NO302120B1 - Kjemisk luminescerende 3-(substituerte adamant 2'-yliden)-1,2-dioksetaner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår forbedrede kjemisk luminescerende 1,2-dioksetanforbindelser. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen forbedrede enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetanforbindelser som inneholder enzymatisk avspaltbare labile grupper. Slike labile grupper forhindrer molekylet fra å dekomponere for å gi lys, dvs. synlig lys eller lys som er detekterbart ved passende instrumentering, inntil et passende enzym blir tilsatt for å fjerne det labile gruppe.

Et enzymmolekyl vil gjennem en katalytisk, cykel, påvirke fjerningen av sin komplementære labile gruppe fra flere tusen enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetan-molekyler. Dette er i klart kontrast til situasjonen med kjemisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner, hvor ett molekyl kjemisk spaltende stoff er nødvendig for å fjerne den komplementære labile gruppe fra hvert dioksetan-molekyl. For eksempel er 1 mol natriumhydroksyd nødvendig for å spalte ett mol hydrogenioner fra hydroksylsubstituenten på fenylgruppen i 3-(2 *-spiro-adamantan)-4-metoksy-4-(3''-hydroksy )fenyl-l,2-dioksetan, mens kun ett eneste mol alkalisk fosfatase ("AP") er nødvendig for å spalte fosforyl-oksygruppen i 1.000-5.000 mol 3-(2'-spiroadamantan )-4-metoksy-4-(3''-fosforyloksy)fenyl-1,2-dioksetandinatriumsalt pr. sekund; se Jablonski, "DNA Probes for Infectious Disieases" (Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1989), side 22.

Enzymatisk spaltbare lysproduserende 1,2-dioksetanforbindelser vil vanligvis også inneholde stabiliserende grupper, som en adamantylidengruppe spirobundet til dioks-etanringens 3-karbonatom, som vil hjelpe til å hindre dioksetanforbindelsen fra å gjennomgå større dekomponering ved romtemperatur (ca. 25°C) før bindingen med hvilken den enzymatisk avspaltbare gruppe er festet til det øvrige molekylet blir spaltet med hensikt. Konseptet med å bruke spiroadamantylgruppe for stabilisering ble introdusert i 1,2-dioksetankjemien av Wierynga et al., Tetrahedron Letters, 169

(1972) og McCapra et al., J. Chem. Soc. , Chem. Comm., 944

(1977). Disse stabiliserende gruppene tillater således at slike dioksetaner kan bli lagret i en tilstrekkelig lang tid før bruk, f. eks. fra ca. 12 måneder til så mye som 12 år ved temperaturer fra ca. 4 og opp til 30°C, uten å gjennomgå større dekomponering.

Denne oppfinnelsen angår videre inkorporering av dets dioks-etanmolekyler i immunoanalyser som er kjent i teknikken, kjemiske analyser og nukleinsyreprobeanalyser og til deres bruk som direkte kjemiske/fysiske prober for'undersøkelser av molekylstrukturer eller mikrostrukturer til varierende makro-molekyler, syntetiske polymerer, proteiner, nukleinsyrer, katalytiske antistoffer, o.l. for å muliggjøre å identifisere eller kvantifisere en analytt (det kjemiske eller biologiske stoffet hvis nærvær, mengde eller struktur skal bli bestemt).

Kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner har antatt økt viktighet i de senere år, spesielt etter oppdagelsen av de enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetan beskrevet av Bronstein i US-søknad nr. 889.823, Bronstein et al. i US-søknad nr. 140.035, Edwards i US-søknad nr. 140.197 og Edwards et al. i US-søknad 213.672.

Igjen i klar kontrast til enzymatisk spaltbare 1,2-dioksetaner, hadde de forskjellig kjemisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner kjent til nå hatt liten, hvis noen nytte, som reporterende molekyl i noen analytiske teknikker og helt klart ikke i biologiske analyser. Dette er fordi de kjente kjemisk spaltbare forbindelsene for det meste er uoppløselige i vann, bortsett fra enkelte acetoksy-substituerte 1,2-dioksetaner som er delvis vannoppløselige så vel som oppløselige i organisk oppløsningsmiddel, og kan derfor ikke være nyttige i biologiske analyser uten å bli modifisert ved å sette på dem grupper eller substituenter som tillater konjugasjon il et biologisk stoff, f.eks. et antistoff, og således muliggjøre at slike konjugerte kjemisk spaltbare 1,2-dioksetaner kan bli brukt som kjemisk aktiverte kjemisk luminescerende merker.

Vannoppløseligheten til typisk enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner på den annen side - f.eks. adamantyl-tilføyd enzymatisk spaltbare 1,2-dioksetaner som spaltes i nærvær av et passende enzym under emisjon av lys, som 3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-tricyklo[3,3,l,l3 «7-dekan]-4-yl)fenylfosfat og dets salter, f.eks. dinatriumsaltet, i det følgende identifisert i kort versjon som adamantylidenmetoksyfenoksyfosforylert dioksetan ("AMPPD"), og 3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-tricyklo[3,3,1,l3 »7]-dekan]-4-yl)fenoksy-3''-3-D-galaktopyranosid og dets salter ("AMPGD") - gjør at de passer utmerket for bruk som rap-porteringsmolekyler i mange typer analytiske teknikker som som blir utført i vandig medium og spesielt i bioanalyser.

Det er blitt observert at AMPPD i vandige oppløsninger og i nærvær av kjemisk luminescensforbedrere, f.eks. et polymert ammonium, fosfon, eller sulfonsalt som poly[vinylbenzyl-(benzyldimetylammoniumklorid)] ("BDMQ") og andre heteropolare polymerer (se Voyta et al., US-søknad nr. 203.263), utviser lengre optimal tidsperiode for å oppnå konstant lysemisjons-karakteristikker (" VA", definert som den tiden som er nødvendig for å oppnå halvparten av den maksimale kjemiske luminescensintensitet ved konstant, stabil tilstandslys-emisjonsnivåer; denne halveringstiden for emisjon varierer som en funksjon av stabiliteten til dioksyetanoksyanionet i forskjellige omgivelser).

Statistisk er omtrent syv tVi-perioder nødvendige for å nå stabil tilstands lysemisjonskinetikk. VA for AMPPD ved konsentrasjon over 2 x 10"^ M i vandig oppløsning ved pH 9,5 i nærvær av BDMQ er funnet å være 7,5 min. Ved 4 x 10~<3>M i fravær av BDMQ er VA funnet å være ca. 30 til 60 min. , mens ved 2 x IO-<5>M i vandig oppløsning er VA for AMPPD funnet å være 2,5 min.

I hurtige bioanalyser som benytter enzymatisk spaltbar kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner som rapporterende molekyler er det ønskelig å oppnå stabil tilstand lysemisjon-kinetikk så hurtig som mulig for å måle et "endepunkt" i analysen. Og mens kjemisk luminescensintensitet kan bli målt før oppnåelsen av stabil tilstandskinetikk, må avansert, termisk kontrollert luminometrisk instrumentering bli brukt hvis man ønsker å oppnå nøyaktig data før oppnåelsen av stabil tilstand emisjonskinetikk.

Videre viser AMPPD i vandig bufret oppløsning både i nærvær og fravær av kjemisk luminescensforbedrere som BDMQ, høyere enn ønskelig termisk og ellers ikke enzymatisk aktivert lysemisjon eller "støy". Slik støy kan skyldes emisjoner fra de eksiterte tilstander av adamantanon og av metyl-m-oksy-benzyatanionet som er avledet fra den aromatiske delen av AMPPD-molekylet. Denne støyen kan begrense nivåene for deteksjon og således forhindre oppnåelsen av optimal følsomhet ettersom det målte støynivå fra AMPPD er omtrent to størrelsesordener over mørkestrømmen i et vanlig luminometer.

Enzymatisk spalting av AMPPD med alkalisk fosfatase genererer også anionisk, defosforylert AMPPD, adamantylidenmetoksy-metylfenolat-dioksetan eller "AMP"D". Dette fenolatanionet kan også bli dannet hydrolytisk i små mengder og gir opphav til et bakgrunns kjemisk luminescenssignal som i en organi-sert molekylsammensetning, som en micelle, liposom, lamellær fase, tynnlag, lipiddobbellag, liposom vesikkel, omvendt micelle, mikroemulsjon, mikrogel, latex, membran eller polymeroverflate og i et hydrofobt miljø som det dannet av en kjemisk luminescens forbedrer, f.eks. BDMQ, kan gi sterke, forsterkede nivåer av lysemisjon og danner derved høye bak-grunnssignaler og senker klart det dynamiske området for signalet som er resultat av enzymatisk hydrolyse av AMPPD.

I samsvar med de ovenfor beskrevne observasjoner er det postulert de følgende mekanismer.

I nærvær av forbedringspolymerer som BDMQ:

1. Enzymatisk vei (AP til stede):

2. Termisk vei (i fravær av AP):

1) "CL" representerer den kjemiske luminescensen.

2) AMPPD i vandig bufret oppløsning inneholder en mindre mengde defosforylert, hydroksylert 1,2-dioksetan ("AMPHD" ). Hvis oppløsningens pH er tilstrekkelig høy (over ca. 9,5), kan det defosforylerte dioksetanet være til stede i den anioniske tilstanden som

AMP<e>D.

3) "CLi" og "CL2" representerer den kjemiske bakgrunns-luminescensen. 4) "A<1*>" representerer adamantanon i den eksiterte energitilstand.

Selv i fravær av forbedrende polymer, kan AMPPD være til stede i vandig oppløsning som et aggregat:

3. Enzymatisk vei: 4. Termisk og hydrolytisk vei:

I mekanismen over er n>>>m; n og m er en funksjon av nærværet eller fraværet av forbedrende polymer og AMPPD konsentrasjon.

Den eksiterte tilstanden til adamantanon-enheten i aggregert form (n eller m > 1) kan gi høyere utbytte avsignalemisjon, spesielt hvis den er "stabilisert" for å sende ut mer lys som f.eks. ved nærvær av kjemisk luminescensforbedrer som BDMQ, enn hva som skjer fra det eksiterte energinivå i ikke-aggregert adamantanon. Dette skyldes muligens at den første har lavere singlettiIstander, lavere nivåer av intersystem-krysninger eller saktere intersystemkryssinger enn den sistnevnte, eller andre hittil ukjente faktorer. Siden luminometeret vanligvis er utformet for å detektere alle emitterte fotoner uavhengig av deres energi eller bølge-lengde, blir både den kjemiske luminescensen ved 415 nm og 477 nm detektert som bagrunnsstøyemisjoner. Tilsvarende når det ble brukt fotografisk eller røntgenfilm for å registrere kjemisk luminescens, kan ingen enkel distriminering mellom emisjoner med forskjellig bølgelengde bli gjort, og følsom-heten av deteksjonen er dermed begrenset av bakgrunnsstøyen.

Til sist kan den observerte aggregeringen av AMPP under de beskrevne forhold skyldes AMPP's amfofile natur eller dets fenolatanion, og lignende molekyler:

Det er et mål for denne oppfinnelsen å redusere den tiden som er nødvendig for å gjennomføre en analyse og spesielt bioanalyser i hvilke enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner blir brukt som rapporterende molekyler.

Det er således et mål for oppfinnelsen å gi nye og forbedrede enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner som når de blir brukt som reportermolekyler i analyser og spesielt bioanalyser, reduserer den nødvendige tiden for å fullføre analysen.

Et videre mål med oppfinnelsen er å gi nye og forbedrede enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 1,2-dioksetaner for bruk som substrater for enzymbasert analyse og spesielt bioanalyser, som gir et forbedret signal til støyforhold og således i å forbedre deteksjonsnivået, og som gjør det mulig å redusere tiden som er nødvendig for å gjennomføre en analyse. Dette mål er oppnådd ved en enzymatisk spaltbar kjemisk luminescerende 1,2-dioksetanforbindelse i stand til å produsere lysenergi under dekomponering som hovedsakelig er stabil ved romtemperatur før en binding med hvilken en enzymatisk spaltbar labil substituent er bundet, blir spaltet med hensikt, kjennetegnet ved at den har følgende formel:

hvor:

Z er en fosfat- eller en galaktosldgruppe,

X er halogen, C-^^-alkoksy eller hydroksy.

Et videre mål ved oppfinnelsen er å gi nye intermediater som er nyttige ved fremstillingen av disse forbedrede enzymatisk spaltbare 1,2-dioksetanene.

Dette mål er oppnådd ved en forbindelse kjennetegnet ved at den er dinatrium 3-(metoksy-5-hydroksytricyklo[3.3.1.I<3>,7^-dec-2-ylidenmetyl)fenylfosfat.

Disse og andre mål så vel som naturen, rammene og bruken for denne oppfinnelsen vil være tydelig for dem som har kunnskaper innen teknikken fra den følgende beskrivelsen og vedlagte krav.

Foreliggende oppfinnelse gir en ny klasse stabile, enzymatisk spaltbare kjemisk luminescerende 3-(substituerte adamant-2'-yliden)-l,2-dioksetan-forbindelser som er i stand til å reagere i vandig medium, for eksempel i en prøve av biologisk væske i oppløsning eller en fast overflate, for eksempel en membranoverflate som en nylonmembran, med et enzym eller enzymmodifisert bindingspar for å frigi optisk detekterbar energi.

I vandig medium muliggjør disse modifiserte adamantyliden-dioksetan analyser i hvilke de blir brukt som rapporterende molekyler å bli gjennomført og med større følsomhet enn hittil mulig ved hjelp av AMPPD.

Uten å ønske å være bundet til noen bestemt mekanisme eller fremsatt teori for å forklare denne uventet overlege oppførselen, er det mulig at nærværet av substituenter av typen beskrevet her eller i adamantylidendelen hindrer dioks-etanmolekylene fra å pakkes effektivt og således hindre dem fra å danne "stabiliserte" organiserte sammensetninger, enten i form av miceller eller andre aggregerte tilstander. Enkelte av disse substituentene kan også' danne hydrogen-bindinger til andre stoffer i sitt vandige miljø, inkludert vannet, og hindrer dermed videre aggregat danning. Det er også mulig at elektriske og dipole effekter kan bidra til dette fenomenet som vist ved kortere VA og lavere bakgrunns-støy. Fig. 1-5 viser TSH, RL mot TSH for henholdsvis AMPPD og dets brom-, B-hydroksy-, A-hydroksy- og kloradaroant-2'-ylidenana-loger, fremstilt som beskrevet i eksempel XII under. Fig. 6-10 sammenligner den totale luminescensemisjon oppnådd fra AMPPD og dets A-hydroksy-, B-hydroksy-, klor- og brom-adamant-2'-ylidenanaloger, oppnådd som beskrevet i eksempel XIII under. Fig. 11 viser den forbedrede kjemisk luminescerende intensitet oppnådd ved hjelp av kloramadant-2'-yliden-analog av AMPPD sammenlignet med AMPPD selv som rapporterende molekyl i en nukleinsyreanalyse; se eksempel XIV under. Fig. 12 viser kinetikken til lysemisjonen oppnådd ved hjelp av kloramadant-2'-ylidenanalogen av AMPPD og AMPPD selv som rapporterende molekyler i en nukleinsyreanalyse; se eksempel XVI under. Fig. 13 er doseresponskurven ved 5 min. for alkalisk fosfataseoppløsning med kloramadant-2'-ylidenanalogen av AMPPD pins poly[vinyl(benzyldimetylammoniumklorid)) ("BDMQ"), sammenlignet med doseresponskurven ved 5 min. for AMPPD selv pluss BDMQ; se eksempel XIX under. Fig. 14 er doseresponskurvene ved 20 min. for de samme stoffene som kurvene vist i fig. 13. Fig. 15 er doseresponskurven ved 5 min. for alkalisk fosfataseoppløsning med kloradamant-2'-ylidenanalogen av AMPPD pluss BDMQ-fluorescein ("emerald"), sammenlignet med doseresponskurven ved 5 min. for AMPPD selv pluss emerald; se igjen eksempel XIX under. Fig. 16 er doseresponskurvene ved 20 min. på de samme stoffene hvis doseresponskurver er vist i fig. 15. Fig. 17 er et TPA-sekvensbilde, fremstilt som beskrevet i eksempel XX under ved hjelp av (1) AMPPD og (2) AMPPD 's kloradamant-2'-ylidenanalog. Fig. 18 viser signalene oppnådd som beskrevet i eksempel XXII ved hjelp av (1) AMPPD og (2) substituerte analoger ifølge oppf innelsen. Fig. 19 er et plott av de kjemiske luminescenssignalene oppnådd ifølge eksempel XXVII ved hjelp av (1) AMPPD og (2) Cl-AMPPD. Fig. 20 viser eksponeringen oppnådd ifølge eksempel XXIX for deteksjonen av pBR322 plasmid DNA, ved hjelp av både (1) AMPPD og (2) Cl-AMPPD. Fig. 21 viser eksponeringer for deteksjon av pBR322 ifølge eksempel XXX ved hjelp av (1) AMPPD, (2) Cl-AMPPD og (3) Br-AMPPD. Fig. 22 er en grafisk illustrasjon av kjemisk luminescerende signaler oppnådd ifølge eksempel (XXXI plottet som en funksjon av tid både for (1) AMPPD og (2) Cl-AMPPD. Fig. 23 og 30 viser eksponeringene oppnådd ifølge eksemplene XXXII og XXXIV for deteksjon av humant transferrin for AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD. Fig. 24 viser en sammenligning i signalene oppnådd ifølge eksempel XXXV og sammenligner AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD og LumiPhos 530. Fig. 25 og 26 sammenligner bilder oppnådd iføge eksempel XXXVI ved hjelp av AMPPD og Cl-AMPPD. Fig. 27 og 28 viser eksponeringer oppnådd ifølge eksemplene XXXVIII og XXXIX og sammenligner eksponeringer oppnådd ved hjelp av AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD. Fig. 29 viser kjemisk luminescensdeteksjon av humant transferin ifølge eksempel 40 og sammenligner AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD.

En foretrukken enzymatisk avspaltbar gruppe Z, er en fosfatgruppe, spesielt en fosfatestergruppe representert ved den generelle formel:

hvor M<+>representerer et kation som et alkalimetall, f.eks. natrium eller kalium, ammonium eller C^- Cj alkyl, aralkyl eller aromatisk kvaternært ammoniumkation, N(Ry)+4, i hvilken hver av R7kan være alkyl, f.eks. metyl eller etyl, aralkyl,

f.eks. benzyl eller danne deler av et heterocyklisk ring-system, f.eks. pyridin. Dinatriumsaltet er spesielt foretrukket. Slike fosfatestergrupper kan bli spaltet ved hjelp av et enzym som alkalisk fosfatase for å gi oksygen-anionsubstituerte grupper som så vil destabilisere dioksetanet med avrivning av dets oksygen-oksygenbinding for å produsere lys. De kvaternaere ammoniumkat ioner i slike fosfatestergrupper kan også bli forbundet gjennom en av sine kvaternaere grupper til et polymerskjelett, nemlig:

hvor n er større enn 1, eller kan være deler av et poly-kvaternært ammoniumsalt, f.eks. en ionenpolymer.

En annen foretrukken enzymatisk avspaltbar gruppe Z, er e-D-galaktocidgruppen, som kan bli spaltet med enzymet p-D-galaktosidase for å gi den konjugerte syren av dioksetan-fenolat, som blir kjemisk luminescerende under trykk.

PCT-søknad W088/00695 beskriver enzymatisk spaltbare 1,2-dioksetaner som er substituert ved 3-karbonatomet ved definert substituent "T-V" og ved 4-karbonatomet med definerte substituenter "X" og "Y-Z". Denne publiserte søknaden beskriver også på side 3, linjene 6-12, at:

I foretrukne utførelser omfatter en eller

flere av gruppene T, X eller Y videre en oppløsende substituent, f.eks. karboksyl-

syre, sulfonsyre eller kvaternaere amino-

salter; gruppen T i dioksetanet er en polycykloalkylgruppe, helst adamantyl;

den enzymspaltbare gruppen omfatter fosfat; og enzymet utviser fosfatase-aktivitet,

på side 22, linje 33 til side 23, linje 6 skrives følgende: For eksempel kan den enzymspaltbare gruppen Z være bundet til gruppe X på dioksetanet istedenfor gruppe Y.' Det spesifikke affinitetsstoffet kan bli bundet til dioksetan gjennom gruppene X, Y eller T (foretrukket gruppe X), istedenfor enzymet. I dette tilfelle, er gruppen til hvilken det spesifikke affinitetsstoffet er bundet, gitt ved f.eks. en karboksylsyre, amino eller maleimidsubstituent for å bidra i bindingen,

og på side 23, linjene 11-21 beskrives at:

Gruppen X, Y eller T opå dioksetanet kan

være bundet til en polymeriserbar gruppe,

f.eks. en vinylgruppe, til hvilken den kan bli pulverisert for å danne en homopolymer eller kopolymer.

Gruppene X, Y eller T til dioksetanet kan

være bundet til f.eks. membraner, filmer,

kuler eller polymerer for bruk i immuno-

eller nukleinsyreanalyser. Disse gruppene er gitt ved f.eks. karboksyl-

syre, amino eller maleimidsubstituenter for å bhjelpe binding.

Gruppene X, Y eller T på dioksetanet kan inneholdende substituenter som forbedrer kinetikken ved den enzymatiske dioksetan-degraderingen, f.eks. elektronrike deler (f.eks. metoksy).

Gruppene Y og T på dioksetanet så vel som

gruppen X kan inneholde oppløsende substituenter.

Problemet som er løst ved 3-substituert adamant-2'-yliden) 1,2-dioksetan-forbindelsene beskrevet og gjort krav på

her, er ikke adressert i denne publiserte PCT-søknaden. Disse forbindelsene er i

seg selv ikke beskrevet i denne eller andre referanser.

Den totale syntesen av disse 3-substituerte amadant-2'-yliden )-l,2-dioksetan kan også bli utført ved hjelp av fremgangsmåter som beskrevet i den ovenfor nevnte søknaden fra Bronstein og Edwards og fra Edwards et al. i US-søknad 279.176. Således kan f.eks. 1,2-dioksetanene som kommer innenfor rammen av formel I over hvor X representerer en hydroksylgruppe, kan bli syntetisert ifølge fremgangsmåten beskrevet i US-søknad 279.176 ved en reaksjonsrekke som skjematisk kan bli illustrert som følger: Som spesielt eksemplifisert under kan 0 = £ - ORg startmaterialet bringes i reaksjon med et ortoformat som trimetylortoformat, metanol og p-toluensulfonsyre for å gi mellomproduktet : som når det bringes i reaksjon med (RgO^P og Lewis-syre, gir fosfonatester-mellomproduktet:

I den foregående reaksjonsrekkefølgen representerer Rg en lav alkylgruppe, f.eks. metyl, etyl eller butyl. Rg representerer en acylgruppe inneholdende fra 2 til ca. 14 karbon-atomer, som acetyl, propionyl, mesitoyl eller pivaloyl, Q representerer et halogen, f.eks. klor eller brom eller ORg, og M representerer uavhengig av hverandre et proton, metallkation, f.eks. Na<+>eller K<+>eller et ammonium, substituert ammonium, kvaternært ammonium eller (H<+>) pyridin-kation. Tiolatspaltingen som beskrevet av Edwards i US-sknad 140.197, kan bli brukt i stedet for basespaltingen av ORg i gruppen i trinn 5 i reaksjonsfølgen illustrert over, i hvilket tilfelle Rg kan være laverealkyl, laverealkenyl eller aralkylgruppe, f.eks. metyl, allyl eller benzyl. Produktet av base eller tiolatspaltingen kan ha i stedet for Rg, hydrogen eller et alkalimetallkation, f.eks. litium, natrium eller kalium.

Mellomproduktene representert over med formelen:

hvor X er annet enn hydrogen, er kjent forbindelser eller kan enkelt bli syntetisert fra kjente startmaterialer ved hjelp av i teknikken anerkjente fremgangsmåter. For eksempel i tilfelle ved monosubstituert adamantan-2-onene: -5-hydroksyadamant-2-on blir fremstilt som beskrevet av Geluk et al. i Synthesis, 374 (1972); -5-bromadamantan-2-on og 5-kloradamantan-2-on blir fremstilt som beskrevet av Geluk et al. i Tetrahedron, 24, 5369 (1968).

Enkle enhetsprosesser tillater omdannelsen av flere av de ovenfor nevnte X eller X<1>substituentene eller andre i tek nikken kjente til 5-X- eller 5-X<1->adamantan-2-oner hvor X eller X<1>kan være trialkylsilyloksy, iod eller cyanogrupper, Disse delene er stabile under de milde betingelsene brukt i trinn 4 i den foregående reaksjonssekvensen. For eksempel når 5-hydroksyadamantan-2-on blir kokt med tilbakeløp i 7 timer med 57% iodvannstoffsyre, blir 5-iodadamantan-2-on (smeltepunkt 73-76°C). 5-karboksyadamantan-2-on, fremstilt som beskrevet av Lantvoev, J. Obshch. Khim., 12, 2361 (1976) eller Le Noble et al., J. Org. Chem., 48, 1101 (1983), etter saponifisering av metylesteren, kan bli omdannet til 5-cyanoadamantan-2-on ved tretrinnsfremgangsmåten fra Tabushi et al., J. Org. Chem., 38, 3447 (1973), brukt for å oppnå den isomere l-cyanoadamantan-2-on gjennom et ketoamid som mellomprodukt. 5-trimetylsilyloksyadamantan-2-on (smp. 34-38°C), er nyttig som en beskyttet versjon av 5-hydroksy-adamantan-2-on, tillater bruk av kun en ekvivalent base i trinn 4 i den foregående reaksjonsrekkefølgen for å frem-stille den korresponderende enoleteren som så kan bli desilylert ved hjelp av standard fremgangsmåter.

Det vil bli forstått av en som er kjent innen teknikken, at andre grupper enn X ikke trenger å være statiske gjennom hele reaksjonsrekkefølgen, men kan bli omdannet med reaksjoner som er forenlige med andre strukturelle hensyn på et hvilket som helst trinn. For eksempel er det blitt oppdaget at når X er et klor eller et bromatom, er enoletermellomprodukter fremstilt i trinnene 4 og 5 i den foregående reaksjons-rekkefølgen gjenstand for å fremme solvolyse i nærvær av molart overskudd av dioler eller flytende ammoniakk i en bombe ved høy temperatur. Reaksjonshastigheten med dioler som etylenglykol eller propolylenglykol blir tilstrekkelig kun ved forhøyede temperaturer (105-120°C) i nærvær av en protonakseptor som kaliumkarbonat. Vanligvis er denne reaksjonen sakte, men ren og forhindrer bruk av sølv eller tungmetallsalter som ofte blir brukt for å stimulere hydroksyalkyleterdannelse. 3-(metoksy-5-(2-hydroksyetoksy)-tricyklo[3.3.1.1<3-7>]-dec-2-ylidenmetyl)fenol kan bli esterifisert med fri metylacetylklorid og trietylamin for å gi den korresponderende diesteren, som så kan bli selektivt spaltet ved hjelp av kaliumkarbonat i metanol for å gi fenolmonoesteren. Det følgende fosforyleringstrinnet omfatter samtidig p-eliminering og saponifisering av den hindrede esteren med natriummetoksyd i metanol, vil skaffe hydroksyetoksyenoleterfosfatet.

Reaksjonen med flytende ammoniakk i dioksan under trykk for å gi 3-(metoksy-5-aminotricyklo[3.3.1.I<3>»<7>]-dec-2-ylidenmetyl)-fenol fra den korresponderende 5-bromfofbindelsen, blir utført ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet av Hummelen, Dissertation University of Groningen, The Netherlands, s. 60

(1985). Mellomproduktacylering av den således oppnådde aminoenoleterfenolen ved hjelp av to ekvivalenter acetyl-klorid eller eddiksyre-maursyre-anhydrid og 4-dimetylaminopyridin som basen ved hjelp av fremgangsmåten til Gawronski et al., J. Am. Chem. Soc, 109, 6726 (1987) brukt for esteri-fisering av (5-hydroksyadamantyliden)etanol, vil gi formamido eller acetamidofenolesterne som selektivt kan bli saponifi-sert som beskrevet ovenfor og så fosforylert og fotooksygi-nert som beskrevet nedenfor.

Hvis en selektivt spaltbar pivaloyloksyarylenolester skal bli oppnådd i noen av reaksjonene som følger rett etter tilset-ningen av en enzymspaltbar gruppe som en fosfatestergruppe, vil det være enklere å unngå isoleringen av hydroksyarylenol-esteren. Dette kan bli oppnådd ved direkte deling av pivaloylesteren med en ekvivalent natriummetoksyd i metanol og isolere natriumaryloksydforbindelsene som er tørt faststoff ved fjerning av alle flyktige forbindelser ved slutten av reaksjonen. I så tilfelle vil trinn 6 i reaksjonen over bli utført ved hjelp av et forhåndsdannet salt i et tørt, polart aprotisk oppløsningsmiddel som dimetylformamid uten bruk av en Lewis-base og biproduktet som uorganisk salt vil bli fjernet i opparbeidingsfasen i trinn 7 eller trinn 8.

2-cyanoetylfosfatdiesterproduktet fra trinn 7 gjennomgår e-eliminering av fosfatmonoesteren i trinn S. I trinn 8 blir derivatene hvor X er klor eller brom, helst reagert med flyktig amin som ammoniakk eller med et oppløsningsmiddel-oppløselig organisk amin som "DBU" (1,8-diaza-bicyklo[5.4.0]undec-7-en) i et alkoholoppløsningsmiddel, f.eks. metanol. Bruken av ammoniakk ved atmosfærisk trykk eller over og ved omgivelsestemperatur er spesielt fordel-aktig siden baseoverskuddet enkelt blir fordampet under vakuum ved slutten av reaksjonen.

Oksydasjon av enoleterfosfatet i trinn 9 i foregående reaksjonsrekkefølge kan bli utført fotokjemisk, som vist ved reaksjonen med singlett oksygen (^C^) * et halogenert oppløsningsmiddel, f.eks. et halogenert hydrokarbon som kloroform som også kan inneholde et medoppløsningsmiddel, f.eks. en laverealkohol som metanol. Singlett oksygen kan bli generert ved hjelp av en fotosensibilisator som en polymerbundet Rose Bengal (Polysciences, Inc.), metylenblått, eller 5, 10, 15, 20-tetrafenyl-21H, 23H-forfin ("TPP").

Alternativt kan rå 2-cyanoetylfosfatdiesteren oppnådd i trinn 7 i foregående reaksjonsrekkefølge bli oksydert med singlett oksygen til sine 1,2-dioksetanmotparter. Påfølgende reaksjoner med natriummetoksyd i metanol ved romtemperatur fulgt ved vandig opparbeiding og preparativ revers fase høytrykks væskekromatografi, gir det rene 1,2-dioksetanfosfatmonoester-saltet som blandinger av deres syn- og antiisomerer. Kjemiske metoder for 1,2-dioksetandannelse, omfattende de som bruker trietylsilylhydrotrioksyd, fosfatozonider eller triarylaminradikal-kationmedierte kan et elektrons oksydasjon i nærvær av triplett oksygen også bli brukt.

Denne oppfinnelsen er som indikert over, også rettet mot bruk av dets kjemisk luminescerende, enzymatisk spaltbare substituerte 1,2-dioksetaner i teknisk kjente analyser, inkludert analyser for detektering av enzymer i prøver, i sett for bruk ved slike prøver og likeledes bruksområder og midler for å oppnå slik bruk.

For eksempel, ved bruk av denne oppfinnelsen for å detektere et enzym i en prøve, bringes prøven i kontakt med et dioksetan som bærer en gruppe som er i stand til å bli spaltet av enzymet som skal bli oppdaget. Enxymet spalter den dioksetanenzym-spaltbare gruppen for å danne en negativt ladet substituent (f.eks. et oksygenanion) bundet til dioksetanet. Denne negativt ladede substituenten destabili-serer deretter dioksanet og forårsaker dekomponering av dioksetanet for å gi en fluorescerende kromofongruppe som avgir lysenergi. Det er denne kromoforgruppen som blir detektert som en indikasjon på nærværet av enzymet. Ved måling av intensiteten av luminescensen, kan konsentrasjonen av enzymet i prøven også bli bestemt.

Mange forskjellige andre analyser som bruker visuelt detekterbare metoder for å bestemme nærværet eller konsentrasjonen av et bestemt stoff i en prøve eksisterer. De ovenfor beskrevne dioksaner kan bli brukt i en hvilken som helst av disse analysene. Eksempler på slike analyser omfatter imunoanalyser for å detektere antistoffer eller anti-gener, f.eks. å- eller e-hCG; enzymanalyser; kjemiske analyser for å detektere f.eks. kalium eller natriumioner; og nukleinsyreanalyser for å detektere f.eks. virus (f.eks. ETLV III eller cytomegalovirus eller bakterier (f.eks. E. coli) og visse cellefunksjoner (f.eks. reseptorbindende seter).

Når det detekterbare stoffet er et antistoff, antigen eller nukleinsyre, er enzymet som er i stand til å spalte den enzymspaltbare gruppen på dioksanet helst bundet til et stoff som har en spesifikk affinitet for det detekterbare stoffet (f.eks. et stoff som spesifikt binder seg til det detekterbare stoffet), f.eks. et antigen, et antistoff eller nukleinsyreprobe. Konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. karboimidkobling, blir brukt for å binde enzymet til stoffet med spesifikk affinitet; bindingen bør helst være en amidbinding.

Vanligvis blir analysene utført som følger: En prøve mistenkt for å inneholde et detekterbart stoff blir bragt i kontakt med en bufret oppløsning inneholdende et enzym bundet til et stoff som har spesifikk affinitet for det detekterbare stoffet. Den resulterende oppløsningen ble inkubert for å tillate det detekterbare stoffet å binde seg til delen med spesifikk affinitet på spesifikk affinitetsenzym-forbindel-sen. Overskudd av spesifikk affinitets-enzymforbindelse ble så vasket bort, og dioksetanet av en gruppe som er spaltbar av enzymdelen av spesifikk affinitets-enzymforbindelsen blir tilsatt. Enzymet spalter den enzymspaltbare gruppen og forårsaker dioksanet å dekomponere til to karbonylforbindel-ser (f.eks. en ester, et keton eller et aldehyd). Kromoforen til hvilken den enzymspaltbare gruppen har vært bundet blir således eksitert og luminiscerer. Luminescensen blir detektert (ved hjelp av f.eks. en kuvette eller lysfølsom film i et kameraluminometer, eller fotomultiplikatorrør), som en indikasjon på nærværet av det detekterbare stoffet i prøven. Luminescensintensiteten blir målt for å avgjøre konsentrasjon av stoffet.

Eksempler på spesifikk analyse følger.

A. Analyse for humant IgG

pn mikrotiterplate med 96 brønner blir dekket med antihuman IgG fra sau (F(ab )g-fragmentspesifikk). En serumprøve inneholdende humant IgG ble tilsatt brønnene, og brønnene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur.

Etter inkubasjonstiden blir serumprøvene fjernet fra brønnene, og brønnene ble vasket 4 ganger med vandig bufret oppløsning inneholdende 0,15M NaCl, 0,1 M fosfat og 0, 1% bovinserumalbumin (pH 7,4).

Alkalisk fosfatase bundet til antihuman-IgG ble tilsatt hver brønn, og brønnene ble inkubert i 1 time. Brønnene ble så vasket 4 ganger med den ovennevnte bufferoppløsning, og en bufferoppløsning av en fosfatinneholdende dioksetan ifølge oppfinnelsen ble tilsatt. Den resulterende lumenescens for-årsaket ved enzymatisk gradering av dioksetanet blir detektert i et luminometer eller med fotografisk film i et kameraluminometer.

B. Analyse for hCG

Anti-a-hCG fra hare ble absorbert på en nylon trådduks-membran. En prøveoppløsning inneholdende hCG, f.eks. urin fra en gravid kvinne, blir suget mellom membranen, hvorpå membranen ble vasket med 1 ml bufferoppløsning inneholdende 0,15 M NaCl, 0,01 M fosfat og 0, 1% bovint serumalbumin (pH 7.4 ).

Alkalisk fosfatase-merket anti-p-hCG ble tilsatt membranen, og membranen ble vasket igjen med 2 ml av den ovennevnte oppløsning. Membranen ble så plassert i kuvetten i et luminometer eller i et kameraluminometer og bragt i kontakt med en fosfatinneholdende dioksetan ifølge oppfinnelsen. Den resulterende luminescensen fra enzymatisk degradering av dioksetanet blir så detektert.

C. Analyse for alkalisk fosfatase i serum

2,7 ml av en vandig bufret oppløsning inneholdende 0,8 M 2-metylaminopropanol blir plassert i et 12 x 75 mm pyrex testrør og 0,1 ml serumprøve inneholdende alkalisk fosfatase blir tilsatt. Oppløsningen blir så ekvilibrert til 30°C.

0,2 ml av et fosfatinneholdende dioksetan ifølge oppfinnelsen blir tilsatt, og testrøret blir øyeblikkelig plassert i et luminometer for å måle den resulterende luminescensen. Nivået av lysemisjon vil være proporsjonal til hurtigheten av alkalisk fosfatase-aktivitet.

D. Nukleinsvre- hybridiseringsanalyse

En prøve cerebrospinalvæske (CSF) mistenkt for å inneholde cytomegalovirus ble samlet og plassert på eri membran, f.eks. en nylon- eller nitrocellulose-membran. Prøven ble så kjemisk behandlet med urea eller guanidinisotiocyanat for å ødelegge celleveggen og degradere alle cellekomponenter fortsett fra det virale DNA. De således fremstilte trådene av viralt DNA blir separert og festet til nitrocellulose-filtere. En DNA-probe spesifikk for det virale DNA og merket med alkalisk fosfatase blir så påført filteret og problen hybriserer med de komplementære virale DNA-tråder. Etter hybridisering blir filteret vasket med vandig bufret oppløsning inneholdende 0,2 M NaCl og 0,1 mM Tris-HCl (pH = 8,10) for å fjerne overskuddet av probemolekyler. En fosfatinneholdende dioksetan ifølge oppfinnelsen blir tilsatt, og den resulterende luminescens fra den enzymatiske degraderin-gen av dioksetan blir målt i et luminometer eller detektert med fotografisk film.

E. Analyse for galaktosidase

I analysen beskrevet over og i de følgende arbeidseksemplene kan dioksetaner inneholdende henholdsvis a- eller p-galaktosidase-spaltbare a-D- eller e-D-galaktosid (galaktopyranosid) grupper, bli tilsatt, og den resulterende luminescensen fra den enzymatiske spaltingen av sukkerdelen av kromoforen målt i et luminometer eller detektert ved fotografisk film.

F. Elektroforese

Elektroforese tillater en å separere sammensatte blandinger av proteiner og nukleinsyrer ifølge deres molekylvekt og struktur på en gel i et elektrisk felt. Denne teknikken er også nyttig for å skille fragmenter av proteiner etter pro-teolyse eller fragmenter av nukleinsyrer etter klipping med restriksjonsendonukleaser (som i DNA-sekvensering). Etter elektroforetisk adskillelse av stoffene i gelen eller etter overføring av de separerte bestanddelene fra en gel til en membran blir bindingene undersøkt med et enzym bundet til en ligand. F.eks. blir peptidfragmenter undersøkt med et antistoff kovalent bundet til alkalisk fosfatase. Som et annet eksempel er ved DNA-sekvensering alkalisk fosfatase, avidinbundet til en biotinylert nukleotidbase. Deretter blir en AMPPD-analog ifølge oppfinnelsen tilsatt gelen eller membranfilteret. Etter kort inkubasjon, blir lys utstrålet som et resultat av enzymatisk aktivering av dioksetanet for å danne de emitterende stoffene. Luminescensen blir detektert enten ved røntgen eller fotografisk film eller scannet med luminometer. Flerkanals-analyse forbedrer videre prosessen ved å tillate at den kan analyse for mer enn ett fragment samtidig.

G. Fasttilstands- analvser

I fasttilstands-analyser er det ønskelig å blokkere ikke-spesifikk binding til matrisen ved forhåndsbehandling av ikke-spesifikke bindingssteder ved ikke-spesifikke proteiner som bovint serumalbumin (BSA) eller gelatin. Det er blitt funnet at kommersielle fremstillinger av BSA inneholder små mengder stoffer som utviser fosfatase-aktivitet som vil gi uønsket kjemisk luminescens som bakgrunn fra AMPPD. Det er også blitt funnet at enkelte vannoppløselige syntetiske makromolekylære stoffer er effektive blokkerere av ikke- spesifikk binding i fast tilstandsanalyser ved bruk av dioksetaner. Foretrukket blant slike stoffer er vann-oppløselige polymere kvaternaere ammoniumsal ter som BDMQ, poly(vinylbenzyltrimetylammoniumklorid) (TMQ), og poly(vinyl-benzyltributylammoniumklorid) (TBQ). Andre slike stoffer er beskrevet i den tidligere nevnte US-søknad 203.263 fra Voyta et al.

H. Analyse fra nukleotidase

En analyse for enzymet ATPase ble utført i to trinn. I første trinn bringes enzymet reaksjon ved sin optimale pH (typisk pH 7,4) med et substrat som består av ATP kovalent bundet via en terminal fosfoester-binding til en kromofor-substituert 1,2-dioksetan for å gi en fosforyl-kromofor-substituert 1,2-dioksetan. I det andre trinnet blir produktet fra det første trinnet dekomponert ved tilsetning av syre for å bringe pH til under 6, helst til pH 2 til 4, og det resulterende lys blir målt på et luminometer eller detektert med fotografisk film. I en lignende totrinns fremgangsmåte blir ADPase analysert ved hjelp av substratet og et ADP-derivat av en kromofor-substituert 1,2-dioksetan ifølge oppfinnelsen og 5'-nukleotidase analysert ved hjelp av substratet og adenylsyrederivatet av en kromofor-substituert I, 2-dioksetan ifølge oppfinnelsen. Det andre trinnet kan også bli utført ved tilsetting av enzymet alkalisk fosfatase for å dekomponere den fosforyl-kromofor-substituerte 1,2-dioksetanen.

I. Nukleinsyre- sekvensering

DNA og RNA fragmenter fremstilt ved sekvenseringsprotokoller kan enkelt bli detektert etter elektroforetisk separasjon ved hjelp av kjemisk lumenescerende 1,2-dioksetaner ifølge oppf innelsen.

DNA-sekvensering kan bli utført ved en dideoksykjede-termineringsfremgangsmåte (Sanger, F. et al., Proe. Nat. Acad. Sei. (USA), 74:5463 (1977)). Kort sagt, for hver av de fire sekvenseringsreaksjonene blir enkeltstrenget sjablong-DNA blandet med dideoksynukleotider og biotinylnert enkelt-strengs-DNA. Etter herding blir Klenow-enzym og deoksy-adenosintrifosfat inkubert med hver av de fire sekvenserings-reaksjonsblandingene, så blir jage-deoksynukleotidtrifosfat tilsatt og inkubasjonen fortsatt.

Deretter blir DNA-fragmentene i reaksjonsblandingen separert ved polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE). Fragmentene blir overført til membranen, helst en nylonmembran hvor fragmentene tverrbundet til membranen ved eksponering av ultrafiolett lys, helst med kort bølgelengde.

Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter med en polymer, f.eks. heparin, kasein eller serumalbumin, blir DNA-fragmentene på membranen bragt i kontakt med avidin eller streptavidin kovalent bundet til et enzym spesifikt for den enzymspaltbare gruppen på det spesielle 1,2-dioksetan-substratet ifølge oppfinnelsen som blir brukt. Ettersom avidin og streptavidin binder seg villig til biotin, vil de biotinylerte DNA-fragmentene nå bli merket med et enzym. F.eks. når det kjemisk luminescerende substratet er dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-klor) tr icyklo[3 . 3 .1.1. 3 » 7] dekan] -4-yl )f enylfosfat-dioksetansalt (Cl-AMPPD), avidin eller være streptavidin være være konjugert til en fosfatase. Tilsvarende når det kjemisk luminescerende substratet er dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-klor)tricyklo[3.3.1.I<3>»<7>]dekan]-4-yl)fenyl p-D-galaktopyranose (Cl-AMPGD), blir avidin eller streptavidin konjugert med galaktosidase.

Etter genereringen av luminescens ved kontakt mellom komplekset av DNA fragment-biotin-avidin (eller streptavi din)-enzym med den passende 1,2-dioksetanen med alkaliske pH-verdier, f.eks. over ca. pH 8,5, vil DNA-f ragmentene vise på lysfølsom film, f.eks. røntgen eller øyeblikkelig film, eller i et fotoelektrisk luminometerinstrument.

Deteksjonsmetoden beskrevet over kan også bli brukt i forbindelse med genom-DNA-sekvenseringsprotokollen til Church et al. [Church, G.M. et al., Proe. Nat. Acad. Sei (USA), 81:1991 (1984)]. Etter overføring av kjemisk spaltet og elektroforetisk separert DNA [Maxam, A.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei (USA), 74:560 (1977)] til en membran, helst en nylonmembran, og tverrbinding av stigene til membranen ved hjelp av ultrafiolett lys, kan spesifikke DNA-sekvenser bli oppdaget ved sekvensiell tilsetting av: biotinylerte oligonukleotider som hybridiseringsprober; avidin eller streptavidin kovalent bundet til et enzym spesifikt for et enzymspaltbart kjemisk luminescerende 1,2-dioksetan ifølge oppfinnelsen; og den passende 1,2-dioksetan. Bilder av sekvensstiger (fremstilt ved PAGE) kan bli oppnådd som beskrevet over.

Seriell undersøkelse av sekvensstiger kan bli utført ved først å strippe den hybridiserte probe og det kjemisk luminescerende materiale fra en membran fra å bringe membranen i kontakt med oppvarmet oppløsning av en detergent, f.eks. fra ca. 0,5 til ca. 556 natriumdodecylsulfat (SDS) i vann fra ca. 80°C til ca. 90°C, avkjøling til ca. 50°C til ca. 70°C, hybridisering av de nå nakne DNA-fragmentene med en annen biotinylert oligonukleotidprobe for å gi en annen sekvens og generere et kjemisk luminescensbilde som beskrevet over.

Tilsvarende detekteringsmetoder kan bli benyttet for RNA-fragmenter generert ved RNA-sekvenseringsmetoder.

For at de som har kunnskaper innen teknikken bedre kan forstå oppfinnelsen, er de følgende eksempler fremlagt. Alle deler og prosentdeler er vekt av volum, bortsett fra TLC-oppløs-ningsmiddelblandinger som er volum av volum uten at annet er sagt.

1-H NMR-dataene som er gitt de enkelte av disse eksemplene for enoleter-mellomprodukter benytter merket-symbolet ( ' ) for å vise aromatiske protoner, mens ikke-merkede tall refererer i alle tilfeller, til substituent adamant-2'-yliden-ring-posisjoner, således:

Eksempel I

200 g (1,64 mol) 3-hydroksybenzaldehyd og 270 ml (1,93 mol) trietylamin ble tilsatt en flaske inneholdende 1 liter metylenklorid i et isbad. Den resulterende bruke oppløs-ningen ble mekanisk omrørt, og 212 ml (172 mol) trimetyl-acetylklorid ble tilsatt i en svak strøm fra et tilsetnings-rør i løpet av 15 min. Den resulterende oppsiemmingen ble omrørt i ytterligere 15 min., isbadet ble fjernet, og reaksjonen ble så tillatt å fortsette for ytterligere 2 timer. TLC (K5F; 25% aceton-heksaner) viste fravær av startmateriale og et enkelt høyere Rf produkt. Reaksjonsblandingen ble overført til en separasjonstrakt og blandet med 250 ml IM saltsyre. Den organiske fasen ble så ekstrahert med vann (2 x 400 ml) og endelig tørket over natriumsulfat. Den tørkede oppløsning ble passert gjennom en silikagelplugg, roteringsfordampet og så pumpet under vakuum (1,0 mm Hg) for å gi 388 g grønnlig, brun olje: 3-pivaloyloksybenzaldehyd, som ble holdt under en argon atmosfære.

Eksempel II

400 mg p-toluensulfonsyre oppløst i 25 ml metanol ble tilsatt under omrøring, til 3-pivaloyloksy-benzaldehyd fra eksempel I. Trimetylortoformat (224 ml; 2,05 mol) ble så tilsatt dråpevis. Den lille varmeutviklingen dette resulterte i, ble tillatt å fortsette mens blandingen ble omrørt i 1 time. Et halv gram natriumbikarbonat ble tilsatt, og flasken ble plassert i rotasjonsfordamperen (badtemperatur 40°C) for å fjerne alle flyktige stoffer. Den resulterende oljen ble ledet gjennom en kort silikagelkolonne under nitrogentrykk for å gi en orangebrun olje som ble pumpet under vakuum (1,0 mm Hg) under omrøring for å gi 426 g rå 3-pivaloyloksy-benzaldehyd-dimetylacetal. Infrarød analyse avslørte ingen aldehydkarbonylabsorpsjon (1695 cm-<1>).

Eksempel III

Rå 3-pivaloyloksybenzaldehyd-dimetylacetal fra eksempel II ble oppløst i 1 liter emtylenklorid, nylig destillert fra P2O5under argonatmosfære i en 3 liters flaske. 347 ml (2,03 mol) dietylfosfitt ble straks tilsatt. Flasken var utstyrt med et innløpsadapter i veggen og avkjølt i is-acetonbad under svakt argontrykk. Bortrifluorideterat (249 ml; 2,03 mol) ble tilsatt i flere porsjoner med en injeksjonssprøyte under kraftig omrøring. Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt ved —55°C i 2 timer og så lagret i en fryser ved

—20°C over natten.

Flasken ble så oppvarmet ved romtemperatur, og dets innhold ble omrørt i 4 timer. Den orangebrune oppløsningen ble helt forsiktig inn i en kraftig omrørt oppslemming av 170 g natriumbikarbonat i 800 ml vann med en fart slik at kraftig skumming ble omgått. Etter kraftig omrøring av den tofasede blandingen i 1 time ble lagene separert i en separasjons trakt, og det vandige laget igjen ekstrahert med metylenklorid (2 x 250 ml). De sammenslåtte organiske ekstraktene ble tørket over natriumsulfat, konsentrert og vakuum-destillert for å gi 535 g dietyl-l-metoksy-l-(3-pivaloyl-oksyfenyl)metanfosfonat som en klar, lysegul olje (kokepunkt 158-161°C ved 0,25 mm Hg). Dette utgjorde et 91% utbytte for den totale prosedyren i eksemplene I-III.

^■H NMR (400 MHz; CDCC3): S 1,21 og 1,25 (6H, to t. 7Hz, 0C<H>2CH3); 3,37 (3H, s, ArCH0CH3); 3,80 (3H, 2, ArOCH3); 3,90-4,10 (4H, m, 0CH2CH3); 4,46 (1H, d, 15,6, Hz, ArCHPO); 6.85 (1H, m); 7,00 (2H, m); 7,26 (1H, m).

IR (ublandet): 2974, 1596, 1582, 1480, 1255 (P=0), 1098, 1050, 1020, 965 cm-<1>.

Eksempel IV

En oppløsning av diisopropylamin (11,6 ml, 82,8 mmol ) i 75 ml tetrahydrofuran ble avkjølt til -78°C i et tørris-acetonbad under argonatmosfære. 30 ml av en 2,5 M oppløsning av n-butyllitium i heksan (Aldrich, 75,0 mmol) ble tilsatt med en injeksjonssprøyte, og etter omrøring av den resulterende litiumdiisopropylamidoppløsningen i 20 ml, ble 13,47 g (37,6 mmol) dietyl-l-metoksy-l-(3-pivaloyloksyfenyl)metanfosfonat i 25 ml tetrahydrofuran tilsatt dråpevis fra en tilsetnings-trakt i løpet av 5 min. Den resulterende røde oppløsning ble omrørt ved lav temperatur for ytterligere 30 min. for å sikre fullstendig dannelse av fosfanatkarbanionet.

En oppløsning av 4,99 g (30, 1 mmol) 5-hydroksyadamantan-2-on i 25 ml tetrahydrofuran ble så tilsatt dråpevis. Den resulterende svakt uklare blandingen ble omrørt i 5 min. ved

—78°C og så sakte oppvarmet til romtemperatur over 40 min. Oppløsningen, som nå var orange i farve, ble kokt under

refluks i 90 min., avkjølt, fortynnet med 200 ml mettet natriumbikabonatoppløsning og ekstrahert med etylacetat (3 x 75 ml). De sammenslåtte organiske ekstraktene ble vasket med mettet natriumkloridoppløsning, raskt tørket over natriumsulfat og konsentrert for å gi 12,49 g av en orange gummi, en blanding av fenolenoleter og dens pivaloatester.

<!>h NMR (pivaloylester, 400 MHz, i CDC13: S 7,33 (1 H, H-5'), 7,12 (1 H, d, J = 7,7 Hz, ArH), 6,95-7,02 (2H, m, ArH), 3,43 (1 H, br. s, H-l), 3,28 (3H, s, OMe), 2,79 (1H, br. s, H-3), 2,23 (1 H, br. s, H-7), 1,59-1,87 (11 H, nr), 1,34 (9 H, s, C0C(CH3)3).

IR (i CHC13): 3590, 3442 (OH), 2924, 2848, 1742 (ester C = 0), 1665, 1602, 1578, 1426, 1274, 1152, 1118, 918 cm"<1>).

Denne blandingen ble tatt opp i 100 ml metanol og kokt under refluks i 3,5 timer i nærvær av 10,7 g vannfri kaliumkarbonat. Metanolen ble strippet av og resten partisjonert mellom vann og etylacetat. Det organiske laget ble vasket med mettet natriumkloridoppløsning og rotasjonsfordampet til en rest som ble rekrystallisert fra kloroformpetroleumseter for å gi 6,5 g 3-(metoksy-5-hydroksytricyklo[3.3.1.I<3>»<7>]dec-2-ylidenmetyl)fenol som et nesten hvitt faststoff (smeltepunkt 171-172°C). Ytterligere 0,80 g ble oppnådd fra den opphavelige væsken, noe som ha et over alt utbytte av fenolenolesteren på 70^ basert på 5-hydroksyadamantan-2-on.

% NMR (400 MHz, i CDC13): S 7,18 (1 H, dd, J =8,4, 7,7 Hz, H-5'), 6,75-6,88 (3 H, m, ArH), 6,36 (1 H, br. s, ArOH), 3,41 (1 H, br. s, H-l), 3,28 (3H, s, OMe), 2,79 (1 H, br. s, H-3), 2,22 (1 H, br. s, H-7), 1,56-1,98 (11 H. m).

IR (i CHC13): 3586, 3320 (0H), 3000, 2920, 2844, 1665, 1590, 1578, 1445, 1296, 1092, 885 cm-<1>.

HRMS beregnet for<C>18<H>2203(M<+>) 286.1573, funnet 286.1569.

Eksempel V

En oppløsning av 5,04 g (17,6 mmol) 3-(metoksy-5-hydroksy-tricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dec-2-ylidenmetyl)fenol i 35 ml tetrahydrofuran, fremstilt under argon, ble sammenblandet med 3,4 ml (24,6 mmol) trietylamin og avkjølt til 0°C i et isbad. 2-klor-2-okso-l,3,2-dioksafosfolan (1,95 ml,' 21,1 mmol) ble tilsatt dråpevis under omrøring. Etter 5 min. ble isbadet fjernet, og omrøringen fortsatt i 45 min. ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 30 ml vannfri dietyleter og filtrert under argon for å hindre fuktighet. Trietylaminhydrokloridet blir så vasket videre med 20 ml dietyleter, og filtratet blir konsentrert ved rotasjons-fordampning for å gi f osfattriesteren som en viskøs lys orange olje.

Triesteren, oppløst i 30 ml molekylsil tørket dimetylformamid under argon, ble bragt i reaksjon i 3,5 timer ved romtemperatur med 1,02 g (20,8 mmol) tørr natriumcyanid, som ble tilsatt alt så en gang under omrøring. Oppløsningsmiddel ble fjernet under vakuum (1,0 mm Hg) med oppvarming til 50°C. En prøve av den resulterende orangebrune resten viste, når den ble oppløst i vann og utsatt for revers fase analytisk kromatografi [0,1$ natriumbikarbonat (vann) - acetonitrilgradient] på en PLRP polystyrenkolonne (Polymer Laboratories), fullstendig reaksjon til mellomproduktet cyanoetyl-fosfatdiesternatriumsalt.

Resten ble så tatt opp i 35 ml metanol og behandlet dråpevis med 4,85 ml av en 4,37 M oppløsning (21,2 mmol) natriummetoksyd i metanol, med omrøring i 30 min. ved romtemperatur. Revers fase analytisk HPLC viste at e-eliminasjonen til fosfatmonoesteren var fullstendig. Oppløsningsmiddelet ble fjernet og resten støtt med 10% vann/aceton for å gi en fast gummi. Videre knusing med 3% vann/aceton ga en hardt, nesten hvitt faststoff som ble filtrert og tørket under vakuum (1,0 mm Hg) for å gi 8,35 g rå dinatrium-3-(metoksy-5-hydroksy-tricyklo[3.3.1.I3 »7]dec-2-ylidenmetyl )fenylfosfat, forurenset med uorganiske salter.

Revers fase preparativ HPLC ved hjelp av vann-acetonitrilgradient på en PLRP polystyrenkolonne (Polymer Laboratories) og lyofilisering av de rette fraksjonene ga 5,2 g ( 72%) av renset forbindelse som et hvitt, kornet faststoff som myknet ved 120°C og smeltet til en lys brun gummi ved 163-168°C.

<*>H NMR (400 MHz, i D20): S 7,17 (1 H, dd, J = 8,3, 7,4 Hz, H-5'), 7,05 (1 H, d, J = 8,3, Hz, ArH), 6,93 (1 H, br. s, H-2'), 6,86 (1 H, d, J = 7,4 Hz, ArH), 3,2 (3 H, s, OMe), 3,17 (1 H, br. s, H-l), 2,61 (1 H, br. s, H-3), 2,06 (1 H, br. s, H-7) 1,42-1,73 (10 H, m).

Elementanalyse viste at fosfatsaltet eksisterte som et dihydrat. Analytiske beregninger for CigH^Na^^P • 2H20 : C , 48,44, H, 5,65, P, 6,94. Funnet C, 48,37, H, 5,90, P 6,87.

Eksempel VI

En oppløsning av 0,8 g dinatrium-3-(metoksy-5-hydroksy-tricyklo[3.3.1.13»7]dec-2-ylidenmetyl )fenylfosfat i 96 ml 2556 vannfri metanol/kloroform inneholdende 5,35 x IO-<5>M metylenblått delt mellom tre glassrør. Hvert rør ble så avkjølt til 5°C i et vannbad og mettet oksygen ved å lede en strøm av gass gjennom oppløsningen. Etter 5 min., og under kontinuerlig gjennombobling av oksygen gjennom oppløsningen, ble rørene bestrålet med lys fra en kald 250 watt høytrykks-natriumdamplampe mens temperaturen ble holdt ved 5°C. Et 5 mil tykt stykke av Katon polyimidfilro (duPont) som var plassert mellom natrlumdamplampen og rørene, filtrerte bort uønsket ultrafiolett bestråling. Etter 20 min.s bestråling var oppløsningen blitt rosa. Revers fase analytisk HPLC [1,0& natriumbikarbonat (vann) - acetonitrilgradient) i en PLRP polystyrenkolonne (Polymer Laboratories) viste to produkttopper: en hurtigeluerende, bred topp (retensjonstid 3,79 min.) og en skarp senere eluerende topp )retensjonstid 5,77 min.). Forholdet mellom det tidlige eluerte produktet (A) i forhold til det sene eluerte produktet (B) var 1,3:1 i halve rørenes oppløsning.

Oppløsningene ble slått sammen og oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum (25,0 mm Eg) på isbad. Resten ble så oppløst i 70 ml vann og filtrert gjennom en 0,45 jjm nylonmembran. Revers fase preparativ HPLC (vann-acetonitrilgradient) separerte enkelt to produkter.

Sammenslåing av de flyktige preparative HPLC-fraksjonene, fulgt av analytisk HPLC, viste at de var homogene. Lyofilisering ga 0,32 g av et produkt (A) og 0,26 g av et annet (B) som ble vist ved % NMR å være isomere (syn og anti ) 1,2-dioksetaner, dvs. syn-dinatrium-3-(4-metoksyspiro-[l,2-dioksetan-3,2'-(5' -hydroksy )tricyklo [3 . 3 .1.13 » 7] dekan] -4-yl )fenylfosfat: og dets anti-isomer (anti-dinatrium-3-(4-metoksyspiro-[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-hydroksy ) tricyklo[3.3.1.13 »7]dekan] -4-yl)fenylfosfat:

Hver av disse isomerene produserte kjemisk' luminescens med unikt lys i forhold til tid og støyprofiler, ved spalting ved pH 10 i vandig "buffermedium med alkalisk fosfatase.

<!>h NMR (A-isomer, 400 MHz, i D20): S 6,98 - 7,6 (4H, m, ArH), 3,11 (3H, s. OMe), 2,97 (1H, br. s, H-l), 2,34 (1H, br. s, H-3), 1,79 (1H, br. s, H-7), 1,3-1,68 (8H, m), 1,01 (1H, d, J 13,5 Hz), 0,8 (1H, d, J = 13 Hz).

<1>H NMR (B-isomer, 400 MHz, i D20): 5 6,94-7,62 (4H, m, ArH), 3,09 (3H, s, OMe), 2,91 (1 H, br. s, H-l), 2,27 (1H, br. s, H-3), 1,84 (1H, br. s, H-7), 1,21-1,75 (8 H, m), 1,02 (1H, d, J = 12,8 Hz), 0,87 (1H, d. J = 12,8 Hz).

Elementanalysen viste at isomer B eksisterer som et dihydrat. Analytisk beregning for CigH2iNa20gP•2H20 (isomer B): C, 45,2, H, 5,27, P. 6,47. Funnet: C, 45,53, H, 5,35, P, 6,11.

Det var ikke mulig spesielt å bestemme hvilken av de to oppnådde isomerer som var synisomeren og hvilken som var antiisomeren på basis av<1>H NMR data.

Eksempel VII

Ved i hovedsak å følge fremgangsmåten i eksempel IV over, ble en oppløsning av 5,35 ml (38,2 mmol) diisopropylamin i 35 ml tetrahydrofuran avkjølt til -78°C i et isbad under argonatmosfære. 14 ml 2,5 M oppløsning av n-butyllitium i heksan (35,0 mmol) ble tilsatt ved injeksjonssprøyte og etter omrøring i 20 min. ble 10,86 g (30,3 mmol) dietyl-l-metoksy-l-(3-pivaloyloksyfenyl)metanfosfonat i 30 ml tetrahydrofuran tilsatt dråpevis over en periode på 10 min. Den resulterende orange oppløsning ble omrørt ved lav temperatur i 1 time, så blandet med en oppløsning av 5,21 g (22,75 mmol) 5-brom-adamantan-2-on i 20 ml tetrahydrofuran i løpet av 7 min. , under omrøring. Omrøringen ble fortsatt for ytterligere 10 min., hvorpå det kalde badet ble fjernet, og reaksjonsblandingen ble tillatt sakte å oppvarmes til romtemperatur i løpet av 1 time.

Oppløsningen ble så kokt under refluks i 1 time, avkjølt, fortynnet med 100 ml heksan og helt i en separasjonstrakt inneholdende mettet vandig natriumbikarbonatoppløsning og ekstrahert med 10$ etylacetat i heksan (3 x 50 ml).De sammenslåtte organiske ekstraktene ble vasket med en vandig 155é natriumkloridoppløsning, raskt tørket over natriumsulfat og konsentrert for å gi 11,62 g av en lys orange viskøs olje. Pluggfiltrering på en kort silikagelkolonne, eluert med 10% etylacetat i n-heksan, ga 11,0 g av en gulgrønn gummi.

XE NMR (pivaloylester, 400 MHz, i CDC13); S 7,34 (1H, t, J = 7,8 Hz, H-5'), 7,1 (1 H, d, J = 7,7 Hz, ArH), 6,95-7,02 (2 H, m, ArH), 3,39 (1H, br, s, H-l), 3,28 (3H, s, OMe), 2,74 (1H, br. s, H-3), 2,3222-2,51 (6 H, m, H-4, H-6, H-9), 2,17 (1 H, br. s, H-7 ), 1,67-1,92 (4H, m, H-8, H-10), 1,34 (9H, s, C0C(CH3)3).

IR (ublandet): 2924, 2850, 1745 (ester C=0), 1654, 1602, 1678, 1478, 1274, 1110, 1018, 808, 758 cm-<1>.

Denne gummien ble tatt opp i 30 ml metanol og kokt under refluks i to timer med 2,4 g vannfri natriumkarbonat. Metanolen ble så fjernet og resten delt mellom vann og 3056 etylacetat i heksan. Det organiske laget ble vasket med vandig mettet natriumkloridoppløsning, tørket over natriumsulfat og konsentert for å gi 9,32 g gul gummi. Denne gummien ble flash-kromatografert på en silikagel for å gi 7,06 g (8856 utbytte basert på 5-bromadamantan-2-on) av en svakt gul gummi som ikke kunne bli krystallisert. IR og NMR indikerte riktignok at det oppnådde produkt, [3.3.1.I<3>»<7>]dec-2-ylidenmetyl )fenol, var rent nok til å bli brukt for å fortsette fosforyleringsreaksjonen.

En prøve av den rene fenolforbindelsen ble oppnådd fra [3.3.1.1<3>'<7>]dec-2-ylidenmetyl]fenylacetat som følger: Den urene fenolforbindelsen (5,57 g; 15,95 mmol) ble oppløst i 30 ml molekylærsil tørket pyridin under en argonatmosfære. 50 mg 4-dimetylaminopyridin ble tilsatt som katalysator. Deretter ble 1,8 ml (19,15 mmol) eddiksyreanhydrid tilsatt m ed en sprøyte, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer.

Reaksjonsblandingen ble overført til en skilletrakt inneholdende 250 ml vandig mettet natriumbikarbonatoppløsning og ekstrahert med 1056 etylacetat i heksan (2 x 100 ml). De sammensatte ekstraktene ble vasket med vann, så hurtig tørket over natriumsulfat. Den tørkede oppløsning ble konsentrert på en rotasjonsfordamper og resten ble rekrystallisert fra n-heksan inneholdende noen få dråper etylacetat. De derved oppnådde nesten hvite faststoffer ble igjen rekrystallisert for å gi 5,21 g (83,556 utbytte) av acetatet, smp. 108-110°C.

HRMS beregnet for C20H23BrO3(M<+>) 390.0833, funnet 390.0831.

1H NMR (400 MHz, i CDC13): S 7,35 (1 H, dd, J = 8, 7,7 Hz, H-5'), 7,13 (1 H, dd, J = 7,7, 1 Hz, ArH), 7,03 (1H, dd, J = 8, 1 Hz, ArH), 6,99 (1 H, d, 1 Hz, H-2'), 3,39 (1H, br. s, H-l), 3,27 (3H, s. OMe), 2,75 (1H, br,, s, H-3), 2,32-2,51 (6 H, M,

H-4, H-6, H-9), 2,29 (3 H, s, OAc), 2,18 (1H, br. s, H-7), 1,69, 1,92 (4H, m, H-8, H-10).

IR (i CHC13): 3000, 2930, 2850, 1760 (ester C 0), 1660. 1602, 1577, 1368, 1192, 1095, 1070, 1016, 804 cm-<1>.

Behandling av det rekrystalliserte acetatet med kaliumkarbonat i metanol i 15 timer ved romtemperatur ga 3-(metoksy-5-bromtricyklo[3.3.1.I<3>'<7>]dec-2-ylidenmetyl]fenol, smp. 42-45°C, som et hvitt, sprøtt skum som ikke kunne bli rekrystallisert videre.

<X>H NMR (400 MHz, i CDCI3): S 7,21 (1 H, t, J = 7,2 Hz, H-5'), 6,73-6,85 (3H, m, ArH), 5,18 (1H, s, ArOH), 3,38 (1H, br. s, H-l), 3,28 (3H, s. OMe), 2,74 (1H, br. s. H-3), 2,3-2,52 (6H, m, H-4, H-6, H-9), 2,17 (1H, br. s, H-7), 1,68-1,92 (4H, m, H-8, H-10).

IR (i CHCI3): 3584, 3320 (OH), 2925, 2850, 1665, 1588, 1578, 1445, 1435, 1092, 1080, 1015, 880, 808 cm-<1>.

Eksempel VIII

Igjen ifølge hovedsakelig fremgangsmåten fra eksempel IV, ble en oppløsning av 2,97 ml (21,3 mmol) diisopropylamin i 21 ml tetrahydrofuran avkjølt til -78°C i et tørris-acetonbad under argonatmosfære, sammenblandet med 8,5 ml av et 2,5 M oppløsning av n-butyllitium i heksan (21,3 mmol), tilsatt dråpevis med en sprøyte omrørt i 20 min. Dietyl-l-metoksy-1-(3-pivaloyloksyfenyl)metanfosfonat (7,26 g; 20,3 mmol) i 20 ml tetrahydrofuran ble så tilsatt dråpevis fra en sprøyte i løpet av 10 min. , og oppløsningen ble omrørt ved lav temperatur i 1 time.

En oppløsning av 2,79 g (15,2 mmol) av 5-kloradamantan-2-on i 15 ml tetrahydrofuran ble tilsatt i løpet av 5 min. og etter omrøring ved lav temperatur i 10 min. , ble det kalde badet fjernet og blandingen oppvarmet til romtemperatur. Blandingen ble så kokt under refluks i 1,5 timer, avkjølt, fortynnet med 50 ml n-heksan og helt i en skilletrakt inneholdende 150 ml vandig mettet natriumbikarbonatoppløsning. Ekstraksjon med 5% etylacetat n-heksan ble fulgt av tørking av de sammenslåtte organiske fraksjonene, som ble konsentrert og pumpet under vakuum (1,0 mm Hg) for å gi en rest som, når den blir kromatografert på silikagel, ga 5,15 g en høyere Rf 3-(metoksy-5-klortricyklo[3.3.1.13 »7] dec-2-yl idenmetyl) - fenyltrimetylacetat som en farveløs olje (struktur bekreftet ved IR og NMR), og 0,865 g av et senere eluerende materiale sammensatt hovedsakelig av den korresponderende fenol. Denne siste fraksjonen ga, når den ble reacetylert med pivaloyl-klorid og trietylamin i metylenklorid (se eksempel I) fulgt av kromatografi, ytterligere 0,35 g av pivaloylesteren ( 93% totalt utbytte basert på 5-kloradamantan-2-on).

<X>H NMR (pivaloylester, 400 MHz, i CDC13): 5 7,36 (1H, t, J = 7,8 Hz, H-5'), 7,13 (1H, d, J = 7,7 Hz, ArH), 6,98-7,04 (2H, m, ArH), 3,45 (1H, br. s, H-l), 3,3 (3H, s, OMe), 2,8 (1 H, br. s, H-3), 2,13-2,32 (7H, m, H-4, H-6, H-7, H-9), 1,65-1,9 (4H, m. H-8, H-10), 1,36 (9H, s, C0C(CH3)3).

IR (ublandet): 2932, 2835, 1750 (ester C = 0), 1664, 1602, 1578, 1478, 1274, 1112, 1022, 827, 758 cm-<1>.

De sammenslåtte pivaloylesterfraksjonene (5,5 g, 14,1 mmol) ble tatt opp i 40 ml metanol og kokt under refluks med 5,37 g vannfri kaliumkarbonat i 40 min. Resten etter at metanolen var strippet av var partisjonert mellom vann og 30% etylacetat-heksan, og de organiske fasene ble konsentrert og pluggfultrert på en kort silikagelkolonne for å gi 4,07 g (88<5>6 utbytte basert på 5-kloradamantan-2-on) av 3-(metoksy-5-klorotricyklo[3.3.1.I<3>»<7>]dec-2-ylidenmetyl)fenol som et sprøtt, hvitt skum som ble svakt klebrig etter eksponering for luft.

HRMS beregnet for C18H21C102(M<+>) 304,1227, funnet 304,1230.

ifi NMR (400 MHz, i CDC13): S 7,23 (1H, dd, J = 7,7, 7,6 Hz, H-5'), 6,85 (1 H, d, J = 7,6 Hz, ArH), 6,77-6,83 (2 H, m, ArH), 3,44 (1 H, br. s, H-l), 3,31 (3H, s, OMe), 2,8 (1 H, br. s, H-3), 2,1-2,31 (7H, m, H-4, H-6, H-7, H-9), 1,65-1,89 (4H, m. H-8, H-10).

IR (i CHCI3): 3590, 3330 (OH), 2930, 2855, 1655, 1590, 1580, 1440, 1295, 1094, 1080, 1022, 880, 826 cm-<1>.'

Eksempel IX 3 - (metoksy-5-bromtricyklo[3.3.1.13'7]dec-2-ylidenmetyl]FEN0L (1,49 G, 4,26 mmol) ble oppløst i 8,5 ml vannfri etylenglykol og så plassert sammen med 0,28 g kaliumkarbonat i et forseglet glassrør. Glassrøret ble oppvarmet i et oljebad til 110°C i 7 timer. Innholdet i røret ble så konsentrert under vakuum (1,0 mm Hg) under oppvarming. Resten ble skilt mellom mettet natriumkloridoppløsning og etylacetat. Den organiske delen ble strippet og kromatografert på en kort silikagelkolonne gor å gi 1,31 g ( 925é utbytte basert på fenol startmaterialet) av 3-(metoksy-5-(2-hydroksy)etoksy-tricyklo[3.3.1•l<3>»<7>]dec-2-ylidenmetyl)fenol som et nesten hvitt skum.

<1>H NMR (400 MHz CDCI3): å 7,19 (1 H, t, J = 7,6 Hz, H-5'), 6,83 (1H, d, J = 7,6 Hz, ArH), 6,73-6,80 (2H, m ArH), 5,83 (1H, s, ArOH), 3,67 (2 H, m, 0CH2, CH2, 0H), 3,51 (2 H, t, J = 4,6 Hz, 0CH2CH20H), 3,44 (1H, br. s, H-l), 3,28 (3H, s. OMe), 2,81 (1H, br. s, H-3), 2,24 (1H, br. s, H-7), 1,55-190 (10H, m).

IR (CHCI3): 3580, 3320 (OH), 2929, 2842, 1664, J586, 1575, 1440, 1092, 1078, 885 cm-<1>.

Eksempel X

3-(metoksy5-klorotricyklo[3.3.1.l3'1]dec-2-ylidenmetyl )fenol (1,23 g, 4,0 mmol) ble fosforylert på samme måte som beskrevet 1 eksempel V med ett unntak, ammoniakk i metanol ble brukt p<->eliminasjon. Det rå oppnådde' ammoniumnatrium-saltet ble støtt med aceton, så pumpet under vakuum (1,0 mm Hg) for å gi 1,2 g av et nesten hvitt faststoff. Revers fase analytisk HPLC viste at det fosforylerte enoleterproduktet som ble oppnådd, var rent nok for direkte fotooksygenering til den korresponderende 1,2-dioksetan.

3-(metoksy-5-klorotricyklo[3.3.1.13»7^l dec-2-yl idenmetyl )-fenylfosfatsalt (0,65 g) ble oppløst i 100 ml vannfri 10% metanol/kloroform som også inneholdt 3,35 x 10~<5>m metylenblått som følsomgjørende farvestoff. Den resulterende opp-løsningen ble delt mellom tre glassrør og bestrålt som beskrevet i eksempel VI over. Opparbeidelsen i dette tilfelle omfattet oppløsning av den pumpede resten i 70 ml vann inneholdende 2,58 mg natriumbikarbonat. Etter utførelse av revers fase preparativ HPLC ble syn- og antiisomerene samlet sammen uten urenheter. Analytisk HPLC l0, 1% NaHC03(H20 )-acetonitrilgradient] viste to produkter (retensjonstid på 8,01 og 8,32 min.). Arealets prosentforhold (270 nm) av den tidligeluerende isomeren i forhold til den senteluerende isomeren ble funnet å være 0,4:1.<1>H NMR bekreftet at det lyofiliserte hvite faststoffet som var oppnådd, hadde en blanding av syn- og anti-dinatrium-3-(4-metoksyspiro-[l , 2-dioksetan -3, 2'-(5 '-klor)tricyklo-[3.3.1.l3 «7]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

Elementanalyse indikerte at produktet eksisterer i form av et dihydrat. Analytisk beregning for C1gH2QClNa207P•2E20: C, 43,52; E, 4,87; Cl, 7,14. Funnet: C, 43,23; H, 4,99; Cl, 7.65.

ifi NMR (400 MEz, i D20, to isomerer): S 6,97-7,68 (4H, m. ArE), 3,08 og 3,09 (3E, 2s, OMe), 2,95 (1 E, br. s, E-I), 0,76-2,35 (12 E, m).

Eksempel XI

3-(metoksy-5-bromtricyklo[3.3.1.I3 »7^dec-2-ylidenmetyl)fenol ble fosforylert og så fotooksygenert som beskrevet for dets 5-kloranalog i eksempel X over. Opparbeidelse i 0,3%

(vekt/volum) vandig natriumbikarbonatoppløsning ga en filtrert, vandig oppløsning av det rå 1,2-dioksetanfosfat-saltet, som så ble utsatt for revers fase preparativ EPLC (vann-acetonitrilgradient) for å gi syn- og anti-isomerene samlet sammen for lyofilisering. Når det lyofiliserte produktet, et hvitt, bløtt faststoff, ble utsatt for analytisk EPLC, ble to topper oppnådd med retensjonstider på 8,52 og 8,94 min. Arealets prosentforhold (270 nm) av den tidligeluerende isomeren i forhold til den senereeluerende isomeren ble funnet å være 0,5:1. ^-H NMR bekreftet at produktet var en blanding av syn- og anti-dinatrium-3-(4-metoksyspiro-[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-brom)tricyklo-[3.3.1.I<3>•<7>]dekan]4-yl)fenylfosfat.

1E NMR (400 MEz, i D20, to isomerer): S 6,99-7,52 (4E, m, ArE), 3,07 og 3,09 (3H, 2s, OMe) 2,91 (1H, br. s. E-I), 0.822.32 (12H, m).

Eksempel XII

Immunoanalyse for TSE ble utført på en serie TSE-standarder ved hjelp av et Hybritech Tandem-E TSH sett (Hybritech, Inc., San Diego, California) ifølge produsentens bruksan-visninger som lå i settet, bortsett fra at ved fullførelsen av anti-TSH-alkalisk fosfatase konjugasjonstrinnet og vask, ble kulene i tillegg vasket med 0,1 M dietanolamin, 1 mM magnesiumklorid, 0,02% natriumazidbuffer, pH 10,0 og så kort lagret i 200 pl av samme buffer.

Kjemisk luminescerende signaler fra anti-TSH-alkalisk fosfatase konjugerte bindinger til overflaten av kulene ble initiert ved at det til rørene som inneholdt kulene ble tilsatt 300 ml 0,67 mM bufferoppløsning inneholdende henholdsvis dinatrium-3-(2'-spiroadamantan )-4-metoksy-4-(3"-fosforyloksy)fenyl-l,2-dioksetan ("AMPPD"), dinatrium-3-(4-metoksyspiro-[l,2-dioksetan-3,2'-(5 '-hydroksy)tricyklo[3.3.1-.I<3>»<7>]dean]-4-yl)fenylfosfat (A-isomer; "A-0H-AMPPD" ), den korresponderende dinatrium-B-isomer ("B-OH-AMPPD") og dinat r ium-3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-klor )tri-cyklo[3.3.1.13»7]dekan]-4-yl )fenolfosfat ("Cl-AMPPD") i 0,1 M dietanolamin, 1 mm magnesiumklorid, 0,02% natriumazid, pH 10,0. Intensiteten av lysemisjonen ble så målt ved 7, 13, 19, 25, 31, 40, 50 og 60 min. etter substrattilsetningen, som et 5 sekunders integral ved romtemperatur (ca. 25°C), ved hjelp av et Berthold LB952T Luminometer (Berthold Instrument, Wildbad, Federal Republic of Germany). (Signalene målt bare ikke signal-til-støy).

TSH, R LU mot TSH for hver av AMPPD, Br-AMPPD, B-OH-AMPPD, A-OH-AMPPD og Cl-AMPPD er vist henholdsvis i figurene 1, 2, 3, 4 og 5 .

Eksempel XIII

En sammenligning av total luminescensemisjon fra AMPPD og fra de korresponderende 1,2-dioksetaner hvis adamant-2'-yl iden- grupper er monosubstituerte med hydroksy (A- og B-isomerer), klor- og brom-grupper ble gjort ved å utføre totalt defosfo-ryleringseksperimenter på hver av disse forbindelsene.

En vandig oppløsning av 1,23-dioksetanet (4,0 mM) i 0,05 M natriumkarbonat/natriumbikarbonat inneholdende 1 mM magnesiumklorid ble fremstilt og så ekvilibrert ved 30°C. 10 jjl av en 7,64 x 10 M vandig oppløsning alkalisk fosfatase (kalvetarm; Biozym) ble så tilsatt, og den kjemiske luminescensen fra den resulterende oppløsningen ble målt ved hjelp av et Turner Modell 20E luminometer (Turner Instruments; Sunnyvale, California).

Hurtigheten av den kjemiske luminescerende nedbrytingen for hver av de fem aktuelle forbindelsene, uttrykt i relative lysenheter (RLU'er) pr. minutt, er gitt i den følgende tabell.

Disse totale kjemisk luminescerende emusjonene er vist grafisk henholdsvis i fig. 6, 7, 8, 9 og 10.

Eksempel XIV

En stripe nøytral BIODYNE A nylonmembran (Pall Corporation, Glen Cove, N.Y.) ble prikket to ganger (ved siden av hverandre) med de følgende konsentrasjoner av biotinylerte pBr322 35-mer oligonukleotidprober (Synthetic Genetics, San Diego, California):

Membranen ble så blokkert i 0,2% kasein / 0,1% Tween 20 detergent i vandig fosfatbufret saltoppløsning (PBS), i 1 time, hvoretter 1/5.000 fortynnet avidin-alkalisk fosfatasekonjugat (Sigma, Inc., St. Louis, MO) i 0,2% kasein i PBS ble tilsatt. Membranen ble inkubert i 13 min., vasket to ganger (5 min. hver gang) i 0,2% kasein / 0,1% Tween 20 detergent i PBS, vasket fire ganger (hver gang 5 min.) i 0,3% Tween 20 detergent i PBS, og to ganger (hver gang 5 min,) i vandig 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, pH 10,0.

Membranen ble så delt på midten for å gi to striper som hver inneholdt ett sett prikker. En av stripene ble inkubert i 5 min. i vandig AMPPD-oppløsning (0,25 mM i 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, pH 10), den andre i 5 min. i den korresponderende kloradamant-2'-ylidenforbindelsen (0,25 mM i den samme buffer). De to stripene ble så plassert i kameraluminometeret og disponert på en polaroid type 612 øyeblikks sort-hvitt film. Den forbedrede ischemiske luminescerende intensiteten oppnådd ved bruk av klorforbind-elsen, sammenlignet med AMPPD selv, kan bli sett ved å sammenligne kolonne 2 (Cl-AMPPD) med kolonne 1 (AMPPD) i fig. 11.

Eksempel 15

pBr322 plasmid (4700 bp) ble utsatt for en nick-translasjons-prosess ved hjelp av et Trans-Light-sett (Tropix, Inc., Bedford, Mass.) for å frembringe en blanding av biotinylerte enkelttrådede polynukleotider med en lengde på fra 200 til 2000 basepar.

Denne blandingen ble prikket på en tørr BIODYNE A-membran som fem parallelle kolonner av prikker med de følgende konsentrasjoner :

Membranen ble utsatt for ultrafiolett bestråling (UVP Mineral Light; UVP, San Gabriel, Calif. ) i 3 min. for å fiksere DNA til membranens overflate og så lufttørke. Membranen blir deretter blokkert i 0,2% kasein / 0,1% Tween 20 detergent i PBS i 1 time, hvoretter 1/5.000 fortynnet avidin-alkalisk fosfatasekonjugat (Tropix, Inc.) i 0,2% kasein i PBS ble tilsatt. Membranen ble så inkubert i 30 min., vasket tre ganger (5 min. hver gang) i 0,2% kasein/0,1% Tween 20 detergent i PBS og vasket en gang i 5 min. i vandig 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid og 0,2% natriumazid, pH 10,0 (substratbuffer).

Deretter ble kolonneraden med prikker 1-5 hver for seg skåret ut av membranen. De utskårne strips 1-5 ble vasket med substratbuff er i 30 min. De utgående stripsene 6-10 ble blokkert med 0,1% BDMQ i substratbuf fer i 30 min. Begge settene med strips ble så inkubert i 5 min. i substratbuffer, så hver for seg inkubert i 5 min. i vandig oppløsning (0,25 mM) 1,2-dioksetan som vist under:

Alle stripsene ble så plassert i kameraluminometeret og eksponert på Polaroid Type 612 øyeblikkelig sort-hvitt film. Den forbedrede kjemiske luminescensintensitet som ble oppnådd ved hjelp av 3-(substituert-adamant-2'-yliden)-l,2-dioksetaner, i forhold til AMPPD, kan sees på resultatene i tabell II under.

Eksempel XVI

En stripe nøytral BIODYNE A nylonmembran ble prikket to ganger (ved siden av hverandre) med 12,5 picogram biotinylert pBR322 35-mer oligonukleotidprobe (Biogen, Inc., Cambridge, Mas.), tørket og utsatt for ultrafiolett lys fra en UVP Mineral Light lampe i 5 min. for å fiksere DNA'et til membranoverflaten. Membranen ble så fuktet 5 x SSC (0,015 M natriumcitrat / 0,15 M natriumklorid) og - blokkert i 0,2% kasein, 0,1% Tween 20 detergent i PBS i 1 time. Den blokkerte membranen ble så inkubert med avidin-alkalisk fosfatasekonjugat ("Avidx-conjugate; Tropix, Inc.), fortynnet 1-10.000 i 0,2% kasein i 30 min.

Membranen ble så vasket (5 min. hver gang) med vandig 0,2% kasein / 0,1% Tween 20 detergent, så to ganger (5 min. hver gang) med vandig 0,1% Tween 20 detergent i PBS, og endelig to ganger (5 min. hver gang) i vandig 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, pH 10 (analysebuffer).

Den vaskede membranen ble skåret i to for å gi to stripet som hver inneholdt en prikk. Strippene ble inkubert henholdsvis i vandig 0,25 mM AMPPD-oppløsning og den korresponderende kloradamant-2'-ylidenforbindelsen i 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, pH 10 i 10 min., så avrent og forseglet i plastpose som ble tapet til vinduene på et Turner model 20E luminometer. Den kjemiske luminescensemisjonen fra hver stripe ble integrert i 20 min. Kinetikken oppnådd fra lysemisjonen er vist i fig. 12.

Eksempel XVII

Forbedringen av kjemisk luminescensemisjon (sammenlignet med emisjonen fra AMPPD) gitt ved den korresponderende hydroksy-adamant-2'-yl iden- (A- og B-isomerer) og kloradamant-2'- ylidenforbindelsene, alle i nærvær av forsterkerpolymerene opplistet under, ble vist på følgende måte.

Fire sett, hver på tre rør, hvor hvert rør i hvert sett inneholdt 450 \ il av 0,4 mM vandig oppløsning av en av de fire 1,2-dioksetanene ble sammenlignet i 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, 0,02% natriumazid og 0,2% av forsterkerpolymeren, pH 10,0 (substratbuffer) ble fremstilt og bakgrunnssignalet fra hvert rør målt ved hjelp av et Berthold LB 952T luminometer (Berthold Instruments; Wildbad, Federal Republic of Germany).

Deretter ble 50 >il av en vandig oppløsning, 2,83 x IO-<12>M, alkalisk fosfatase i 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid, 0,02% natriumazid, pH 10,0 (endelig enzymkonsentrasjon 2,83 x 10~<13>M) tilsatt til hvert rør, og det kjemiske luminescenssignalet ble målt i luminometeret etter 5 og 10 min. Intensiteten av de kjemiske luminescenssignalene og og signalet: bakgrunnsforhold oppnådd for hver av de fire 1,2-dioksetanene i nærvær av forsterkningspolymerene er vist i tabell III.

De brukte forsterkende polymerer og symbolene for disse polymerene som brukt i tabell III, var som følger:

Eksempel XVIII

Bakgrunnssignalene og t^-parametrene (sammenlignet med dem fra AMPPD) oppnådd for de substituerte adamant-2'-yliden-forbindelsene listet under i to forskjellige buffere ble bestemt på følgende måte.

Vandig 4 x IO"<4>M oppløsninger av 1,2-dioksetanene i en bufferoppløsning laget av 0,05 M natriumkarbonat/natriumbikarbonat inneholdende 1 mM magnesiumklorid, pH 9,5, så vel som vandig 4 x IO-<4>M oppløsninger av 1,2-dioksetanene i en bufferoppløsning laget av 0,1 M dietanolamin inneholdende 1 mM magnesiumklorid og 0,02% natriumazid, pH 10,0. 1 ml pr. rør av hver av disse oppløsningene ble plassert i et Turner Model 20E luminometer, og bakgrunnssignalene ble målt.

Deretter ble ttø-verdiene målt for hver av prøvene som følger. 100 pl av prøvedioksetan i 900 pl av en av de over beskrevne bufferoppløsningene ble repretert i et rør (endelig dioksetankonsentrasjon 4 x 10"^ M) og bragt i likevekt ved 30°C. 10 pl av en 1-1.000 oppløsning av kalvetarm alkalisk fosfatase i den samme buffer (enzymkonsentrasjon 7,6 x 10"^^ M) ble så tilsatt, og den resulterende kjemiske luminescensintensiteten ble målt ved hjelp av et Turner Model 20E luminometer i en periode på 30 min. TVi-verdiene ble så utregnet fra nedbrytingskurvene. Resultatene fra disse målingene er gitt i tabell IV under. 2. 0,1 M dietanolamin, 1 mM magnesiumklorid, 0,02% natriumazid, pH 10,0

Eksempel XIX

Alkalisk fosfatase (kalvetarm; Biozyme) ble fortynnet i 1-1.000.000 for å gi en lageroppløsning, konsentrasjon 2,54 x 10"<12>M. En serie av rør ble forberedt i duplikat, inneholdende 450 pl av en vandig 0,1 M dietanolaminoppløsning inneholdende 1 mM magnesiumklorid og 0,02% natriumazid, pH 10, foruten 0,1% av en av forsterkerpolymerene angitt under, og 4,4 x 10<4>M av en 1,2-dioksetan: AMPPD eller den korresponderende kloramandant-2'-ylidenforbindelse.

50 pl av alkalisk fosfatase lageroppløsning ble så tilsatt for å gi prøver inneholdende de følgende enzymkonsentrasjo-ner :

Den endelige konsentrasjonen av 1,2-dioksetan i hvert rør var 4 x 10~<4>M: den endelige konsentrasjonen av forsterkerpolymer var 0,09%. 5 sekunders integraler ble målt ved 5 og 20 min. etter 1,2-dioksetantilsetningen.

Fig. 13 viser doseresponskurven for alkalisk fosfatase-oppløsning med kloradamant-2'-yliden-1,2-dioksetan med forsterker I og II ved 5 min. etter diokssetantilsetning, sammenlignet med doseresponskurven for AMPPD med de samme forsterkerne vist som RLU versus [AP] og signal/støy (S/N versus [AP]). Fig. 14 viser alkalisk fosfataseoppløsning oppdaget med kloradamant-2'-yliden-1,2-dioksetan pluss BDMQ-fluorescein ("emerald I") og poly(vinylbenzyltributyl-ammoniumklorid) ("TBQ")fluorescein (emerald II) ved 5 og 20 min. etter substrattilsetning sammenlignet med AMPPD pluss de samme forsterkerpolymerer.

Eksempel XX

pBR 322 plasmid (Biogen, Inc., Cambridge, Mass.) inneholdende en innskutt TPA-sekvens ble fordøyet med et MSP1 restriksjonsenzym. Den kjemiske spaltingen ble utført som beskrevet av Maxam et al., PNAS, 74, 560 (1977) for å oppnå G, AG, AC, T og C - og en annen, T, som beskrevet av Rubin et al., Nucleic Acids Research, 8, 4613 (1980). En syvendedel av hver reaksjonsrør innhold ble lagt i vært felt på en 0,4 mm TBE-gradient sekvenseringsgel (60 cm lengde). Etter 4 timers elektroforese, ble DNA elektrooverført til en BIODYNE A nylonmembran (0,45 pm) og behandlet med ultrafiolett lys for å fiksere DNA'et på membranen overflate.

Membranen ble så tørket, prehybridisert i 30 min. ved 45°C i vandig bufferoppløsning inneholdende 1% BSA, 0,5 M natrium-fosfat og 7% SDS, pH 7,2, så hybridisert i 2 timer ved 45°C med 10 pl NNB "snap direct" alkalisk fosfatasekonjugert probe (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, California) i 40 ml av den ovenfor beskrevne BSA-bufferoppløsningen. Membranen ble så vasket to ganger i vandig 5 x SSC / 1% SDS (hver gang i 5 min.) ved 45°C, to ganger i vandig 1 x SSC / 1% SDS (hver gang i 5 min.) ved 45°C, en gang i en vandig oppløsning inneholdende 125 mM natriumklorid, 50 mM Tris og 1% Triton X-100 detergent, pH 8,0, to ganger i vandig 1 x SSC (hver gang 1 min.) ved romtemperatur, og til sist to ganger (1 min. hver gang) ved romtemperatur i en vandig oppløsning inneholdende 0,1 M dietanolamin, 1 mM magnesiumklorid og 0,02% natriumazid ved pH 10,0.

Membranen ble så fuktet med vandig AMPPD-oppløsning (0,25 mM), pakket inn i Såran-innpakning og eksponert for Kodak XAR røntgenfilm i 40 min. En 5 minutters eksponering ble tatt 1 time etter AMPPD-tilsetning. Bildesekvensene er vist i fig. 17 (1).

Gjentagelse av hele fremgangsmåten ved hjelp av den korresponderende adamant-2'-yliden-1,2-dioksetanforbindelsen ga de følgende bilder vist i fig. 17 (2).

Eksempel XXI

Den termiske bakgrunnen fra hver dioksetan som vist i tabell 4, ble målt i en oppløsning av 0,4 mM dioksetan i 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0 ved 30°C i en Turner Model 20E luminometer (Sunnyvale, CA). Den gjennomsnittlige kjemiske luminescensintensiteten fra hver prøve i fravær av enzymet er vist under "Bakgrunn ved 0,4 mM i Turner lysenheter (TLU) i tabell 4.

Halveringstiden for dioksetananionet også vist i tabell 4, ble målt som følger: En 1 ml oppløsning av 0,04 mM dioksetan (i den samme bufferen som ovenfor) ble fullstendig defosforylert ved tilsetning av 0,764 picomol alkalisk fosfatase ved 30°C i en Turner Model 20E luminometer. Halveringstiden for dioksetananionet ble så beregnet fra første ordens nedbryting av den kjemiske luminescensemisjonen.

Tabell 4

Sammenligning av halveringstid og termisk bakgrunn for forskjellige dioksetanfosfater

Eksempel XXII

Deteksjonsmetoden for alkalisk fosfatase med forskjellige kjemisk luminescerende 1,2-dioksetansubstrater ble bestemt som følger: Duplikater av serielle fortynninger (1 til 3) av alkalisk fosfatase ble inkubert ved romtemperatur ved 0,4 mM dioksetan i 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2»pH 10,0, inneholdende 1 mg/ml av en av de polymere forsterkerne Forsterker 1 eller Forsterker 2 i et Berthold LB952T luminometer (Vildbad, Tyskland)

Etterfulgt av enten en 5 eller 20 minutters inkubasjon med et substrat, ble den kjemiske luminescensintensiteten målt som et 5 sekunders integrat av relative lysenheter (RLU) og plottet som i fig. 10. Alkalisk fosfatasekonsentrasjonen, som resulterte i et kjemisk luminescenssignal som var dobbelt så sterkt som signalet som ble oppnådd uten enzym, ble ekstrapolert fra ovenviste fig. 18. Alkalisk fosfatasekonsentrasjonen ved to ganger bakgrunnen ble brukt som deteksjonsgrense i tabell 5.

Deteksjonsgrenser er uttrykt i femtomol/liter.

Eksempel XXIII

Duplikater av serielle fortynninger (1 til 3) av alkalisk fosfatase ble inkubert ved romtemperatur ved 0,4 mM AMPPD eller Cl-AMPPD i 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0, inneholdende 1 mg/ml av en av de polymere forsterkerne, forsterker 1 eller forsterker 2, i et Berthold LB952T luminometer. Etter 5 minutters inkubasjon, ble de kjemiske luminescensintensitetene målt som 5 sekunders integraler av relativ lysenhet (RLU), gjennomsnittet av duplikatene ble tatt og plottet mot alkalisk fosfatasekonsentrasjon i den øvre kurven på fig. 18. Den nedre kurven viser forholdet mellom det kjemisk luminescerende signalet i forhold til bakgrunns (intet enzym) kjemisk luminescenssignal som funksjon av enzymkonsentrasjonen.

Eksempel XXIV

Det kjemisk luminescerende signalet i forhold til støynivåene ble funnet ved 2,83 x IO"<13>M alkalisk fosfatase forskjellige R-substituerte adamantyl 1,2-dioksetanfosfåter i nærvær av forskjellige forsterkere. Alle målingene ble utført i et Berthold LB952T luminometer ved romtemperatur. Først ble kjemisk luminescens-bakgrunnsnivåene (signal i fravær av enzymet) fra hver prøve (i triplikat) målt. Hver prøve besto av 0,2 jumol dioksetan i 0,45 ml 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2»pH 10,0, uten eller med 1 mg/ml av den indikerte forsterker. Rørene ble satt inn i luminometeret og luminescensintensiteten ble målt. Deretter ble rørene fjernet fra luminometeret og alkalisk fosfatase (50 pl inneholdende 1,415 x 10~<16>mol) ble tilsatt hver rør, og luminescensintensiteten ble målt ved 5 og 20 min. etter substrattilsetning. Den endelige konsentrasjonen av dioksetan i hvert rør var 0,4 mM. Tabell 6 viser forholdet av kjemisk luminescenssignal oppnådd i nærvær av alkalisk fosfatase ved 5 og 20 min. i forhold til bakgrunnssignalet (oppnådd i fravær av enzym).

Alle forsterkere ble brukt ved 1 mg/ml i 0,1 M DEA, pH 10.

Alkalisk fosfatasekonsentrasjon = 2,83 x 10~<13>M.

Målingene ble utført i et Berthold LB952T luminometer.

Eksempel XXV

Tabell 7 viser deteksjonsgrensene for alkalisk fosfatase-deteksjon med de R-substituerte dioksanene bestemt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i tabell 5, eksempel XXII, med det unntak at det ble brukt et instrument for å oppnå målingene for kjemisk luminescensintensitet. Det brukte luminometeret i dette eksempelet var LabSystems Luminoskan mikrotiter plateleser.

1) Buffer: 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, 0,02% natriumazid, pH 10,0 2) Signalregistreringsapparat i et Labsystem Luminoskan mikrotiter plateleser.

Eksempel XXVI

Tabell 8 viser 20 minutters inkubasjonsdataene fra tabell 4, foruten målinger utført i et Wilj mikrotiter platelumino-meter.

Eksempel XXVII

Egenskapene til AMPPD og Cl-AMPPD på en nylonmembran ble sammenlignet som følger: 12,5 picogram av biotinylert pBR322-(35-mer) i 1 pl ble prikket på tørr nylonmembran og tverrbundet til membranen med UV-lys. Membranen ble deretter fuktet med 1 x SSC-buffer, inkubert med 0,2% kasein, 0,1% Tween-20 i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 1 time ved romtemperatur, vasket 4 ganger med 0,3% Tween 20 i PBS, vasket to ganger i substratbuffer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0), og inkubert i 5 min. i 0,25 mM dioksetan i substratbuffer. På denne måten ble to membraner generert, 1 inkubert med AMPPD og en annen med Cl-AMPPD. Membranene ble så forseglet i plastikk, festet til utsiden av et 12 x 75 mm glass testrør og satt inn i et Turner Modell 20E luminometer utstyrt med en sidemontert fotomultiplikatordtektor og innstilt i termisk likevekt ved 30°C. Den kjemiske luminescensintensiteten ble målt i 20 til 24 timer. Som vist i fig. 19 ble det kjemiske luminescenssignalet plottet som funksjon av tiden for både AMPPD og Cl-AMPPD.

Eksempel XXVIII

Halveringstiden for maksimum kjemisk luminescensintensitet oppnådd med AMPPD og Cl-AMPPD på PVDF og nylonmembraner ble utregnet fra data samlet som beskrevet i eksempel XXVII, for nylonmembranen. For PVDF-membrann omfattet den reviderte protokollen en annen substratbuffervask fulgt av membran-inkubasjonen i 5 min. ved romtemperatur i Tropix Nitroblock-reagensen og påfølgende vasking med substratbuffer før dioksetansubstrattilsetning. Halveringstiden for det maksimalt kjemiluminescerende signal ble beregnet fra en kurve av logaritmen (maksimalt kjemisk luminescenssignal minus signalet ved hvert tidspunkt) som en funksjon av tid, og er vist i tabell 9.

12,5 pg biotinylert pBR322-35mer ble detektert med Avidix-AP og 0,24 mM dioksetan i 0,1 M DEA, pH 10,0.

Eksempel XXIX

Deteksjonen av pBR322 plasmid DNA med en biotinylert pBR322 DNA-probe ved hjelp av AMPPD og Cl-AMPPD på PVDF nylonmembraner ble utført på følgende måte: pBR322 DNA ble denaturert ved koking, serielt fortynnede prøver i 1 x SSC buffer (endelig DNA-masse pr. spalte er vist i fig. 20), påført ImmobilonP PVDF-membran, Pall Biodyn A nylon-membran og Amersham Eybond N nylon-membran ved hjelp av en Schleicher og Schuell spalteavsettingsapparat. DNA'et ble tverrbundet til Biodyne A og Hybond N-membranene med UV-lys. Immobilon P-membranene ble først blokkert og så UV-behandlet. Membranene ble fuktet med 1 x SSC buffer, prehybridisert ved 65°C i hybridiseringsbuffer (IM NaCl, 0,2% heparin, 0,5% polyvinylpyrrolidon, 4% natriumdodecylsulfat, 1 mM etylen-diamineteteddiksyre, 5% dekstransulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) og hybridisert ved 65°C med 12 ng/ml pBR322-probe (biotinylert ved hjelp av nick-translasjonsprosedyre) i den samme buffer, vasket en gang ved 65°C i den samme buffer minus dekstransulfat, EDTA og tepahn, vasket to ganger i 10 min. i 1 x SSC/1% SDS ved 75°C, to ganger i 15 min. i 0,1 x SSC / 1% SDS med 75°C, to ganger i 5 min. i 1 x SSC ved romtemperatur, blokkert i 1 time i 0,2% kasein, 0,11% Tween-20 i PBS, vasket en gang i 5 min. i 0,2% kasein i PBS, inkubert i 30 min. i en 1-15.000 fortynning av streptavidin-merket alkalisk fosfatase i 0,2% kasein i PBS, så vasket seks ganger med 0,2% kasein, Tween 20 i PBS, vasket to ganger i substratbuffer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0), og så inkubert i 5 min. ved 0,25 mM AMPPD og Cl-AMPPD (to forskjellige membraner) i substratbuffer. Før substrattilsetning ble PVDF-membranen inkubert i 5 min. i NitroBlock og vasket to ganger med substratbuffer. Membranene ble så pakket i plastikk og eksponert på Polaroid Type 612 film i en tid som indikert etter substrattilsetning som vist i fig. 20.

Eksempel XXX

Deteksjonen av pBR322 plasmid med et biotinylert pBR322 DNA-probe ved hjelp av AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD på PVDF, nylon, og nitrocellu.losemembraner utført ved hjelp av protokoller i likhet med dem beskrevet i eksempel XXIX, med det unntak ved bruk av PVDF og nitrocellulosemembraner, med hvilken mål-DNA ble fiksert ved baking av membranene i S0°C i 2 timer. Før dioksetantilsetning ble både PVDF og nitro-cellulosemembranene behandlet med Nitroblock. Polaroid type 612bilder av de kjemisk luminescerende signalene fra dekomponeringen av forskjellig dioksetanfosfater katalysert ved alkalisk fosfatase DNA-probekonjugater på forskjellige membranstøtter er vist i fig. 21.

Eksempel XXXI

Kinetikken til alkalisk fosfatase-avhengig lysemisjon fra AMPPD og Cl-AMPPD på nitrocellulosemembraner ble sammenlignet ifølge følgende prosedyre: pBR322-(35 mer) som på forhånd hadde blitt 3'-endemerket med biotin-ll-dUTP (1 pl inneholdende 12,5 pg) ble prikket på en tørr ni trocellulose-membran. Membranen ble så fuktet med 1 x SSC buffer, inkubert med 0,2% kasein, 0,1% Tween-20 i fosfat bufret saltoppløsning (PBS) i 1 time ved romtemperatur, vasket 4 ganger med 0,3% Tween-20 i PBS, vasket to ganger med substratbuffer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2>pH 10,0), inkubert i 5 min. med NitroBlock reagens, vasket to ganger i substratbuffer og deretter ble to deler membran inkubert i 5 min. hver gang i 0,25 mM AMPPD og Cl-AMPPD i substratbuffer. Membranene ble så forseglet i plast, festet på utsiden av et 12 x 75 mm glass-testrør, og satt inn et Turner Model 20-E luminometer i termisk likevekt ved 30°C utstyrt med en side fotomultiplikator-detektor. Den kjemiske luminescensintensiteten ble målt i 20 til 24 timer. Som vist i fig. 22 ble det kjemisk luminescerende intensitetssignalet plottet som en funksjon av tid for både AMPPD og Cl-AMPPD.

Eksempel XXXII

Halveringstiden for den maksimale kjemiske luminescenssignal-intensiteten for en membran basert på protein, IgG, deteksjon med alkalisk fosfatase konjugert geit-antimus-antistoff og AMPPD og CL-AMPPD ble evaluert ved hjelp av følgende protokoll. 1 pl av 1 pl oppløsning av renset mus IgG i 20% metanol elektroforese-overføringsbuffer ble avsatt på tørr nitrocellulose og våte PVDF-membraner. Membranene ble deretter renset med 0,1% Tween-20/PBS, blokkert i 1 time i blokkeringsbuffer (0,2% kasein, 0,1% Tween 20 i PBS), inkubert med en 1-10.000 fortynning av alkalisk fosfatase kunjugert geit-antimus-antistoff og blokkeringsbuffer, vasket to ganger i 5 min. i blokkeringsbuffer, vasket to ganger i 5 min. i 0,1% Tween-20/PBS, vasket to ganger i 5 min. i substratbuffer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0), separert i to eksempler og inkubert i 5 min. hver i 0,25 mM AMPPD og Cl-AMPPD. Membranene ble forseglet i plastikk, festet på utsiden av et 12 x 75 mM glassrør og satt inn i en Turner Modell 20E luminometer utstyrt med en side foto-multiplikatordetektor ved termisk likevekt på 30°C. Som vist i tabell 10 ble kjemisk luminescerende intensiteter målt i 8 til 12 timer og halveringstiden for maksimumssignal ble utregnet som i eksempel XXVIII.

1 ng fra mus ble detektert med geit anti-mus-AP og 0,24 mM dioksetan i 0,1 M DEA, pH 10,0.

Eksempel XXXIII

Western flekkanalyse ble utført for deteksjon av humant transferin på en nylonmembran ved hjelp av kjemisk luminescens, serielle fortynninger av renset, humant transferin på 0-5,1,,2,,4,8,16,32,64,128 og 256 nanongram ble fremstilt ved SDS polyakrylamidgel-elektroforese og elektroforetisk overført til Pall FBiodyne A nylon membran. Membranene ble deretter vasket med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), blokkert i 30 min. med 0,3% kasein i PBS, inkubert med en 1-1000 fortynning av anti-humantransferin fra mus i 0,3% Tween-20/PBS, vasket fire ganger i 5 min. med 0,3% Tveen-20/PBS, inkubert med en 1-10.000 fortynning av alkalisk fosfatase merket geite-antimus-antistoff i 0,3% Tween-20/PBS, vasket 4 ganger 5 min. i 0,3% Tween-20/PBS, vasket to ganger i substratbuf fer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10,0), inkubert i 5 min. hver i 0,25 mM AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD i substratbuffer, pakket inn i plast og eksponert for Polaroid type 612 øyeblikks sort-hvitt film i 5 min. Resultatene er vist i fig. 30.

Eksempel XXXIV

Den kjemiske luminescensdeteksjonen fra humans transferrin på Immobilon-P PVDF-membraner ble utført ifølge protokollen beskrevet i eksempel 13, bortsett fra følgende endringer: Straks før dioksetantilsetning, ble to av de fire PVDF-membranene inkubert i 5 min. i NitroBlock og vasket to ganger i substratbuffer. 5 minutters eksponering for AMPPD og Cl-AMPPD uten og med NiroBlock er vist i fig. 23.

Eksempel XXXV

Kjemisk luminescensdeteksjon av murin interleukin-4-gen ved hjelp av direkte alkalisk foasfatase merkede oligonukleorid-prober med AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD og LumiPhos 530. Et plasmid inneholdende genet eller murin interleukin-4 (MIL-4) gen ble serielt fortynnet i 1 x SSC og spottet på tørr Biodyn A membran med 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,5, 0,25, 0,0125, 0,0063 og 0,00315 nanogram DNA. DNA'et ble UV-fiksert til membranen og deretter fuktet med 1 x SSC, prehybridisert i hybridiseringsbuffer (7% SDS, 1% kasein, 0,25 M Na2P04, pH 7,2 med fosforsyre) i 30 min. ved 50°C, hybridisert med 5 nM alkalisk fosfatase merket oligonukleotidprobe i 2 timer ved 50°C, vasket som følger: to ganger 5 min. i 2 x SSC, 1% SDS ved romtemperatur; to ganger 15 min. i 1 x SSC, 1% SDS ved 50°C, to ganger 5 min. i 1 x SSC, 1% Triton X-100 ved romtemperatur; to ganger 5 min. i 1 x SSC; og to ganger 5 min. i substratbuffer (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2>pH 10). Separate prøver fra membraner ble så inkubert i 5 min. hver i 0-25 mM AMPPD, Cl-AMPPD, Br-AMPPD og LumiPhos 530 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA), pakket inn i plastikk og eksponert for Kodak XAR-5 røntgen-film i 1 time etter 1 times inkubasjon. Resultatet fra dette eksperiment er vist i fig. 24.

Eksempel XXXVI

Sammenligning av intensitetene av kjemisk luminescenssignal-intensitetene oppnådd med Cl-AMPPD og AMPPD ble studert i fig. 9. Sekvenseringsreaksjoner ble utført ved hjelp av M13mpl8 DNA med 5'-bionylert universal primer med BioRad-polymerase. To sett reaksjoner ble separert på en 7,67 M urea iongradient polyakrylamidgel og overført til nylonmembranen ved passiv kapillær overføring. DNA ble tverrbundet til membranen ved UV-bestråling i 5 min. Membranen ble så inkubert ved romtemperatur i blokkeringsbuffer ( 0, 2% kasein, 0,1% Tween 20 I PBS) i 30 min., i 30 min. med en 1-5.0000 fortynning av streptavidin merket alkalisk fosfatase i 0,2% kasein, PBS, vasket 5 min. i blokkeringsbuffer, vasket to ganger i 0,3% Tween-20 i PBS og vasket i 1 min. i substratbuffet (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10). Membranen ble delt i to deler og inkubert i 5 min. i 0,25 mM dioksetan (en stripe i hver av AMPPD og Cl-AMPPD). Membranene ble så forseglet i plast eksponert for XAR-5 røntgenfilm i 7 min. med start 5 min. etter substrattilsetning som vist i fig. 25.

Eksempel XXXVII

Sammenligning av DNA båndoppløsning ved hjelp av CSPD og CL-AMPPD ble utført ved hjelp av sekvenseringsreaksjoner, over-føringer og kjemisk luminescensdeteksjon ble utført under de samme forholdene som beskrevet i eksempel XXXV ved hjelp av AMPPD og Cl-AMPPD. Eksponeringene vist i fig. 26 er en 1 minutts eksponering 24 timer etter substrattilsetning.

Eksempel XXXVIII

Deteksjon av pBR322 plasmid DNA med biotinylert pBR322 DNA probe ved hjelp av AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD på nitrocellulosemembran. pBR322 plasmid DNA ble serielt fortynnet og avsatt med 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 og 1 mikrogram i 3 striper tørr nitrocellulosemembran. Membran- stripene ble så bakt i 2 timer ved 80°C og behandlet med UV-lys i 5 min., fuktet med 1 x SSC, prehybridisert i 60 min. i hybridiseringsbuffer (1 M NaCl, 0,2% heparin, 0,5% polyvinylpyrrolidon, 40% natriumdodecylsulfitt, 1 mM etylendiamin-tetraeddiksyre, 5% dekstransulfat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) ved 651, hybridisert over natten med 15 ng/ml pBR322 probe biotinylert ved nick-translasjon, vasket 5 min. i hybridiseringsbuffer minus heparin, dekstransulfat og EDTA ved 65°C, vasket to ganger 5 min. med 1 x -SSC / 1% SDS ved 75°C, to ganger 15 min. med 0,01 x SSC / 1% SDS ved 75°C og en gang 5 min. med 1 x SSC ved romtemperatur. Membranene ble så prosesert for kjemisk luminescensdeteksjon ved romtemperatur ved å rense dem to ganger med 0,2% kasein i PBS), blokkert i 1 time med blokkeringsbuffer (0,20% kasein, 0,1% Tween 20 i PBS, vasket i 5 min. ved 0,21% kasein i PBS, så 5 min. med 0,2% kasein i PBS, inkubering av membranene i 30 min. med en 1-15.000 fortynning av streptavidin merket alkalisk fosfatase i 0,2% kasein/PBS, to gangers vasking i 5 min. med NitroBlock-oppløsning, så fire gangers vasking i 5 min. i 0,3% Tween-20/PBS, så to ganger 5 min. i substratbuf f er (0,1 M dietanolamin, 1 mM MgClg, pH 10), og inkubering av en stripe i hver av de tre dioksetanfopsfåtene: AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD ved 0,25 mM dioksetankonsentrasjon. Tidseksponeringer på Polaroid 612 film etter forskjellig inkubasjonstid er vist i fig. 27.

Eksempel XXXIX

Deteksjon av pBR322 DNA med et biotinylert pBR322 DNA probe med streptavidin alkalisk fosfatasekonjugat og og kjemisk luminescens dioksetanfosfater, AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD på nøytral nylon membran ble utført ved hjelp av protokollen beskrevet i eksempel XXXVIII, bortsett fra at 5 min.s NitroBlock-inkuberingen ble sløyfet. Resultatene er vist i fig. 28.

Eksempel XL

Kjemisk luminescens-deteksjonen av human transferin ble utført på Immobilon-P PVDF-membran. Gelelektroforese, overføring, blokkering og deteksjonstrinnene ble utført ifølge protokollene utført i eksempel XXIV, bortsett fra at alle PVDF-membranene blir inkubert i 5 min. i NitroBlock-reagens. Fig. 29 viser resultatene fra sammenligningen av AMPPD, Cl-AMPPD og Br-AMPPD i deteksjonen av humant transferin på PVDF-membraner.

Eksempel XLI

Den termiske bakgrunnen av hver av dioksetanene som spesifi-sert i tabell 11, ble målt i en oppløsning av 0,4 mM dioksetan i 0,1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2»pH 10,0 ved 30°C i et Turner modell 20E luminometer (Sunnyvale, CA). Den gjennomsnittlige kjemisk luminescerende intensitet av hver prøve i fravær av et enzym som oppgitt i "ikke-spesifikk bakgrunn" i 0,04 mM i relative luminometerenheter.

Halveringstiden til dioksetananionet som også er oppført i tabell 11, ble målt som følger: 1 ml oppløsning av 0,04 mM dioksetan (i samme buffer som ovenfor) ble fullstendig defosforylert ved tilsetting av 0,764 picomol alkalisk fosfatase ved 30°C i et Turner Modell 20E luminometer. Halveringstiden til dioksetananionet blir så utregnet fra første ordens nedbryting av den kjemisk luminescerende emisjon.

Diskusjonen over av oppfinnelsen er hovedsakelig rettet mot foretrukne utførelser og praktiseringen av disse. Det er tydelig for den som er kjent innen teknikken at ytterligere 10 forandringer og modifikasjoner i de aktuelle implemente-ringer av de her beskrevne konsepter enkelt kan bli gjort uten å forlate ånden og rammen av oppfinnelsen som den er definert ved de følgende krav.

Claims (16)

1. Enzymatisk spaltbar kjemisk luminescerende 1,2-dioksetanforbindelse i stand til å produsere lysenergi under dekomponering som hovedsakelig er stabil ved romtemperatur før en binding med hvilken en enzymatisk spaltbar labil substituent er bundet, blir spaltet med hensikt,karakterisert vedat den har følgende formel:

hvor: Z er en fosfat- eller en galaktosidgruppe, X er halogen, C^.^-alkoksy eller hydroksy.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat X er klor.

3. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat X er brom.

4. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er dinatrium 3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-hydroksy)tricyklo[3.3.1.I3 >7]dekan)-4-yl)fenylfosfat.

5. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er dinatrium 3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-klor)tricyklo[3.3.1.13»<7>]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

6. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er dinatrium 3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5 '-brom)tricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

7. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er syji-dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l ,-2-dioksetan-3,2 *-(5'-hydroksy)tricyklo[3.3.1.13 »7]dekan]-4-yl-fenylfosfat.;

8. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er sy_n-dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2 '-(5 *-kloro)tricyklo[3.3.1.13•7]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

9. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er sy_n-dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l, 2-dioksetan-3 ,2 '-(5'-brom)tricyklo[3.3.1.l3 »7]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

10. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er anti-dinatrium-3-( 4-metoksyspiron . 2-di okse t an - 3,2'-(5 '-hydroksy)tr icyklo[3.3.1.13'7]dekan]-4-yl-fenylfosfat.

11. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er ant_i-3-(4-metoksyspiro[l ,2-dioksetan-3 ,2 '-( 5 ' - klor)tricyklo[3.3.1.13»<7>]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

12. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er anti-dinatrium-3-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5 '-brom)tricyklo[3.3.1.13>7]dekan]-4-yl)fenylfosfat.

13. Enoleter,karakterisert vedformelen:

hvor Y' er en fosfat- eller galaktosidgruppe, og X er halogen, C^-C^-alkoksy eller hydroksy.

14. Forbindelse ifølge krav 13,karakterisertved at den er dinatrium 3-(metoksy-5-hydroksytricy-klo[3.3.1.I<3>,7]dec-2-ylidenmetyl)fenylfosfat.

15 . Forbindelse ifølge krav 13,karakterisert vedat den er dinatrium 3-(metoksy-5-klortricyklo[3.3.1.I<3>»<7>]dec-2-ylidenmetyl)fenylfosfat.

16. Forbindelse ifølge krav 13,karakterisert vedat den er dinatrium 3-(metoksy-5-bromtricyklo[3.3.1.I<3>•<7>)dec-2-ylidenmetyl)fenylfosfat.