann,
(iii) ein Enzym und eine 1,2-Dioxetanverbindung, die eine Gruppe enthält, die durch das Enzym spaltbar ist.
Bevorzugt ist die zuvor erwähnte Sonde ein markiertes Oligonukleotid, komplementär zu der Nukleinsäure. DNA, RNA und Fragmente davon können gemäß einem Sequenzierprotokoll gebildet werden.
Dieses bevorzugte Assayverfahren umfaßt weiter die Stufen von (a) Behandlung der DNA, RNA oder eines Fragments davon mit einer markierten komplementären Oligonuldeotidsonde unter Bildung eines Hybridisierungspaares, (b) Behandlung des hybridisierten Paares mit einem Molekül, das stark an die Markierung des Oligonukleotids gebunden ist, das covalent mit einem Enzym konjugiert ist, welches ein enzymatisch spaltbares 1,2-Dioxetan unter Freisetzung von Lichtenergie spalten kann,
(c) Zugabe eines 1,2-Dioxetansubstrats und
(d) Nachweis des erzeugten Lichts.
Bevorzugt ist die Oligonukleotidmarkierung Biotin oder ein Biotinderivat. Das Molekül, das stark mit der Markierung des Oligonukleotids eine Wechselwirkung eingehen kann, ist bevorzugt Avidin oder Streptavidin.
Die zuvor erwähnte covalente Markierung für die Oligonukleotidsonde ist die Verwendung eines Enzyms, welches die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, wünschenswert.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Assayverfahren ein Verfahren, bei dem die Markierung an der Oligonukleotidsonde ein covalent gebundenes Antigen umfaßt, das immunochemisch an ein Antikörper-Enzym Konjugat gebunden ist, wobei der Antikörper gegen das Enzym gerichtet ist, und das Enzym fähig ist, die 1,2- Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zu zersetzen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase, R&sub1; bedeutet Methoxy und R&sub2; bedeutet eine Metaphosphat-substituierte Phenoxygruppe
Die Bindung der Sonde an die Nukleinsäure erfolgt bevorzugt mit einer Nylonmembran. Das gleiche gilt für die Hybridisierung zwischen DNA, RNA oder einem Fragment davon und der markierten Oligonukleotidsonde.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Assayverfahrens wird eine feste Matrixverwendet, bei der eine nichtspezifische Bindung an die Matrix durch Vorbehandlung der Matrix mit einem polymeren quaternären Ammoniumsalz blockiert ist. Es ist weiterhin wünschenswert, das Assayverfahren weiter in Anwesenheit einer wasserlöslichen Verstärkungssubstanz, welche die spezifische Lichtenergiebildung über den Wert bei ihrer Abwesenheit verstärkt. Als Beispiel für eine solche Verstärkungssubstanz kann ein polymeres quaternäres Ammoniumsalz erwähnt werden. Bevorzugte polymere quaternäre Ammoniumsalze werden ausgewählt aus Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] oder Poly[vinyl(benzyltributylammoniumchlorid)].
Ein bevorzugtes Verfahren ist ein Verfahren, bei dem die Verstärkungssubstanz ein positiv geladenes polymeres quaternäres Ammoniumsalz und Fluorescein, welches mit dem negativ geladenen Produkt der 1,2-Dioxetanverbindung, die nach der Enzym-katalysierten Zersetzung der 1,2-Dioxetanverbindung gebildet wurde, einen ternären Komplex bilden kann, umfaßt, wobei eine Energieübertragung zwischen dem negativ geladenen Produkt und Fluorescein stattfindet und wobei von Fluorescein Licht emittiert wird. Die Verwendung der zuvor erwähnten quaternären Ammoniumsalze ist bei diesem Verfahren ebenfalls bevorzugt.

Es folgen Beispiele für spezifische Assays.

A. Assay für human-IgG

Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit einem Schafanti-human-IgG (F(ab)&sub2;- Fragment spezifisch) beschichtet. Eine Serumprobe, welche humanes IgG enthält, wird dann in die Vertiefungen gegeben, und die Vertiefungen werden während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wird die Serumprobe aus den Vertiefungen entfernt, und die Vertiefungen werden viermal mit einer wäßrigen Pufferlösung; enthaltend 0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat und 0,1% Rinderserumalbumin (pH 7,4), gewaschen.
Alkalische Phosphatase, gebunden an anti-human-IgG, wird in jede Vertiefung gegeben, und die Vertiefungen werden 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen werden dann viermal mit der obigen Pufferlösung gewaschen, und eine Pufferlösung aus Phosphat-enthaltendem Dioxetan gemäß der Erfindung wird zugegeben. Die entstehende Lumineszenz, die durch enzymatischen Abbau des Dioxetans verursacht wird, wird mit einem Luminometer oder mit einem photographischen Film in einem Kameraluminometer nachgewiesen.

B. Assay für hCG

Kaninchen anti-α-hCG wird an eine Nylon-Mesh-Membran adsorbiert. Eine Probenlösung, enthaltend hCG, beispielsweise, Harn von einer schwangeren Frau, wird durch die Membran geblottet, danach wird die Membran mit 1 ml Pufferlösung, enthaltend 0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat und 0,1% Rinderserumalbumin (pH 7,4) gewaschen.
Das alkalische Phosphatase-markierte β-hCG wird zu der Membran gegeben, und die Membran wird erneut mit 2 ml der obigen Pufferlösung gewaschen. Die Membran wird dann in die Küvette eines Luminometers oder in einen Kamera-Luminometer gegeben und mit einem erfindungsgemäßen Phosphat-enthaltenden Dioxetan kontaktiert. Die Lumineszenz, die durch den enzymatischen Abbau des Dioxetans auftritt, wird dann nachgewiesen.

C. Assay für alkalische Serumphosphatase

2,7 ml einer wäßrigen Pufferlösung, enthaltend 0,8 M 2-Methyl-2-aminopropanol, werden in ein 12 · 75 mm Pyrex-Reagensglas gegeben, und 0,1 ml Serumprobe, enthaltend alkalische Phosphatase, werden zugegeben. Die Lösung wird dann bei 30ºC equilibriert. 0,2 ml eines erfindungsgemäßen phosphatenthaltenden Dioxetans werden zugegeben, und das Reagensglas wird sofort in einen Luminometer zum Aufzeichnen der entstehenden Lumineszenz gegeben. Der Wert der Lichtemission ist proportional zu der Geschwindigkeit der alkalischen Phosphataseaktivität.

D. Nukleinsäure-Hybridisierungsassay

Eine Probe aus zerebrospinaler Flüssigkeit (CSF), von der angenommen wird, daß sie das Cytomegalievirus enthält, wird gesammelt und auf eine Membran, beispielsweise eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran, gegeben. Die Probe wird dann chemisch mit Harnstoff oder Guanidiniumisothiocyanat zum Brechen der Zellwände und zum Abbau aller zellulären Komponenten, ausgenommen der viralen DNA, behandelt. Die Stränge der viralen DNA, die so gebildet wurden, werden abgetrennt und an das Nitrocellulosefilter gebunden. Eine DNA-Sonde, spezifisch für die virale DNA und markiert mit alkalischer Phosphatase, wird dann auf das Filter aufgebracht; die Sonde hybridisiert mit den komplementären viralen DNA-Strängen. Nach der Hybridisierung wird das Filter mit einer wäßrigen Pufferlösung, enthaltend 0,2 M NaCl und 0,1 mM Tris-HCl (pH = 8,10) zur Entfernung überschüssiger Sondenmoleküle gewaschen. Ein erfindungsgemäßes phosphatenthaltendes Dioxetan wir zugegeben, und die entstehende Lumineszenz von dem enzymatischen Abbau des Dioxetans wird in einem Luminometer gemessen oder mit einem photographischen Film nachgewiesen.

E. Assay für Galactosidase

In den oben beschriebenen Assays und in den folgenden Arbeitsbeispielen können Dioxetane, die α- oder β-Galactosidase-spaltbare α-D- oder β-D-Galactosid(Galactopyranosid)- gruppen enthalten, zugegeben werden, und die Lumineszenz, die von der enzymatischen Abspaltung der Zuckergruppierung von dem Chromophoren gebildet wird, wird in einem Luminometer gemessen oder mit einem photographischen Film nachgewiesen.

F. Elektrophorese

Die Elektrophorese erlaubt die Trennung komplexer Gemische aus Proteinen und Nukleinsäuren entsprechend ihren Molekülgrößen und Strukturen an Gelträgern in einem elektrischen Feld. Diese Technik kann ebenfalls zum Trennen von Proteinfragmenten nach der Proteolyse oder von Fragmenten von Nukleinsäuren nach dem Abschneiden durch Restriktionsendonukleasen (wie bei der DNA-Sequenzierung) angewendet werden. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Spezies in einem Gel oder nach der Übertragung der aufgetrennten Spezies von einem Gel auf eine Membran werden die Proben mit einer Sonde eines Enzyms, gebunden an einen Liganden, behandelt. Beispielsweise werden Peptidfragmente mit einem Antikörper covalent gebunden an alkalische Phosphatase als Sonde untersucht. Als anderes Beispiel bindet bei der DNA-Sequenzierung alkalische Phosphatase-Avidin an biotinylierte Nukleotidbase. Danach wird ein erfindungsgemäßes AMPPD-Analog zu dem Gel oder dem Membranfilter zugegeben.
Nach kurzer Inkubation wird Licht als Ergebnis einer enzymatischen Aktivierung des Dioxetans unter Bildung entsprechender emittierender Spezies emittiert. Die Lumineszenz wird entweder mit Röntgenstrahlen oder durch einen photographischen Sofortbild-Film nachgewiesen oder mit einem Luminometer abgetastet. Die Mehrkanalanalyse verbessert das Verfahren weiter, wodurch es möglich ist, flir mehr als ein Fragment gleichzeitig Sonden einzusetzen.

G. Assays in festem Zustand

Bei Assays in festem Zustand ist es wünschenswert, die nichtspezifische Bindung an die Matrix durch Vorbehandlung der nichtspezifischen Bindungsstellen mit nichtspezifischen Proteinen, wie mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Gelatine, zu blockieren. Es wurde gefunden, daß einige im Handel erhältliche Präparate von BSA geringe Mengen an Substanzen die Phosphataseaktivität aufweisen, enthalten, wodurch eine unerwünschte Hintergrundschemilumineszenz aus AMPP gebildet wird. Es wurde auch weiterhin gefunden, daß bestimmte wasserlösliche synthetische makromolekulare Substanzen effiziente Blockierungsmittel für die nichtspezifische Bindung in Assays in festem Zustand unter Verwendung von Dioxetanen sind. Bevorzugt unter solchen Substanzen sind wasserlösliche polymere quaternäre Ammoniumsalze, wie BDMQ, Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) (TMQ) und Poly(vinylbenzyltributylammoniumchlorid) (TBQ). Andere solche Substanzen werden in der zuvor erwähnten Voyta, et al. '263-Anmeldung beschrieben und sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.

H. Assay für Nukleotidase

Ein Assay für das Enzym ATPase wird in zwei Stufen durchgeführt. Bei der ersten Stufe wird das Enzym bei optimalem pH (typischerweise pH 7,4) mit einem Substrat, enthaltend ATP, covalent gebunden über eine terminale Phosphoesterbindung an ein Chromophor-substituiertes 1,2-Dioxetan umgesetzt, wobei Phosphoryl-Chromophor-substituiertes 1,2-Dioxetan hergestellt wird. Bei der zweiten Stufe wird das Produkt der ersten Stufe durch Zugabe einer Säure, um den pH unter 6, bevorzugt auf pH 2 bis 4, einzustellen, zersetzt, und das entstehende Licht wird in einem Luminometer gemessen oder mit einem chromatographischen Film nachgewiesen. In einem ähnlichen Zweistufenverfahren wird ADPase unter Verwendung als Substrat eines ADP- Derivats eines erfindungsgemäßen Chromophor-substituierten 1,2-Dioxetans analysiert und 5'- Nukleotidase wird unter Verwendung eines Adenylsäurederivats als Substrat eines erfindungsgemäßen Chromophor-substituierten 1,2-Dioxetans analysiert. Die zweite Stufe kann ebenfalls durch Zugabe der alkalischen Enzymphosphatase zur Zersetzung des Phosphoryl-Chromophorsubstituierten 1,2-Dioxetans erfolgen.

I. Nukleinsäuresequenzierung

DNA- oder RNA-Fragmente; die bei Sequenzprotokollen gebildet werden, können nach der elektrophoretischen Trennung unter Verwendung von erfindungsgemäßen chemilumineszenten 1,2-Dioxetanen nachgewiesen werden.
Die DNA Sequenzierung kann gemäß einem Didesoxy-Kettenterminierungsverfahren durchgeführt werden [Sanger, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 74: 5463 (1977)]. Kurz, für jede der vier Sequenzierungsreaktionen wird einzelstrangige Matrizen-DNA mit Desoxynukleotiden und biotinylierter Primerstrang-DNA vermischt. Nach dem Assoziieren werden Klenow-Enzym und Desoxyadenosintriphosphat mit je der vier Sequenzreaktionsgemische inkubiert, und dann wird Chase-Desoxynukleotidtriphosphat zugegeben, und die Inkubation wird weitergeführt.
Danach werden die DNA Fragmente in den Reaktionsgemischen mittels Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Die Fragmente werden dann auf eine Membran, bevorzugt einer Nylonmembran, übertragen, und die Fragmente werden an die Membran durch Belichtung mit UV-Licht, bevorzugt mit kurzer Wellenlänge, gebunden.
Nach Blockierung der nichtspezifischen Bindungsstellen mit einem Polymeren, beispielsweise Heparin, Casein oder Serumalbumin, werden die DNA-Fragmente auf der Membran mit Avidin oder Streptavidin, covalent an ein Enzym gebunden, das für die enzymspaltbare Gruppe des besonderen erfindungsgemäßen 1,2-Dioxetansubstrats, das verwendet wird, spezifisch ist, kontaktiert. Da Avidin oder Streptavidin stark an Biotin binden, werden biotinylierte DNA- Fragmente jetzt an ein Enzym angefügt. Wenn beispielsweise das chemilumineszierende Substrat Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphatdioxetansalz (Cl-AMPPD) ist, wird Avidin oder Streptavidin mit einer Phosphatase konjugiert. Ähnlich, wenn das chemilumineszierende Substrat Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2- dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenyl-β-D-galactopyranose (Cl-AMPGD) ist, wird Avidin oder Streptavidin mit Galactosidase konjugiert.
Nach der Erzeugung der Chemilumineszenz durch Behandlung des Komplexes aus DNA- Fragment-Biotin-Avidin-(oder Streptavidin-)Enzym mit dem geeigneten 1,2-Dioxetan bei alkalischen pH-Werten, beispielsweise über etwa 8,5, können die DNA Fragmente mit einem lichtempfindlichen Film, beispielsweise einem Röntgen- oder Sofortbild-Film, oder in einem photoelektrischen Luminometer-Instrument visualisiert werden.
Das oben beschriebene Nachweisverfahren kann ebenfalls bei dem genomischen DNA- Sequenzprotokoll von Church, et al., [Church, G. M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 81: 1991 (1984)] angewendet werden. Nach der Übertragung der chemisch gespaltenen und elektrophoretisch getrennten DNA [Maxam, A. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci (USA), 74: 560 (1977)] auf eine Membran, bevorzugt eine Nylonmembran, und Vernetzen der Leitern an die Membran mittels UV-Licht können spezifische DNA-Sequenzen durch sequenzielle Addition von: biotinylierten Oligonukleotiden als Hybridisierungssonden; Avidin oder Streptavidin, covalent an ein Enzym gebunden, spezifisch für das erfindungsgemäße durch ein Enzym spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetan, und dem geeigneten 1,2-Dioxetan nachgewiesen werden: Bilder der Sequenzleitern (gebildet durch PAGE) können wie oben beschrieben erhalten werden. Die Reihen-Wiedersondenbildung von Sequenzleitern kann durchgeführt werden, indem zuerst die hybridisierte Sonde und chemilumineszierendes Material von der Membran durch Behandlung der Membran mit einer erhitzten Lösung von Detergenz, beispielsweise von etwa 0,5 bis etwa 5% Natriumdodecylsulfat (SDS) in Wasser bei etwa 80ºC bis etwa 90ºC, abgestreift werden, Abkühlen von etwa 50ºC bis etwa 70ºC, Hybridisierung der jetzt nackten DNA- Fragmente mit einer anderen biotinylierten Oligonukleotidsonde unter Erzeugung einer unterschiedlichen Sequenz und dann Erzeugung einer abbildenden Chemilumineszenz, wie oben beschrieben.
Ähnliche Nachweisverfahren können mit RNA-Fragmenten, die durch RNA- Sequenzverfahren gebildet werden, durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit für den Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe, umfassend eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, welche Lichtenergie bei der Zersetzung bilden kann, dargestellt durch die Formel
worin die Substituenten R&sub1;, R&sub2;, X und X¹ die zuvor gegebenen Bedeutungen besitzen. In diesem Kit wird bevorzugt eine 1,2-Dioxetanverbindung verwendet, worin R&sub1; Methoxy, R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeuten und das Enzym saure oder alkalische Phosphatase ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäure oder des Fragments an eine komplementär markierte Oligonukleotidsonde, umfassend eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie oben definiert, eine mit einem Enzym covalent markierte Oligonukleotidsonde und eine Nylonmembran, auf der die Nukleinsäure- Oligonukleotidsonde-Hybridisierung durchgeführt wird. Solch ein Kit ist bevorzugt, worin R&sub1; Methoxy, R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeuten, und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäure oder eines Fragments davon mit einer komplementär markierten Oligonukleotidsonde. Das Kit umfaßt eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie oben definiert, eine komplementäre Oligonukleotidsonde, covalent mit einem Biotin oder Biotinderivat markiert, Avidin oder Streptavidin, covalent gebunden an ein Enzym, welches die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, und eine Nylonmembran, auf der die Nukleinsäure oder ein Fragment davon an die Oligonukleotidsonde hybridisiert wird. Ein solches Kit, bei dem R&sub1; Methoxy, R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeuten, und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist, ist bevorzugt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäure oder des Fragments davon mit einer komplementär markierten Oligonukleotidsonde. Das Kit umfaßt eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2- Dioxetanverbindung, wie oben definiert, eine komplementäre Oligonukleotidsonde, covalent markiert mit einem Antigen, einen Antikörper, der gegen das Antigen gerichtet ist, der covalent an ein Enzym gebunden ist, das die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, und einer Nylonmembran, auf der die Nukleinsäure oder das Fragment davon an die Oligonukleotidsonde hybridisiert wird.
Ein Kit, bei dem das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist, und worin R&sub1; Methoxy und R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeuten, ist bevorzugt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Nachweis eines Proteins in einer Probe, welches eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie oben definiert, einen Antikörper, der gegen das Protein gerichtet ist, covalent gebunden an ein Enzym, welches die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, und eine Membran, auf der die Protein-Antikörper-Bindung durchgeführt wird, umfaßt.
Bevorzugt ist die Membran eine Nylon-, Nitrocellulose- oder eine PVDF-Membran.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Kits bedeuten R&sub1; eine Methoxygruppe und R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe, und das Enzym ist saure oder alkalische Phosphatase.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Nachweis eines Proteins in einer Probe, welches eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie oben defniert, einen ersten Antikörper, direkt gerichtet gegen das Protein und einen zweiten Antikörper, gerichtet gegen den ersten Antikörper, covalent gebunden an ein Enzym, welches die 1,2- Dioxetanverbindung zersetzen kann, umfaßt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Kits bedeuten R&sub1; eine Methoxygruppe und R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe, und das Enzym ist eine saure oder alkalische Phosphatase. Es ist wünschenswert, daß das Kit weiter eine wasserlösliche Verstärkungssubstanz, die die spezifische Lichtenergiebildung über diejenige erhöht, die in ihrer Abwesenheit gebildet wird, umfaßt. Bevorzugt ist diese Verstärkungssubstanz ein polymeres; quaternäres Ammoniumsalz, insbesondere Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poy[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumclorid)] oder Poy[vinylbenzyl(tributylammoniumchlorid)].
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Kit, bei dem die Verstärkungssubstanz ein positiv geladenes polymeres quaternäres Ammoniumsalz und Fluorescein umfaßt, welches mit dem negativ geladenen Produkt der 1,2-Dioxetanverbindung, die nach der enzymkatalysierten Zersetzung der 1,2-Dioxetanverbindung gebildet wird, einen ternären Komplex bilden kann, wodurch eine Energieübertragung zwischen dem negativ geladenen Produkt und Fluorescein stattfindet und Lichtenergie durch das Fluorescein emittiert wird. Die zuvor erwähnten polymeren quaternären Ammoniumsalze werden bevorzugt in diesem Kit verwendet.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe, welches die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Bereitstellung einer enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2- Dioxetanverbindung, wie oben definiert;
(b) Behandeln der 1,2-Dioxetanverbindung mit der das Enzym enthaltenden Probe, wobei das Enzym den enzymatisch spaltbaren labilen Substituenten aus der 1,2-Dioxetanverbindung unter Bildung eines negativ geladenen Substituenten, gebunden an die 1,2-Dioxetanverbindung, abspaltet, wobei der negativ geladene Substituent bewirkt, daß sich die 1,2-Dioxetanverbindung unter Bildung einer lumineszierenden Substanz, welche eine fluoreszierende chromophore Gruppe enthält, zersetzt; und
(c) Nachweis der Iumineszierenden Substanz als Anzeichen für die Anwesenheit des Enzyms.
Bei diesem Verfahren ist die Verwendung einer sauren oder alkalischen Phosphatase als Enzym und die Verwendung einer 1,2-Dioxetanverbindung, worin R&sub1; Methoxy und R&sub2; eine me ta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeuten, bevorzugt. Ebenfalls ist die Verwendung von Galactosidase als Enzym und einer 1,2-Dioxetanverbindung, worin R&sub1; Methoxy und R&sub2; eine meta-β-D-Galactosid-substituierte Phenoxygruppe bedeuten, bevorzugt.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung für den Fachmann. Diese Beispiele sind nur zum Zwecke der Erläuterung angegeben und stellen keinerlei Einschränkungen, außer in den beigefügten Ansprüchen angegeben, dar. Alle Teile und Prozentangaben werden durch Gewicht pro Volumen, ausgenommen TLC-Lösungsgemische, welche durch Volumen pro Volumen angegeben werden, sofern nicht anders angegeben, ausgedrückt.
Die ¹H-NMR-Werte, die in bestimmten der Beispiele für die Enolether- Zwischenprodukte angegeben werden, und die ein Index-Symbol (') verwenden, geben aromatische Protonen an, während Zahlen ohne Index in allen Fällen die Substituenten-Adamant-2'- yliden-Ringpositionen angeben, wie:

BEISPIEL I

200 g (1,64 mol) 3-Hydroxybenzaldehyd und 270 ml (1,93 mol) Triethylamin werden in einen Kolben gegeben, der 1 l Methylenchlorid enthält und sich in einem Eisbad befindet. Die entstehende braune Lösung wird mechanisch gerührt, und 212 ml (1,72 mol) Trimethylacetylchlorid werden in einem dünnen Strom durch einen Tropftrichter im Verlauf von 15 Minuten zugegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird weitere 15 Minuten gerührt, das Eisbad wird entfernt, und die Reaktion kann dann weitere 2 Stunden ablaufen. TLC (KSF; 25% Aceton- Hexane) zeigt die Abwesenheit des Ausgangsmaterials und ein einzelnes Produkt mit etwas höherem Rf. Das Reaktionsgemisch wird in einen Scheidetrichter gegeben und mit 250 ml 1M Chlorwasserstoffsäure vermischt. Die organische Phase wird dann mit Wasser (2 · 400 ml) extrahiert und schließlich über Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird durch eine Silicagelschicht gegeben, auf dem Rotationsverdampfer eingedampft und dann unter Vakuum (1,0 mm Hg) gepumpt, wobei 348 g grünlich-braunes Öl erhalten werden: 3- Pivaloyloxybenzaldehyd, der unter Argonatmosphäre aufbewahrt wird.

BEISPIEL 11

400 mg p-Toluolsulfonsäure, gelöst in 25 ml Methanol, werden unter Rühren zu dem 3- Pivaloylbenzaldehyd von Beispiel I gegeben.
Trimethylorthoformiat (224 ml, 2,05 mol) wird dann tropfenweise zugegeben. Die geringfügig exotherme Reaktion konnte unkontrolliert ablaufen, während das Gemisch 1 Stunde gerührt wurde. ¹/&sub2; g Natriumbicarbonat wurde dann zugegeben, und der Kolben wurde auf einem Rotationsverdampfer (Badtemperatur 40ºC) zur Entfernung aller flüchtigen Stoffe gegeben. Das entstehende Öl wurde durch eine kurze Silicagelsäule unter Stickstoffdruck geleitet, wobei ein orange-braunes Öl erhalten wurde, welches im Vakuum (1 mm Hg) unter Rühren gepumpt wurde, wobei 426 g rohes 3-Pivaloyloxybenzaldehyddimethylacetal erhalten wurden. Die Infrarotanalyse zeigte keine Aldehydcarbonylabsorption (1695 cm&supmin;¹).

BEISPIEL III

Das rohe 3-Pivaloyloxybenzaldehyddimethylacetal von Beispiel 11 wird in 1 l Methylenchlorid, frisch destilliert über P&sub2;O&sub5;, unter Argonatmosphäre in einen 3-Liter-Kolben gegeben. Dann werden 347 ml (2,03 mol) Triethylphosphit auf einmal zugegeben. Der Kolben ist mit einem Septumeinlaßadapter ausgerüstet und wird in einem Trockeneis-Acetonbad unter geringem Argondruck gekühlt. Bortriffuoridetherat (249 ml, 2,03 mol) wird in mehreren Teilen mit einer Spritze unter heftigem Rühren zugegeben. Das entstehende Reaktionsgemisch wird bei -55ºC 2 Stunden gerührt und dann in einem Tiefkühlgerät bei -20ºC über Nacht aufbewahrt.
Danach wird der Kolben auf Raumtemperatur erwärmt, und sein Inhalt wird 4 Stunden gerührt. Die orange-braune Lösung wird sorgfältig in eine stark gerührte Aufschlämmung von 170 g Natriumbicarbonat in 800 ml Wasser in solcher Geschwindigkeit gegeben, daß ein heftiges Schäumen vermieden wird. Nach dem heftigen Rühren des zweiphasigen Gemisches während 1 Stunde werden die Schichten in einem Scheidetrichter getrennt, und die wäßrige Schicht wird erneut mit Methylenchlorid (2 · 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, konzentriert und im Vakuum destilliert, wobei 535 g Diethyl-1- methoxy-1-(3-pivaloyloxyphenyl)methanphosphonat als klares, hellgelbes Öl (Kp: 158-161ºC bei 0,25 mm Hg) erhalten werden. Dies entspricht einer 91%igen Ausbeute für das Gesamtverfahren der Beispiele I bis III:
¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,21 und 1,25 (6H, 2t, 7 Hz, OCH&sub2;CH&sub3;), 3,37 (3H, s, ArCHOCH&sub3;), 3,80 (3H, s, ArOCH&sub3;), 3,90-4,10 (4H, m, OCH&sub2;CH&sub3;), 4,46 (1H, d, 15,6 Hz, ArCHPO), 6,85 (1H, m), 7,00 (2H, m), 7,26 (1H, m).
IR (rein): 2974, 1596, 1582, 1480, 1255 (P=O), 1098, 1050, 1020, 965 cm&supmin;¹.

BEISPIEL IV

Eine Lösung aus Diisopropylamin (11,6 ml, 82,8 mmol) in 75 ml Tetrahydrofuran wurde auf -78ºC in einem Trockeneis-Aceton-Bad unter Argonatmosphäre gekühlt. 30 ml 2,5 M Lösung von n-Butyllithium in Hexanen (Aldrich, 75,0 mmol) werden mit einer Spritze zugegeben, und nach dem Rühren der entstehenden Lithiumdiisopropylamidlösung während 20 Minuten werden 13,47 g (37,6 mmol) Diethyl-1-methoxy-1-(3-pivaloyloxyphenyl)methanphosphonat in 25 ml Tetrahydrofuran tropfenweise aus einem Tropftrichter im Verlauf von 5 Minuten zugege ben. Die entstehende rote Lösung wird bei niedriger Temperatur weitere 30 Minuten gerührt, um eine vollständige Bildung des Phosphonatcarbonions sicherzustellen.
Eine Lösung aus 4,99 g (30,1 mmol) 5-Hydroxyadamantan-2-on in 25 ml Tetrahydrofuran wird dann tropfenweise zugegeben. Das entstehende leicht trübe Gemisch wird 5 Minuten bei -78ºC gerührt und langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 40 Minuten erwärmt. Die Lösung, jetzt orange gefärbt, wird 50 Minuten am Rückfluß erhitzt, gekühlt mit 200 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung verdünnt und mit Ethylacetat (3 · 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, schnell über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wobei 12,49 g eines orangen Gummis, ein Gemisch aus phenolischem Enolether und seinem Pivaloatester erhalten wurde.
¹H-NMR (Pivaloatester, 400 MHz in CDCl&sub3;): δ 7,33 (1H, m, H-5'), 7,12 (1H, J = 7,7 Hz, ArH), 6,95-7,02 (2H, m, ArH), 3,43 (1H, br. s, H-1), 3,28 (3H, s, OMe), 2,79 (1H, br. s, H-3), 2,23 (1H, br. s, H-7), 1,59-1,87(11H, m); 1,34 (9H, s, COC(CH&sub3;)&sub3;).
IR (in CHCl&sub3;): 3590, 3442 (OH), 2924, 2848, 1742 (Ester C=O), 1665, 1602, 1578, 1426, 1274, 1152, 1118, 918 cm&supmin;¹).
Dieses Gemisch wurde in Methanol aufgenommen und 3,5 Stunden in Anwesenheit von 10,7 g wasserfreiem Kaliumcarbonat am Rückfluß erhitzt. Das Methanol wurde dann abgestreift, und der Rückstand wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und am Rotationsverdampfer zu einem Rückstand eingedampft, welcher aus Chloroform-Petrolether umkristallisiert wurde, wobei 6,5 g 3-(Methoxy-5-hydroxytricyclo[3.3.1.13,7]deo-2-ylidenmethyl)phenol als stumpf weißer Feststoff erhalten wurden (Fp. 171-172ºC). Weitere 0,80 g wurden aus der Mutterlauge erhalten, was eine Gesamtausbeute an phenolischem Enolether, bezogen auf 5-Hydroxyadamantan-2- on, von 79% entspricht.
¹H-NMR (400 MHz, in CDCl&sub3;): δ 7,18 (1H, dd, J = 8,4, 7,7 Hz, H-5'), 6,75-6,88 (3H, m, ArH), 6,36 (1H, br. s, ArOH), 3,41 (1H, br. s, H-1), 3,28 (3H, s, OMe), 2,79 (1H, br. s, H- 3), 2,22 (1H, br. s, H-7), 1,56-1,98 (11H, m).
IR (in CHCl&sub3;): 3586, 3320 (OH), 3000, 2920, 2844, 1665, 1590, 1578, 1445, 1296, 1092, 885 cm&supmin;¹.
HRMS berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub2;O&sub3;(M&spplus;) 286, 1573, gefunden 286, 1569.

BEISPIEL V

Eine Lösung aus 5,04 g (17,6 mmol) 3-(Methoxy-5-hydroxytricyclo[3.3.1.13,7]dec-2- ylidenmethyl)phenol in 35 ml Tetrahydrofuran, hergestellt unter Argon, wurde mit 3,4 ml (24,6 mmol) Triethylamin vermischt und dann auf 0ºC in einem Eisbad abgekühlt. 2-Chlor-2-oxo- 1,3,2-dioxaphospholan (1,95 ml, 21,1 mmol) wurde tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 5 Minuten wurde das Eisbad entfernt, und es wurde weitere 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 30 ml wasserfreiem Diethylether verdünnt und unter Argon filtriert, um Feuchtigkeit auszuschließen. Das Triethylaminhydrochlorid wurde dann wei ter mit 20 ml Diethylether gewaschen, das Filtrat wurde an einem Rotationsverdampfer konzentriert, wobei der Phosphattriester als viskoses helloranges Öl erhalten wurde.
Der Triester wurde in 30 ml Dimethylformamid; das über Molekularsieben getrocknet war, unter Argon gelöst und 3,5 Stunden bei Raumtemperatur mit 1,02 g (20,8 mmol) trockenem Natriumcyanid, welches auf einmal zugegeben wurde, unter Rühren umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (1,0 mm Hg) unter Erhitzen auf 50ºC entfernt. Eine Probe des entstehenden orange-braunen Rückstands zeigte nach dem Lösen in Wasser und Durchführung der Umkehrphasen-Analysenchromatographie [0,1% Natriumbicarbonat (Wasser) - Acetonitrilgradient] an einer PLRP-Polystyrolsäule (Polymer Laboratories), eine vollständige Umsetzung des Zwischen-Cyanoethylphosphatdiesternatriumsalzes an.
Der Rückstand wurde dann in 35 ml Methanol aufgenommen und tropfenweise mit 4,85 ml einer 4,37 M Lösung (21,2 mmol) Natriummethoxid in Methanol unter Rühren während 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die Umkehrphasen-analytische HPLC zeigte, daß die β-Eliminierung für den Phosphatmonoester vollständig war. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde mit 10% Wasser/Aceton unter Bildung eines gummiartigen Feststoffs verrieben. Ein weiteres Verreiben mit 3% Wasser/Aceton ergab einen harten, fast stumpf weißen Feststoff, welcher filtriert und im Vakuum (1,0 mm Hg) getrocknet wurde, wobei 8,35 g rohes Dinatrium-3-(methoxy-5-hydroxytricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenylphosphat, kontaminiert mit anorganischen Salzen erhalten wurde.
Die präparative Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Wasser-Acetonitril- Gradienten an einer PLRP-Polystyrolsäule (Polymer Laboratories) und die Lyophilisierung der geeigneten Fraktionen ergaben 5,2 g (72%) gereinigte Verbindung als weißen, granulären Feststoft der bei 120ºC erweicht und zu einem hellbraunen Gum ni bei 163-168ºC schmilzt.
¹H-NMR (400 MHz, in D&sub2;O). δ 7,16 (1H, dd, J = 8,3, 7; 4 Hz, H-5'), 7,05 (1H, d, J = 8,3 Hz, ArH), 6,93 (1H, br. s, H-2'), 6,86 (1H, d; J = 7,4 Hz, ArH), 3,2 (3H, s, OMe), 3; 17 (1H, br. s, H-1), 2,61 (1H, br. s, H-3), 2,06 (1H, br. s, H-7), 1,42-1,73 (IOH, m).
Die Elementaranalyse zeigte, daß das Phosphatsalz als Dihydrat vorlag. Analyse berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;Na&sub2;O&sub6;P·2H&sub2;O: C, 48,44, H, 5,65, P, 6,94. Gefunden: C, 48,37, H, 5,90, P, 6,87.

BEISPIEL VI

Eline Lösung aus 0,8 g Dinatrium-3-(methoxy-5-hydroxytricyclo[3.3.1.13,7]dec-2- ylidenmethyl)phenylphosphat in 96 ml 25%igem wasserfreiem Methanol/Chloroform, enthaltend 5,35 · 10&supmin;&sup5; M Methylenblau-Sensibilisierungsfarbstoffwurde auf drei Glasreagensgläser verteilt. Jedes Glas wurde daün auf 5ºC in einem Wasserbad gekühlt und mit Sauerstoff gesättigt, indem ein Gasstrom durch die Lösung geleitet wurde. Nach 5 Minuten, während noch Sauerstoff durch die Lösung durchperlte, wurden die Gläser mit Licht einer 250 Watt Hochdruck- Natriumdampflampe bestrahlt, während die Temperatur bei 5ºC gehalten wurde. Ein 5 mil dickes Stück aus Kapton-Polyimidfilm (duPont) wurde zwischen die Natriumdainpflampe und die Gläser gegeben, um nichterwünschte UV-Einstrahlung herauszufiltrieren. Nach 20 Minuten Bestrah lung hatten sich die Lösungen rosa verfärbt. Die analytische Umkehrphasen-HPLC [0,1% Natriumbicarbonat (Wasser - Acetonitrilgradient)] an einer PLRP-Polystyrolsäule (Polymer Laboratories) zeigte zwei Produktpeaks: einen früh eluierenden, verbreiterten Peak (Retentionszeit 3,79 Minuten) und einen später eluierenden scharfen Peak (Retentionszeit 5,77 Minuten). Das Verhältnis von dem früher eluierenden Produkt (A) zum später eluierenden Produkt (B) betrug 1,3 : 1 in jeder Lösung der Reagensgläser.
Die Lösungen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum (25,0 mm Hg) auf Eisbad entfernt. Der Rückstand wurde in 70 ml Wasser gelöst und durch eine 0,45 um Nylonmembran filtriert. Die präparative Umkehrphasen-HPLC (Wasser-Acetonitrilgradient) trennte leicht zwei Produkte.
Eine Kombination der entsprechenden Fraktionen der präparativen HPLC, gefolgt von analytischer HPLC, zeigte, daß sie homogen waren. Die Lyophilisierung ergab 0,32 g eines Produkts (A) und 0; 26 g eines anderen Produkts (B), wobei durch ¹H-NMR gezeigt werden konnte,- daß sie Isomere (syn und anti) 1,2-Dioxetane waren, nämlich syn-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro- (1,2-Dioxetan-3,2'-(5'-hydroxy)tricyclo[3.3.1.13,7]decan)-4-yl)phenylphosphat:
und sein anti-Isomer (anti-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro-[1,2-Dioxetan-3,2'-(5'-hydroxy)- tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphat):
Jedes dieser Isomere erzeugte Chemilumineszenz mit einzigartigem Licht (Wellenlänge) gegenüber der Zeit und Geräuschprofilen bei Spaltung bei pH 10 in wäßrigem Puffermedium mit alkalischer Phosphatase.
¹H-NMR (A Isomeres, 400 MHz in D&sub2;O): δ 6,98-7,6 (4H, m, ArH), 3,11 (3H, s, OMe), 2,97 (1H, br. s, H-1), 2,34 (1H, br. s, H-3), 1,79 (1H, br. s, H-7), 1,3-1,68 (8H, m), 1,01 (1H, d,J = 13,5 Hz), 0,9(1H, d,J = 13 Hz).
¹H-NMR (B-Isomeres, 400 MHz in D&sub2;O): δ 6,94-7,62 (4H, m, ArH), 3,09 (3H, s, OMe), 2,91 (1H, br. s, H-1), 2,27 (1H, br. s, H-3), 1,84 (1H, br. s, H-7), 1,21-1,75 (8H, m), 1,02 (1H, d, J = 12,8 Hz), 0,87 (1H, d, J = 12,8 Hz).
Die Elementaranalyse zeigte, daß das Isomere B als Dihydrat vorlag. Analyse berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub2;Na&sub2;O&sub8;P·2H&sub2;O (Isomeres B): C, 45,2, H, 5,27, P, 6,47. Gefunden: C, 45,53, H, 5,35, P, 6,11.
Auf der Grundlage der ¹H-NMR-Werte war es nicht möglich, spezifisch zu bestimmen, welches der beiden erhaltenen Isomeren das syn-Isomere und welches das anti-Isomere war.

BEISPIEL VII

Es wurde allgemein dem Verfahren von Beispiel IV oben gefolgt. Eine Lösung aus 5,35 ml (38,2 mmol) Diisopropylamin in 35 ml Tetrahydrofuran wurde auf -78ºC in einem Eisbad unter Argonatmosphäre abgekühlt. 14 ml einer 2,5 M Lösung aus n-Butyllithium in Hexanen (35,0 mmol) wurden mit einer Spritze zugegeben, und nach dem Rühren während 20 Minuten wurden 10,86 g (30,3 mmol) Diethyl-1-methoxy-1-(3-pivaloyloxyphenyl)methanphosphonat in 30 ml Tetrahydrofuran tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten zugegeben. Die entstehende orange Lösung wurde bei niedriger Temperatur 1 Stunde gerührt, dann mit einer Lösung aus 5,21 g (22,75 mmol) 5-Bromadamantan-2-on in 20 ml Tetrahydrofuran im Verlauf von 7 Minuten unter Rühren vermischt. Es wurde weitere 10 Minuten gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Kältebad entfernt, und das Reaktionsgemisch konnte sich langsam auf Raumtemperatur im Verlauf von 1 Stunde erwärmen.
Die Lösung wurde dann 1 weitere Stunde am Rückfluß erhitzt, abgekühlt, mit 100 ml Hexanen verdünnt und in einen Scheidetrichter gegeben, der eine gesättigte wäßrige Natriumbicarbonatlösung enthielt und mit 10%igem Ethylacetat in Hexanen (3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit wäßriger 15%iger Natriumchloridlösung gewaschen, schnell über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wobei 11,62 g eines hellorangen viskosen Öls erhalten wurden. Eine Stopfenfiltration auf einer kurzen Silicagelsäule unter Eluierung mit 10% Ethylacetat in n-Hexanen ergab 11,0 g gelblich-grünen Gummi.
¹H-NMR (Pivaloylester, 400 MHz in CDCl&sub3;): δ 7,34 (1H, t, J = 7,8 Hz, H-5'), 7,1 (1H, d, J = 7,7 Hz, ArH), 6,95-7,02 (2H, m, ArH), 3,39 (1H, br. s, H-1), 3,28 (3H, s, OMe), 2,74 (1H, br. s, H-3), 2,32-2,51 (6H, m, H-4, H-6, H-9), 2; 17 (1H, br. s, H-7), 1,67-1,92 (4H, m, H-8, H-10), 1,34 (9H, s, COC(CH&sub3;)&sub3;):
IR (rein): 2924, 2850, 1745 (Ester C=O), 1654, 1602, 1578, 1478, 1274, 1110, 1018, 808, 758 cm&supmin;¹.
Dieser Gummi wurde in Methanol aufgenommen und 2 Stunden mt 2,4 g wasserfreiem Kaliumcarbonat am Rückfluß erhitzt. Das Methanol wurde dann entfernt, und der Rückstand wurde zwischen Wasser und 30% Ethylacetat in Hexanen verteilt. Die organische Schicht wurde mit einer wäßrigen gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, wobei 9,32 g eines gelben Gummis erhalten wurden. Der Gummi wurde an Silicagel Flash-chromatographiert, wobei 7,06 g (88% Ausbeute, bezogen auf 5- Bromadamantan-2-on) eines gelblichen Gummis erhalten wurden, der nicht kristallisiert werden konnte: IR und NMR zeigten jedoch an, daß die erhaltene Verbindung 3-(Methoxy-5- bromtricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol war, welches rein genug war, um es bei der Phosphorylierungsreaktion zu verwenden.
Eine Probe der reinen phenolischen Verbindung wurde aus 3-(Methoxy-5- bromtricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenylacet, wie folgt erhalten: die unreine phenolische Verbindung (5,57 g, 15,95 mmol) wurde in 30 ml Pyridin, welches über Molekularsieben getrocknet war, unter Argonatmosphäre gelöst. 50 mg 4-Dimethylaminopyridin wurden als Katalysator zugegeben. Danach wurden 1,8 ml (19,15 mmol) Essigsäureanhydrid mit einer Spritze zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen Scheidetrichter übertragen, welcher 250 ml wäßrige gesättigte Natriumbicarbonatlösung enthielt, und dann mit 10% Ethylacetat in Hexanen (2 · 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mehrere Male mit Wasser gewaschen und dann über Natriumsulfat schnell getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde in einem Rotationsverdampfer konzentriert, und der Rückstand wurde aus n-Hexan, enthaltend einige Tropfen Ethylacetat, umkristallisiert. Der so erhaltene stumpf weiße Feststoff wurde erneut umkristallisiert, wobei 5; 21 g (83,5% Ausbeute) des Acetats, Fp. 108-110ºC, erhalten wurden.
HRMS berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub3;BrO&sub3;(M&spplus;) 390,0833, gefunden, 390,0831.
¹H-NMR (400 MHz in CDCl&sub3;): δ 7,35 (1H, dd, J = 8, 7,7 Hz, H-5'), 7,13 (1H; dd, J = 7,7, 1 Hz, ArH), 7,03 (1H, dd, J = 8, 1 Hz, ArH), 5,99 (1H, d, 1 Hz, H-2'), 3,39 (1H, br. s, H- 1), 3,27 (3H, s, OMe), 2,75 (1H, br. s, H-3), 2,32-2,51 (6H, M, H-4, H-6, H-9), 2,29 (3H, s, OAc), 2,18 (1H, br. s, H-7), 1,69-1,92 (4H, m, H-8, H-10).
IR (in CHCl&sub3;): 3000, 2930, 2850, 1760 (Ester C=O), 1660, 1602, 1577, 1868, 1192, 1095, 1070, 1016, 804 cm&supmin;¹.
Die Behandlung des umkristallisierten Acetats mit Kaliumcarbonat in Methanol während 15 Stunden bei Raumtemperatur ergab 3-(Methoxy-5-bromtricyclo[3.3.1.13,7]dec-2- ylidenmethyl)phenol, Fp. 42-45ºC, als weißen, bröckeligen Schaum, der nicht weiter umkristallisiert werden konnte.
¹H-NMR (400 MHz in CDCl&sub3;): δ 7,21 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-5'), 6,73-6,85 (3H, m, ArH), 5,18 (1H, s, ArOH), 3,38 (1H, br. s, H-1), 3,28 (3H, s, OMe), 2,74 (1H, br. s, H-3), 2,3- 2,52 (6H, m, H-4, H-6, H-9), 2,17 (1H, br. s, H-7), 1,68-1,92 (4H, m, H-8, H-10).
IR (in CHCl&sub3;): 3584, 3320 (OH), 2925, 2850, 1665, 1588, 1578, 1445, 1435, 1092, 1080, 1015, 880, 808 cm&supmin;¹.

BEISPIEL VIII

Es wurde erneut dem allgemeinen Verfahren von Beispiel IV oben gefolgt. Eine Lösung aus 2,97 ml (21,3 mmol) Diisopropylamin in 21 ml Tetrahydrofuran wurde auf -78ºC in einem Trockeneis-Acetonbad und unter Argonatmosphäre gekühlt, mit 8,5 ml einer 2,5 M Lösung von n-Butyllithium in Hexanen (21,3 mmol) vermischt, welches tropfenweise mit einer Spritze zugegeben wurde, und während 20 Minuten gerührt. Diethyl-1-methoxy-1-(3-pivaloyloxyphenyl)methanphosphonat (7,26 g, 20,3 mmol) in 20 ml Tetrahydrofuran wurde dann tropfenweise mit einer Spritze im Verlauf von 10 Minuten zugegeben, und die Lösung wurde bei niedriger Temperatur 1 Stunde gerührt.
Eine Lösung aus 2,79 g (15,2 mmol) 5-Chloradamantan-2-on in 15 ml Tetrahydrofuran wurde im Verlauf von 5 Minuten zugegeben und nach dem Rühren bei niedriger Temperatur während 10 Minuten wurde das Kältebad entfernt und das Gemisch bis Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wurde dann 1,5 Stunden am Rückfluß erhitzt, gekühlt, mit 50 ml n- Hexanen verdünnt und in einen Scheidetrichter, welcher 150 ml einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung enthielt, gegeben. Die Extraktion mit 5%igem Ethylacetat-n-Hexan wurde durch Trocknen der vereinigten organischen Fraktionen, ihre Konzentration und Pumpen im Vakuum (1,0 mm Hg) gefolgt, wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher an Silicagel chromatographiert wurde, wobei 5,15 g des höheren Rf 3-(Methoxy-5-chlortricyclo[3.3.1.13,7]dec-2- ylidenmethyl)phenyltrimethylacetat als farbloses Öl (Struktur, bestätigt durch IR und NMR) und 0,865 g später eluierendes Material, zusammengesetzt hauptsächlich aus dem entsprechenden Phenol, erhalten wurden. Diese letztere Fraktion wurde mit Pivaloylchlorid und Triethylamin in Methylenchlorid (vergleiche obiges Beispiel I) reacyliert und anschließend chromatographiert, wobei weitere 0,35 g Pivaloylester (93% Gesamtausbeute, bezogen auf 5-Chloradamantan-2-on) erhalten wurden.
¹H-NMR (Pivaloylester, 400 MHz, in CDCl&sub3;): δ 7,36 (1H, t, J = 7,8 Hz, H-5'), 7,13 (1H, d, J = 7; 7 Hz, ArH), 6,98-7,04 (2H, m, ArH), 3,45 (1H, br. s, H-1), 3,3 (3H, s, OMe), 2,8 (1H, br. s, H-3), 2,13-2,32 (7H, m, H-4, H-6, H-7, H-9), 1,65-1,9 (4H, m, H-8, H-10), 1,36 (9H, s, COC(CH&sub3;)&sub3;).
IR (rein): 2932, 2835, 1750 (Ester C=O), 1664, 1602, 1578, 1478, 1274, 1112, 1022, 827, 758 cm&supmin;¹.
Die vereinigten Pivaloylesterfraktionen (5,5 g, 14,1 mmol) wurden in 40 ml Methanol aufgenommen und mit 5,37 g wasserfreiem Kaliumcarbonat während 40 Minuten am Rückfluß erhitzt. Der nach dem Abstreifen des Methanols verbleibende Rückstand wurde zwischen Wasser und 30% Ethylacetat-Hexanen verteilt, und die organischen Fraktionen wurden konzentriert und an einer kurzen Silicagelsäule stopfenfiltriert, wobei 4,07 g (88% Ausbeute, bezogen auf 5- Chloradamantan-2-on) 3-(Methoxy-5-chlortricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol als bröckeliger weißer Schaum, der an der Luft etwas klebrig wurde, erhalten wurden.
HRMS berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub1;ClO&sub2;(M&spplus;) 304, 1227, gefunden 304, 1230.
¹H-NMR (400 MHz, in CDCl&sub3;): δ 7,23 (1H, J = 7,7, 7,6 Hz H-5') 6,85d, J = 7,6 Hz, ArH), 6,77-6,83 (2H, m, ArH), 3,44 (1H, br. s, H-1), 3,31 (3H, s, OMe), 2,8 (1H, br. s, H-3), 2,1-2,31 (7H, m, H-4, H-6, H-7, H-9), 1,65-1,89 (4H, m, H-8, H-10).
IR (in CHCl&sub3;): 3590, 3330 (OH), 2930, 2855, 1655, 1590, 1580, 1440, 1295, 1094, 1080, 1022, 880, 826 cm&supmin;¹.

BEISPIEL IX

3-(Methoxy-5-bromtricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol (1,49 g, 4,26 mmol) wurde in 8,5 ml: wasserfreiem Ethylenglykol gelöst und dann: mit 0,28 g Kallumcarbonat in ein dicht verschlossenes Glasrohr gegeben. Das Rohr wurde in einem Ölbad bei 110ºC 7 Stunden erhitzt. Der Inhalt wurde dann im Vakuum (1,0 mm Hg) unter Erhitzen konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumchloridlösung und Ethylacetat verteilt. Die organische Fraktion wurde dann abgestreift und an einer kurzen Silicagelsäule chromatographiert, wobei 1,31 g (92% Ausbeute, bezogen auf das Phenol-Ausgangsmaterial) an 3-(Methoxy-5-(2- hydroxy)ethoxytricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol als stumpf weißer Schaum erhalten wurden.
¹H-NMR (400 MHz, in CDCl&sub3;): δ 7,19 (1H, t, J = 7,6 Hz, H-5'), 6,83 (1H, d, J = 7,6 Hz, ArH), 6,73-6,80 (2H, m, ArH), 5,83 (1H, s, ArOH); 3,67 (211, m, OCH&sub2; CH&sub2; OH), 3,51 (2H, t, J = 4,6 Hz, OCH&sub2;CH&sub2;OH), 3,44 (1H, br. s, H-1), 3,28 (3H, s, OMe), 2,81 (1H, br. s, H-3), 2,24 (1H, br. s, H-7), 1,55-1,90 (10H, m).
IR (CHCl&sub3;): 3580, 3320 (OH), 2929, 2842, 1664, 1586, 1575, 1440, 1092, 1078, 885 cm&supmin;¹.

BEISPIEL X

3-(Methoxy-5-chlortricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol (1,23 g, 4,0 mmol) wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel V oben beschrieben phosphoryliert mit einer Ausnahme - Ammoniak in Methanol wurde für die β-Eliminierung verwendet. Das erhaltene rohe Ammoniumnatriumsalz wurde mit Aceton verrieben, dann im Vakuum gepumpt (1,0 mm Hg), wobei 1,2 g stumpf weißer Feststoff erhalten wurde. Die analytische Umkehrphasen-HPLC zeigte, daß das so erhaltene phosphorylierte Enoletherprodukt rein genug für die direkte Photooxygenierung zu dem entsprechenden 1,2-Dioxetan war.
3-(Methoxy-5-chlortricyclo[3.3.1.1.3,7]dec-2-ylidenmethyl)phenylphosphatsalz (0,65 g) wurde in 100 ml wasserfreiem 10%igem Methanol/Chloroform, welches ebenfalls 5,35 · 10&supmin;&sup5; M Methylenblau als Sensibilisierungsfarbstoff enthielt, gelöst. Die entstehende Lösung wurde unter drei Glasreagenzgläser aufgeteilt und wie in Beispiel VI oben beschrieben bestrahlt. Die Aufar beitung umfaßt in diesem Fall die Auflösung des gepumpten Rückstands in 70 ml Wasser, welches 258 mg Natriumbicarbonat enthielt. Bei der Durchführung der präparativen Umkehrphasen- HPLC wurden syn- und anti-Isomeren zusammen gesammelt, ausschließlich der Verunreinigungen. Analytische HPLC [0,1% NaHCO&sub3;(H&sub2;O)-Acetonitrilgradient] zeigte zwei Produktpeaks (Retentionszeiten 8,01 und 8,32 Minuten). Das Flächenprozentverhältnis (270 nm) des zuerst eluierten Isomeren zu dem später eluierten Isomeren betrug 0,4 : 1. ¹H-NMR bestätigte, daß der erhaltene lyophilisierte weiße Feststoff ein Gemisch aus syn- und anti-Dinatrium-3-(4- methoxyspiro-[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan-2-yl)phenylphosphat war.
Die Elementaranalyse zeigte an, daß das Produkt als Dihydrat existiert. Analyse berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub0;ClNa&sub2;O&sub7;P·2H&sub2;O: C, 43,52, H, 4,87, Cl, 7,14. Gefunden: C, 43,23, H, 4,99, Cl, 7,65.
¹H-NMR (400 MHz, in D&sub2;O, zwei Isomere): δ 6,97-7,68 (4H, m, ArH), 3,08 und 3,09 (3H, 25, OMe), 2,95 (1H, br. s, H-1), 0,76-2,35 (12H, m).

BEISPIEL XI

3-(Methoxy-5-bromtricyclo[3.3.1.13,7]dec-2-ylidenmethyl)phenol wurde phosphoryliert und dann, wie für das 5-Chloranaloge in Beispiel X oben beschrieben, photooxygeniert. Die Aufarbeitung in 0,3%iger (Gew./Vol.) wäßriger Natriumbicarbonatlösung ergab eine filtrierte wäßrige Lösung des rohen 1,2-Dioxetanphosphatsalzes, welches dann der präparativen Umkehrphasen- HPLC (Wasser-Acetonitrilgradient) unterworfen wurde, wobei die syn- und anti-Isomeren erhalten wurden, die zusammen für die Lyophilisierung gesammelt wurden. Wurde das lyophilisierte Produkt, ein weißer, flockenartiger Feststoff, der analytischen HPLC unterworfen, wurden zwei Peaks mit Retentionszeiten von 8,52 und 8,94 Minuten erhalten. Das Flächenprozentverhältnis (270 nm) des zuerst eluierenden Isomeren zu dem später eluierenden Isomeren betrug 0,5 : 1. Das ¹H-NMR bestätigte, daß das Produkt ein Gemisch aus syn- und anti-Dinatrium-3-(4- methoxyspiro-[1,2-diöxetan-3,2'-(5'-brom)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan-4-yl)phenylphosphat war.
¹H-NMR (400 MHz, in D&sub2;O, zwei Isomere): δ 6,99-7,52 (4H, m, ArH), 3,07 und 3,09 (3H, 25, OMe), 2,91 (1H, br. s, H-1), 0,822,32 (12H, m).

BEISPIEL XII

Immunoassays für TSH wurden an einer Reihe von TSH-Standards unter Verwendung eines Hybritech Tandern-E TSH-Kit (Hybritech, Inc., San Diego, Kalifornien) gemäß dem Anweisungen des Herstellers, die dem Kit beilagen, durchgeführt, ausgenommen, daß nach Beendigung der anti-TSH-alkalischen Phosphatase-Konjugat-Inkubationsstufe und dem Waschen die Kunststoffperlen zusätzlich mit 0,1 M Diethanolamin, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02% Natriumazidpuffer, pH 10,0, gewaschen und dann kurz in 200 ul des gleichen Puffers gelagert wurden. Chemilumineszenzsignale von anti-TSH-alkalische Phosphatasekonjugat, gebunden an die Oberfläche der Perlen, wurden durch Zugabe zu den Reagenzgläsern, welche Perlen enthielten, von 0,67 mM Pufferlösungen, enthaltend Dinatrium-3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4- (3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan ("AMPPD"), Dinatrium-3-(4-methoxyspiro-[1,2- dioxetan-3,2'-(5'-hydroxy)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan]-4-yl)phenylphosphat (A Isomeres; "A OH- AMPPD"), das entsprechende Dinatrium-B-Isomere ("B-OH-AMPPD") und Dinatrium-3-(4- methoxyspiro-[1,2-dioxetan-3,2'-(5'-chlor)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan]-4-yl)phenylphosphat ("Cl- AMPPD") in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02% Natriumazid, pH 10,0, gegeben. Die Intensität der Lichtemission wurde nacheinander bei 7, 13, 19, 25, 31, 40, 50 und 60 Minuten nach der Substrataddition als 5 Sekundenintegral bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) unter Verwendung eines Berthold LB952T-Luminometers (Berthold Instrument, Wildbad, Bundesrepublik Deutschland) gemessen. (Es wurden nur die Signale, kein Signal-zu-Geräusch gemessen).
TSH, RLU v. TSH für jedes AMPPD, BR-AMPPD, B-OH-AMPPD, A-OH-AMPPD und CL-AMPPD sind in den Fig. 1, 2, 3, 4 bzw. 5 gezeigt.

BEISPIEL XIII

Ein Vergleich der gesamten Lumineszenzemission von AMPPD und von den entsprechenden 1,2-Dioxetanen, deren Adamant-2'-ylidengruppen mit Hydroxy (A- und B-Isomeren), Chlor- und Bromgruppen substituiert waren, wurde durchgeführt, indem Gesamt- Dephosphorylierungsversuche an jeder dieser Verbindungen durchgeführt wurden.
Eine wäßrige Lösung des 1,2-Dioxetans (4,0 mM) in 0,05 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, wurde hergestellt und dann bei 30ºC äquilibriert. 10 ul einer 7,64 · 10 M wäßrigen Lösung aus alkalischer Phosphatase (Kälberdarm; Biozyme) wurde dann zugegeben, und die Chemilumineszenz der entstehenden Lösung wurde unter Verwendung eines Turner Modell 20E-Luminometers (Turner Instruments; Sunnyvale, Kalifornien) gemessen.
Die Geschwindigkeiten des Chemilumineszenzabklingens für jede der fünf fraglichen Verbindungen, ausgedrückt als relative Lichteinheiten (RLE) pro Minute, sind in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle I Abklinggeschwindigkeit (RLE/Minute)
Diese Gesamt-Chemilumineszenz-Emissionen sind graphisch in den Fig. 6, 7, 8, 9 bzw. 10 dargelegt.

BEISPIEL XIV

Ein Streifen neutraler BIODYNE A-Nylonmembran (Pall Corporation, Glen Cove, N. Y.) wurde zweimal (Seite an Seite) mit den folgenden Konzentrationen an biotinylierter pBR-322- 35-mer-Oligonukleotidsonde (Synthetic Genetics, San Diego, Kalifornien) aufgetragen:
1/ Einzelsträngige, nichtmarkierte DNA, 1 ng.
Danach wurde die Membran in 0,2% Casein/0,1% Tween 20 Detergens in wäßriger phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1 Stunde blockiert, danach wurden 1/5000 verdünntes Avidin-alkalische Phosphatasekonjugat (Sigma, Inc., St. Louis, MO) in 0,2% Casein in PBS zugegeben. Die Membran wurde dann 30 Minuten inkubiert, zweimal (je 5 Minuten) in 0,2% Casein/0,1% Tween 20 Detergens in PBS gewaschen, viermal (je 5 Minuten) in 0,3% Tween 20- Detergenz in PBS gewaschen, und zweimal (je 5 Minuten) in wäßrigem 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, pH 10,0, gewaschen.
Die Membran wurde dann in der Mitte durchgeschnitten, um zwei Streifen zu ergeben, wobei jeder einen Satz von Punkten enthielt. Einer der Streifen wurde 5 Minuten in wäßriger AMPPD-Lösung (0,25 mM in 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, pH 10) inkubiert, der andere wurde 5 Minuten in der entsprechenden Chloradamant-2'- ylidenverbindung (0,25 mM in dem gleichen Puffer) inkubiert. Die zwei Streifen wurden dann in Kamera-Luminometer gegeben und mit einem Polaroid Typ 612 Sofortbild-Schwarz-Weißfilm belichtet. Die verbesserte Chemilumineszenzintensität, die unter Verwendung der Chlorverbindung, verglichen mit AMPPD selbst, erhalten wurde, ist erkennbar, wenn man Spalte 2 (C1- AMPPD) mit Spalte 1 (AMPPD) in Fig. 11 vergleicht.

BEISPIEL XV

pBR 322-Plasmid (4700 bp) wurde einem Nick-Translationsverfahren unter Verwendung eines Trans-Light-Kits (Tropix, Inc., Bedford, Mass.) unter Erzeugung eines Gemisches aus biotinylierten einzelsträngigen Polynukleotiden von 200 bis 2000 bp in der Länge unterworfen. Dieses Gemisch wurde dann auf eine trockene BIODYNE A-Membran als fünf parallele Spalten von Punkten der folgenden Konzentrationen aufgetragen.
Die Membran wurde der Ultraviolett-Bestrahlung (UVP Mineral Light; UVP, San Gabriel, Kalif) während 3 Minuten zur Fixierung der DNA an die Oberfläche der Membran unterworfen und dann an der Luft getrocknet. Danach wurde die Membran in 0,2% Casein/0,1% Tween 20-Detergens in PBS während 1 Stunde blockiert, und danach wurden 1/5000 verdünntes Avidin-alkalische Phosphatasekonjugat (Tropix, Inc.) in 0,2% Casein in PBS zugegeben. Die Membran wurde dann 30 Minuten inkubiert, dreimal (während 5 Minuten jeweils) in 0,2% Casein/0,1% Tween 20-Detergens in PBS gewaschen und einmal während 5 Minuten in wäßrigem 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid und 0,02% Natriumazid, pH 10,0 (Substratpuffer), gewaschen.
Danach wurden die fünf Spalten der Reihen der Punkte 1-5 individuell aus der Membran herausgeschnitten ("Streifen 1-5"), wie auch die fünf Spalten der Reihen der Punkte 6-10 ("Streifen 6-10"). Die Streifen 1-5 wurden mit Substratpuffer während 30 Minuten gewaschen. Die Streifen 6-10 wurden in 0,1% BDMQ in Substratpuffer 30 Minuten blockiert. Beide Sätze von Streifen wurden dann 5 Minuten in Substratpuffer, dann individuell 5 Minuten in wäßrigen Lösungen (0,25 mM) von 1,2-Dioxetanen, wie unten angegeben, inkubiert:
Alle Streifen wurden dann in Kamera-Luminometer gegeben und mit einem Polaroid-Typ 612 Sofortbild Schwarz-Weißfilm belichtet. Die verbesserte Chemilumineszenzintensität, die unter Verwendung von 3-(substituiertem Adamant-2'-yliden)-1,2-dioxetanen, verglichen mit AMPPD selbst, erhalten wurde, ist aus den Ergebnissen der folgenden Tabelle 11 erkennbar. Tabelle II ALKALISCHE PHOSPHATASE-MARKIERTE DNA SONDEN-DETEKTION IN EINER MEMBRAN MIT UND OHNE BDMQ-BLOCKIERUNGSSTUFE
1/ Es erfolgte eine 5-Minuten-Belichtung 40 Minuten nach der Dioxetanzugabe
2/ Es erfolgte eine 1-Minute-Belichtung 77 Minuten nach der Dioxetanzugabe

BEISPIEL XVI

Auf einen Streifen neutrale BIODYNE-A-Nylonmembran wurde zweimal (Seite an Seite) 12,5 Picogramm biotinylierte pBR 322 35-mer Oligonukleotidsonde (Biogen, Inc., Cambridge, Mass.) aufgetropft; getrocknet und der Ultraviolettbestrahlung an einer UVP-Mlnerallichtlampe während 5 Minuten zur Fixierung der DNA an die Oberfläche der Membran unterworfen. Danach wurde die Membran mit 5 X SSC (0,015 M Natriumcitrat/0,15 M Natriumchlorid) angefeuchtet und in 0,2% Casein, 0,1% Tween 20-Detergens in PBS während 1 Stunde blockiert. Die blockierte Membran wurde dann mit Avidin-alkalische Phosphatasekonjugat ("Avidx"- Konjugat; Tropix, Inc.), verdünnt 1-10.000 in 0,2% Casein, während 30 Minuten inkubiert.
Die Membran wurde dann zweimal (während 5 Minuten jeweils) mit wäßrigem 0,2% Casein/0,1% Tween 20-Detergens gewaschen, dann zweimal (während 5 Minuten jeweils) mit wäßrigem 0,1% Tween 20-Detergens in PBS gewaschen und schließlich zweimal (während 5 Minuten jeweils) in wäßrigem Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, pH 10 (Assaypuffer), gewaschen.
Die gewaschene Membran wurde halbiert, wobei zwei Streifen erhalten wurden, die jeweils einen Punkt trugen. Die Streifen wurde dann in wäßrige 0,25 mM Lösungen von AMPPD und der entsprechenden Chloradamant-2'-ylidenverbindung in 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, pH 10, während 5 Minuten inkubiert, dann ablaufen gelassen und in Plastikbeutel versiegelt, die an dem Fenster eines Turner Modell 30E Luminometers mit Klebeband angebracht wurden. Die Chemilumineszenzemission von jedem Streifen wurde 20 Stunden integriert. Die kinetischen Werte für die erhaltenen Lichtemissionen sind in Fig. 12 dargestellt.

BEISPIEL XVII

Die Verstärkung der Chemilumineszenzemission (verglichen mit der Emission von AMPPD), die das entsprechende Hydroxyadamant-2'-yliden (A- und B-Isomere) und Chloradamant-2'-ylidenverbindungen, alle in weiterer Anwesenheit von Verstärkerpolymeren, die im folgenden angegeben werden, erhalten wurde, wird auf folgende Weise demonstriert.
Vier Sätze von je drei Reagenzgläser, wobei jedes Reagenzglas in jedem Satz 450 ul einer 0,4 mM wäßrigen Lösung von einem der vier 1,2-Dioxetane enthielt, die in 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02% Natriumazid und 0,1% Verstärkungspolymer, pH 10,0 (Substratpuffer) verglichen wurden, wurden hergestellt und das Hintergrundssignal von jedem Rohr, bestimmt unter Verwendung eines Berthold LB 952T-Luminometers (Berthold Instruments, Wildbad, Bundesrepublik Deutschland), wurde gemessen.
Danach wurden 50 ul einer wäßrigen Lösung 2,83 · 10&supmin;¹² M aus alkalischer Phosphatase in 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02% Natriumazid, pH 10,0, (Endenzymkonzentration 2,83 · 10&supmin;¹³ M) zu jedem Reagenzglas zugegeben, und die Chemilumineszenzsignale wurden in dem Luminometer bei 5 und 20 Minuten gemessen. Die Intensität der Chemilumineszenzsignale und die Signal : Hintergrund-Verhältnisse, die für jedes der vier 1,2- Dioxetane in Anwesenheit von Verstärkungspolymeren erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.
Die verwendeten Verstärkerpolymere und die Symbole für jedes der in Tabelle III verwendeten Polymeren sind wie folgt: TABELLE III

BEISPIEL XVIII

Die Hintergrundssignale und die t1/2-Parameter (verglichen mit solchen von AMPPD), erhalten für die substituierten Adamant-2'-ylidenverbindungen, die im folgenden angegeben sind, wurden in zwei verschiedenen Puffern auf folgende Weise bestimmt.
Wäßrige 4 · 10&supmin;&sup4; M Lösungen von 1,2-Dioxetanen in einer Pufferlösung, hergestellt aus 0,05 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid, pH 9,5, wurden hergestellt, wie auch wäßrige 4 · 10&supmin;&sup4; M Lösungen der 1,2-Dioxetane in einer Pufferlösung, hergestellt aus 0,1 M Diethanolamin, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid und 0,02% Natriumazid, pH 10,0. 1 ml jeder dieser Lösungen pro Reagenzglas wurde in einen Turner Modell 20E- Luminometer gegeben, und die Hintergrundssignale wurden bestimmt.
Danach wurden die t1/2-Werte für jede Probe wie folgt gemessen. 100 ul des Probendioxetans in 900 ul einer der oben beschriebenen Pufferlösungen wurde in ein Reagenzglas pipettiert (End-Dioxetan-Konzentration 4 · 10&supmin;&sup5; M) und bei 30ºC äquilibriert. 10 ul einer 1 bis 1000 Verdünnung von alkalischer Kälberdarm-Phosphatase in dem gleichen Puffer (Enzymkonzentration 7,6 · 10&supmin;¹&sup0; M) wurde zugegeben, und die entstehende Chemilumineszenzintensität wurde unter Verwendung eines Turner Modell 20E-Luminometers im Verlauf von 30 Minutenaufgezeichnet. Die t1/2-Werte wurden dann aus den Abklingkurven berechnet. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. TABELLE IV 1. 0,05 M Natriumcarbonat/Natriumbicarbonat, 1 mM Magnesiumchlorid, pH 9,5 2. 0,1 M Diethanolamin, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02% Natriumazid, pH 10,0

BEISPIEL XIX

Alkalische Phosphatase (Kälberdarm; Biozyme) wurde auf 1-1.000.000 zur Erzeugung einer Vorratslösung (Konzentration 2,54 · 10&supmin;¹¹ M) verdünnt. Eine Reihe von Reagenzgläsern wurde im Duplikat hergestellt, enthaltend 450 ul einer wäßrigen 0,1 M Diethanolaminlösung, enthaltend 1 mM Magnesiumchlorid und 0,02% Natriumazid, pH 10, plus 0,1% eines der im folgenden angegebenen Verstärkungspolymeren, und 4,4 · 10&supmin;&sup4; M eines 1,2-Dioxetans: AMPPD oder die entsprechende Chloradamant-2'-ylidenverbindung.
50 ul einer alkalischen Phosphatase-Vorratslösung wurden dann zugegeben, wobei Proben mit den folgenden Enzymkonzentrationen erhalten wurden:
Die Endkonzentration an 1,2-Dioxetan in jedem Reagenzglas betrug 4 · 10&supmin;&sup4; M die Endkonzentration des Verstärkerpolymeren betrug 0,09%. Fünf Sekunden-Integrale wurden bei 5 und 20 Minuten nach der 1,2-Dioxetanzugabe aufgezeichnet.
In Fig. 13 sind die Dosisansprechkurven für die alkalische Phosphataseverdünnung mit Chloradamant-2'-yliden-1,2-dioxetan mit BDMQ 5 Minuten nach der Dioxetanzugabe dargestellt. In Fig. 14 sind die alkalischen Phosphataseverdünnungen, nachgewiesen mit Chloradamant-2'-yliden-1,2-dioxetan plus BDMQ 20 Minuten nach der Substratzugabe, verglichen mit AMPPD plus BDMQ, dargestellt.

BEISPIEL XX

Das pBR322-Plasmid (Biogen, Inc., Cambridge, Mass.), enthaltend ein Insert einer TPA- Sequenz, wurde mit MSP1-Restriktionsenzym gespalten. Chemische Spaltungen wurden, wie von Maxam, et al., PNAS. 74 560 (1977) beschrieben, durchgeführt, wonach G, AG, AC, TC und C - und ein weiteres, T, wie von Rubin, et al., Nucleic Acids Research. 8 4613 (1980) beschrieben, erhalten wurden. Ein Siebtel von jedem Reaktion-Reagenzglasinhalt wurde per Zeile auf ein 0,4 mm TBR-Gradienten-Sequenzgel (60 cm Länge) aufgetragen. Nach 4 Stunden Elektrophorese wurde die DNA auf eine BIODYNE A Nylonmembran transferriert und mit ultraviolettem Licht behandelt; um die DNA an die Membranoberfläche zu fixieren.
Danach wurde die Membran getrocknet, 30 Minuten bei 45ºC in wäßriger Pufferlösung, enthaltend 1% BSA, 0,5 M Natriumphosphat und 7% SDS, pH 7,2, vorhybridisiert, dann während 2 Stunden bei 45ºC mit 10 ul NNB schneller (snap) direkter alkalischer Phosphatase konjugierter Sonde (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, Kalifornien) in 40 ml der oben be schriebenen BSA-Pufferlösung hybridisiert. Die Membran wurde dann zweimal in wäßrigem 5 · SSCh% SDS (für jeweils 5 Minuten) bei 45ºC, zweimal in wäßriger 1 X SSC/1% SDS (für jeweils 5 Minuten) bei 45ºC, einmal in einer wäßrigen Lösung, enthaltend 125 mM Natriumchlorid, 50 mM Tris und 1% Triton X-100-Detergens, pH 8,0, zweimal in wäßrigem 1 X SSC (jeweils 1 Minute) bei Raumtemperatur und schließlich zweimal (für je eine Minute) bei Raumtemperatur in einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,1 M Diethanolamin, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,02% Natriumazid, pH 10,0, gewaschen.
Die Membran wurde dann mit wäßriger AMPPD-Lösung (0,25 mM) benetzt, in Saran- Umhüllung eingepackt und einem Kodak XAR-Röntgenfilm 40 Minuten ausgesetzt. Eine 5minütige Belichtung erfolgte dann 1 Stunde nach der AMPPD-Zugabe. Die Sequenzbilder sind in Fig. 17(1) dargestellt.
Die Wiederholung dieses gesamten Verfahrens unter Verwendung der entsprechenden Chloradamant-2'-yliden-1,2-dioxetanverbindung ergab die Sequenzbilder, die in Fig. 17(2) dargestellt sind.

BEISPIEL XXI

Der thermische Hintergrund von jedem Dioxetan, wie in Tabelle 4 angegeben, wurde in einer Lösung aus 0,4 mM Dioxetan in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0, bei 30ºC in einem Turner Modell 20E Luminometer (Sunnyvale, CA) gemessen. Die durchschnittliche Chemilumineszenzintensität von jeder Probe in Abwesenheit eines Enzyms ist unter "Hintergrund bei 0,4 mM in Turner Licht-Einheiten (TLE) in Tabelle 4 aufgeführt.
Die Halbwertszeit des Dioxetananions, ebenfalls in Tabelle 4 angegeben, wurde wie folgt gemessen: eine 1 ml-Lösung von 0,04 mM Dioxetan (in dem gleichen Puffer wie oben) wurde vollständig durch Zugabe von 0,764 picomol alkalischer Phosphatase bei 30ºC in einem Turner Modell 20E Luminometer dephosphoryliert. Die Halbwertszeit des Dioxetananions wurde dann aus dem Abklingen erster Ordnung der Chemilumineszenzemission berechnet. TABELLE 4 VERGLEICH DER HALBWERTZEITEN UND DER THERMISCHEN HINTERGRÜNDE VERSCHIEDENER DIOXETANPHOSPHATE
TLE = Turner Licht-Einheiten
* Anion, hergestellt durch Zugabe von 0,764 picomol alkalischer Phosphatase bis 40 nanomol AMPPD und R-AMPPD in 0,1 M DEA, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0.

BEISPIEL XXIII

Die Nachweismöglichkeiten fllr alkalische Phosphatase mit unterschiedlichen chemilumineszierenden 1,2-Dioxetansubstraten wurden wie folgt bestimmt: Duplikate von Reihenverdünnungen (1 bis 3) alkalischer Phosphatase wurden bei Raumtemperatur mit 0,4 mM Dioxetan in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0, enthaltend 1 mg/ml entweder des polymeren Verstärkers 1 oder Verstärkers 2, in einem Berthold LB952T Luminometer (Wildbad, Deutschland) inkubiert.
Darauf folgte entweder eine 5 Minuten oder eine 20 Minuten lange Inkubation mit einem Substrat, die Chemilumineszenzintensität wurde als 5 Sekunden integrierte relative Licht- Einheiten (RLE) bestimmt und graphisch, wie in Fig. 18 dargestellt, aufgetragen. Die alkalische Phosphatasekonzentration, die ein chemilumineszierendes Signal ergab, nämlich zweimal das Signal, das ohne das Enzym erhalten wurde, wurde von der graphischen Darstellung der Fig. 18 extrapoliert. Die alkalische Phosphatasekonzentrationen bei doppeltem Hintergrund wurden als Nachweisgrenzen in Tabelle 5 verwendet. TABELLE 5 NACHWEISGRENZEN FÜR ALKALISCHE PHOSPHATASE MIT UNTERSCHIEDLICHEN CHEMILUMINESZENZ- 1,2-DIOXETANSUB STRAT/VERSTÄRKERSYSTEMEN
Die Nachweisgrenzen sind in femtomol/Liter angegeben.

BEISPIEL XXIII

Duplikate von Reihenverdünnungen (1 bis 3) alkalischer Phosphatase wurden bei Raumtemperatur mit 0,4 mM AMPPD oder Cl-AMPPD in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0, enthaltend 1 mg/ml entweder der polymeren Verstärker 1 oder Verstärker 2 in einem Berthold LB952T Luminometer inkubiert. Nach 5minütiger Inkubation wurden die Chemilumineszenzintensitäten als 5 Sekunden integrierte relative Licht-Einheiten (RLE) gemessen, und der Durchschnitt der Duplikate wurde ermittelt und gegen die alkalische Phosphatasekonzentration in der oberen graphischen Darstellung von Fig. 18 aufgetragen. Die untere graphische Darstellung zeigt das Verhältnis des Chemilumineszenzsignals zum Hhntergrund-(kein Enzym)-Chemilumineszenzsignal als Funktion der Enzymkonzentration aufgetragen.

BEISPIEL XXIV

Das Chemilumineszenzsignal zu den Geräuschgehalten wurde mit 2,83 · 10&supmin;¹³ M alkalischer Phosphatase und verschiedenen R-substituierten Adamantyl-1,2-dioxetanphosphaten in Anwesenheit verschiedener Verstärker erhalten. Alle Messungen erfolgten in einem Berthold LB952T Luminometer bei Raumtemperatur. Zuerst wurden die Hintergrund- Chemilumineszenzwerte (Signal in Abwesenheit des Enzyms) von jeder Probe (dreifach) gemessen. Jede Probe bestand aus 0,2 umol Dioxetan in 0,45 ml 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0, ohne oder mit 1 mg/ml des angegebenen Verstärkers. Die Reagenzgläser wurden in das Luminometer gestellt, und die Lumineszenzintensität wurde gemessen. Danach wurden die Reagenzgläser auf dem Luminometer entfernt und alkalische Phosphatase (50 ul enthaltend 1,415 · 10&supmin;¹&sup6; mol) wurde in jedes Reagenzglas gegeben und die Lumineszenzintensität wurde bei 5 und 20 Minuten nach der Substrataddition gemessen. Die Endkonzentration des Dioxetans in jedem Rohr betrug 0,4 mM. Tabelle 6 zeigt das Verhältnis des Chemilumineszenzsignals, erhalten in Anwesenheit von alkalischer Phosphatase bei 5 und 20 Minuten zu dem Hintergrundsignal (erhalten in Abwesenheit des Enzyms). TABELLE 6 VERGLEICH DES CHEMILUMINESZENZSIGNALS ZU DEN GERÄUSCHWERTEN VERSCHIEDENER R-SUBSTITUIERTER AMPPD-VERBINDUNGEN
Alle Verstärker wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M DEA, pH 10, verwendet. Alkalische Phosphatasekonzentration = 2,83 · 10&supmin;¹³ M. Die Messungen erfolgten in einem Berthold LB952T-Luminometer.

BEISPIEL XXV

In der Tabelle 7 sind die Nachweisgrenzen für den Nachweis alkalischer Phosphatase mit den R-substituierten Dioxetanen angegeben, bestimmt unter Verwendung der in Tabelle 5, Beispiel XXII beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme eines Instruments, welches verwendet wurde, um die Chemilumineszenzintensitätsablesungen zu erhalten. Das in diesen Beispielen verwendete Luminometer war ein LabSystems Luminoskan-Mikrotiterplatten-Ablesegerät. TABELLE 7 ALKALISCHE PHOSPHATASE-NACHWEISGRENZEN MIT CHEMILUMINESZENZ (BEI 2X HINTERGRUND) 5 MINUTEN INKUBATION 20 MINUTEN INKUBATION
1) Puffer: 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, 0,02% Natriumazid, pH 10,0
2) Signalaufzeichnungsgerät in einem Labsystems Luminoskan-Mikrotiterplatten-Ablesegerät

BEISPIEL XXVI

In der Tabelle 8 sind die 20 Minuten Inkubationswerte der Tabelle 7 plus Messungen, die mit einem Wilj-Mikrotiterplatten-Luminometer durchgeführt wurden, angegeben. TABELLE 8 ALKALISCHE PHOSPHATASE-NACHWEISGRENZEN MIT CHEMILUMINESZENZ (BEI 2X HINTERGRUND) 20 MINUTEN INKUBATION, LABSYSTEMS 23 MINUTEN INKUBATION, WILJ

BEISPIEL XXVII

Die Leistung von AMPPD und Cl-AMPPD auf einer Nylonmembran wurde wie folgt verglichen: 12,5 Picogramm biotinyliertes pBR322-(35 mer) in 1 ul wurde auf eine trockene Nylonmembran als Flecken aufgetüpfelt und durch UV-Licht mit der Membran vernetzt. Die Membran wurde danach mit 1 X SSC-Puffer befeuchtet, mit 0,2% Casein, 0,1% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, 4mal mit 0,3% Tween 20 in PBS gewaschen, zweimal in Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen und während 5 Minuten in 0,25 mM Dioxetan in Substratpuffer inkubiert. Auf diese Weise wurden zwei Membranen hergestellt: eine inkubiert mit AMPPD und die zweite mit Cl-AMPPD. Die Membranen würden dann in Kunststoff luftdicht verpackt, an der Außenseite eines 13 · 75 mm Reagenzglases befestigt und in ein Turner Modell 20-E Luminometer, ausgerüstet mit einem an der Seite montiertem Photomultiplier-Detektor gestellt und thermisch auf 30ºC äquilibriert. Die Chemilumineszenzintensität wurde dann während 20 bis 24 Stunden verfolgt. Wie in Fig. 19 dargestellt, wurde das Chemilumineszenzsignal als Funktion der Zeit sowohl für AMPPD als auch für Cl-AMPPD graphisch aufgetragen.

BEISPIEL XXVIII

Die Halbwertszeiten der maximalen, mit AMPPD und Cl-AMPPD auf PVDF und Nylonmembranen erhaltenen Chemilumineszenzintensitäten wurden aus den Werten berechnet, wie sie in Beispiel XXVII für die Nylonmembran erhalten wurden. Für die PVDF-Membran umfaßte das revidierte Protokoll eine zweite Substratpufferwaschung, gefolgt von der Membraninkubation während 5 Minuten bei Raumtemperatur in Tropix NitroßlockTM-Reagenz und eine darauffolgende Wäsche mit Substratpuffer vor der Dioxetansubstrataddition. Die Halbwertszeiten zu dem maximalen Chemilumineszenzsignal wurden von der graphischen Darstellung des Logarith mus (maximales Chemilumineszenzsignal minus Signal zu jedem Zeitpunkt) als Funktion der Zeit berechnet und sind in Tabelle 9 angegeben. TABELLE 9 CHEMILUMINESZENZNACHWEIS VON BIOTINYLIERTER DNA AUF MEMBRANEN - HALBWERTSZEIT ZU MAXIMALER CHEMILUMINESZENZ -
* Die PVDF-Membran wurde mit Nitroßlock vor der Addition des Substrats behandelt. 12,5 pg des biotinylierten pBR322-35mer wurden mit Avidix-AP und 0,24 mM Dioxetan in 0,1 M DEA, pH 10,0, nachgewiesen.

BEISPIEL XXIX

Der Nachweis von pBR322-Plasmid-DNA mit einer biotinylierten pBR322-DNA Sonde unter Verwendung von AMPPD und Cl-AMPPD auf PVDF- und Nylonmembranen erfolgte auf folgende Art: pBR322-DNA wurde durch Kochen denaturiert, serienmäßig verdünnte Proben in 1 X SSC-Puffer (Endmasse an DNA pro Slot ist in Fig. 20 angegeben) wurden auf Immobilin- PVDF-Membran, Pall-Biodyne-A Nylonmembran, und Amersham Hybond-N Nylonmembran unter Verwendung einer Schleicher-Schuell-Slotblotvorrichtung aufgetragen. Die DNA wurde mit den Biodyne A- und Hybond N-Membranen mit UV-Licht vernetzt. Die Immobilon P- Membran wurde zuerst blockiert und dann mit UV behandelt. Die Membranen wurden dann mit 1 X SSC-Puffer benetzt, in einem Hybridisierungspuffer (1 M NaCl, 0,2% Heparin, 0,5% Polyvinylpyrrolidon, 4% Natriumdodecylsulfat, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5% Dextransulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) prähybridisiert und dann bei 65ºC mit 12 ng/ml pBR322-Sonde (biotinyliert unter Verwendung eines Nick-Translationsverfahrens) in dem gleichen Puffer hybridisiert, einmal bei 65ºC in dem gleichen Puffer minus Dextransulfat, EDTA und Heparin gewaschen, zweimal während 10 Minuten mit 1 X SSC/1% SDS bei 75ºC gewaschen, zweimal während 15 Minuten mit 0,1 X SSC/1% SDS bei 75ºC gewaschen, zweimal während 5 Minuten in 1 X SSC bei Raumtemperatur gewaschen, 1 Stunde mit 0,2% Casein, 0,1% Tween 20 in PBS blockiert, einmal während 5 Minuten mit 0,2% Casein in PBS gewaschen, 30 Minuten in einer 1 bis 15.000 Verdünnung von Streptavidin markierter alkalischer Phosphatase in 0,2% Casein/PBS inkubiert, dann 6mal mit 0,2% Casein, Tween 20 in PBS gewaschen, zweimal in Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen und dann während 5 Minuten in 0,25 mM AMPPD und Cl-AMPPD (zwei getrennte Membranen) in Substratpuffer inkubiert. Vor der Substratzugabe wurde die PVDF-Membran 5 Minuten in NitroßlockTM inkubiert und zweimal mit Substratpuffer gewaschen. Die Membranen wurden dann in Kunststoff eingewickelt und einem Film des Polaroidtyps 612 bei den Zeiten, die nach den Substratzugaben, wie sie in Fig. 20 gezeigt sind, angegeben sind, ausgesetzt.

BEISPIEL XXX

Der Nachweis von pBR322-Plasmid-DNA mit einer biotinylierten pBR322-DNA Sonde unter Verwendung von AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD auf PVDF, Nylon und Nitrocellulosemembranen erfolgte unter Verwendung von Protokollen, ähnlich wie sie in Beispiel XXIX beschrieben werden, mit einer Ausnahme im Falle von PVDF- und Nitrocellulosemembranen, auf die die Ziel-DNA fixiert war, durch Erhitzen der Membranen bei 80ºC während 2 Stunden. Weiterhin wurden vor der Dioxetanzugabe sowohl die PVDF- als auch die Nitrocellulosemembranen mit Nitroblock behandelt. Die Bilder eines Polaroid Typ 612 Sofortbild-Films des chemilumineszierenden Signals von der Zersetzung verschiedener Dioxetanphosphate, katalysiert durch alkalische Phosphatase-DNA-Sondenkonjugate auf verschiedenen Membranträgern, ist in Fig. 21 dargestellt.

BEISPIEL XXXI

Die kinetischen Werte der von der alkalischen Phosphatase abhängigen Lichtemission von AMPPD und Cl-AMPPD auf Nitrocellulosemembranen wurden gemäß dem folgenden Verfahren verglichen: pBR322-(35-mer), welches zuvor am 3'-Ende mit Biotin-11-dUTP (1 ul, enthaltend 12,5 pg) markiert worden war, wurde auf eine trockene Nitrocellulosemembran aufgetüpfelt. Die Membran wurde dann mit 1 X SSC-Puffer benetzt, mit 0,2% Casein, 0,1% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, viermal mit 0,3% Tween 20 in PBS gewaschen, zweimal mit Phosphatpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen, 5 Minuten mit NitroßlockTM-Reagens inkubiert, zweimal mit Substratpuffer gewaschen, und anschließend wurden zwei Stücke der Membran je 5 Minuten in 0,25 mM AMPPD und Cl-AMPPD in Substratpuffer inkubiert. Die Membranen wurden dann in Kunststoff dicht verpackt, an der Außenseite eines 12 · 75 mm Reagensglases befestigt und in ein Turner Modell 20-E-Luminometer eingesetzt, das thermisch auf 30ºC äquilibriert war, und das mit einem Seiten-Photomultiplier-Detektor ausgerüstet war. Die Chemilumineszenzintensität wurde 20 bis 24 Stunden verfolgt Wie in Fig. 22 dargestellt, wurde das Chemilumineszenz-Intensitätssignal als Funktion der Zeit für sowohl AMPPD als auch für Cl- AMPPD graphisch dargestellt.

BEISPIEL XXXII

Die Halbwertszeit zu der maximalen Chemilumineszenz-Signalintensität für ein Protein an eine Membran wurde bewertet. Der IgG-Nachweis mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-Maus-Antikörpern und AMPPD und Cl-AMPPD wurde unter Verwendung des folgenden Protokolls bestimmt. 1 ul von 1 ug/ml Lösung gereinigtem Maus-IgG in 20% Methanol- Elektrophorese-Übertragungspuffer wurde auf eine trockene Nitrocellulose und nasse PVDF- Membran aufgetüpfelt. Die Membranen wurden anschließend mit 0,1% Tween 20/PBS, blockiert während 1 Stunde in einem Blockierungspuffer (0,2% Casein, 0,1% Tween 20 in PBS), gespült mit einer 1 bis 10.000fachen Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegeanti-Maus-Antikörper in Blockierungspuffer, inkubiert, zweimal während 5 Minuten mit Bloc kierungspuffer gewaschen, zweimal während 5 Minuten mit 0,1% Tween 20-PBS gewaschen, zweimal während 5 Minuten mit Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen, in zwei Proben unterteilt und je während 5 Minuten mit 0,25 mM AMPPD und Cl- AMPPD inkubiert. Die Membranen wurden in Kunststoff luftdicht abgepackt, an der Außenseite eines 12 · 75 mm Glasrohres befestigt und in ein Turner Modell 20E-Luminometer, ausgerüstet mit einem Seiten-Photomultiplier-Detektor, eingesetzt und thermisch auf 30ºC äquilibriert. Wie aus Tabelle 10 hervorgeht, wurden die Chemilumineszenzintensitäten während 8 bis 12 Stunden verfolgt, und die Halbwertszeit zu dem maximalen Signal wurden, wie in Beispiel XXVIII berechnet, bestimmt. TABELLE 10 CHEMILUMINESZENZNACHWEIS VON MAUS-IgG AN MEMBRANEN - HALBWERTSZEIT ZU MAXIMALER CHEMILUMINESZENZ -
* Die PVDF-Membran wurde mit Nitroßlock vor der Zugabe des Substrats behandelt. 1 ng Maus-IgG wurde mit Ziege-anti-Maus-AP und 0,25 mM Dioxetan in 0,1 M DEA, pH 10,0, nachgewiesen:

BEISPIEL XXXIII

Eine Western-Blotanalyse wurde für den Nachweis von humanem Transferrin auf einer Nylonmembran mit Chemilumineszenz durchgeführt. Reihenverdünnungen von gereinigtem humanem Transferrin mit 0-5,1,2,4,8,16,32,64,128 und 256 Nanogramm wurden durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und elektrophoretisch auf eine Pall Biodyne A- Nylonmembran übertragen. Die Membranen wurden nacheinander mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, 30 Minuten mit 0,3% Casein in PBS blockiert, mit einer 1 bis 1000fachen Verdünnung von Maus-anti-human-Transferrin in 0,3% Tween 20/PBS inkubiert, viermal während 5 Minuten mit 0,3% Tween 20/PBS gewaschen, mit 1 bis 10.000facher Verdünnung an mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper in 0,3% Tween 20/PBS inkubiert, viermal während 5 Minuten in 0,3% Tween 20/PBS gewaschen, zweimal mit Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0) gewaschen, 5 Minuten in je 0,25 mM AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD in Substratpuffer inkubiert, in Kunststoff eingewickelt und dann einem Polaroid Typ 612 Sofortbild-Schwarz-Weißfilm während 5 Minuten ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 30 dargestellt.

BEISPIEL XXXIV

Humanes Transferrin (die Mengen sind in Fig. 22 angegeben) wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und dann auf eine Immobion-PVDF-Membran übertragen.
Der Chemilumineszenznachweis von humanem Transferrin an Immobilon-P-PVDF- Membran erfolgte gemäß dem in Beispiel XXII beschriebenen Protokoll, ausgenommen der folgenden Änderungen: unmittelbar vor der Dioxetanzugabe wurden zwei der vier PVDF- Membranen während 5 Minuten in NitroßlockTM inkubiert und dann zweimal mit Substratpuffer gewaschen. 5 Minuten Belichtungen für AMPPD und Cl-AMPPD ohne und mit Nitroßlock sind in Fig. 23 dargestellt.

BEISPIEL XXXV

Der Chemilumineszenznachweis von murinem Interleukin-4-Gen unter Verwendung von direkt mit alkalischer Phosphatase markierten Oligonukleotidsonden mit AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD und LumiPhos 530 wurde durchgeführt. Ein Plasmid, enthaltend das Genoder murines Interleukin-4-Gen (MIL-4) wurde reihenmäßig in 1 X SSC verdünnt und auf eine trockene Biodyne A Membran bei 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, 0,0063 und 0,00315 Nanogramm DNA aufgetragen. Die DNA wurde auf die Membran mit UV fixiert und danach mit 1 X SSC benetzt, mit Hybridisierungspuffer (7% SDS, 1% Casein, 0,25 M Na&sub2;PO&sub4;, pH 7,2 mit Phosphorsäure) während 30 Minuten bei 50ºC vorhybridisiert, mit 5 nM mit alkalischer Phosphatase markierter Oligonukleotidsonde während 2 Stunden bei 50ºC hybridisiert und wie folgt gewaschen: zweimal während 5 Minuten mit 2 X SSC, 1% SDS bei Raumtemperatur, zweimal während 15 Minuten mit 1 X SSC, 1% SDS bei 50ºC, zweimal währendº 5 Minuten mit 1 X SSC, 1% Triton X-100 bei Raumtemperatur, zweimal während 5 Minuten mit 1 X SSC, und zweimal während 5 Minuten in Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10). Getrennte Proben der Membranen wurden dann während 5 Minuten je in 0 bis 25 mM AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD und LumiPhos 530 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) inkubiert, in Kunststoff eingewickelt und einem Kodak XAR-5 Röntgenfilm während 1 Stunde nach 1 Stunde Inkubierung ausgesetzt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 24 angegeben.

BEISPIEL XXXVI

Der Vergleich der Chemilumineszenz-Signalintensitäten, erhalten mit Cl-AMPPD und AMPPD, wurde wie in Fig. 9 dargestellt, untersucht. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung von M13mp18-DNA mit 5'-biotinyliertem Universalprimer mit BioRad-BST- Polymerase durchgeführt. Zwei Sätze von Reaktionen wurden auf einem 7,67 M Harnstoff- Ionengradient-Polyacrylamidgel getrennt und dann auf eine Nylonmembran durch passive Kapillarübertragung übertragen. Die DNA wurde mit der Membran durch UV-Bestrahlung während 5 Minuten vernetzt. Die Membran wurde dann bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (0,2% Casein, 0,1% Tween 20 in PBS) während 30 Minuten inhibiert, während 30 Minuten mit einer 1 bis 5000 Verdünnung an Streptavidin markierter alkalischer Phosphatase in 0,2% Casein, PBS inkubiert, 5 Minuten mit Blockierungspuffer gewaschen, zweimal mit 0,3% Tween 20 in PBS gewaschen und 1 Minute mit Substratpuffer gewaschen (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10). Die Membran wurde in zwei Stücke geteilt und 5 Minuten in 0,25 M Dioxetan (ein Streifen je für AMPPD und Cl-AMPPD) inkubiert. Die Membranen wurden dann in Plastik versiegelt und einem Kodak XAR-5 Röntgenfilm während 7 Minuten, beginnend 5 Minuten nach der Substratzugabe, wie in Fig. 25 dargestellt, ausgesetzt.

BEISPIEL XXXVII

Der Vergleich der DNA Bandenauflösung unter Verwendung von AMPPD und Cl- AMPPD wurde unter Verwendung von Sequenzierreaktionen durchgeführt, Übertragungen und Chemilumineszenznachweise wurden bei den gleichen Bedingungen wie in Beispiel XXXVI unter Verwendung von AMPPD und Cl-AMPPD beschrieben durchgeführt. Die Belichtung in Fig. 26 ist eine 1-Minuten-Belichtung 24 Stunden nach der Substratzugabe.

BEISPIEL XXXVIII

Der Nachweis von pBR322-Plasmid-DNA mit einer biotinylierten pBR322-DNA Sonde unter Verwendung von AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD an einer Nitrocellulosemembran wurde durchgeführt. pBR322-Plasmid-DNA wurde reihenmäßig verdünnt und mit 512, 256, 128, 64; 32, 16, 8, 4, 2 und 1 Picogramm der DNA auf 3 Streifen trockene Nitrocellulosemembran aufgetüpfelt. Die Membranstreifen wurden dann 2 Stunden auf 80ºC erhitzt und mit UV- Licht während 5 Minuten bestrahlt, benetzt mit 1 X SSC, während 60 Minuten in einem Hybridisierungspuffer (1 M NaCl, 0,2% Heparin, 0,5% Polyvinylpyrrolidon, 40% Natriumdodecylsulfit, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 5% Dextransulfat; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) bei 65ºC vorhybridisiert, über Nacht mit 15 ng/ml pBR322-Sonde hybridisiert, biotinyliert durch Nick-Translation, 5 Minuten in Hybridisierungspuffer minus Heparin, Dextransulfat und EDTA bei 65ºC zweimal während 5 Minuten mit 1 X SSC/1% SDS bei 75ºC gewaschen, zweimal während 15 Minuten mit 0,01 X SSC/1% SDS bei 75ºC gewaschen und einmal während 5 Minuten mit 1 X SSC bei Raumtemperatur gewaschen. Die Membranen wurden dann für den Chemilumineszenznachweis bei Raumtemperatur durch zweimaliges Spülen mit 0,2% Casein in PBS weiterbehandelt, 1 Stunde mit Blockierungspuffer (0,20% Casein, 0,1% Tween 20 in PBS) blokkiert, 5 Minuten mit 0; 2% Casein in PBS gewaschen, dann 5 Minuten mit 0,2% Casein in PBS gewaschen, dann wurden die Membranen 30 Minuten mit einer 1 bis 15.000fachen Verdünnung von Streptavidin markierter alkalischer Phosphatase in 0,2% Casein/PBS inkubiert, zweimal während 5 Minuten in Nitroßlock-Lösung gewaschen, dann viermal während 5 Minuten in 0; 3% Tween-20/PBS gewaschen, dann zweimal während 5 Minuten mit Substratpuffer (0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10) gewaschen, und dann wurde ein Streifen in je drei Dioxetanphosphaten: AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD bei 0,25 M Dioxetankonzentration inkubiert.
Zeitlich begrenzte Belichtungen mit einem Polaroid 612-Film nach verschiedenen Inkubationszeiten sind in Fig. 27 dargestellt.

BEISPIEL XXXLX

Der Nachweis von pBR322-DNA mit einer biotinylierten pBR322-DNA-Sonde mit Streptavidin-alkalischer Phosphatase-Konjugat und chemilumineszierenden Dioxetanphosphaten, AMPPD, Cl-AMPPD und Br-AMPPD auf einer neutralen Nylonmembran wurde unter Verwen dung des in Beispiel XXXVIII beschriebenen Protokolls durchgeführt, ausgenommen, daß die 5 Minuten Nitroßlock-Inkubation ausgelassen wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 28 dargestellt.

BEISPIEL XL

Der Chemilumineszenznachweis von humanem Transferrin wurde an einer Immobilon- PPVDF-Membran durchgeführt. Die Gelelektrophorese, die Übertragung, die Blockierung und die Nachweisstufen wurden gemäß dem in Beispiel XXXIV beschriebenen Protokoll durchgeführt, ausgenommen, daß alle PVDF-Membranen während 5 Minuten in NitroßlockTM-Reagens inkubiert wurden. Fig. 29 zeigt die Vergleichsergebnisse von AMPPD, Cl-AMPPD und Br- AMPPD bei dem Nachweis von humanem Transferrin an PVDF-Membranen.

BEISPIEL XLI

Der thermische Hintergrund von jedem Dioxetan, wie in Tabelle 11 spezifiziert, wurde in einer Lösung aus 0,4 mM Dioxetan in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, pH 10,0, bei 30ºC in einem Turner Modell 20E-Luminometer (Sunnyvale, CA) gemessen. Die durchschnittliche Chemilumineszenzintensität von jeder Probe in Abwesenheit eines Enzyms wird als "nichtspezifischer Hintergrund" bei 0,4 mM in relativen Luminometereinheiten (TLE) in Tabelle 11 angegeben.
Die Halbwertszeit des Dioxetananions, die ebenfalls in Tabelle 11 angegeben ist, wurde wie folgt gemessen: alkalische Phosphatase (Endkonzentration) 2,83 · 10&supmin;¹³ M wurde zu 1 ml Lösung von 0,04 mM Dioxetan (in dem gleichen Puffer wie oben) gegeben und vollständig bei 30ºC in einem Turner Modell 20E-Luminometer dephosphoryliert. Die Halbwertszeit des Dioxetananions wurde dann wie in Beispiel XVIII beschrieben berechnet. TABELLE 11 HALBWERTSZEITEN UND NICHTSPEZIFISCHE HINTERGRUNDEMISSION VON DIOXETANEN BEI 31,5ºC
* Das Rohr enthielt 2,83 · 10&supmin;¹³ M alkalische Phosphatase in 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl&sub2;, 0,02% Natriumazid, pH 10,0
Die obige Diskussion der vorliegenden Erfindung betrifft vor allem bevorzugte Ausführungsformen und Praktiken davon. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß weitere Änderungen und Modifizierungen bei der tatsächlichen Durchführung des hier beschriebenen Konzepts leicht gemacht werden können, ohne daß der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, geändert wird.

Claims

1. Enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2- Dioxetanverbindung, die Lichtenergie bei der Zersetzung bilden kann, im wesentlichen bei Raumtemperatur stabil ist, bevor die Bindung an einen enzymatisch spaltbaren labilen Substituenten davon mit Absicht gespalten wird, dargestellt durch die Formel:

worin:

X und X¹ je einen Substituenten in den 5' - und 7' - Stellungen des Adamant-2'-ylidensubstituenten bedeuten, die individuell Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, ein Halogensubstituent, eine -O(CH&sub2;)nCH&sub3;-Gruppe, worin n 0-19 bedeutet, eine Hydroxy(niedrig)alkylgruppe, eine Halogen(niedrig)alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenhenylgruppe, eine Alkoxyphenylgruppe, eine Hydroxyalkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Amidogruppe ist, wobei mindestens einer der Substituenten X und X¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoff besitzt, und

R&sub1; und R&sub2; individuell oder zusammen einen organischen Rest bedeuten, der die Erzeugung von Licht nicht stört, wenn die Dioxetanverbindung enzymatisch gespalten wird und der Wertigkeit des 4-Kohlenstoffatoms der Dioxetanverbindung genügt, mit den Maßgaben, daß, wenn R&sub1; und R&sub2; individuelle Substituenten bedeuten, der R&sub2;-Substituent ein aromatischer, heteroaromatischer oder ungesättigter Substituent in Konjugation mit dem aromatischen Ring ist, und wobei mindestens einer der Substituenten R&sub1; und R&sub2; oder R&sub1; und R&sub2; zusammen eine fluoreszierende chromophore Gruppe, die mit einer enzymatisch spaltbaren labilen Gruppe substituiert ist, bedeuten, die luminesziert, wenn der enzymatisch abspaltbare labile Substituent davon mittels eines Enzyms entfernt wird.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dargestellt durch die Formel:

worin Z eine durch ein Enzym spaltbare Gruppe bedeutet, der Sauerstoff an dem Phenylring ortho, meta oder para ist, und Q Wasserstoff, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, Heteroaryl mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, eine Allylgruppe, eine Hydroxy(niedrig)alkylgruppe, eine Niedrigalkyl-OSiR³ (worin R³ Niedrigalkyl, Aryl, Alkoxy-C&sub1;&submin;&sub6;, Alkoxyalkyl mit 12 oder weniger Kohlenstoffatomen, Hydroxy(niedrig)alkyl, Amino(niedrig)alkyl bedeutet), -OR&sup4; oder -SR&sup4; (worin R&sup4; Alkenyl, substituiertes (Niedrig)alkenyl, (Niedrig)alkyl oder Aralkyl mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen bedeutet), -SO&sub2;R&sup5; (worin R&sup5; Methyl, Phenyl oder NHC&sub6;H&sub5; bedeutet), substituiertes oder unsubstituiertes (Niedrig)alkyl, Nitro, Cyano, Halogen, Hydroxy, Carboxy, Trimethylsilyl oder eine Phosphoryloxygruppe bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X Hydroxyl und X¹ Wasserstoff bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X Chlor und X¹ Wasserstoff bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X Brom und X¹ Wasserstoff bedeutet.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 3 bis einschließlich 5, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet.

8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Phosphatsubstitüent als Dinatriumsalz vorhanden ist.

9. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß 1% eine meta-β-D- galactosidsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet.

10. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'- hydroxy) tricyclo [3.3.1.13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat,

Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3, 2'-(5'- chlor) tricyclo [3.3.1.13,7]decan] -4-yl) phenylphosphat,

Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'- brom) tricyclo [3.3.1. 13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat,

syn-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- (5' -hydroxy) tricyclo [3. 3. 1.13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat,

syn-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- (5' -chlor) tricyclo [3.3.1. 13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat,

syn-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan.-3,2' - (5'-brom) tricyclo [3.3.1.13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat,

anti-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2' - (5' -hydroxy) tricyclo [3.3.1.13,7]decan] -4-yl) phenylphosphat,

anti-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'- (5'-chlor) tricyclo [3. 3.1.13,7] decan] -4-yl) phenylphosphat und

anti-Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1, 2-dioxetan-3,2'- (5'-brom) tricyclo [3.3.1.13,7]decan] -4-yl)phenylphosphat.

11. Enolether der Formel:

worin:

X und X¹ je einen Substituenten an den 5'- und 7' - Stellungen des Adamant-2'-ylidensubstituenten bedeuten, der individuell Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe, ein Halogensubstituent, eine unsubstituierte Niedrigalkylgruppe, eine Hydroxy(niedrig)alkylgruppe, eine Halogen(niedrig) - alkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe, eine Alkoxyphenylgruppe, eine Hydroxyalkoxygruppe, eine Cyanogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Amidogruppe bedeuten, wobei mindestens einer der Substituenten X und X¹ eine andere Bedeutung als Wasserstoff besitzt;

Y eine Niedrigalkylgruppe bedeutet und

Y' Wasserstoff, eine Niedrigalkylgruppe, eine Niedrigalkenylgruppe, eine Aralkylgruppe mit bis zu 20 Kohlen stoffatomen, ein Alkalimetallkation, eine Acylgruppe mit 2 bis etwa einschließlich 14 Kohlenstoffatomen,

ein Alkalimetallkation bedeutet, wobei M unabhängig ein Proton, ein Alkalimetallkation, Ammonium, substituiertes Ammonium, quaternäres Ammonium oder ein H&spplus;-Pyridiniumkation bedeutet.

12. Verbindung nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

Dinatrium-3-(methoxy-5-hydroxytricyclo[3.3.1.13,7]- dec-2-ylidenmethyl)phenylphosphat,

Dinatrium-3- (methoxy-5-chlortricyclo [3. 3.1.13,7]dec- 2-ylidenmethyl)phenylphosphat und

Dinatrium-3- (methoxy-5-bromtricyclo [3.3.1.13,7]dec- 2-ylidenmethyl)phenylphosphat.

13. Assayverfahren, bei dem eine optisch nachweisbare Reaktion zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer besonderen Substanz in einer Probe verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die optisch nachweisbare Reaktion die Reaktion mit einem Enzym der enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1, 2-Dioxetan- verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt.

14. Assayverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß X Chlor und X¹ Wasserstoff bedeuten.

15. Assayverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die 1,2-Dioxetanverbindung

Dinatrium-3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-(5'- chlor) tricyclo [3. 3. 1.13,7]decan] -4-yl) phenylphosphat ist.

16. Assayverfahren nach Anspruch 13, umfassend die folgenden Stufen:

(i) Behandlung einer Probe, von der vermutet wird, daß sie eine nachweisbare Substanz enthält mit einer gepufferten Lösung, die ein Enzym, gebunden mit einer Substanz mit einer spezifischen Affinität für die nachweisbare Substanz, enthält,

(ii) Inkubieren der entstehenden Lösung, damit die nachweisbare Substanz sich an den spezifischen Affinitätsteil der spezifischen Affinitäts-Enzym- Verbindung binden kann,

(iii) Abwaschen des Überschusses der spezifischen Affinitäts-Enzym-Verbindungen,

(iv) Zugabe der enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetanverbindung, wie in Anspruch 1 definiert, die eine Gruppe enthält, die durch den Enzymteil der spezifischen Affinitäts-Enzym-Verbindung spaltbar ist,

(v) Nachweis der erhaltenen Lumineszenz als Anzeichen für die Anwesenheit der nachweisbaren Substanz in der Probe und Messung der Lumineszenz zur Bestimmung der Konzentration der Substanz.

17. Assayverfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die nachweisbare Substanz und die Substanz, die eine spezifische Affinität für die nachweisbare Substanz besitzt, ausgewählt wird aus Antigenen bzw. Antikörpern.

18. Assayverfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die nachweisbare Substanz eine Nukleinsäure ist und daß die Substanz, die eine spezifische Affinität für die nachweisbare Substanz besitzt, eine Sonde ist, die an die gesamte Nukleinsäure oder einen Teil davon binden kann.

19. Assayverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde ein markiertes Oligonukleotid ist, das zu der Nukleinsäure komplementär ist.

20. Assayverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA, die RNA oder das Fragment davon gemäß einem Sequenzierprotokoll gebildet wird.

21. Assayverfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter die Stufen umfaßt (a) Behandlung der DNA, RNA oder des Fragments davon mit einer markierten komplementären Oligonukleotidsonde unter Bildung eines Hybridisierungspaars, (b) Behandeln des hybridisierten Paars mit einem Molekül, das an die Markierung des Oligonukleotids, welches covalent mit einem Enzym konjugiert ist, stark binden kann, welches ein enzymatisch spaltbares 1,2-Dioxetan unter Freisetzung von Lichtenergie spalten kann, (c) Zugabe eines 1,2-Dioxetansubstrats und (d) Nachweis des gebildeten Lichts.

22. Assayverfahren nach Ansprüch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidmarkie- rung Biotin oder ein Biotinderivat ist.

23. Assayverfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül, das mit der Markierung des Oligonukleotids eine starke Wechselwirkung eingehen kann, Avidin oder Streptavidin ist.

24. Assayverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonde covalent mit einem Enzym markiert ist, das das 1,2-Dioxetan unter Emittierung von Lichtenergie zersetzen kann.

25. Assayverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der Oligonu- kleotidsonde ein covalent gebundenes Antigen umfaßt, das immunchemisch an ein Antikörper-Enzym-Konjugat gebunden ist, der Antikörper gegen das Antigen gerichtet ist und das Enzym die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann.

26. Assayverfahren nach einem der Ansprüche 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist, R&sub1; Methoxy und R&sub2; eine meta-phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet.

27. Assayverfahren nach einem der Ansprüche 17, 19, 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Sonde an die Nukleinsäure auf einer Nylonmembran durchgeführt wird.

28. Assayverfahren nach einem der Ansprüche 21 bis einschließlich 23, dadurch gekennzeichnet,

daß die Hybridisierung zwischen der DNA, der RNA oder einem Fragment davon und der markierten Oligonukleotidsonde auf einer Nylonmembran durchgeführt wird.

29. Assayverfahren nach Anspruch 13, durchgeführt unter Verwendung einer festen Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß die nichtspezifische Bindung an die Matrix durch Vorbehandlung der Matrix mit einem polymeren quaternären Ammoniumsalz blockiert wird.

30. Assayverfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay die Vorbehandlung einer Nitrocellulosemembran mit BDMQ und TBQ umfaßt.

31. Assayverfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Assay die Vorbehandlung der PVD-Membran mit BDMQ und TBQ umfaßt.

32. Assayverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter in Anwesenheit einer wasserlöslichen Verstärkungssubstanz, die die spezifische Lichtenergiebildung über den Wert, der in ihrer Abwesenheit gebildet wird, erhöht, ausgeführt wird.

33. Assayverfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkungssubstanz ein polymeres quaternäres Ammoniumsalz ist.

34. Assayverfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] oder Poly[vinyl(benzyltributylammoniumchlorid)] ist.

35. Assayverfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkungssubstanz ein positiv geladenes polymeres quaternäres Ammoniumsalz und ein Fluorescein, das einen ternären Komplex mit dem negativ geladenen Produkt der 1,2-Dioxetanverbindung, die nach der enzymkatalysierten Zersetzung der 1,2- Dioxetanverbindung gebildet wird, umfaßt, wobei eine Energieübertragung zwischen dem negativ geladenen Produkt und Fluorescein stattfindet und Lichtenergie von dem Fluorescein emittiert wird.

36. Assayverfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] oder Po- ly[vinyl(benzyltributylammoniumchlorid)] ist.

37. Kit zum Nachweis einer ersten Substanz in einer Probe, umfassend die enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht, und ein Enzym, das die enzymatisch spaltbare 1abile Gruppe der 1,2-Dioxetanverbindung spalten kann.

38. Kit nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy; R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.

39. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäure oder des Fragments davon zu einer komplementären markierten Oligonukleotidsonde, umfassend die enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2- Dioxetanverbindung nach Anspruch 1, eine Oligonukleotidsonde, die mit einem Enzym covalent markiert ist, und eine Nylonmembran, auf der die Nukleinsäure-Oligonukleotidsonden-Hybridisierung durchgeführt wird.

40. Kit nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet, R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und daß das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.

41. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon, wie in Anspruch 39 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementäre Oli gonukleotidsonde covalent mit Biotin oder einem Biotinderivat, Avidin oder Streptavidin markiert ist.

42. Kit nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet, R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.

43. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure oder eines Fragments davon in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäure oder des Fragments davon an eine komplementäre markierte Oligonukleotidsonde, umfassend eine enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1, 2-Dioxetanverbindung, eine komplementäre Oligonukleotidsonde, covalent markiert mit einem Antigen, ein Antikörper, der gegen das Antigen, das covalent an ein Enzym gebunden ist, welches die 1, 2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, gerichtet ist und eine Nylonmembran, auf der die Nukleinsäure oder das Fragment davon mit der Oligonukleotidsonde hybridisiert wird.

44. Kit nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist, R&sub1; Methoxy bedeutet und R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet.

45. Kit zum Nachweis eines Proteins in einer Probe, umfassend eine enzymatische spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetanverbindung, wie in Anspruch 1 definiert, einen Antikörper, der gegen das Protein gerichtet ist, covalent gebunden an ein Enzym, das die 1,2-Dioxetanverbindung unter Lichtenergieemittierung zersetzen kann, und eine Membran, auf der die Protein-Antikörper-Bindung durchgeführt wird.

46. Kit nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran Nylon, eine Nitrocellulosemembran oder eine PVDF-Membran ist.

47. Kit nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet, R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.

48. Kit zum Nachweis eines Proteins in einer Probe, wie in Anspruch 45 definiert, weiter umfassend einen zweiten Antikörper, der gegen den ersten Antikörper covalent gebunden an ein Enzym, das die 1,2-Dioxetanverbindung zersetzen kann, gerichtet ist.

49. Kit nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet, R&sub2; eine metaphosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym saure oder alkalische Phosphatase ist.

50. Kit nach einem der Ansprüche 37, 39, 41, 43, 45 oder 48, weiter umfassend eine wasserlösliche Verstärkungssubstanz, die die spezifische Lichtenergiebildung über den Wert, der in ihrer Abwesenheit gebildet wird, erhöht.

51. Kit nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkungssubstanz ein polymeres quaternäres Ammoniumsalz ist.

52. Kit nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] oder Poly[vinylbenzyl(tributylammoniumchlorid)] ist.

53. Kit nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß die Verstärkungssubstanz ein positiv geladenes polymeres quaternäres Ammoniumsalz und ein Fluorescein, welches einen ternären Komplex mit dem negativ geladenen Produkt der 1,2-Dioxetanverbindung, das nach der enzymatisch katalysierten Zersetzung der 1,2- Dioxetanverbindung gebildet wird, bilden kann, umfaßt, wobei die Energieübertragung zwischen dem negativ geladenen Produkt und dem Fluorescein stattfindet und Lichtenergie von dem Fluorescein emittiert wird.

54. Kit nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylammoniumchlorid)] oder Poly[vinylbenzyl(tributylammoniumchlorid)] ist.

55. Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe, umfassend die Stufen von:

(a) Bereitstellen einer enzymatisch spaltbaren chemilumineszierenden 1,2-Dioxetanverbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht,

(b) Behandlung der 1,2-Dioxetanverbindung mit der das Enzym enthaltenden Probe, wobei das Enzym den enzymätisch spaltbaren labilen Substituenten von der 1,2- Dioxetanverbindung abspaltet unter Bildung eines negativ geladenen Substituenten, der an die 1,2-Dioxetanverbindung gebunden ist, wobei der negativ geladene Substituent bewirkt, daß sich die 1,2-Dioxetanverbindung unter Bildung einer lumineszierenden Substanz, die die fluoreszierende chromophore Gruppe enthält, zersetzt und

(c) Nachweis der lumineszierenden Substanz als Anzeichen für die Anwesenheit des Enzyms.

56. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet, R&sub2; eine meta phosphatsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym eine saure oder alkalische Phosphatase ist.

57. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß R&sub1; Methoxy bedeutet und R&sub2; eine meta-β-D-galactosidsubstituierte Phenoxygruppe bedeutet und das Enzym eine Galactosidase ist.