CN1173954C - 与磷酸酶反应产生化学发光的化合物、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能和磷酸酶反应产生化学发光的新的杂环化合物及其制备方法以及其中有用的中间体。该化合物包含一个含N，O或S的、带有一个外向环的碳-碳双键的杂环系统。该双键的远侧末端碳被磷酸基和含有一个O或S的基团进一步取代。本发明还提供了新的组合物，其除了含有该杂环磷酸酯化合物外，还含有一种阳离子芳香族化合物(CAC)。在该组合物中加入CAC可大大增强化学发光的产生并改善检测灵敏度。那些进一步含有阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的组合物可更加改善检测灵敏度。该新的化学发光化合物和组合物可用于发光方法、磷酸酶和酶抑制剂的检测以及那些使用酶标记的特异结合对的检测中。

Description

与磷酸酶反应产生 化学发光的化合物、组合物和方法

本申请是申请人的同时待审的申请日为1996年1月16日的08/585,090号和申请日为1996年7月19日的08/683,927号的美国申请的部分继续申请。

本发明涉及能和磷酸[酯]酶反应并发光的化学发光化合物。本发明特别涉及带有一个杂环基团和一个磷酸烯醇酯基团的化学发光化合物，在磷酸烯醇酯基用磷酸酶除去磷酸基并生成烯醇盐时，它和氧发生反应，产生化学发光和一个羰基化合物。

本发明还涉及与磷酸酶反应而发光的组合物。该化学发光组合物包括含有一个杂环基和磷酸烯醇酯基的第一化合物，以及在磷酸酯化合物和磷酸酶反应中起着增强光产生作用的第二化合物。本发明涉及通过磷酸酶和化学发光组合物反应而发光或化学发光的方法。本发明尤其涉及这些方法的改进，而这些改进可以显著地增强光的发射。

本发明还涉及该化学发光反应和组合物在测定磷酸酶的，和在免疫检测、核酸探针检测及其它类似的检测中，测定磷酸酶标记的特异结合对的，方法中的应用。

本发明涉及能与磷酸酶反应并产生化学发光的化学发光化合物的制备方法。本发明涉及在本方法中有用的新的中间体。本发明尤其涉及制备带有杂环基和磷酸烯醇酯基的化学发光化合物的方法和中间体，它在磷酸烯醇酯基在除去磷酸保护基的情况下和氧反应，产生化学发光和一个羰基化合物。

a.化学发光检测磷酸酶

诸如碱性磷酸酯酶的水解酶经常在生物分子和诸如药物，激素，类固醇以及肿瘤标记物等其它重要被分析物的酶联检测中用作标记物。此外，诸如碱性磷酸酶(AP)和酸性磷酸酶(AcP)的磷酸酶本身就在人类和兽医学诊断中具有重要的临床意义。作为一种安全，方便和灵敏的检测这些酶的方法，化学发光法提供了一个定量测定样品中酶量或酶标记的被分析物的量或标记的被分析物的特异结合对象的量的方法。很多化学发光反应方案已发展到定量的，尤其是定量水解酶的水平。这些方案的大部分是复杂且昂贵的，并需要多种酶或几种试剂。因而阻碍了大部分的此类方法应用于商业化的大批样品的测定。

申请人的以参考文献形式完整地引入本发明的，同时待审的08/585,090号的美国专利申请，公开了带有一个磷酸烯醇酯基的杂环化合物和磷酸酶的化学发光反应。光发射因为阳离子表面活性剂的存在下而增加，从而可检测出10^-18到10^-19摩尔水平的磷酸酶。

申请人的以参考文献形式完整地引入本发明的，同时待审的08/683,927号的美国专利申请，公开了使用阳离子芳香化合物(CAC′s)，使带有一个磷酸烯醇酯基的某种杂环化合物与磷酸酶的反应所发射的光的量显著增加。磷酸酶的检测限也因此而显著地降低。

b.化学法和酶法激发的二氧四节环(Dioxetanes)

带有一个保护苯酚基的激发基团的稳定的1，2-二氧四节环，在除去保护基的条件下，进行化学发光分解(A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.DeSilva，和B.P.Giri，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1155(1987)；A.P.Schaap，R.S.Handley，和B.P.Giri，Tetradron Lett.，935(1987)；A.P.Schaap，M.D.Sandison，和R.S.Handley，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，1159(1987)；和A.P.Schaap，光化学和光生物学(Photochem Photobiol)， 475，50S(1988))。酶法激发的二氧四节环带有一个可用酶法除去的保护基所封闭的芳醚取代基。其在含水的缓冲液中和水解酶反应暴露出芳醚阴离子，而该阴离子按级数促进该二氧四节环的化学发光降解率。化学法激发的二氧四节环带有一个用保护基封闭的芳醚取代基，而该保护基可用简单的化学试剂除去。例如，用氢氧化物对乙酰二氧四节环脱保护，或，用氟化物对甲硅烷氧基二氧四节环脱保护。已公开了很多此类可激发二氧四节环，例如，美国专利4,857,652，5,068,339，4,952,707，5,112,960，5,220,005，5,326,882以及PCT申请WO96/24849，WO94/10258和WO94/26726。然而，一些可激发二氧四节环的固有的缺点是，其在无酶存在时通过缓慢的热分解或非-酶水解而有产生背景化学发光的趋势。

c.鲁米诺(Luminol)衍生物

鲁米诺的磷酸酯和NAG衍生物是众所周知的(K.Sasamoto，Y.Ohkura，化学药学杂志(Chem.Pharm.Bull.)，38，1323-5(1991)；M.Nakazono，HNohta，K.Sasamoto，Y.Ohkura，分析科学(Anal.Sci.)，8，779-83(1992))。用合适的酶处理该鲁米诺衍生物释放出鲁米诺，其再和铁氰化物反应而发光。

d.荧光素衍生物

磷酸酯和半乳糖苷的萤光荧光素衍生物是众所周知的(N.Ugarova，Y.Vosny，G.Kutuzova，I.Dementieva，生物发光和化学发光的最新展望(Biolum.and Chemilum.New Perspectives)，P.Stanley和L.J.Kricka，eds.，Wiley；Chichester，511-4(1981)；W.Miska，R.Gerger，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin.Chemilumin.)，4，119-28(1989))。用合适的酶处理萤光荧光素释放萤光荧光素，其再和荧光素酶和ATP反应而发光。

e.涉及还原剂产生的反应

用碱性磷酸酶催化磷酸酯而产生还原剂的化学发光方法已有报道。(M.Maeda，A.Tsuji，K.H.Yang，S.Kamada，生物发光和化学发光的目前状况(Bioluim.and Chemilum.Current Status)，119-22(1991)；M.kitamura，M.Maeda，A.Tsuji，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin..Chemilumin.)，10，1-7(1995)；H.Sasamoto，M.Maeda，A.Tsuji，分析化学学报(Anal.Chim.Acta)，306，161-6(1995))。该还原剂再引起氧和荧光素间的反应，而从荧光素中发生光。典型的还原剂包括维生素C，丙三醇，NADH，二羟基丙酮，氢化可的松和苯甲酰甲醇。这些方法不同于本发明，本发明涉及从脱保护的荧光化合物而不是光泽精中发光。已知的用酶法产生的，和光泽精反应的还原剂的方法都要求了酶和磷酸酯化合物间的单独的预先温育步骤。这便增添了额外的复杂性和试验时间。

美国专利5,589,328(Mahant)公开了一个化学发光反应，其中的3-吲哚氧基酯，硫代-3-吲哚氧基酯和苯并呋喃酯用酶水解并产生超氧化物。通过加入化学发光产生剂，比如光泽精，而增强发光效应。光泽精通过和超氧化物反应产生化学发光。

f.酶联方法

已知有很多其它的通过酶联反应而检测诸如磷酸酯酶的水解酶的方法和试验。此类方法汇编于A.Tsnji，M.Maeda，H.Arakawa，分析科学(Anal.Sci.)，5，497-506(1989)。其它的双酶化学发光反应的例子见于美国5,306,621和普通的转让申请08/300,367。前者描述的是酶法产生一个过氧化物酶增强因子，以增强过氧化物酶对鲁米诺的化学发光氧化作用；而后者描述的是酶法产生一个过氧化物酶增强因子，以增强过氧化物酶对9，10-二氢化吖啶酸衍生物的化学发光氧化作用。

除了酶法-激发的二氧四节环外，前述的每一个方法均存在需要多种试剂或酶以产生光信号的缺点。虽然已证实这些方法具有优越的检测灵敏度，但这些附加的费用或操作上的复杂性却阻碍其在商业上的应用。已达到这样的灵敏度水平的，但除了酶底物外无需另外的酶或辅助试剂的，检测并定量水解酶的化学发光方法是优选的。本发明提供了这样的方法和化合物。

本发明的一个目的是提供化学发光检测磷酸酶的化合物，该化合物在室温中具有持久的热稳定性和水解稳定性，并能用磷酸酶分解磷酸酯部分。

本发明也有一个目的是提供新的化合物，该化合物的双键的一个末端用含有N，O或S的杂环基取代，另一个末端用酶法可分解的磷酸酯(O-PO₃ ^{2 -})基团取代，该磷酸酯基团可被激发降解并发光。

本发明还有一个目的是提供一个产生化学发光的方法和组合物，该组合物含有上述的可用磷酸酶激发的新化合物。

本发明还有一个目的是提供一种化合物，其在用于检测磷酸酶、免疫测定和众所周知的用磷酸酶标记测定待分析物的方法测定酶联核酸，抗体，半抗原和抗原时，具有优越的发光能力并具有显著的优点。

本发明的上述及其它目的和优越性，是通过具有式I的化合物实现的：

其中，Het是一至少含有一个至少含有一个选自N，O和S的杂原子的五或六元环的杂环系统，Z选自O和S原子，R₆是一个有机基团，每个M独自选自H和一个阳离子中心，n是一个可满足电荷中性的数字。

本发明的上述和其它目的及优点，还要通过能在磷酸酶存在时产生化学发光的组合物试剂的水溶液而实现：一种式I化合物和至少一种有效剂量的能增强化学发光的表面活性剂增强因子。

本发明的上述和其它目的及优点，还要通过包括磷酸酶和至少一种式I化合物反应产生化学发光的方法而实现。

本发明的上述和其它目的及优点，还要通过用化学发光实验过程测定样品中的待分析物的方法而实现，该过程包括：将磷酸酶和至少一种式I化合物反应产生用于检测待分析物的化学发光；测定该化学发光；并将化学发光量和该待分析物的量在数学上联系起来。

本发明的上述和其它目的及优点，还要通过在检测过程中用一个化学发光反应测定待分析物的方法而实现，其包括：提供一个能在磷酸酶存在时产生化学发光的组合物试剂(它作为一个水溶液至少含有一种能和磷酸酶反应的式I化合物，以及有效剂量的用于增强化学发光的表面活性剂增强因子)；磷酸酶和该组合物反应以产生用于测定该待测物的化学发光；并将化学发光量和该待分析物的量在数学上联系起来。

本发明还有一个目的是，提供包括一种阳离子芳香族化合物和一种可被激发降解并发光的式I化合物的组合物。

本发明还有一个目的是，提供一个改进的试剂组合物和磷酸酶反应并发光的方法。

本发明还有一个目的是，提供一个能和磷酸酶反应而迅速地产生有效的化学发光的组合物和方法。

本发明的上述和其它目的及优点，要通过包括一种阳离子芳香族化合物和一种式I化合物在内的试剂组合物，来实现。

本发明的上述和其它目的及优点，要通过一种能在磷酸酶存在时产生化学发光的试剂组合物而实现，该试剂组合物作为水溶液包括：一种阳离子芳香族化合物，一种能和磷酸酶反应的式I化合物，另结合了能迅速地产生高效的化学发光的有效剂量的至少一种阴离子型表面活性剂和至少一种非离子型表面活性剂。

本发明还有一个目的就是，提供一个用于制备能和磷酸酶反应并发光的化学发光化合物的合成方法，以及其中有用的中间体。

本发明还有一个目的就是，提供一个用于制备式I的化学发光化合物的方法和中间体，该式I化合物包括磷酸烯醇酯基和杂环基，它能在去除磷酸酯保护基的情况下和氧反应，产生发光和一个羰基化合物。

本发明还有一个目的就是，提供一个包括磷酸化烯醇的酯或烯醇的硫酯化合物，产生能去除保护成为磷酸单酯盐的磷酸二酯或三酯中间体的方法。

附图的简要说明

图1所示的是100μl的试剂在25℃加入8×10^-16摩尔的碱性磷酸酶(AP)，激发产生的化学发光的强度-时间曲线。该试剂含0.33mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯(acridan phosphate)1(9-(苯氧磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二钠盐)的pH8.5的0.1M tris缓冲液的溶液，和0.01mg/ml的增强因子聚乙烯苄基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯苄基三辛基鏻氯化物(三丁基∶三辛基基团比例约为3∶1)，(增强因子A)。该图也显示了由10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸苯酯代替 1的类似的试剂组合物的化学发光对比曲线。

图2所示的是，在室温下，包括有3毫升的含 1的试剂组合物和2.4×10^-12摩尔的AP在内的反应混和物的紫外-可见吸收光谱曲线。标有A-F的曲线分别代表加入酶后0，5，10，20，40和60分钟的扫描结果。

图3所示的是，由含有 1的200μl试剂组合物和8×10^-13摩尔AP在室温反应所产生的化学发光光谱曲线。

图4所示的是，由含有9，10-二氢化吖啶磷酸酯1的100微升试剂在室温激发所发射的最大化学发光强度相对于AP量的曲线。该化学发光是在室温通过将10微升的分别含有8×10^-15～8×10^-20摩尔酶的AP液加到100微升含有0.33mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯1的tris缓冲液(0.1M，pH8.5)、0.88mM Mg²⁺和0.01mg/ml的增强因子的溶液的白色微孔板的孔中。该术语S-B是指有AP存在时，以相对光单位(RLU)表示的化学发光信号(S)除去无AP存在时的本底化学发光(B)。该图显示了碱性磷酸酶的线性检测。在此条件下，理论上的检测限(本底标准差的两倍)定为8×10^-19摩尔。

图5所示的是，由100微升的含有0.33mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯. 1的0.1Mtris缓冲溶液(pH9)，0.88mMgCl₂的试剂组合物所发射的总化学发光强度相对于AP的量的曲线。将这种组合物于室温和10μl的含有8×10^-15到8×10^-20摩尔的酶的AP溶液，或是作为空白试剂的10μl水在黑色的微孔板孔中反应。加入含有0.5mg/ml的增强因子A的1N NaOH(100μl)溶液后积分光强度10秒钟。该图显示了碱性磷酸酶的线性检测关系。

图6所示的是Western-blot实验的X-射线胶片的数值扫描图，该实验是用化学发光试剂组合物通过AP标记的抗体在PVDF膜上检测人铁传递蛋白。将分别含有5000，1000，180，30和5pg蛋白的铁传递蛋白稀释液电泳并转移到膜上。蛋白测定是将该蛋白斑快速浸入含有0.5mg/ml的增强因子A的0.2M，pH9.6的2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲溶液，0.88mM MgCl₂和0.66mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯 1的试剂组合物中，并在保温10分钟后暴露于X-射线胶片1分钟而进行的。

图7所示的是加入光泽精到 5和碱性磷酸酶(AP)的反应溶液后，该反应所产生的化学发光效应曲线。将相同体积的两种含有5的缓冲液溶液和8×10^-16摩尔的碱性磷酸酶(AP)反应。其中一个溶液还含有6.4μM的光泽精。

图8所示的是100μl的试剂A在室温通过加入8×10^-16摩尔的AP激发而发射的化学发光强度的时间曲线，其中该试剂A是由0.1M的tris缓冲液(pH8.8)，6.4μM光泽精，0.66mM9，10-二氢化吖啶磷酸酯 5(从0.066M的甲醇溶液中1∶100稀释而来)，1mg/ml十二烷基硫酸钠SDS，0.01mg/mlNa₂SO₃，0.033％(w/v)吐温20和0.88mM MgCl₂所组成的。该图还显示了含有 5和阳离子型聚合表面活性剂增强因子(0.25TB/TO)的试剂组合物的对比的化学发光曲线。

图9所示的是由100μl含有9，10-二氢化吖啶磷酸酯 5，光泽精，SDS和TWEEN 20的本发明的组合物试剂在25℃激发而产生的最大化学发光的强度相对于AP量的曲线。作为对照，还提供了用试剂组合物(试剂B)在37℃激发经过一系列实验而得到的类似曲线。该试剂B包含有相同的9，10-二氢化吖啶磷酸酯和(0.25TB/TO)，但却不含光泽精。该化学发光的发射是通过将10μl的含有8×10^-13和8×10^-22摩尔的酶的AP溶液加入到100μl的存在于白色微孔板的孔中的各个试剂组合物中。该S-B是指用相对光单位(RLU)表示的化学发光信号(S)在AP存在时的值减去无AP存在时的本底化学发光(B)值所得的值。该图显示了含有光泽精的试剂A对AP的检测限降低了100倍。

图10所示的是由100μl的试剂组合物所发射的最大化学发光的强度相对于AP的量的曲线图。该组合物包括0.66mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯 7的0.1M tris缓冲液(pH8.8)溶液，6.4μM光泽精，1mg/ml SDS，0.01mg/ml Na₂SO₃，0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM MgCl₂。该组合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10^-15到8×10^-22摩尔的酶的AP溶液，或和作为空白对照的10μl的水室温反应的，并在75秒钟后进行检测。

图11所示的是由100μl的试剂组合物所发射的最大化学发光强度相对于AP量的曲线图。该组合物包括0.66mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯 8的0.1M tris缓冲液(pH8.8)溶液，6.4μM光泽精，1mg/ml SDS，0.01mg/ml的Na₂SO₃，0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM的MgCl₂。该组合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10^-15到8×10^-22摩尔的酶的AP溶液，或和作为空白试剂的10μl的水室温反应并在75秒钟后进行检测。

图12所示的是由100μl的试剂在室温通过加入8×10^-16摩尔的AP而激发并发射的化学发光的快速产生的曲线(时间-光强度)。该试剂由0.1MTris缓冲液(pH8.8)，6.4μM光泽精，0.66mM9，10-二氢化吖啶磷酸酯 7(从其0.066M的甲醇溶液中1∶100稀释而来)，1mg/ml的SDS，1mg/ml的Na₂SO₃，0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM的MgCl₂所组成。

图13所示的是用本发明的检测试剂化学发光免疫测定人绒毛膜促性腺的激素(hCG)的结果的曲线。

图14所示的是本发明的检测试剂快速化学发光免疫测定甲状腺刺激素(TSH)的结果的曲线。

图15所示的是用本发明的检测试剂化学发光免疫测定甲状腺刺激素(TSH)的结果的曲线。

图16所示的是用本发明的检测试剂化学发光免疫测定雌二醇的结果曲线。

图17所示的是在一个样品中同时测定酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的能力的曲线。上面的曲线是从含有两种酶的一个样品中发射的光，下面的曲线则代表从仅含酸性磷酸酶样品中发射的光，中间的曲线则代表可归因于碱性磷酸酶的上述两曲线的差别。

图18所示的是由100μl的组合物试剂所发射的最大化学发光强度相对于AP量的曲线。该组合物包括0.66mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯 12的0.1M tris缓冲液(pH8.8)溶液，6.4μM的光泽精，1mg/ml的SDS，0.01mg/ml的Na₂SO₃，0.033％(w/v)的TWEEN 20和10μM的MgCl₂。该组合物在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10^-15到8×10^-22摩尔酶的AP溶液，或和作为空白对照的10μl水室温反应并在75秒钟后进行检测。

图19所示的是由100μl的组合物试剂所发射的最大化学发光强度相对于AP量的曲线。该组合物包括0.3mM的9，10-二氢化吖啶磷酸酯 13的0.1M tris缓冲液(pH8.8)溶液，3.2μM光泽精，0.016％(w/v)的TWEEN 20和5μM的MgCl₂。该组合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10^-15到8×10^-22摩尔酶的AP溶液，或和作为空白试剂的10μl水室温反应并在75秒钟后进行检测。

优选的实施方案的说明

如申请人的同时待审的美国专利申请08/585,090所公开的那样，现已意外地发现，某些新的化合物和磷酸酶反应产生易于检测的化学发光。本发明的在磷酸酶存在时能产生化学发光的化合物具有通式：

其中，Het是一至少含有一个含有至少一个选自N，O和S原子的五或六元环的杂环系统，Z是一个O或S原子，R₆是允许光产生的机基团，每个M独立选自H和阳离子中心，n是可满足电荷中性的数字。磷酸酶和化合物I在氧存在的条件下反应生成电子激发状态的含有羰基的式VI化合物(VI^*)和去磷酸化的产物VII。辐射分解该VI^*导致光的发射。

式I的杂环系统包括至少一个选自N，O和S原子的杂原子并和带有外向环双键的碳环相联。优选的杂环化合物包括下列的式II和III化合物及其双键异构体或异构体的混合物。

其中的Z，M，n和R₆如上述定义，而R₁～R₅如下文定义。

作为式I化合物的优选骨架，典型的含有Het基的环结构包括下列结构，其中的星号指示外向环双键的位置。虽然没有清楚地给出所有可能的取代类型，但显而易见的是，每个环位置都可含有除了氢外的取代基。本领域的熟练技术人员会理解那些没被具体列出的，却属于式I范围的其它杂环化合物。

在所有的上述化合物中，R₁是一个有机基团，其除了含有为满足基团中原子价而必需的H外，还含有1到50个选自C，N，O，S，P和卤素的原子。该有机基团优选地选自烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基和芳烷基。更优选地，R₁基团包括C₁-C₄的烷基和苯基。

在全部上述化合物中，可以是相同或不同的每个R₂-R₅基团是H或一个允许光产生的取代基，并且其一般都带有1到50个选自C，N，O，S，P和卤素的原子。可以列出的典型的取代基包括(但并不限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，链烯基，炔基，烷氧基，芳氧基，卤素，氨基，取代氨基，羧基，羰烷氧基，甲酰胺，氰基以及磺酸基。相邻的基团对的任一个或两个基团，即R₂-R₃或R₄-R₅都可以联成碳环或杂环系统。该系统至少含有一个五或六元环并和带有外向环双键的环稠合。该稠合的杂环可以含有1个或多个N，O或S原子并且可以在环碳上用诸如上述的非氢的基团所取代。

取代基可以不同的数量在选择的环位点引入，以便改良该化合物的特性或为合成最终的磷酸酯化合物提供便利。这些特性包括诸如化学发光量子率和酶反应率，最大光发射强度，光发射的持续时间，发射光的波长及其在反应介质中的溶解度。在下列具体的实施例中阐明了具体的取代基及其效应，然而，这却无论如何不能认为是对本发明范围的限制。

每个M基团分别含有一个氢原子或一个阳离子中心。阳离子中心的意思是诸如钠原子Na⁺的带正电荷的原子，诸如铵离子NH₄ ⁺的原子团或是带有一个或多个位点的正电荷的分子的一部分。后者的例子包括申请人的美国专利5,451,347中所述的二价阳离子化合物和申请人的美国专利5,393,469所述的带有多价阳离子基团的聚合化合物。该阳离子中心的正电荷可以是任何单位值，即1，2，3等。典型的阳离子中心包括，但并不限于，碱金属离子，碱土离子，季铵离子和季鏻离子，并且它们是按其价态所要求的数量而存在的。如果在式I化合物中为了电中性的需要有两个基团，那么它们可以是相同的或不同的。优选的抗衡离子是碱金属离子。

如上所述，该有机基团R₆可以是任何允许，或不干扰，光产生的基团，并且优选地含有1到50个选自C，N，O，S，P和卤素的原子，而所必需的H原子的数目是为了满足基团中原子的价态的需要。可以作为R₆的基团包括(但非限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基。除了H原子外的诸如离子基团或极性基团的取代基可以不同的数目在所选择的R₆碳链或环的位置引入，以便改良该化合物的特性，或为最终的磷酸酯化合物的合成提供便利。这些特性包括诸如化学发光量子率和酶反应率，最大发射光强度，光发射的持续时间，发射光波长及其在反应介质中的溶解度。在下列的具体实施例中阐明了具体的取代基及其效应，但无论如何却不能认为这是对本发明范围的限制。

该化合物的一种优选类别具有下式IV的结构，其中，Ar是带有至少一个碳-或杂-芳环的芳环基团，并且它还可以进一步被取代，Z选自O和S原子，R₁如上述定义，M是如上述的H或单价或二价阳离子的抗衡离子，和n是2或1。

可以是相同或不同的每一个R₇～R₁₄基团是H，或是含有1到50个选自C，N，O，S，P和卤素的原子并且允许光产生的取代基。这些基团可包括(并非限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，链烯基，炔基，烷氧基，芳氧基，卤素，氨基，取代氨基，羧基，羰烷氧基，甲酰胺，氰基和磺酸基。相邻的基团，如R₇～R₈或R₈～R₉，可以联接成含有至少一个5或6元环的碳环或杂环系统。R₇～R₁₄优选选自氢和诸如甲氧基，乙氧基，叔-丁氧基的烷氧基及其类似物。特别优选的化合物具有式V结构，其中的Z是O或S，Ar是苯基、取代苯基、萘基或取代萘基，M和n则如上述定义。

本发明的另一方面是在和磷酸酶反应产生可见的化学发光的方法中，式I-V的任何一个化合物的使用。将式I-V化合物和磷酸酶在含水缓冲溶液中反应产生易于检测的化学发光。当该反应于室温在碱性pH进行时，光强度在数分钟内达到最高水平。任选地，该反应可在有增强因子存在的条件下进行。

尽管在这里不希望束缚于任何对该发现的具体的机理解释，但分子氧是必需的反应物并且该反应产物是酮VI，酯或硫酯VII，式R₆ZH化合物和磷酸根离子。光发射来自处于电子激发态的VI。光产生的一个必要条件是该反应在能产生足够的能量以形成激发态的VI。如果VI是荧光的，那么化学发光通过激发态的VI发射而直接从反应中产生。一个特别意外的发现是式I化合物和磷酸酶在中等碱性pH中反应所产生的光发射强度要比，其通过断裂磷酸基所形成的烯醇酯中间体(VII阴离子)的自动氧化作用所产生的强度，要高得多。

在一个优选的产生化学发光的方式中，含有9，10-二氢化吖啶环的化合物和碱性磷酸酶，在pH介于8到10的碱性缓冲液中反应，产生起始于该酶和磷酸酯化合物反应的连续化学发光信号。任何时间点的光强度都可通过加入至少一种将在下文中有更为详细的说明的表面活性剂增强因子而增加到至少40倍。

在一个优选的从式IV化合物和磷酸酶的反应中产生光的方法中，该反应是在温度介于5℃到50℃，优选介于20℃到40℃，pH介于7到10.5，优选介于8.5到10的缓冲水溶液中进行的。所用的式IV化合物的浓度介于1μM到20mM，优选介于10μM到1mM。该酶优选是碱性磷酸酶或碱性磷酸酶的联接物。光是从激发态的VIII中发射的。

典型地，本发明的化合物产生出发射波段宽度介于100-200nm的光，且其在波长从近紫外区到可见区的电磁波谱中具有最大强度。典型的最大强度波长λmax介于350-500nm。考虑到可能是，带有共价联接的但并非和乙烯基磷酸酯部分的双键结合的荧光团的式I磷酸酯化合物可以在激发态的产物VI^*形成的基础上进行分子内的能量转移，从而导致激发态的荧光团在较长的波长辐射。

可以在一种方法中，同时使用多于一种的式I化合物通过与磷酸酶的作用而发光。在一些情况下，同时使用二种或更多种式I化合物和磷酸酶反应可能有利。当该两种或更多种化合物具有不同的发光或物理性质时，可以期望此二者的结合产生出具有使用任何一种化合物都不易获得的特征的发光反应。式I化合物间可能不同的发光和物理特性的例子包括发射光谱，光发射时间，酶周转，增长到最大的辐射的速率，疏水性/亲水性以及溶解度。尽管在本方法的式I化合物间不同的可能尤其是发光性质，但这些性质上的差异并不影响该化合物的基本用途；可以根据这里所述的指导和方法对具有合适的特性的特别化合物作出选择。

本方法的光发射可以用任何已知的合适设备进行检测，比如发光计，X射线胶片，高速摄相胶片，CCD照相机，闪烁计数器，化学曝光计或视觉方法。每种方式具有不同的光谱敏感性。人眼对绿光最敏感，CCD照相机对红光最敏感，X射线胶片对紫外到蓝色的光或对绿光最敏感。检测设备的选择可根据用途和费用、方便性的考虑以及是否需要永久记录结果而进行。

可以考虑，使用荧光能量受体将最大发射(波长)移至更长的波长处(红移)。各种红移发射技术在光化学反应和试验领域内是众所周知的。如上述的共价联接荧光团就是一个例子。荧光增白剂可作为单独的物质加入该反应液中。荧光增白剂可以和诸如阳离子聚合物的增强因子相联，或和诸如胶束或聚合物的增强因子相联，以便使该荧光增白剂和该化合物紧密接触。或者，可以在酶反应期间，通过去除磷酸酯基团，提供可转化成荧光形式的以非荧光形式存在的荧光增白剂。而后者的例子包括荧光素二磷酸酯，香豆素磷酸酯如4-甲基-7羟基香豆素磷酸酯，苯并噻唑磷酸酯如ATTOPHOS(用LScientific，San Luis Obispo，California)。

在本发明的化学发光反应中也可以使用至少一种增强因子化合物以便增加发射光的量。在本方法中有效的增强因子的作用可以通过增加发光的激发态产物分子的份额，通过增加以激发态形成的产物分子的份额，通过增加酶的反应或周转率，通过增加随后的化学反应步骤的速率，通过改善酶的稳定性，通过促进该酶和式I化合物的结合，通过抑制或阻止竞争性的非发光副反应，或通过任何这些机理的组合。使用有效剂量的增强因子以增强化学发光，其剂量在终反应液中优选介于0.001到5mg/ml间，更优选介于0.01到2.5mg/ml间。

在本方法的操作中有效的增强因子化合物是典型的表面活性剂化合物，即那些具有表面活性的特性，如表面张力减弱，表面湿润或去污的化合物。表面活性剂包括一个带有极性的和/或离子的基团的亲水区域和一个主要含有烃基或亚烷氧基或两者都有的疏水区域。表面活性剂可分成阳离子型，阴离子型，非离子型和两性离子型，并可以是单聚的或多聚的。已发现的在本发明的实际操作中有用的阳离子型表面活性剂包括带有季鏻基侧基的聚乙烯型聚合物，这在美国专利5,393,469中已公开，其公开内容作为参考文献引入本发明。这类聚合物的实例包括聚乙烯苄基三丁基鏻氯化物和聚乙烯苄基三辛基鏻氯化物的共聚物，以及(聚乙烯苄基三丁基鏻氯化物)。带有季铵侧基的聚乙烯型聚合物也作为增强因子用于本发明。此类聚合物的实例公开于美国专利5,112,960，其公开内容作为参考文献引入本发明，并且它包括聚乙烯苄基苄基二甲基铵氯化物和聚乙烯苄基三丁基铵氯化物。

另一类已发现的在本发明的实践中有用的阳离子表面活性剂增强因子是，如美国专利5,451,347(其公开内容作为参考文献引入本发明)中所公开的，带有两个季铵基或鏻基的二价阳离子化合物。比如可以使用(二氯化1-三辛基鏻甲基-4-三丁基鏻甲基苯，在按照本发明的发光方法中增强化学发光。还有其它一些在本发明的实践中有用的表面活性剂增强因子是，单季铵盐如十六烷基甲基铵氯化物或溴化物和如十六烷基甲基溴化铵的单季鏻盐。

阴离子型表面活性剂增强因子包括烷基硫酸盐和烷基磺酸盐。非离子型表面活性剂增强因子包括聚氧乙烯化的烷基酚，聚氧乙烯化的乙醇，聚氧乙烯化的醚和聚氧乙烯化的山梨醇酯。两性离子表面活性剂增强因子包括季铵烷基磷酸盐和磺酸盐。每类表面活性剂的示范结构的更全面的记录可参考任何级别的有关表面活性剂的论文中。已试验出许多典型的表面活性剂并已发现其在不同的程度上比其不存在时可增加光产生的量和强度。特别地，已发现阳离子表面活性剂季铵盐和季鏻盐是最有效的增强因子。

如上文所述，表面活性剂增强因子还可以通过静电作用或疏水作用，带有共价结合或缔合的荧光基团。

在完成本化学发光反应的一个另外的替代方式中，该化学发光化合物在没有增强因子存在的几秒钟到约等于十分钟的第一段时间内，和缓冲液中的磷酸酶在5.0到9.5的第一个pH范围内反应。忽略在此第一段时间发出的所有光。然后立即加入含有增强因子的强碱性激发溶液并测定发射光的峰值，或积分第二个固定时间段内或直至光发射终止的光发射。理想的是，选择合适的pH和增强因子量以便使全部光在一个优选约为一分钟或更少的时间段内发射。该激发溶液的pH应该大于11且优选大于12。优选的碱是氢氧化钠和氢氧化钾。在这种反应方式中有用的增强因子是按前述的方法分类的并以有效的剂量使用，以增强化学发光。该剂量优选是在终反应液中介于0.001到1mg/mL。

这种产生化学发光的方式可能在同时处理大量样品以便在随后的时间内检测的试验中有利。酸性磷酸酶的检测也可以按此方式进行。一个也可任选加入该化学发光反应或试验的步骤是，在第一段时间后加入一种酶抑制剂到该反应体系中，以终止全部的进一步的酶反应。

由于该反应是由磷酸酶催化的，极少量的酶足以产生可检测的量的光。灵敏度已达到1×10^-18摩尔。这种检测如此少量磷酸酶的能力使得本化学发光技术适于测定许多类型的使用酶联检测的被分析物。

本发明的化学发光反应提供了一个特别有效的检测那些结合于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，尼龙膜和硝酸纤维素滤纸和膜上的AP联接物的试剂。令人惊奇地发现，PVDF膜上的抗体-AP联接物和含有化合物 1的试剂组合物反应，产生了强烈的几乎立即达到最高水平的化学发光并且它基本上能维持连续的强度至少两天。因此，这对胶片检测和优化影像强度是特别方便的。

意外地发现，产生于PVDF膜上的光发射在有用的水平上持续很长时间，超过一个月。那些本领域熟悉的用于基于膜的检测方案的化学发光试剂提供了一个带有时间程序的化学发光信号，它表示：或迅速衰减，如带有过氧化物酶的鲁米诺在3-4小时内衰减；或，缓慢上升且渐渐地衰减，如酶激发的二氧四节环类。

另一方面，本发明涉及通过和磷酸酶反应而产生化学发光的试剂组合物，其包括一种pH介于大约7到10.5的缓冲水溶液，一种浓度介于0.01到10mM间的式I化合物，以及可选择性加入的，至少一种优选介于0.001到10mg/ml间有效效量的用于增强化学发光的增强因子。和碱性磷酸酶进行化学发光反应的配方还可包括0.01-10mM浓度的镁或锌盐以增加酶的活性。

一个优选的和碱性磷酸酶反应产生化学发光的试剂组合物包含有一种pH介于大约7到10.5间的缓冲水溶液，浓度介于0.01到10mM的式IV或V的9，10-二氢化吖啶磷酸酯，以及优选介于0.001到10mg/ml的有效剂量的用于增强该化学发光的表面活性剂增强因子。该配方还包含有浓度介于0.01到10mM的镁盐。

组合物试剂中的表面活性剂优选选自含有铵或鏻基团的聚合阳离子增强因子和含有铵或鏻基团的二价阳离子增强因子。特别优选的是在每个单体单元上带有一个三烷基鏻基侧基的聚乙烯聚合物，以及在每个单体单元上带有一个三烷铵基或苄基二烷铵基侧基的聚乙烯聚合物。在一个给定的应用中，可按照常规的实验方法选择增强因子及其量以期发挥其最佳作用。一个优选的测定溶液中的AP或联接物的组合物包括胺缓冲液(pH8.5)，9-(苯氧磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢化吖啶，二钠盐化合物，0.1-1mM，镁盐化合物，0.1-1mM，以及增强因子A(聚乙烯苄基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯苄基三辛基鏻氯化物，三甲基∶三辛基约为3∶1的比率)，0.01-0.1mM。一个优选的测定膜上的AP或其联接物的组合物包括一pH9.6的胺缓冲液，9-(苯氧磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶，二钠盐化合物，0.1-1mM，镁盐化合物，0.1-1mM，以及增强因子A，0.1-1mM。

申请人的同时待审的美国专利申请08/683,927公开了在上述反应体系中加入阳离子芳族化合物(CAC)从而大大地提高了光产生的量和/或强度。而且，将该CAC在无磷酸酶存在的情况下加入式I化合物并没有导致相应自发的(背景)化学发光的增加，因为据信，该CAC是对衍生于式I化合物的去磷酰化中间体起作用而并非对式I化合物本身起作用。明显的是，该光发射连续产生于激发态的VI而不是CAC。

已发现各种CAC能对光产生的量和/或强度的增加起作用。各种CAC(CACs)是在该芳环或环体系或其中的一个环上一个取代基上带有至少一个正电荷的芳族化合物，前提是该取代基和不饱和环原子相联。

本发明的CACs是那些具有氧化/还原能力的、适于在本发明的反应中引起化学发光增加的化合物。作为CACs的化合物的适应性可通过下列具体实施例所述的方法而容易地确定。不限制于任何具体的机理解释，I的去磷酰化作用的中间产物将进行一个可逆的或不可逆的氧化还原反应。分子氧和该反应中的选自CAC、还原态的CAC或式I化合物的去磷酰化中间体、或其氧化态或还原态的一种或几种的反应物反应，并最终生成衍生于式I化合物的氧化反应产物。该氧化反应产物再进行一个很可能是O-O键断裂的化学发光反应。

本发明的CACs可以是带有一个或多个单独的或稠合的芳环的杂芳环化合物，并且该芳环含有至少一种非碳原子(杂原子)，优选含有一个或多个氮原子并且该正电荷基本上位于一个或多个杂原子上。此类CAC的实例是花青染料，硫代花青染料，羰花青染料，硫代羰花青染料，硒酸羰花青染料，偶氮染料和下式的吖啶衍生物：

其中Q是吸电子基团，X-是无干扰的阴离子抗衡离子，R是可选择性含有非干扰取代基的烷基或芳烷基。其中的一些环氢被其它取代基取代的吖啶衍生物也在该CACs的范围内。该吸电子基团Q可以是如卤素(如CD，氰基，或是诸如酯基-COOR，硫酯基-COSR，酰胺基-COMR¹R²的羰基，或是磺酰胺基-CON(R)SO₂R’。类似地，该CAC可以是菲啶或菲咯啉化合物的一个衍生物。

如果该阳离子位点是和芳环相结合的，本发明的CACs可以是含有一个或多个弧立的或稠合的碳环的芳环的芳环化合物，且该芳环至少带有一个含至少一个杂原子的阳离子取代基。在最新种类的CAC中，该杂原子优选是N或S原子。其实例包括亚甲蓝和尼罗蓝。

本发明的CACs可带有不止一个正电荷；如二价阳离子化合物属于本发明的范围内。典型的此类化合物包括俗称光泽精的N，N′-二甲基二吖啶二硝酸酯，和俗称二氯化甲基Viologen或二氯化百草枯的1，1′-二甲基-4，4′-二吡啶二氯化物。

顺便说明，在本发明中用作CAC成分的其它化合物包括表1中的化合物。

表1，CACs

Alcian黄，碱性蓝41，碱性蓝66，碱性红29，

3-苄基-5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑，

高氯酸[2-[2-[2-氯-3-[(1，3-二氢-1，3，3-三甲基-2H-吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]1，3，3-三甲基吲哚，{IR-786高氯酸盐}，

碘化反式-4-[4-(二丁基氨基)苯乙烯基]-1-甲基吡啶

碘化5，5′-二氯-11-二苯基氨基-3，3′-二乙基-10，12-乙烯硫代三羰花青，{IR-140}，

碘化3，3′-二乙基-9-甲基硫代羰花青，

碘化1，1′二乙基-2，2′奎诺三羰花青，

碘化3，3′-二乙基硒代羰花青，

碘化3，3′-二乙基硫代花青，

碘化3，3′-二乙基硫代二羰花青，

碘化2-[4-(二甲基氨基)苯乙烯基]-3-乙基苯并噻唑，

溴化3，6-二甲基-2-(4-二甲基氨基苯基)-苯并噻唑，

碘化3，4-二甲基-5-(2-羟乙基)噻唑，

四氢硼酸4-[2-[3-[(2，6-二苯基-4H-噻喃-4-亚基)亚乙基]-2-苯基-1-环-己烯-1-基]乙烯基]-2，6-二苯基-硫代吡咯，{IR-1040}，

碘化5-[3-乙氧基-4-(3-乙基-5-甲基-2(3H)-苯并噻唑基-亚基)-2-亚丁烯基]-3-乙基-2-[(3-乙基-4，5-二苯基-2(3H)-亚噻唑基)甲基]-4，5-二氢-4-氧代噻唑，

氯化3-乙基-2-(2-羟基-1-丙烯基)苯并噻唑，

碘化3-乙基-2-甲基苯并噻唑，

碘化3-乙基-2-甲基苯并噁唑，

氯化1-乙基-3-甲基-1H-咪唑，

亚甲蓝，尼罗蓝A，以及三磷酸吡啶核苷酸，钠盐水合物

因此，本发明的另一方面是在通过和磷酸酶反应而产生可检测的化学发光的方法中，使用任何一个式I-V化合物和CAC。式I-V化合物和磷酸酶在有CAC存在的含水缓冲液中反应，产生出发自激发态的IV中的易于检测的化学发光。当该反应于室温在碱性pH中进行时，光强度在数秒到数分钟内即可达到最高水平。

在一个优选的产生化学发光的方法中，含有一个9，10-二氢化吖啶环的式IV化合物，在有CAC存在且pH介于7到10.5的碱性缓冲液中，和碱性磷酸酶反应，产生出起始于该酶反应的连续的化学发光信号，并迅速达到强度峰值。如同下文中更加详细说明的那样，在该组合中加入一种阴离子表面活性剂和一种非离子型表面活性剂将会进一步改进该发光反应。

在一个优选的从式IV化合物和磷酸酶以及CAC的反应中发光的方法中，该反应是在温度介于5℃到50℃，通常介于20℃到40℃，pH介于7到10.5，优选介于8到10的缓冲水溶液中进行的。由于近乎室温的温度对光强度的影响较小，所以在室温中进行该反应特别方便，无需精确地调节温度。所用的式IV化合物的浓度介于1μM到20mM，优选10μM到10mM。而该酶则优选是碱性磷酸酶或其结合物。

可在一个方法中同时使用不止一种的式I-V化合物，其通过碱性磷酸酶在有CAC存在的条件下的作用而发光。将两种或两种以上的式I-V化合物同时和磷酸酶及CAC反应在一些情况下可能有利。当两种或两种以上的化合物具有不同的发光或物理特性时，可以要求该组合产生出其特性不易通过使用任何一个化合物而获得的光发射反应。式I-V化合物间可能不同的发光和物理特性的实例包括发射光谱，发光持续时间，酶周转，最大发射的发生率，疏水性/亲水性和溶解度。

类似地，可在一种方法中同时使用多于一种的CAC，通过碱性磷酸酶的作用而发光。所用的CAC浓度介于10^-2M到10^-9M间，优选10^-4到10^-7M间。用于本法中具体的CAC的理想浓度可按照下文具体的实施例中所述方法而方便地确定。

另一方面，本发明涉及一种通过和碱性磷酸酶反应而产生化学发光的试剂组合物，其包括一种pH介于大约7到10.5的缓冲水溶液，一种式I-V化合物以及能提供可增强化学发光水平的有效量的CAC。

另外，已发现在式I-V化合物及CAC和碱性磷酸酶的反应中加入某种添加剂将进一步对该发光反应产生有利的改进。因此，本发明还有一方面是涉及含有一种式I-V化合物，一种CAC，一种有效剂量的阴离子表面活性剂和一种有效量的非离子型表面活性剂的试剂组合物。阴离子型表面活性剂实际上起着提高达到最大化学发光强度的速度的作用。非离子型表面活性剂则实际上起着增强化学发光产生的量和强度的作用。使用后者组合物对提供可迅速达到并维持光强度峰值的增强的光发射尤其有利。

和其中的阳离子表面活性剂能增强化学发光的产生的申请人的同时待审的申请08/585,090的方法相反，无论加入单体的或聚合的阳离子型表面活性剂，都不能促进需要CAC存在的化学发光反应。在一些情况下，含有阳离子型表面活性剂实际上会抑制光的产生。本方法和组合物中的阳离子型表面活性剂的相反的作用，更支持和说明了本化学发光反应方法的引用CAC的独到之处。

在含有一种CAC的组合物中使用的阴离子型表面活性剂包括具有至少十个碳原子的烷基的烷基硫酸盐和烷基磺酸盐。优选的化合物是十二烷基磺酸钠(SDS)。所用的阴离子型表面活性剂的量优选为大约10mg/ml到10μg/ml。

用于含有一种CAC的组合物中的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯化的烷基酚，聚氧乙烯化的乙醇，聚氧乙烯化的醚以及聚氧乙烯化的山梨醇酯。优选的非离子型表面活性剂包括TWEEN 20和TRITON X-100。所用的非离子型表面活性剂的量优选介于该组合物的大约1.0％到0.001％的重量百分比。

各类表面活性剂的示解结构的更为广泛的记录可参考有关表面活性剂的任何级别的论文，并且这也是本领域熟练技术人员所共知的。申请人已试验了许多代表性的表面活性剂，并发现，和其不存在时相比，它们能在不同程度上增加光产生的量和强度。

本发明还有一个方面是一种试剂组合物，其包括一种式I-V的化合物，一种CAC，一种有效量的阴离子型表面活性剂，一种有效量的非离子型表面活性剂，以及一种有效量的能减少在无碱性磷酸酶存在时的组合物中光产生(背景化学发光)的背景抑制剂。

背景抑制剂是那些能减少无碱性磷酸酶存在的组合物中光产生的化合物。这种抑制剂也能起着防止背景化学发光在一段时间内的累聚作用。这种抑制剂还能起着改善由该组合物和碱性磷酸酶的反应所产生的特异信号和背景化学发光的比率(信噪比)的作用。优选的能有效地减少背景化学发光的量的化合物包括，诸如亚硫酸锂，亚硫酸钠和亚硫酸钾等亚硫酸盐。

一个优选的检测溶液中的AP或联接物的组合物包括：一种胺缓冲液，pH8.5-9，0.1-1000μM的光泽精，0.1-1.0mM的化合物5，0.1-5mg/ml SDS，1-100μg/ml Na₂SO₃，0.01-0.1％(w/v)TWEEN 20和0.1-1.0mM镁盐。一个优选的检测膜上的AP或联接物的组合物包括一种胺缓冲液，pH8.5-9，0.1-1000μM的光泽精，0.1-1.0mM化合物5，0.1-5mg/ml SDS，1-100μg/ml Na₂SO₃，0.01-0.1％(w/v)TWEEN 20和0.1-1.0mM镁盐。

在本方法中有效的组合物发挥作用，可以通过增加发光的激发态产物分子的份额，通过增加用于形成激发态的产物分子的份额，通过增加酶的反应率或周转率，通过增加随后的化学反应步骤的速率，通过改善该酶的稳定性，通过促进该酶和式I化合物的结合，通过抑制或阻止竞争性的非发光副反应，或通过其它还不清楚的机理。

考虑到的是，能使用荧光能量受体将最大发射移至较长的波长区(红-移)。各种有关发射红-移的技术在化学发光反应和检测领域内是共知的。荧光增白剂能和式I-V化合物共价联接，从而使得相应的激发态化合物VI能进行分子内的能量转移，进而可在较长的波长处发射光。荧光增白剂可作为单独的物质加入该反应液中。荧光增白剂可以和能形成胶束的阴离子型或非离子型表面活性剂相联，以便使荧光增白剂和该发光物紧密接触。或者，荧光增白剂可以能在酶反应期间通过去除磷酸基而转化成荧光形式的非荧光形式存在。而后种类型的化合物的实例包括荧光素二磷酸酯，香豆素磷酸酯如4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯和苯并噻唑磷酸酯如ATTOPHOS(JBLScientific，San Lais Obispo，California)。

本化学发光方法的一个重要用途是，通过化学发光反应在一个试验步骤中检测待分析物的存在或含量。该方法的步骤包括，将可能含有被分析物的样品和本发明的化学发光化合物及碱性磷酸酶接触，用定性方法检测光的产生，并且若需要定量分析，则进一步建立起光产生量和被分析物的量之间的数学关系。而这种光强度和待分析物量之间的关系，可以容易地通过用已知量的被分析物所建立的标准曲线而得出。该化学发光化合物所用的浓度一般大约为10^-5M到10^-3M，优选介于大约10^-4M到10^-3M之间。当在溶液中检测时，该碱性磷酸酶的浓度优选大约低于10^-9M。用该化学发光反应的方法分析的样品一般是诸如血液，血浆，血清，尿和精液等体液。

这里所说的被分析物(与待分析物通用)是指能在一样品中检测其存在或含量的物质。用本法检测的被分析物可以包括磷酸酶，当然在此检测中不需另外加入磷酸酶。被分析物可以是磷酸酶抑制剂。被分析物可以是那些能用本领域共知的包括免疫试验，核酸探针试验，细胞受体试验及其类似试验的配体-结合试验进行检测的各种类型的有机和生物分子。在这些试验中，该被分析物是用磷酸酶标记或通过磷酸酶标记的特异的结合对象，而被特异地检测。磷酸酶可作为被分析物结合化合物的标记物而直接结合。或，被分析物结合化合物可以和至少一种磷酸酶标记的该分析物结合化合物的特异结合物结合。或，该被分析物结合化合物可用至少一种第二特异结合物标记并再和磷酸酶标记的第二特异结合物的结合物结合。磷酸酶也可以作为配体类似物如竞争性试验中的酶-半抗原联接物上的标记物而被提供。

能进行化学发光反应的磷酸酶包括来源于诸如E.coli的细菌的碱性磷酸酶，或哺乳动物的碱性磷酸酶，或来源于植物或哺乳动物的酸性磷酸酶。磷酸酶和生物分子的结合物也可以用于本方法中以产生化学发光，唯一的条件是该结合物表现出磷酸酶活性，即水解磷酸单酯的能力。能和一个或多个磷酸酶分子结合的生物分子包括DNA，RNA，寡聚核苷酸，抗体，抗体片段，抗体-DNA嵌合体，抗原，半抗原，蛋白质，植物凝血素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白和生物素。作为生物分子的连接物的、含有或结合有磷酸酶的结合物，如脂质体，胶束，泡囊和聚合物，也可以用于本发明的方法中。

本发明的组合物和磷酸酶的产生化学发光的反应构成了一个检测磷酸酶的存在和含量的快速且高度灵敏的方法。因此，使用本方法通过测定由样品和式I化合物反应所产生的光的量或强度而达到检测样品中磷酸酶的存在和含量的目的。这种检测可用于诸如测定血清中碱性磷酸酶的水平，以作为反映患者肝功能状况的一个指标，或作为某些疾病的一个线索。前列腺酸性磷酸酶可作为临床诊断前列腺癌的一个线索。

本发明的组合物也用于测定能产生在2-5秒迅速达到最大强度并在短时间内衰减的化学发光的酸性磷酸酶(AcP)。即使该组合物的pH远远高于AcP活性的最适pH，还是可能以良好的灵敏度定量分析该酶。此外，还可通过本检测试剂检测有AP存在时的AcP。由于AcP和AP诱发的化学发光信号表现出不同的动力学特性，所以有可能在一个试验中对相同的样品同时测定AcP和AP的活性。

该化学发光检测磷酸酶活性的应用的第二方面是检测和测定酶抑制剂。抑制剂可作为一个和诸如本发明的化合物的另一底物竞争的底物而可逆地起作用。另一种称作自杀抑制的抑制作用是通过使该酶失活而不可逆地起作用。碱性磷酸酶的抑制剂包括无机磷酸酶，左旋四咪唑(levamisole)和其外消旋形式的四咪唑及其它咪唑[1，2-b]噻唑，L-苯基丙氨酸和L-高精氨酸，并鉴定于R.B.McComb，G.N.Bowers，S.Posen 碱性磷酸酶，Plenum出版社，New York 1979，第268-275，332-334，394-397，410-413页。酸性磷酸酶的抑制剂包括氟化物，钼酸盐，正磷酸盐离子，酒石酸，4-(氟代甲基)苯基磷酸盐和4-(氟代甲基)苯基膦酸盐(J.K.Myers，T.S.Widlanski，科学，262，1451-3(1993))。已知一些物质只在某些浓度具有抑制作用并且可能只是部分抑制。

通过在能产生可检测的产物的底物及一定量的抑制剂存在条件下，检测可能含有该酶的样品中的酶活性的方法，进行抑制剂的定量和特性如抑制常数Ki，或抑制半衰期t_1/2的测定。在一个按照本发明的检测磷酸酶抑制剂的方法中，式I化合物产生出作为可检测产物的光。分别在有和无抑制剂物质存在的条件下进行磷酸酶和化学发光化合物的反应并将所得结果进行比较以确定该抑制剂的存在或含量。该抑制剂的效应可以是降低光强度，降低光强度增长的速率或延长光发射前的时间等三者中的一个或任意几个。

该化学发光检测磷酸酶活性的应用的第三个方面是在基因表达试验中。碱性磷酸酶以及特别是在胎盘中产生并分泌的一种同功酶可用作指示基因(J.Alam，J.Cook，生物分析化学，188，245-54(1990))。在这种试验中，将表达一种指示酶的基因通过质检克隆到生物的启动子或增强子序列附近的基因材料中。该启动子或增强子序列在转录活性上的效应是通过测定指示酶的产物水平来判断的。

有关进行酶试验的技术是众所周知的。在如本说明书的实施例所提供的准则指导下，制备样品、测定试剂的合适量和比率、反应时间、建立标准曲线及类似的步骤的各种变化是作为常规实验设计，属于普通技术人员的能力范围之内的。

由于用磷酸酶催化该反应，所以极少量的酶就足以产生可检测量的光。该灵敏度已达到4×10^-21mol。这种检测如此小量的磷酸酶的能力使得本化学发光技术适于分析许多类型的用酶联试验的被分析物。这种分析和试验要求有检测少量磷酸酶的能力，这是由于待分析样品中被分析物的低丰度或由于样品量的有限。在这种试验中，碱性磷酸酶联接于特异的结合对象的一部分。一个实例是化学发光酶联免疫检测如所谓的酶联免疫吸附检测或ELISA。此试验通常是以手动形式和在自动多重检测免疫试验系统上进行的。在一个典型的免疫检测中，通过测定被分析物的酶标记特异结合对象或酶标记类似物，而检测被分析物半抗原，抗原或抗体。用于进行免疫化学步骤的各种试验形式和方案是本领域内所共知的，无需构成本发明本身的一部分。这些试验广义上分成两类。竞争性试验，其特征是特异抗体和被分析物及其类似物的免疫结合，如一种可检测地标记的被分析物分子。夹心试验，是通过被分析物顺序或同时结合其中的一个已进行了可检测标记的两种抗体而进行的。所得的可检测酶标记的结合对可以用本发明的化合物和方法检测。检测可在酶标记物吸附于诸如本领域常用的包括小珠，试管，微孔，磁粒，试验条带，膜和滤纸的固相表面或支持物上的情况下进行。该可检测的酶标记物也可游离于溶液中而存在，或包裹于诸如脂质体的有机装置中，不过后者则需要一种溶解剂以溶解该脂质体并释放该可检测酶。

另一个典型应用是通过Western blotting技术检测蛋白质。将作为被分析物的包含待测蛋白的样品电泳分离。将该分离的蛋白通过毛细管作用或借助电场而转移至吸渗膜上(blotting membrane)。这种转膜蛋白一般是用特异的第一抗体和酶标记的能识别并结合于第一抗体的第二抗体进行检测。标记酶的显色活性反映了被分析蛋白的存在。为了适应本发明的Western blotting方法，可使用一种AP联接的第二抗体并用本发明的化合物作为化学发光剂的化学发光法检测AP的活性。本技术的变化形式，如使用生物素化的抗体和抗生物素蛋白-AP都属于使用本法能进行的试验的范围之内。

除了上述的抗原-抗体，半抗原-抗体或抗体-抗体对外，特异的结合对也包括补充的寡核苷酸或多核苷酸，抗生素蛋白-生物素，链霉抗生物素蛋白-生物素，激素-受体，植物凝血素-碳水化合物，IgG-蛋白A，核酸-核酸结合蛋白以及核酸-抗核酸抗体。

本检测方法的一个特别有用的应用是，通过使用酶标记的核酸探针而检测核酸。使用酶标记化学发光检测和分析核酸的方法如杂交检测，Southernblotting检测DNA，Northern blotting检测RNA，DNA序列测定，DNA指纹测定，菌落杂交及plaque lifts都是相当成熟的技术。该酶标记(如AP)可以探针寡核苷酸或俘获寡核苷酸的直接联接物形式存在，或它也可通过众所周知的间接联接方式而结合。间接联接方式的实例包括使用半抗原标记的寡核苷酸和抗-半抗原-AP联接物或生物素化的寡核苷酸和抗生物素蛋白-AP联接物。这种核酸检测可在吸渗(blotting)膜上或在寡核苷酸吸附于固相表面的溶液中进行，而该固相表面包括众所周知的小珠，试管，微孔，磁粒，试验条带。

化合物I-IV的制备方法

本发明的化学发光的磷酸盐化合物I-IV的制备方法和有用的中间体的公开和实施，均在同时待审的585,090申请中。为了详细说明更多的典型方法和条件，下文提供了其它的说明信息。

简单地说，该方法包括杂环酯或硫代酯化合物VIII，和碱反应生成VIII的烯醇酯；通过该烯醇酯和磷酸化剂反应，磷酸化该VIII烯醇酯，形成保护的烯醇磷酸酯IX，通过将IX和至少一种脱保护剂在阳离子物质M存在的条件下，如果该阳离子物质并非该保护剂的一部分，反应，从而去除该烯醇磷酸酯的保护基生成烯醇磷酸盐化合物I。

在一个实施例中，该保护的烯醇磷酸酯IX首先是通过化合物VIII的烯醇酯和磷酰卤化合物POW₃(其中的W是选自F，Cl，Br和I的卤原子)反应而生成烯醇二卤化磷酸酯X。该中间体烯醇二卤化磷酸酯X通过和至少两个当量的羟基化合物Y-OH反应，转化成保护的烯醇磷酸酯IX。然后，该磷酸三酯再和至少一种去保护剂在阳离子物质M，如果该阳离子物质并非该去保护剂的一部分，存在的条件下反应，转化成磷酸盐I。

优选的卤素W是Cl。能作为羟基化物Y-OH的化合物包括但不限于，低级醇如甲醇和乙醇，取代的低级醇如3-羟基丙腈(HOCH₂CH₂CN)和2-三甲基硅乙醇，酚，取代酚，苄醇以及众所周知的其它物质。

在另一实施例中，该被保护的烯醇磷酸酯IX可通过VIII烯醇酯和含有保护基Y的且具有通式WO-PO(OY)₂的磷酸化剂反应，直接从VIII中制得。

此磷酸化剂中的O-Y基可以包括烷氧基如OCH₃，OCH₂CH₃，及其类似物，取代烷氧基如氰乙氧基(OCH₂CH₂CN)或三甲基硅乙氧基(OCH₂CH₂Si(CH₃)₃)，苯氧基，取代苯氧基，苄氧基及本领域的有机化学技术人员熟知的其它类似物。该两个基团O-Y也可结合在一起作为一个基团而出现在该试剂中

该烯醇酯是在-90℃到25℃的温度范围内，酯或硫酯化合物VIII和强碱在一种惰性的有机溶剂中反应而生成的。在一个优选的方式中，该反应是在干冰/丙酮浴的温度，亦即-78℃的温度中，进行一段时间并且随后再加温至0到25℃而进行第二段时间，合适的溶剂是那些能和用于生成烯醇酯的强碱相混溶的非质子性溶剂，其包括醚和烃类溶剂。优选的溶剂是四氢呋喃。该强碱和羰基化合物VIII可以任意顺序加入该反应器中。

该磷酸化步骤是在相同的溶液中于大约-78℃到25℃的温度范围内进行的。无论是POW₃或是WPO(OY)₂的磷酸化剂，都是以可控的方式加入以免引起反应液变热。该磷酸化剂优选和胺碱，优选吡啶，共同作用。

该脱保护步骤是通过该被保护的烯醇磷酸酯IX和以足以除去该保护基的量的去保护剂，在有阳离子物质M(如果该阳离子物质并非该脱保护剂的一部分)存在的条件下，反应而完成的。通常要求两当量的脱保护基，然而为了方便，该脱保护剂也可以过量的摩尔数使用。在某些情况下，该保护基可以一次除去一个。例如，在其中的两个Y基共同构成单个的-CH₂CH₂-基团并因此而形成一个五元环的式XI化合物中，该第一个O-CH₂键可用氰化盐处理而脱去。所得的化合物VII再和碱反应除去第二个O-CH₂并生成盐I。

脱保护剂的选择将部分依赖于待脱去的Y基的性质而定。该脱保护剂还必须不产生诸如水解该乙烯基醚或乙烯基硫醚的基团的副反应，或引起杂环基的不良改变。优选的脱保护剂包括有机的和无机的碱如氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钾，甲醇钠，乙醇钠，叔-丁醇钠，氢氧化铵及其类似物。其它优选的脱保护剂包括亲核试剂如氰离子，氟离子。

据申请人所知，其中的Het是一个含有N或S的杂环的化合物IX，X，XI和XII还没有被制备出来。美国3,130,203虽然公开了其中有一个含氧的内酯环附着于该双键上的烯醇磷酸酯化合物。但是该化合物是用不涉及烯醇酯或硫酯的磷酸化作用的不同方法制备的。

                           实施例

下列描述的式I化合物的制备及其化学发光反应是为了更详细地说明本发明。

化合物    R ₇ -R ₁₄                     Z        R ₆

   1         全是H                       O        苯基

   2         全是H                       O        3，5-二氟苯基

   3         R₉＝OCH₃                  O        苯基

   4         R₉＝Cl                     O        2，6-二甲基苯基

   5         全是H                       S        苯基

   6                                    O        苯基

   7         全是H                       S        4-氟苯基

   8         全是H                       S        4-甲氧苯基

   9         全是H                       S        2，6-二甲基苯基

   10        R₈，R₁₃＝F                S        苯基

   11        全是H                       S        三氟乙基

   12        全是H                       S        4-氯苯基

   13        全是H                       S        2-萘基

除非具体指明，R₇-R₁₄都是H

每个化合物 1-13都是按照下列合成路线(流程)制备的。要理解的是，可以在上述的合成方法所限制的范围内，进行该反应条件的改进以制备这些和其它的式I化合物。

流程1

实施例1.合成9，10-二氢吖啶衍生物1.

a.吖啶-9-羧酸苯酯.将吖啶-9-羧酸(1克，4.1毫摩尔)悬浮于亚硫酰氯(5毫升)中，并回流该反应混和物3小时。减压除去溶剂得到黄色固体，在充氩气下将其溶于CH₂Cl₂和吡啶(350μl)中。冰浴冷却该溶液并滴加苯酚(0.78克，8.2毫摩尔)的CH₂Cl₂溶液。室温中搅拌该反应混合物过夜。蒸发除去溶剂后，将残留物重新溶解于乙酸乙酯并用水洗涤。用MgSO₄干燥该有机层并浓缩得到粗产物，再用硅胶色谱(30％乙酸乙酯/己烷)处理得到黄色固态的纯产物。¹H NMR(CDCl₃)δ7.35-7.57(m，5H)，7.63-8.37(m，8H)。

b.10-甲基吖啶-9-羧酸苯酯的三氟甲磺酸盐.

将吖啶-9-羧酸苯酯(530毫克，1.7毫摩尔)在氩气氛溶解于CH₂Cl₂(5毫升)中，并加入三氟甲磺酸甲酯(triflate)(1毫升，8.8毫摩尔)。室温中搅拌该溶液过夜，得到粘稠的黄色沉淀。过滤该沉淀，用醚洗涤并干燥得到黄色晶体产物。¹HNMR(丙酮-d₆)δ5.22-(S，3H)，7.47-7.71(m，5H)，8.23-9.07(m，8H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-羧酸苯酯.

将10-甲基吖啶-9-羧酸苯酯的三氟甲磺酸盐(10毫克，0.0216毫摩尔)悬浮于无水乙醇(10毫升)中并回流该混合物15分钟得到澄清的溶液。分批将氯化铵(88毫克，1.6毫摩尔)加入该溶液中，再加入锌(108毫克，1.6毫摩尔)。锌的加入使得该溶液的黄色立即消失。回流该无水溶液2小时。薄层色谱(TLC)分析该反应混和物显示其彻底地转变成一个非极性物质。将该溶液过滤并用乙醇(3×20毫升)洗涤沉淀。浓缩该滤液得到灰白的固体，再将其溶解于CH₂Cl₂并用水(2×15毫升)洗涤。用Na₂SO₄干燥该有机层，浓缩得到粗产物，再通过制备的(preparative)TLC(30％乙酸乙酯∶己烷)纯化。所得的纯产物是灰白色的固体。

¹H NMR(CDCl₃)δ3.38(s，3H)，5.16(s，1H)，6.89-7.37(m，13H)；¹³CNMR(CDCl₃)δ33.29，49.72，112.93，120.19，121.36，125.73，128.67，129.16，129.26，142.37，151.04，170.22。

d.9-(苯氧磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二(氰 乙基)酯.将一只三颈烧瓶充氩气，并加入5毫升的无水THF和二异丙胺(0.04毫升，0.29毫摩尔)。将该烧瓶在干冰-丙酮浴中冷却。将正丁基锂(0.116毫升，0.29毫摩尔)加入该溶液中。20分钟后，将步骤(c)所得的9，10-二氢化吖啶酯(70毫克，0.22毫摩尔)的5毫升THF溶液加入到此溶液中，在-78℃连续搅拌30分钟。最后再加入POCl₃(0.02)毫升，0.29毫摩尔)和吡定(0.023毫升，0.29毫摩尔)的3毫升THF溶液，并撤去干冰浴。45分钟后，加入吡啶(0.039毫升，0.58毫摩尔)和3-羟基丙腈(0.094毫升，1.16毫摩尔)，连续搅拌过夜。然后，过滤并从滤液中除去溶剂。用制备的TLC(80％乙酸乙酯/己烷)处理该残留物得到产物；

¹H NMR(CDCl₃)δ2.35-2.54(m，4H)，3.47(s，3H)，3.79-3.90(m，2H)，3.98-4.08(m，2H)，6.825-7.45(m，12H)，7.80-7.83(dd，1H)；¹³CNMR(CDCl₃)δ19.12，19.24，33.63，62.19，62.49，88.72，112.40，112.52，115.83，116.07，119.68，120.44，120.71，123.81，126.69，128.03，128.27，128.58，130.09，142.39，143.06，165.73，202.09。

e.9-(苯氧磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二钠盐 (1).

将磷酸二(氰乙基)化合物(2.897克，5.77毫摩尔)的50毫升丙酮溶液充氩气30分钟。滴加已氩气洗过的479毫克(12毫摩尔)NaOH的7.5毫升水溶液并搅拌该溶液过夜。过滤所得沉淀，用50毫升的已用氩气洗过的丙酮洗涤，空气干燥。产物是3.473克含有一些水份的白色固体 1.

¹H NMR(D₂O)δ3.326(s，3H)，6.825-7.45(m，11H)，7.80-7.83(d，1H)；¹³C NMR(D₂O)δ32.95，102.86，102.92，112.30，115.85，120.68，121.01，122.35，122.41，122.62，127.48，127.66，128.23，129.66，143.17，143.32，144.66，156.01；³¹P NMR(D₂O)δ0.581(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例2.合成9，10-二氢化吖啶衍生物2.

a.吖啶-9-羧酸3′，5′-二氟苯酯.将吖啶-9-羧酸(0.25克)悬浮于10毫升的亚硫酰氯中并回流该反应混和物3小时。减压除去溶剂得到黄色固体。在充氩气下将其溶于CH₂Cl₂和吡啶(0.22克)。滴加3，5-二氟苯酚(0.16克)的CH₂Cl₂溶液。室温中搅拌该反应混合物过夜，然后用另加的CH₂Cl₂(100毫升)稀释并用水(3×50毫升)洗涤。用Na₂SO₄干燥该有机层并浓缩得到产物，再用硅胶色谱纯化(30％乙酸乙酯/己烷)，得到乳状固态纯产物。¹HNMR(CDCl₃)δ6.84-7.09(m，3H)，7.67-8.37(m，8H)。

b.10-甲基吖啶-9-羧酸3′，5′-二氟苯酯的三氟甲磺酸盐.将从步骤(a)所得的吖啶酯(0.20克)在氩气氛中溶解于CH₂Cl₂(5毫升)中，并加入三氟甲磺酸甲酯(0.472毫升，7当量)。室温中搅拌该溶液过夜得到粘稠的黄色沉淀。过滤该沉淀，用醚洗涤并干燥得到黄色晶体产物。¹H NMR(丙酮-d₆)δ5.25(s，3H)，7.22-7.59(m，3H)，8.23-9.09(m，8H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸3′，5′-二氟苯酯.

将从步骤(b)所得的吖啶酯(0.10克)溶于10毫升的冰醋酸，得到黄色溶液，加入锌(1.30克)使溶液立即脱色。室温中搅拌5分钟后，TLC分析该反应混和物显示为一非极性材料。倾折醋酸，用CH₂Cl₂洗涤该固体。蒸发该合并的有机溶液得到粗制固体，再将其溶解于CH₂Cl₂并用2或3份50毫升的水洗涤。将蒸发CH₂Cl₂后所得的粗产物用硅胶色谱(20-30％乙酸乙酯/己烷)纯化得到白色固态纯产物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.44(s，3H)，5.16(s，1H)，6.49-6.65(m，3H)，6.99-7.36(m，8H)。

d.9-(3，5-二甲基苯氧基)磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二(氰乙基)酯.将一只三颈烧瓶用氩气洗过并加入4毫升的无水THF和二异丙胺(0.0494毫升，0.35毫摩尔)。将该烧瓶在干冰-丙酮浴中冷却。将正丁基锂(0.141毫升，0.35毫摩尔)加入该溶液中。20分钟后，将步骤(c)所得的9，10-二氢化吖啶酯(75毫克，0.22毫摩尔)的4毫升THF溶液滴加入此LDA中。漏斗另用4毫升的已用氩气洗过的THF洗涤并加入该反应液。在-78℃连续搅拌30分钟。最后加入POCl₃(0.034毫升，0.35毫摩尔)和吡啶(0.057毫升，0.35毫摩尔)的4毫升THF溶液，使该褐色溶液脱色。撤去该干冰浴并连续搅拌15分钟。加入吡啶(0.095毫升，1.17毫摩尔)和3-羟基丙腈(0.080毫升，1.17毫摩尔)的4毫升THF溶液并连续搅拌过夜。然后，过滤并从滤液中除去溶剂。用制备的TLC(55％乙酸乙酯/己烷)处理从而分离出少量的纯产物；¹H NMR(丙酮-d₆)δ2.82(m，4H)，3.51(s，3H)，4.10-4.31(m，3H)，6.75-7.93(m，1H)。

e.9-(3，5-二甲基苯氧基)磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二钠盐(2).

将从步骤(d)所得的磷酸二(氰乙基)酯(5毫克，5.77毫摩尔)的5毫升甲醇溶液冰浴，并用氩气洗30分钟。滴加已用氩气洗过的6毫克Na₂CO₃的0.5毫升水溶液并通过氩气搅拌过周。蒸去溶剂并真空干燥固体化合物 2。¹HNMR(D₂O)δ3.34(s，3H)，6.66-8.09(m，11H)。

实施例3.合成9，10-二氢吖啶衍生物3

(E/Z混合物)

a.N-甲基-3-甲氧靛红.将溶于900毫升CH₂Cl₂的3-甲氧二苯胺(250.2克，1.26mol)在氩气氛中加入草酰氯(140毫升，1.6mol)的1升CH₂Cl₂的热熔液中。该加入过程在两小时内完成。加入过程中的加热暂停，因为该反应所产生的热足以维持回流。加入胺后，再在回流温度搅拌30分钟。蒸发该所得褐色液以除去过量的草酰氯。将该褐色固体重新溶于用氩气洗涤过的1.8升CH₂Cl₂。在45分钟内，分批加入氯化铝(359克，3.69mol)，并将该混和液机械搅拌。在该加料过程中，混合物变得粘稠并开始回流。在全部的AlCl₃都加入后，再回流一小时。真空蒸发该冷却的混和物并用大约4公斤冰，500毫升水和240毫升浓HCl使其骤冷。在冰点搅拌2小时，将暗色固体小心捣碎成小颗粒。然后，吸滤该固体并用总量达8升的水洗涤。空气干燥得到其中的一个异构体含量大于90％的靛红异构体的混和物。

b.3-甲氧吖啶-9-羧酸.将从步骤(a)所得的靛红混和物在10％的KOH水溶液中回流大约40小时。将该溶液冷却到＜60℃并通过玻璃棉过滤到剧烈搅拌着的480毫升的浓HCl和10升冰水的混合液中。一小时后，抽滤该固体并用8升水洗涤。空气干燥该固体过夜，然后真空干燥。¹HNMR(CD₃OD/NaOH)δ4.062(s，3H)，7.25-8.18(m，7H)。

c.3-甲氧吖啶-9-羧酸苯酯.将甲氧基-吖啶-9-羧酸(0.50克)悬浮于10毫升亚硫酰氯(3-10毫升)中并回流该反应混合物3小时。减压除去该溶剂得到黄色固体并将其在氩气氛中溶解于CH₂Cl₂和吡啶(0.44克)。滴加2，6-二氟苯酚的CH₂Cl₂溶液。室温中搅拌该溶液过夜，然后用另外的CH₂Cl₂(100毫升)稀释并用水(3×50毫升)洗涤。用Na₂SO₄干燥该有机层，浓缩得到粗产物，再进一步用硅胶色谱纯化(30％乙酸乙酯/己烷)得到乳油状固态的纯产物。¹HNMR(丙酮-d₆)δ4.08(s，3H)，7.39-8.29(m，12H)。

d.3-甲氧-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸苯酯.将氯化铵(3.45克，64毫摩尔)和4.2克锌(64毫摩尔)加入到0.85克(2.5毫摩尔)步骤(c)所得的酯于50毫升乙醇中的经氩气洗过的悬浮液中。混合物搅拌2小时，过滤并用CH₂Cl₂洗涤该固体。将合并的溶液蒸干得到白色固体，再将其溶于乙酸乙酯中并用3×25毫升的水洗涤。该产物无需进一步纯化即可使用。¹H NMR(CDCl₃)δ3.76(s，3H)，5.29(s，1H)，6.47-7.36(m，12H)，8.21(br，s，1H)。

e.3-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸苯酯.将前述步骤中所得的9，10-二氢吖啶(0.77克，2.3毫摩尔)溶于CH₂Cl₂中并加入三氟甲磺酸甲酯(3.8克，23毫摩尔)。搅拌过夜后，TLC分析表明其已彻底甲基化。蒸去挥发性组分并用18％的乙酸乙酯/己烷洗脱该柱，色谱纯化该残留物。产物是含0.75克胶粘固体。¹H NMR(CDCl₃)δ3.41(s，3H)，3.84(s，3H)，5.13(s，1H)，6.52-7.38(m，12H)。

f.(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亚甲基)-3-甲氧基-10-甲基-9，10 -二氢化吖啶，二(氰乙基)酯.

基本上按照实施例2d所述制备LDA溶液。-78℃搅拌25分钟后，滴加从步骤3e所得的9，10-二氢化吖啶酯(95毫克，0.26毫摩尔)的4毫升THF溶液。最后加入POCl₃(0.04毫升)和吡啶(0.05毫升)的4毫升THF溶液，使该黄色溶液脱色。撤去干冰浴并连续搅拌105分钟。用冰浴冷却该溶液并用4毫升的吡啶(0.106毫升)和3-羟基丙腈(0.090毫升)的THF溶液处理。室温中搅拌20小时，过滤该反应混合物并用IHF洗涤该黄色沉淀。真空蒸去溶剂，残留物和沉淀结合。用制备的TLC(60％乙酸乙酯/己烷)处理此材料，分离出少量双键异构体混合物形式存在的产物；¹H NMR(丙酮-d₆)δ2.75-2.82(m，4H)，3.52(s，3H)，3.82(s)，3.91(s)，4.00-4.26(m，4H)，6.47-7.96(m，12H)。

g.(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亚甲基)-3-甲氧基-10-甲基-9，10 -二氢化吖啶，二钠盐(3).

将从步骤3(f)中所得的磷酸二(氰乙基)酯溶解于经Ar洗过的10毫升MeOH中，并冰浴冷却。滴加已用Ar洗过的11毫克Na₂CO₃的1毫升水溶液并搅拌该溶液19小时。再加入3毫升的甲醇，并再连续搅拌24小时使脱保护进行彻底。蒸去溶剂，用CH₂Cl₂洗涤该固态化合物 3并真空干燥。¹HNMR(D₂O)δ3.24(s，3H)，3.66(s)，3.83(s)，6.35-8.07(m，12H)。

实施例4.合成9，10-二氢化吖啶衍生物4.

                                 (E/Z混合物)

a.3-氯靛红.在Ar氛的条件下，将溶于250毫升CH₂Cl₂的3-氯二苯胺(20克，0.98摩尔)加入14.0克(0.11mol)草酰氯的150毫升CH₂Cl₂溶液中。回流该溶液30分钟。蒸去该所得溶液中过量的草酰氯。将该固体重新溶解于已用Ar气洗过的CH₂Cl₂中。在45分钟内，将氯化铝(54.48g)分批加入机械搅拌的溶液中。在该加成过程中，该混合液变稠并开始回流。在全部AlCl₃加入后再维持回流一小时。真空蒸发该冷却的混合物，在冰浴中用900毫升的1M HCl急冷。抽滤出固体并用水洗涤。¹HNMR(CDCl₃)δ6.8-7.8(m，8H)

b.3-氯吖啶羧酸.从步骤(a)所得的靛红产物在300毫升的10％KOH水溶液中回流大约48小时。冷却该溶液并用HCl酸化至pH2-3。一小时后，抽滤该黄色固体，然后用水洗涤。空气干燥该固体过夜，用CH₂Cl₂洗涤，然后空气干燥得到23.76克的吖啶酸，¹HNMR(DMSO-d₆)δ7.72-8.30(m，7H)。

c.3-氯吖啶羧酸2′6′二甲基苯酯.

将该酸(3.0克)用2，6-二甲基酚(2.24克，1.5当量)和吡啶(1.98毫升，2当量)的约100毫升CH₂Cl₂溶液在室温氮气氛的条件下酯化。蒸去该溶剂并通过用10-30％乙酸乙酯/己烷的色谱柱纯化该残留物，从而分离出该1-氯(较少)和3-氯异构体；¹H NMR(CDCl₃)δ2.430(s，6H)，7.20-7.28(m，3H)，7.60-7.75(m，3H)，8.28-8.50(m，4H)。

d.3-氯-10-甲基吖啶羧酸2′，6′-二甲基苯酯的三氟甲磺酸盐。将从前述步骤中所得的吖啶化合物(2.47克，6.7毫摩尔)溶于CH₂Cl₂中并加入三氟甲磺酸甲酯(3.8毫升，5当量)。搅拌过夜后，TLC分析显示其已彻底甲基化。蒸去挥发性组分并通过用5％乙酸乙酯/己烷洗脱该柱色谱纯化该残留物。在CH₂Cl₂/己烷中重结晶该产物，得到1.7克白色晶体。

e.3-氯-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-羧酸2′，6′-二甲基苯酯.将氯化铵(2.91克，64毫摩尔)和3.56克锌(64毫摩尔)加入已用Ar洗过的步骤(c)所得的2.00克(5.4毫摩尔)酯的50毫升乙醇的悬浮液中。搅拌该混合物2小时，过滤，CH₂Cl₂洗涤该固体。蒸干该合并的溶液得到白色固体。该产物可以不经进一步纯化而直接使用。¹H NMR(CDCl₃)δ1.746(s，6H)，3.400(s，3H)，5.152(s，1H)，6.88-7.04(m，7H)，7.26-7.39(m，3H)。

f.(E.Z)-9-(2，6-二甲基苯氧基)磷酰氧亚甲基)-3-氯-10-甲基 -9，10-二氢化吖啶，二(氰乙基)酯.将从步骤(e)中所得的9，10-二氢化吖啶酯(0.100克，0.29毫摩尔)加入到LDA(0.44毫摩尔)的10毫升THF溶液中。-78℃搅拌30分钟后，加入POCl₃(42μl)和吡啶(47μl)的4毫升THF溶液。撤去干冰浴并连续搅拌30分钟。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)分析显示起始物已完全反应。冰浴冷却该溶液并用4毫升的吡啶(117μl)和3-羟基丙腈(94μl)的THF溶液处理。室温搅拌过夜后，滤去沉淀并蒸发该反应溶剂。用制备的TLC(60％乙酸乙酯/己烷)处理该残留物并从其分离出异构体产物；¹H NMR(CD₃OD)δ(1.91(s)，1.95(s)，结合3H)，(2.03(s)，2.04(s)，结合3H)，2.69-2.76(m，4H)，(3.52(s)，3.59(s)，结合3H)，4.16-4.34(m，4H)，6.97-7.65(m，10H)。

g.(E.Z)-9-(2，6-二甲基苯氧基)磷酰氧亚甲基)-3-氯-10-甲基 -9，10-二氢化吖啶，二钠盐(4).将从前述步骤中所得的磷酸二(氰乙基)酯在Ar氛溶于10毫升的甲醇中并用冰浴冷却。滴加已用Ar洗过的11毫克Na₂CO₃的1毫升水溶液，并通氩气搅拌直至脱保护进行完全。蒸去溶剂，用CH₂Cl₂洗涤固体并真空干燥得到产物 4。

实施例5.合成9，10-二氢化吖啶衍生物5.

a.9-(苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二 (氰乙基)酯.将10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(70毫克，0.2毫摩尔)加入LDA(0.24毫摩尔)的THF溶液中。-78℃搅拌30分钟后，加入4毫升的POCl₃(25μl)和吡啶(21μl)的THF溶液。撤去干冰并继续搅拌30分钟。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)检测发现起始反应物已彻底反应。冰浴冷却该溶液并用4毫升的吡啶(210μl)和3-羟基丙腈(44μl)的THF溶液处理。室温搅拌过夜后，滤去沉淀的吡啶-HCl，并真空蒸去该反应溶剂。用制备的TLC(乙酸乙酯)处理该残留物，分离出产物；¹HNMR(CDCl₃)δ2.4-2.6(m，4H)，3.521(s，3H)，3.8-4(m，2H)，4.0-4.1(m，2H)，6.9-7.2(m，4H)，7.22-7.5(m，7H)，7.75-8(dd，2H)。

b.9-(苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶， 二钠盐(5).将磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.59克，1.21毫摩尔)的50毫升丙酮溶液用Ar洗涤30分钟。滴加已用Ar洗过的104毫克(2.6毫摩尔)NaOH的10毫升水溶液并通氩气搅拌过夜。抽滤所得的沉淀，用50毫升Ar洗过的丙酮洗涤并空气干燥。产物是含有少许丙酮的0.50克微黄色固体 5。

¹H NMR(D₂O)δ3.36(s，3H)，6.9-7.4(m，11H)，7.75-7.8(d，1H)，8.2-8.22(d，1H)；³¹P NMR(D₂O)δ1.85(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例6.合成苯并[c]9，10-二氢化吖啶衍生物6.

                                   (E/Z混合物)

a.苯并[c]吖啶-7-羧酸.在氩气氛的条件下，将溶于25毫升CS₂的1-萘基-苯胺(10克，46毫摩尔)用4.8毫升(55毫摩尔)草酰氯回流。蒸发该所得褐色溶液，除去过量的草酰氯。将该黄色固体溶于60毫升的CS₂并且其用氩气鼓泡。分批加入AlCl₃(21.4克，160毫摩尔)到该溶液中，并搅拌该混合物。在加料过程中，该混合物变稠并开始回流。该回流在全部AlCl₃都加入后再维持两个多小时。真空蒸发该冷却的混合物，用1M HCl和冰急冷。将该暗色固体小心捣成小颗粒并吸滤该固体，并用水洗涤。

将该靛红产物在10％KOH水溶液中回流过夜。冷却该溶液到＜60℃并用6M HCl和冰中和。抽滤该固体，用水洗涤并空气干燥。¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.80-8.13(m，8H)，8.36-8.39(d，1H)，9.38-9.40(m，1H)

b.苯并[c]吖啶-7-羧酸苯酯.将苯并[c]吖啶-7羧酸(6.0克)悬浮于75毫升的亚硫酰氯(3-10毫升)中并回流该反应混合物4小时。减压除去溶剂并将产物溶于75毫升CH₂Cl₂中。加入吡啶(8.9毫升)和酚(2.27克)并室温氩气氛搅拌该溶液。用硅胶色谱(50％CH₂Cl₂/己烷)纯化得到3.05克浅褐红色固态的纯产物。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.40(t，1H)，7.48-7.59(m，4H)，7.71-8.01(m，7H)，8.259(d，1H，J＝7.8Hz)，8.465(d，1H，J＝7.8Hz)，9.54-9.57(m，1H)。

c.苯并[c]9，10-二氢化吖啶-7-羧酸苯酯.将氯化铵(10克)和10克锌加入到Ar气洗过的1.0克步骤(b)所得的酯在乙醇的悬浮液中。搅拌该混合物2小时，过滤并用CH₂Cl₂洗涤。将该合并的溶液蒸干得到白色固体，再将其溶解于乙酸乙酯并用3×25毫升的水洗涤。使用10％乙酸乙酯/己烷的洗脱液色谱纯化该产物。¹H NMR(CDCl₃)δ5.48(s，1H)，5.69-7.27(s，9H)，7.41-7.55(m，5H)，7.83-7.88(m，2H)。

d.12-甲基苯并[c]9，10-二氢化吖啶-7-羧酸苯酯.将从前述步骤中所得的9，10-二氢化吖啶化合物(0.70克)溶于CH₂Cl₂并加入三氟甲磺酸甲酯(2.3毫升)。搅拌过夜后，TLC表明其已彻底甲基化。蒸去挥发性成分并过使用5％乙酸乙酯/己烷洗脱该柱，色谱纯化该残留物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.75(s，3H)，5.21(s，1H)，6.92-6.94(d，2H)，7.09-7.62(m，11H)，7.86-7.89(dd，1H)，8.23-8.26(d，1H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ45.07，49.99，120.01，121.23，122.66，123.51，124.69，125.30，125.45，125.84，126.33，126.97，128.39，128.64，129.36，134.89，141.20，147.09，151.00，170.89。

e.(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亚甲基)-12-甲基苯并[c]9，10-二氢 化吖啶，二(氰乙基)酯.

如上述制备LDA溶液。在-78℃搅拌25分钟后，滴加苯并9，10-二氢吖啶酯(0.30克)的THF溶液。在-78℃连续搅拌30分钟。最后加入POCl₃(0.123毫升)和吡啶(0.107毫升)的THF溶液，使得该深红色的溶液变成橙色。撤去干冰浴并继续搅拌1小时。用冰浴冷却该溶液并用吡啶(0.213毫升)和3-羟丙腈(0.180毫升)的THF溶液处理。室温中搅拌过夜后，过滤该反应溶剂，该残余物和沉淀结合。用制备的TLC(60％乙酸乙酯/己烷)处理该物料，从中分离出以双键异构体的混合物形式存在的少量产物；¹HNMR(CDCl₃)δ2.44-2.52(m，4H)，3.81-4.10(m，7H)，6.89-8.24(m，15H)。

f.(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亚甲基)-12-甲基苯并[c]9，10-二氢 化吖啶，二钠盐(6).将从前述步骤中所得的磷酸二(氰乙基)酯溶于10毫升氩气洗过的丙酮中并冰浴冷却。滴加一种已用Ar气洗过的溶液(0.1毫升的2MNaOH水溶液)，并在Ar气氛中搅拌该溶液过夜。过滤该固体，用丙酮洗涤该产物化合物 6，干燥。¹H NMR(D₂O)δ3.52(s，3H)，6.85-6.90(t，1H)，7.03-7.06(d，2H)，7.15-7.23(m，3H)，7.33-7.48(m，5H)，7.72-7.75(d，1H)，7.87-7.89(d，1H)，8.10-8.17(t，2H)。

实施例7.合成9，10-二氢化吖啶衍生物7.

a.吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯.将吖啶-9-羧酸(10克，45毫摩尔)悬浮于亚硫酰氯(约100毫升)并回流该反应混合物2小时。减压除去溶剂得到黄色固体，再在氩气氛条件下溶于100毫升的CH₂Cl₂中。分别先后加入4-氟苯硫酚(5.25毫升，49毫摩尔)和30毫升吡啶。该反应混和物变成浅红褐色，并升温至近乎回流。室温中氩气氛中搅拌该混合物2天。蒸去溶剂后，用800毫升己烷洗涤该残留物，然后再用总量为1升的水洗涤。将残留固体溶于300毫升的CH₂Cl₂中，通过Na₂SO₄/硅胶/Na₂SO₄填料(plug)。所得的是一黄色固态硫酯(11.55克)。¹H NMR(CDCl₃)δ7.20(t，2H)，7.60-7.68(m，4H)，7.80-7.88(m，2H)，8.129(d，2H)，8.278(d，2H)。

b.10-甲基吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯三氟甲磺酸盐.将吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯(11.36克，34毫摩尔)在氩气氛条件下溶于CH₂Cl₂(100毫升)中并加入三氟甲磺酸甲酯(20毫升)。该溶液变成褐色并产生黄色沉淀。两天后，过滤该沉淀，分别用50毫升CH₂Cl₂和500毫升己烷洗涤并干燥得到黄色固态产物(15.3克)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ4.93(s，3H)，7.53(t，2H)，7.97-8.37(m，2H)，8.14(t，2H)，8.54(t，2H)，8.61(d，2H)，8.92(d，2H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯.

在室内避光条件下，将10-甲基-吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯三氟甲磺酸盐(15.05克，30毫摩尔)悬浮于2-丙醇(150毫升)和2.1毫升的乙酸中。然后，加入10.0克锌粉。锌的加入使得该溶液的黄色在数分钟内消失。搅拌该混和物过夜。过滤并用2-丙醇，再用己烷，洗涤所得固体。用CH₂Cl₂洗涤该残留固体。由于TLC分析显示出该固体已熔于两个溶液中，浓缩该滤液并结合得到褐色固体，再将其溶于CH₂Cl₂并通过Na₂SO₄/硅胶/Na₂SO₄填料层，用CH₂Cl₂洗脱。得到了源于酯基转移作用的所需的9，10-二氢化吖啶硫酯和9，10-二氢化吖啶异丙基酯的混合物。用柱色谱(50％CH₂Cl₂∶己烷)分离该两产物。从其中一个馏分中得到白色固态的纯9，10-二氢化吖啶硫酯2.5克。从第二个馏分中所得是其和该异丙酯的混合物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.45(s，3H)，5.08(s，1H)，6.94-7.06(m，6H)，7.17-7.24(m，2H)，7.31-7.39(m，4H)。

d.9-(4-氟苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二(氰乙基)酯.在室内避光条件下，将10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4-氟苯酯(1.00克，2.87毫摩尔)的10毫升无水THF溶液滴加入-78℃的LDA的THF溶液中。在-78℃搅拌60分钟后，用POCl₃(0.79克)和吡啶(3.0毫升)的10毫升THF溶液处理该黄色溶液25分钟。一小时后，撤去干冰浴并继续搅拌2小时。冰浴冷却该溶液并用3-羟丙腈(0.71毫升)处理，冰浴在加料完成后撤去。室温中搅拌过夜后，过滤该沉淀的吡啶-HCl并用50毫升的THF洗涤。真空蒸发该合并的滤液。通过使用50-100％乙酸乙酯/己烷洗脱的柱色谱，分离该残留物，从中得到0.658克产物；¹H NMR(CDCl₃)δ2.44-2.64(m，4H)，3.49(s，3H)，3.86-4.16(m，4H)，6.92-7.15(m，6H)，7.26-7.46(m，4H)，7.786(d，1H)，7.906(d，1H)；³¹PNMR(CDCl₃)δ-9.49(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

e.9-(4-氟苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二钠盐(7).在室内避光条件下，将溶于20毫升丙酮的磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.658克)充氩气30分钟。加入116.5毫克NaOH的4.0毫升水溶液并在氩气氛中搅拌该溶液过夜。抽滤该所得沉淀，用100毫升丙酮洗涤并空气干燥。在该滤液中形成了第二固体产物并和第一产物混合。产物是0.545克微黄色固态的 7。¹H NMR(D₂O)δ3.16(s，3H)，6.80-6.98(m，4H)，7.06-7.14(m，4H)，7.21(t，1H)，7.78(t，1H)，8.19(d，1H)；³¹P NMR(D₂O)δ1.22(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例8.合成9，10-二氢化吖啶衍生物8.

a.吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯.将按前述方法制备的吖啶-9-碳酰氯溶于20毫升的CH₂Cl₂中。分别先后滴加4-甲氧苯硫酚(1.27克)和1.96克吡啶。室温中搅拌该反应混和物3.5天。收集沉淀，用水洗涤并干燥获得第一批产物。将该CH₂Cl₂溶液用3×50毫升水洗涤，干燥并蒸发得到粗物质，再将其在硅胶(乙酸乙酯)色谱上处理获得第二批纯产物。¹HNMR(CDCl₃)δ3.86(s，3H)，7.01(d，1H)，7.56(d，2H)，7.62-8.28(m，8H)。

b.9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯.将吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯(2.0克)悬浮于2-丙醇(150毫升)中。分别先后分批加入NH₄Cl(7.35克)和锌(8.9克)到该溶液中。室温中搅拌该溶液2小时，然后稍微温热3小时。TLC分析显示该反应混合物的起始材料已彻底消耗。过滤该溶液并用CH₂Cl₂洗涤该沉淀。将滤液和洗涤液浓缩得到一个粗产物，再将其重新溶于CH₂Cl₂中并用水(3×50毫升)洗涤。干燥该有机层并浓缩得到含有少量9，10-二氢化吖啶异丙酯的产物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.74(s，3H)，5.19(s，1H)，6.29(br，s，1H)，6.75-7.31(m，12H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯三氟甲 磺酸盐.将9，10-二氢吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯在氩气氛条件下溶于CH₂Cl₂并加入三氟甲磺酸甲酯(6.3克)。室温中搅拌该溶液过夜以便使其彻底甲基化。浓缩该反应混和物并用柱色谱(30％乙酸乙酯/己烷)分离该残留物以获得1.08克产物。¹HNMR(CDCl₃)δ3.45(s，3H)，3.76(s，3H)，5.07(br s，1H)，6.81-7.36(m，12H)。

d.9-(4-甲氧苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二(氰乙基)酯.

将10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯(700毫克)的10毫升无水THF溶液在维持-78℃的条件下，滴加入LDA(1.4当量)的10毫升无水THF溶液中。-78℃搅拌1小时后，滴加入POCl₃(520毫克)和吡啶(1.64克)的4毫升THF溶液。在-78℃连续搅拌30分钟，撤去干冰浴并再继续搅拌1小时。再用冰浴冷却该溶液并滴加入吡啶(1毫升)和3-羟基丙腈(0.86毫升)。室温搅拌过夜后，滤去沉淀的吡啶-HCl并真空蒸去该反应溶剂。将残留物溶于乙酸乙酯并用水(3×25毫升)洗涤。将该有机溶液干燥并浓缩，并用柱色谱(30-100％乙酸乙酯/己烷)处理该粗产物，分离出浅黄色固态产物；¹H NMR(CDCl₃)δ2.44-2.62(m，4H)，3.51(s，3H)，3.82(s，3H)，3.88-4.11(m，4H)，6.53-7.41(m，10H)，7.84-7.91(m，2H)；³¹PNMR(CDCl₃)δ-9.63(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

e.9-(4-甲氧苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二钠盐(8).将磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.42克)的11毫升丙酮溶液用氩气鼓泡。滴加入614微升的2.5M的NaOH水溶液并氩气氛中搅拌该溶液过夜。抽滤所形成的沉淀并空气干燥，得到一定量的微黄色固态产物 8。¹HNMR(D₂O)δ3.32(s，3H)，3.70(s，3H)，6.69-7.33(m，10H)，7.80(d，1H)，8.18(d，1H)。

实施例9.合成9，10-二氢化吖啶衍生物9.

a.9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，6′-二甲苯酯.将吖啶-9-羧酸(2克)悬浮于亚硫酰氯(25毫升)中，并将该反应混合物回流2.5小时。减压除去溶剂并将所得固体溶于50毫升的CH₂Cl₂中。冰浴冷却该溶液并分别先后滴加入2，6-二甲基苯硫酚(1.23克)和3.6毫升吡啶。室温搅拌该红棕色反应混合物1.5小时。用CH₂Cl₂稀释该反应混和物并用3×50毫升的水洗涤。干燥该有机层并浓缩得到橙色产物，再用硅胶色谱(乙酸乙酯)处理得到灰白色固体纯产物2.5克。¹H NMR(CDCl₃)δ2.68(s，6H)，7.30-7.41(m，3H)，7.63-8.31(m，8H)。

b.9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，6′-二甲苯酯.

将吖啶-9-硫代羧酸2′，6′-二甲基苯酯(2.46克)悬浮于2-丙醇(200毫升)中。分别先后分批加入氯化铵(9.6克)和锌(11.65克)到该溶液中。稍温热该溶液2小时。TLC分析该反应混和物表明起始材料已彻底消耗完。过滤该溶液并用CH₂Cl₂洗涤该沉淀。浓缩该滤液得到白色固体，再将其溶于CH₂Cl₂中，用水(3×50毫升)洗涤。用Na₂SO₄干燥该有机层并浓缩得到白色固体的2.46克产物。¹H NMR(CDCl₃)δ2.08(s，6H)，5.24(s，1H)，6.27(brs，1H)，6.78-7.31(m，11H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶硫代羧酸2′，6′-二甲基苯酯.将9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，6′-二甲基苯酯在氩气氛条件下溶于30毫升的CH₂Cl₂中并加入三氟甲磺酸甲酯(6.6毫升)。室温中搅拌该溶液3天。蒸干该混合物并用柱色谱(CH₂Cl₂)纯化该粗产物得到1.85克白色固态产物。¹H NMR(CDCl₃)δ2.09(s，6H)，3.46(s，3H)，5.09(s，1H)，6.97-7.36(m，11H)。

d.9-(2，6-二甲基苯基硫代磺酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二(氰乙基)酯.将溶于12毫升无水THF的10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2，6-二甲苯酯加入LDA(1.4当量)的10毫升无水THF的-78℃溶液中。-78℃搅拌该橙色溶液60分钟。滴加入4毫升的POCl₃(280μl)和吡啶(1.57毫升)的THF溶液。搅拌该反应混和物15分钟后，撤去干冰浴。继续搅拌60分钟。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)显示大部分起始反应物已反应。

冰浴冷却该溶液并用吡啶(1.0毫升)和3-羟基丙腈(666μl)处理。室温中搅拌过夜后，过滤沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗涤。真空蒸发该合并的有机溶液。干燥该有机层并浓缩得橙色产物，再将其在硅胶(乙酸乙酯)上色谱分离得到80毫克黄色油状的纯产物。¹H NMR(CDCl₃)δ2.34-2.43(m，4H)，2.47(s，6H)，3.47(s，3H)，3.42-3.71(m，4H)，7.01-8.07(m，11H)；³¹PNMR(CDCl₃)δ-10.207(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

e.9-(2，6-二甲基苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二钠盐(9).将磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.80克)的6毫升丙酮溶液氩气鼓泡洗涤。分别先后滴加1M NaOH的水溶液(293μl)和另外的300μl水，氩气氛中搅拌该溶液过夜。抽滤该所得沉淀，用丙酮洗涤并进行空气干燥。产物是0.60克白色固体9。¹HNMR(D₂O)δ2.13(s，6H)，3.19(s，3H)，6.60-8.19(m，1H)；³¹P NMR(D₂O)δ1.653(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例10.合成9，10-二氢化吖啶衍生物10.

a.4-氟代-N-乙酰苯胺.将4-氟代苯胺(20克)溶于25毫升的乙酸中并在冰浴中冷却。以5毫升为一批分批加入乙酐(25毫升)到该搅拌的溶液中。将所得溶液倾入200毫升的冷水中并滤去沉淀物。用水洗涤该固体并真空干燥。¹H NMR(CDCl₃)δ2.175(s，3H)，7.014(t，2H)，7.15(br s，1H)，7.43-7.48(m，2H)。

b.4，4′-二氟二苯胺.在有11.08克K₂CO₃和1.61克CuI存在的条件下，将4-氟代-N-乙酰苯胺(12.0克)和1-溴-4-氟苯(21毫升)在190℃缩合90小时。冷却后，过滤该混和物并用CH₂Cl₂洗涤该固体。真空蒸发该合并的有机溶液得到大约20克暗棕色液体。将其溶于100毫升的乙醇并和9克KOH回流24小时。蒸去乙醇并将该暗色残留物溶于醚，再用水洗涤(3×100毫升)。干燥并浓缩该醚溶液，再用硅胶柱色谱(15％乙酸乙酯/己烷)纯化该粗产物：¹H NMR(CDCl₃)δ5.46(br s，1H)，6.947(s，4H)，6.97(s，4H)；³¹C NMR(CDCl₃)δ115.86，116.16，119.38，119.47。

c.2，7-二氟吖啶-9-羧酸.将溶于50毫升CH₂Cl₂中的4，4′-二氟二苯胺(5.4克)以维持回流的速度在氩气氛的条件下，加入到2.52毫升(0.11摩尔)草酰氯的30毫升CH₂Cl₂溶液中。再回流该混和物35分钟。蒸去所得溶液中过量的草酰氯。将该固体重新溶于75毫升的CH₂Cl₂中并用冰浴冷却。将该烧瓶以氩气洗涤排气，并分批加入Al₃Cl₃(14.28克)，同时搅拌该混和物。该混和物在加料过程中变得粘稠并开始回流。在全部AlCl₃加入后，再维持回流一小时。真空蒸发该冷却的混和物并用300毫升的3∶1的冰/5MHCl急冷。搅拌该混和物一小时，抽滤该橙色固体(靛红)并用水洗涤。¹HNMR(丙酮-d₆)δ6.92-6.97(m，1H)，7.35-7.61(m，6H)。

将该靛红产物在110毫升10％KOH水溶液中回流过夜。用400毫升1∶1的冰/5m HCl冷却并酸化该暗绿色混和物。用水洗涤该固体并空气干燥得到吖啶酸。¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.81-7.94(m，4H)，8.31-8.36(m，2H)。

d.2，7-二氟吖啶-9-硫代羧酸苯酯.将2，7-二氟吖啶-9-羧酸(1.0克)悬浮于SOCl₂(5毫升)，并回流该反应混和物3小时。减压除去溶剂并将所得棕色固体在氩气氛的条件下溶于20毫升的CH₂Cl₂中。先后加入苯硫酚(486毫克)和吡啶(2毫升)。室温中搅拌该混合物过夜。以CH₂Cl₂稀释该反应混和物并用水洗涤(3×50毫升)。该有机相用MgSO₄干燥并浓缩得到粗产物，再用硅胶色谱(40％乙酸乙酯/己烷)纯化得到1.2克纯产物。¹HNMR(CDCl₃)δ7.52-7.75(m，9H)，8.26-8.30(m，2H)。

e.2，7-二氟-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸苯酯.将2，7-二氟-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(1.2克)和NH₄Cl(4.57克)一起悬浮于2-丙醇(125毫升)中。加入锌(5.5克)并加温该反应混和物2.5小时，随后置于室温中1.5小时。TLC分析该反应混和物表明已彻底转变成一个新物质。过滤该溶液并用CH₂Cl₂洗涤该沉淀。浓缩该滤液并将浅橙色残留物重新溶于CH₂Cl₂中并用水(2×100毫升)洗涤。该有机层用Na₂SO₄干燥并浓缩，得到无需进一步纯化的粗产物。¹HNMR(CDCl₃)δ5.12(s，1H)，6.19(brs，1H)，6.72-7.35(m，11H)。

f.2，7-二氟-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代-羧酸 苯酯.将2，7-二氟-9，10-二氢化吖啶-9-硫代-羧酸苯酯在氩气氛条件下溶于CH₂Cl₂并加入三氟甲磺酸甲酯(5.29克)。室温搅拌该溶液过夜。TLC分析表明该转化约完成50％，所以另加入2毫升三氟甲磺酸甲酯并继续搅拌40小时。浓缩该反应混和物，并使用20-50％CH₂Cl₂/己烷色谱分离该残留物，得到带有少量的9，10-二氢化吖啶羧酸异丙酯副产物的产物。¹HNMR(丙酮-d₆)δ3.41(s，3H)，4.98(s，1H)，6.98(s，1H)，6.89-7.34(m，11H)。

g.9-(苯基硫代磺酰氧亚甲基)-2，7-二氟-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二(氰乙基)酯.将2，7-二氟-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(500毫克，1.3毫摩尔)加入到-78℃的LDA(1.4毫摩尔)的THF溶液中。搅拌一小时后，加入4毫升的POCl₃(313毫克)和吡啶(1.07克)的THF溶液并将该反应混和物保持在-78℃一小时。撤去该干冰浴并继续搅拌一小时。

冰浴冷却该溶液，滴加吡啶和3-羟基丙腈(484毫克)的4毫升THF溶液处理。室温中搅拌过夜后，滤去沉淀出的吡啶-HCl并真空蒸发该反应溶剂。将该残留物溶于乙酸乙酯中并用4×25毫升水洗涤。干燥并蒸发该乙酸乙酯后，色谱(75-80％乙酸乙酯/己烷)分离该残留物获得产物；¹HNMR(CDCl₃)δ2.48-2.65(m，4H)，3.48(s，3H)，4.02-4.16(m，4H)，6.91-7.66(m，11H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ-9.874(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

h.9-(苯基硫代磷酰氧亚甲基)-2，7-二氟-10-甲基-9，10-二 氢化吖啶，二钠盐(10).将磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.28克)的17毫升丙酮溶液用冰浴冷却，并氩气鼓泡。滴加1.02毫升的1NNaOH水溶液并通氩气搅拌该溶液16小时。抽滤所得的沉淀，用丙酮洗涤并真空干燥。产物是0.236克灰白色固体10。¹H NMR(D₂O)δ3.28(s，3H)，6.78-8.21(m，11H)，³¹PNMR(D₂O)δ1.006(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例11.合成9，10-二氢化吖啶衍生物11.

a.吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯.

将如上述制备的吖啶-9-碳酰氯(1.89克)在氩气氛条件下溶于30毫升的CHCl₂中。冰浴冷却该溶液并分别先后滴加2，2，2-三氟乙硫醇(1.0克)和3.23克吡啶。室温搅拌该反应混和物3天。加入水(20毫升)并过滤残存沉淀，弃去。用3×25毫升水洗涤该CH₂Cl₂溶液，干燥并蒸发获得纯度足以用于下步反应的灰白色固体产物。¹H NMR(CDCl₃)δ4.02-4.10(q，2H)，7.61-8.31(m，8H)。

b.9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯.将9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯(1.7克)和NH₄Cl(7.08克)一起悬浮于2-丙醇(150毫升)中。加入锌(8.61克)，在室温中搅拌该反应混和物1.5小时。TLC分析试反应混和物表明其已彻底转化成一个新的物质。过滤该溶液并用CH₂Cl₂洗涤该沉淀。浓缩该滤液并将浅橙色残留物重新溶于CH₂Cl₂中并用水洗涤(3×50毫升)。该有机层干燥并浓缩得到纯度足以用于下步反应的灰白色固态粗产物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.37-3.47(q，2H)，5.206(s，1H)，6.27(br s，1H)，6.78-7.27(m，8H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯.将9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯在氩气氛条件下溶于CH₂Cl₂(20毫升)并加入三氟甲磺酸甲酯(4.06毫升)。室温搅拌该棕色溶液1.5天。浓缩该CH₂Cl₂后，通过使用50％CH₂Cl₂/己烷的柱色谱，纯化该粗产物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.39-3.43(q，2H)，3.43(s，3H)，5.04(s，1H)，6.98-7.38(m，8H)。

d.9-(2′，2′，2′-三氟乙基硫代磷酰亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢 化吖啶，二(氰乙基)酯.将溶于10毫升的THF中的10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸2′，2′，2′-三氟乙酯(300毫克)，滴加入-78℃的LDA(1.4当量)的10毫升THF溶液中。-78℃搅拌60分钟后，缓慢加入POCl₃(239毫克)和吡啶(703毫克)在4毫升THF中的溶液。30分钟后，撤去干冰浴并继续搅拌60分钟。冰浴冷却该溶液并用吡啶(500μ1)和3-羟基丙腈(395μ1)处理。形成了棕黄色沉淀。室温中搅拌过夜后，滤去沉淀并真空蒸发该反应溶剂。将该残留物溶于乙酸乙酯，用5×25毫升水洗涤，干燥并浓缩。通过用CH₂Cl₂洗脱该柱色谱分离该粗产物，然后转换该溶剂成60-100％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱液。分离此两个馏分(每个都是两个靠近的洗脱产物的混和物，较慢洗脱的是较少含量的组份)。每个馏分通过使用25％乙酸乙酯/己烷的制备的TLC进一步分离纯化。已证明较慢洗脱的产物是所需的磷酸二(氰乙基)酯。¹H NMR(CDCl₃)δ2.69(t，4H)，3.41-3.54(q，2H)，3.49(s，3H)，4.04-4.24(m，4H)，7.04-7.95(m，8H)；³¹P NMR-8.66(p)。

通过¹H NMR，³¹C NMR，¹⁹F NMR和³¹P NMR以及同核和异核去偶合试验测定，其它产物是衍生于SCH₂CF₃基团的HF的消除作用和烯醇酯的磷酰化作用的9-(2′，2′-二氟乙烯硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二(氰乙基)酯。¹H NMR(CDCl₃)δ2.60-2.76(m，4H)，3.49(s，3H)，4.02-4.26(m，4H)，5.17(d，1H)，7.03-7.88(m，8H)；¹⁹FNMR(CDCl₃)δ-76.76(d，J＝Hz)，-78.88(t，J＝Hz)；³¹P NMR(CDCl₃)δ-8.83(p)。

在δ5.17处的双重峰(的irradiation)不影响¹H NMR光谱中任何其它信号。在δ4.02-4.26处的多重峰能将δ2.60-2.76处的多重峰压并(collapsed)成单峰并将该磷信号压并成单峰。在¹H光谱中δ5.17处的双重峰能将¹⁹F光谱中的三重峰压并成双重峰。

e .9-(2′，2′，2′-三氟乙硫基磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢 化吖啶，二钠盐(11).将磷酸二(氰乙基)酯化合物(15毫克)的4毫升丙酮溶液氩气鼓泡。分别滴加入1M NaOH的水溶液(58μl)和100微升水，并在氩气氛条件下搅拌过夜。TLC分析显示其已彻底去保护。浓缩该混合物至干燥得到灰白色固体，再用20％CH₂Cl₂/丙酮洗涤并空气干燥。¹H NMR(D₂O)δ3.399(s，3H)，3.45-3.61(m，2H)，7.04-8.18(m，8H)；³¹P NMR(D₂O)δ1.465(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例12.合成9，10-二氢化吖啶衍生物12.

a.吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯.将4-氯苯硫酚(4.75克)和7.22克吖啶-9-碳酰氯溶于100毫升的CH₂Cl₂中，再加入12.1毫升吡啶。该反应混和物变成橙棕色。室温中氩气氛搅拌该混和物过夜。蒸去溶剂后，用100毫升的己烷洗涤该固体，过滤，再用100毫升己烷洗涤，过滤，再用500毫升的水洗涤，过滤并空气干燥。得到微棕黄色固态的硫酯(8.71克)。¹HNMR(CDCl₃)δ7.47-7.50(m，2H)，7.58-7.67(m，4H)，7.81-7.86(m，2H)，8.12(d，2H)，8.29(d，2H)。

b.9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯.

将吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯(2.0克)溶于CH₂Cl₂(25毫升)。将该溶液氩气鼓泡，然后分别先后加入3.72克锌粉和0.45毫升的乙酸。TLC分析显示该起始反应物在20分钟内消耗完。过滤该混和物并用CH₂Cl₂洗涤该固体。用水(3×50毫升)洗涤该合并的CH₂Cl₂溶液并干燥。用制备的TLC纯化该少量产物以供测定其特性，而其余产物则无需进一步纯化就可使用。¹HNMR(CDCl₃)δ5.22(s，1H)，6.28(s，1H)，6.29-7.31(m，12H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯.

将9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯(2.0克)在氩气氛条件下溶于CH₂Cl₂(30毫升)中并加入三氟甲磺醇甲酯(6.5克)。蒸发该棕色溶液并通过使用30％乙酸乙酯/己烷的柱色谱纯化该粗产物。从而获得纯产物(1.8克)。¹H NMR(CDCl₃)δ3.47(s，3H)，5.09(s，1H)，7.02-7.39(m，12H)。

d.9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二(氰乙基)酯.

将溶于10毫升无水THF中的10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸4-氯苯酯滴加入-78℃的LDA(1.4当量)的THF溶液中。-78℃搅拌60分钟后，用POCl₃(0.517克)和吡啶(1.52毫升)的4毫升THF溶液缓慢地处理该黄色溶液。30分钟后，撤去干冰并继续搅拌1小时。该溶液变成黄色并形成沉淀。

冰浴冷却该混和物并用3-羟基丙腈(0.89克)和1.0毫升吡啶处理。该加料完成后，撤去冰浴。室温中搅拌过夜后，滤去沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗涤。真空蒸发该合并的滤液，并将所得棕色物溶于乙酸乙酯中，再以4×25毫升水洗涤。干燥并浓缩该乙酸乙酯溶液。使用80-100％乙酸乙酯/己烷柱色谱分离该残余物并从中分离出0.325克产物；¹HNMR(CDCl₃)δ2.48-2.64(m，4H)，3.53(s，3H)，3.86-4.16(m，4H)，6.94-7.94(m，12H)；³¹PNMR(D₂O)δ-9.48(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

e.9-(4’-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖 啶，二钠盐(12).

将溶于10毫升丙酮中的磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.325克)氩气鼓泡洗涤。分别先后加入2.5M NaOH(473μl)和500微升水。将该溶液在氩气氛搅拌过夜。抽滤该形成的沉淀并空气干燥。发现母液中含有单(氰乙基)-保护的化合物(140毫克)。通过重复NaOH脱保护的步骤，得到第二产物二钠盐。¹H NMR(D₂O)δ3.35(s，3H)，6.92-7.36(m，10H)，7.78(d，1H)，8.20(d，¹H)；³¹PNMR(D₂O)δ1.22(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例13.合成9，10-二氢化吖啶衍生物13.

a.吖啶-9-硫代羧酸萘酯.将2-萘硫酚(48.81克)和，从65.17克吖啶-9-羧酸制备的吖啶-9-碳酰氯，溶于100毫升的CH₂Cl₂中，随后加入120毫升的吡啶。室温氩气氛条件下搅拌该混和物过夜。蒸去溶剂后，该固体用500毫升的己烷洗涤，过滤，再用500毫升的己烷洗涤，过滤，然后，用600毫升水洗涤，过滤并空气干燥过夜。将该硫酯溶解于1500毫升的CH₂Cl₂，Na₂SO₄干燥，过滤，真空干燥。所得的硫酯是棕色固体。¹HNMR(CDCl₃)δ7.54-8.00(m，11H)，8.17-8.31(m，4H)。

b.10-甲基吖啶-9-硫代羧酸萘酯三氟甲磺酸盐.

将吖啶-9-硫代羧酸萘酯(26.38克)悬浮于CH₂Cl₂(200毫升)中。加入三氟甲磺酸甲酯并搅拌该混和物过夜。过滤该混和物并用CH₂Cl₂(300毫升)和己烷(500毫升)洗涤。空气干燥后，所得的产品是一黄色固体。¹HNMR(丙酮-d₆)δ5.20(s，3H)，7.66-7.75(m，2H)，7.88-7.92(m，1H)，8.03-8.09(m，2H)，8.15(d，1H)，8.26(t，2H)，8.48(s，1H)，8.61-8.68(m，2H)，8.80(d，2H)，9.03(d，2H)。

c.10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸萘酯.

将10-甲基吖啶-9-硫代羧酸萘酯三氟甲磺酸盐(65.50克)在氩气氛条件下悬浮于CH₂Cl₂(1000毫升)中，并加入冰醋酸(21.2毫升)和锌(40.43克)。搅拌过夜后，TLC分析显示出起始反应物已消失并形成了新产物。将该反应混和物通过硅胶床过滤，并真空除去CH₂Cl₂。将所得的浅黄色固体在异丙醇(500毫升)中搅拌，过滤，用多于500毫升的异丙醇洗涤，并空气干燥。获得了纯产物(46.36克)。¹H NMR(CDCl₃)δ3.47(s，3H)，5.13(s，1H)，7.00-7.06(m，4H)，7.25-7.49(m，7H)，7.70-7.79(m，4H)。

d.9-(萘硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二(氰 乙基)酯。将溶于600毫升无水THF中的10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸萘酯(17.32克)滴加入-78℃的LDA(1.25当量)的THF溶液中。-78℃搅拌90分钟后，用POCl₃(20.80克)和吡啶(50毫升)的150毫升THF溶液缓慢地处理该橙棕色溶液。60分钟后，撤去干冰浴，并继续搅拌一小时。该溶液变成棕色并形成沉淀。

用3-羟基丙腈(27.8毫升)处理该混和物。室温中搅拌过夜后，滤去沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗涤。真空蒸去该合并的滤液并将所得的棕色油状物用50-100％乙酸乙酯/己烷柱色谱分离，从而得到产物。将该黄色油状物溶于CH₂Cl₂(300毫升)，用水(450毫升)洗涤，Na₂SO₄干燥，过滤，并真空干燥。所得的产物(17.76克)是黄色固体。¹HNMR(CDCl₃)δ2.33-2.53(m，4H)，3.53(s，3H)，3.82-4.06(m，4H)，6.93(t，1H)，7.03(d，1H)，7.10-7.18(m，2H)，7.25-7.55(m，5H)，7.79-7.92(m，5H)，8.02(d，1H)；³¹P NMR(CDCl₃)δ-9.69(p)(rel.to ext.H₃PO₄)。

e.9-(萘硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶，二钠盐( 13).

将溶于200毫升丙酮的磷酸二(氰乙基)酯化合物(17.28克)氩气鼓泡洗涤。加入NaOH(2.76克)的50毫升水溶渡，并在氩气氛搅拌该溶液过夜。抽滤所得沉淀，并用20％的水的丙酮(300毫升)溶液洗涤，真空干燥。所得的产物(15.07克)是浅黄色固体。¹HNMR(D₂O)δ3.22(s，3H)，6.67(d，1H)，6.87(t，1H)，7.01(t，1H)，7.08-7.15(m，2H)，7.23(d，1H)，7.31-44(m，3H)，7.51(s，1H)，7.59(d，2H)，7.73(d，1H)，7.86(d，1H)，8.25(d，1H)；³¹P NMR(D₂O)δ1.30(s)(rel.to ext.H₃PO₄)。

实施例14.用化合物1化学发光检测碱性磷酸酶.

一种有效的用于化学发光检测碱性磷酸酶的试剂组合物，它包括0.1Mtris缓冲液(pH8.5)，0.88mM镁盐，0.33mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯1(从0.03M的甲醇溶液中1∶100稀释而来)和0.01毫克/毫升增强因子A(聚乙烯苄基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯苄基三辛基鏻氯化物，三丁基∶三辛基基团的比率是3∶1)。在置于Turner TD-20e发光计的试管中，该组合物和10^-13摩尔的AP在25℃反应，发出在两发钟内达到最高强度的易于检测的蓝色化学发光。

实施例15.用化合物2-13检测化学发光.

按照实施例14的方法，分别含有化合物2-13的组合物和AP在25℃反应。每个反应均产生出可分辨于无AP存在时测出的背景的，易于检测的，化学发光。

对本领域的熟练技术人员显而易见的是，除了这里具体例证的外，式I的其它化合物也能以类似的方式在本方法中起作用。

实施例16.用化合物5化学发光检测碱性磷酸酶.

一种有效的用于化学发光检测碱性磷酸酶的试剂组合物包括0.2M的2-甲基-2-氨基-1-丙醇缓冲液(pH9.6)，0.88mM的Mg²⁺，0.66mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯 5(从0.033M的甲醇溶液中以1∶100稀释而来)和0.5毫克/毫升增强因子A。在置于Turner TD-20e发光计的试管中，100微升该组合物和10^-13摩尔AP在25℃反应产生出易于检测的且在2分钟内达到最高强度的蓝色化学发光。在1到10分钟内测定的光强度和8×10^-14摩尔到8×10^-18摩尔范围内的酶的量相关。

实施例17.化学发光强度的动力学分布.

图1的曲线显示了含有磷酸9，10-二氢化吖啶酯 1的组合物所达到的快速检测速度。100微升的实施例14的试剂组合物和8×10^-6摩尔的AP在25℃反应引起光的突然发射并在大约2分钟内达到最高强度。该图也显示了类似于实施例14所述的，以10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸苯酯代替 1的试剂组合物的化学发光的对比分布曲线。在该后者的酯溶液中加入AP没有什么效果。该酯的自发的自氧化作用的过低的光强度和过慢的产生时间不相容于反应1的发射情况，这是仅因为通过AP(从磷酸烯醇酯上除去磷酸酯保护基)产生酯，随后该酯产生自氧化作用。

实施例18.化合物1和AP反应的光谱学研究.

用带有二极管系统检测器的UV-可见分光光度计监测实施例14的试剂组合物和2.4×10^-12摩尔的AP在室温中的反应进程。以5分钟的间隔测定该光谱。图2显示的光谱演变表明了由多种中间体和产物所构成的复杂图谱。标有A-F的曲线代表在加入酶后0，5，10，20，40和60分钟的扫描图。

实施例19.化学发光光谱.

使用由Luingon的Barry Schoenfelner博士所制的装置得到化学发光光谱。实施例14的试剂组合物在由置于光密闭盒的试管所构成的样品箱中和AP(8×10^-13mol)反应。该发射光用透镜收集，并通过单色光栅分散到CCD成像器件上。由于该系统同时成像了全部波长的可见光，所以无需修正光强度随着时间的改变。图3所示的发射光光谱是在大约430nm处有最大强度的宽发射。该光谱类似于N-甲基吖啶酮的荧光。光谱中明显的细微结构是仪器噪音的结果。

实施例20.pH对化合物1和碱性磷酸酶的化学发光反应的影响.

本发明的用9，10-二氢化吖啶化学发光检测碱性磷酸酶的方法可以在宽范围的pH下完成。制备含有0.1M缓冲液(无论是tris或2-甲基-2-氨基-1-丙醇，221)，pH7-10.5，0.88mM的Mg²⁺，0.33mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯1(从0.33M甲醇溶液中1∶100稀释而来)和0.01毫克/毫升的增强因子的溶液并在25℃10分钟后测定背景光发射。加入含有8×10^-16摩尔酶的AP溶液并监测光强度直到最大强度。S/B代表最大光强度对无酶存在时的光强度的比值。

                      表2

项目         pH              缓冲液      S/B

 1            7.0              tris         37

 2            7.5              tris         144

 3            8.0              tris         273

 4            8.5              tris         280

 5            9.0              tris         195

 6            9.0              221          200

 7            9.5              221          87

 8            10.0             221          13

 9            10.5             221          1.3

实施例21.用表面活性剂增强化学发光.定义为在无检测物质存在的水平上增加光强度的增强化学发光，是在有各种表面活性剂化合物存在的标准的试验条件下，在9，10-二氢化吖啶 1和AP的反应中测定的。分别测定每个表面活性剂产生最大增强效应的浓度。在标有S/B列的值代表有10^-16摩尔AP存在时的光强度和无酶存在时的光强度的比率。标有Rel的列提供了有增强因子存在的条件下的光强度对无增强因子时的光强度(第11项)的归一化比率。

                       表3

项目        表面活性剂        浓度         S/B     Rel

 1             A                0.01克/升     562      40.1

 2             B                0.01          431      30.8

 3             C                0.01          389      27.8

 4             D                0.25          295      21.1

 5             E                0.10          162      11.6

 6             F                0.05          120      8.6

 7             G                0.10          63       4.5

 8             H                0.10          26       1.9

 9             I                0.43          24       1.7

 10            J                0.10          17       1.2

 11            无               ----          14       1

^*2分钟时测定

A.聚(乙烯苄基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯苄基三辛基鏻氯化物)(三丁基；三辛基基团的比率为3∶1)

B.聚乙烯苄基苄基二甲基铵氯化物

C.聚(乙烯苄基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯苄基三辛基鏻氯化物)-共-聚(乙烯-苄基荧光素)(75∶25∶1)

D.聚(乙烯苄基三丁基鏻氯化物)

E.1-三辛基鏻甲基-4-三丁基鏻-甲苯二氯化物

F.TweenTM20，聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯

G.1-三辛基鏻甲基-4-三丁基铵-甲苯，混和溴氯化物

H.SDS，十二烷基硫酸钠

I.CTAB，十六烷基三甲基溴化铵

J.二氯化1-三辛基铵甲基-4-三丁基铵甲苯

由于在使用4-11项的增强因子后，光强度连续增长超过一小时，所以4-11项的S/B值并不代表所得的最大增强效应。

实施例22.增强因子A的浓度对光强度以及磷酸9，10-二氢化吖啶酯的动 力学的影响.进行浓度依赖性研究是为了测定在9，10-二氢化吖啶和AP的化学发光反应中产生最高的信号/背景(S/B)水平的增强因子A的量。制备含有0.88mM的M^g+和0.5，0.25，0.1，0.05或0.025毫克/毫升增强因子A的1的0.1M tris缓冲溶液(pH8.5)。取等份试液(100μ1)在25℃平衡，并和8×10^-16摩尔的AP反应。列于表4的S/B值显示了用0.005-0.01g/L增强因子时，产生了最大光增强效应。

                        表4

项目       浓度                S/B2分钟       S/B10分钟

 1         0.0025g/L               431             262

 2         0.005                   714             500

 3         0.010                   660             562

 4         0.025                   399             360

 5         0.050                   247             240

 6         0.10                    212             163

 7         0.50                    40              84

实施例23.用磷酸9，10-二氢化吖啶酯1检测碱性磷酸酶的线性和灵敏性.使用本发明的含有磷酸9，10-二氢化吖啶酯 1的试剂组合物测定对AP检测的灵敏度和线性。在一块96孔的白色微孔板的每3孔中，加入含有8×10^-15摩尔到8×10^-20摩尔范围的酶的10微升的AP稀释液。每孔加入100微升的含有0.3mM的溶于0.1M tris缓冲液(pH8.5)的磷酸9，10-二氢吖啶酯1的溶液，0.88mM的MgCl₂，0.01毫克/毫升增强因子A和1％甲醇的检测试剂。2.5分钟后，测定光强度。图4显示了碱性磷酸酶的线性检测。术语S-B是指有AP存在时，以相对光单位(RLU)表示的化学发光信号(s)减去没有AP存在时的本底化学发光信号(B)。在这些情况下，测定的理论检测限(本底标准差的两倍)是1.2×10^-19摩尔。十分钟后，光强度检测可得到类似结果。

实施例24.通过pH改变的化学发光检测AP.另一个可供选择的通过AP和1的反应检测光发射的方法是，先在无增强因子存在的第一pH的条件下培育含 1的试剂组合物和AP，然后再通过加入含有增强因子的强碱溶液，迅速升高pH导致光发射的突然发生。设计一套可检测＜10^-18的AP的实验条件。

含有溶于0.1M tris缓冲液(pH9)的0.33mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯1，0.88mM的MgCl₂的试剂组合物(100μl)，和10微升AP(8×10^-15-8×10^-20mol)或10微升水(作为空白试剂)，在黑色微孔板中室温反应4分钟。加入含有溶于1N NaOH的0.5毫克/毫升增强因子A的溶液(100μl)，并光强度10秒钟内积分。如图5所示，光强度在8×10^-15到8×10^-19摩尔AP的范围内是AP量的线性函数。

实施例25.酸性磷酸酶的化学发光检测及酒石酸抑制作用。用于化学发光检测酸性磷酸酶(AcP)的试剂组合物包括0.1M tris缓冲液(pH7)，0.33mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯 1(从0.033M的甲醇溶液中l∶100稀释而来)以及0.01-0.1％增强因子A。在置于Turner TD-20e发光计的试管中，100微升的该组合物和AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重组到2.0毫升，83U/L)，在室温中反应，产生出几乎立即达到最大光强度并几乎连续保持几分钟的化学发光。加入0.1％的胎牛血清白蛋白到该检测试剂中能显著地延长光发射的时间。

加入5微升的0.04M的酒石酸的柠檬酸盐缓冲液(0.09M，pH4.8)中，引起光发射的彻底消失。这是由于酒石酸(一种前列腺酸性磷酸酶的特异抑制剂)对酶的抑制作用。由于加入10微升的柠檬酸盐缓冲液只引起光强度降低25％，所以该发射的骤灭并不是因为pH的降低。

实施例26.通过pH改变的化学发光检测AcP.

一种可供选择的通过AcP和 1反应检测光发射的方法是，先在第一pH的条件下培育含 1和增强因子的试剂组合物和AcP，然后通过加入强碱溶液而迅速升高pH引起光的突然发射。含有溶于0.1M tris缓冲液(pH7.0)的0.33mM的磷酸9，10-二氢化吖啶酯 1，0.1％BSA和0.01％增强因子A的试剂组合物(100μl)和3微升AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重组到2.0毫升，83U/L)在一试管中室温反应8分钟。加入1N NaOH(50μl)溶液并在4分钟积分光强度。光强度是空白试剂的3倍。

实施例27.使用PVDF膜的Western Blot检测.

本发明的组合物在Western blot中是通过AP标记的抗体(反应)，而用于检测和定量聚偏氟乙烯(PVDF)上的蛋白质，人铁转移蛋白。将分别含有5000，1000，180，30和5pg的蛋白质的铁转移蛋白稀释液电泳，并转移到PVDF膜上(Millipore，Beford，MA)。该铁转移蛋白带分别先后用羊抗人铁转移蛋白和兔抗羊AP联接物封闭和反应。将该膜简短地浸于含有0.2M的221缓冲液(pH9.6)，0.88mM的MgCl₂，0.66mM的磷酸9，10-二氢化吖啶酯 1和0.1到1毫克/毫升的增强因子A的试剂中。将该膜置于透明塑料纸间并暴露于X-射线胶片。图6显示了使用含有0.1毫升/毫升的增强因子的试剂组合物浸泡15分钟后再暴露于X-射线胶片一分钟的人铁转移蛋白的检测。使用这些带有不同量的增强因子的组合物产生的光导致了能在至少2周的时间内成像的强烈的光发射。

令人惊奇地发现含有0.5毫克/毫升的增强因子A的组合物产生出在相对带强度上连续四天几乎没有强度变化的光发射。在PVDF膜产生的光发射能维持在有用的水平上很长的超过一个月的时间。5pg带在5周后只暴光20分钟还可以成像。这个维持在有用水平上的发射时间是没有先例的。

实施例28.使用硝酸纤维膜的Wlestern Blot.

按照实施例27的步骤的Western blot检测还可以使用硝酸纤维素膜作为固相支持物而完成。使用5000-30pg的铁转移蛋白的标准品。可以检测全部水平的蛋白质的检测试剂包括0.2M的22缓冲液(pH9.6)，0.88mM的MgCl₂，0.33mM的磷酸9，10-二氢化吖啶酯和0.5毫克/毫升的增强因子A。该检测可以在几小时内完成。

实施例29.用化学发光检测的Southern Blot分析.

下面的实施例阐明了使用本发明的组合物通过Southern blotting技术化学发光检测硝酸纤维素膜上的DNA。

抗生物蛋白-AP联接物是来自Cappel的产品(Durham，NC)。胎牛血清白蛋白(热激)购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。人基因组DNA和人铁转移蛋白受体cDNA购自Clontech(Palo Alto，CA)。生物素化的λDNA/HindIII片段，生物素-7-dATP和缺口平移试剂盒(Nick Translation kit)来自LifeTeehnologies，限制性核酸内切酶Hind III来自于Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)，而硝酸纤维素膜来自Schleicher & Schuell公司(Keene，NH)。X-射线胶片是来自Kodak(Rochester，NY)的X-OMAT AR。

用Hind III彻底剪切人基因组DNA(19.5μg)并分成13微克和6.5微克部分。限制的DNA通过苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀而纯化。该纯化的DNA在0.75％的琼脂糖凝胶上用40毫摩尔/升的Tris-乙酸盐，2毫摩尔/升的EDTA(pH8.0)作为洗脱缓冲液电泳分离。电泳后，用水漂洗该凝胶，在0.25M的HCl中平衡12分钟，再用水漂洗，在0.5MNaOH，1.5M的NaCl中培育15分钟，再换成新鲜的相同溶液培育30分钟，用水漂洗，再在1Mtris，1.5MNaOH的溶液中培育，换液三次，每次15分钟。

将该硝酸纤维素膜先后浸于水中两分钟，10X SSC中30分钟。DNA通过毛细管吸附作用在10X SSC中过夜转移到膜上。将该膜在轻轻振荡的条件下用10X SSC室温洗涤十分钟并在Whatman 3MM吸渗(blotting)纸上空气干燥30分钟并于80℃真空烘2小时。

将该膜浸于6X SSPE(20X SSPE是3M NaCl，0.2M NaH₂PO₄，20MEDTA，pH7.4)，随后用预杂交液(6X SSPE，新鲜去离子的50％甲酰胺，过滤的5×Denhardt′s液(50X是1％ Ficoll 400，1％PVP，1％BSA(热激的初始组分))，过滤的1％SDS和200μg/毫升切变鲱鱼精子DNA)在42℃预杂交。按照使用说明书的方法，通过缺口平移技术用生物素-7-dATP标记该杂交探针即人铁转移蛋白受体cDNA。基因组DNA和300μg/毫升变性的生物素化探针在6X SSPE，45％甲酰胺，过滤的5X Denharts，1％SDS，200μg/毫升鲱鱼精子DNA中42℃杂交过夜。该生物素化探针是通过煮沸4分钟再在0℃冷却10分钟而变性。将该膜在25℃的0.5X SSC，0.4％SDS中洗涤两次，每次5分钟，在55℃的0.5X SSC，0.4％SDS中洗涤三次，每次10分钟，在25℃的2X SSC中洗涤一次，5分钟，在TBS(50mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl)中洗涤两次，每次3分钟。洗涤后，将该膜在过滤的3％BSA，100mM Tris-HCl，pH7.4，0.15MNaCl中63℃封闭一小时并在T-TBS(0.05％ Tween 20的TBS溶液)中洗涤一分钟。

将该封闭的膜和1∶2000稀释的抗生物素蛋白-AP的T-TBS溶液共同培育12分钟，随后换成新鲜的T-TBS四次，分别培育5，10，15，20分钟，最后再用TBS洗涤5分钟。倾去过量的缓冲液并将核酸斑点(blots)浸入如实施例27所述的检测试剂中3分钟。倾去过量的试剂，将杂交斑点置于透明纸间并暴露于X-射线胶片。

通过将膜浸入检测试剂并暴露于X-射线胶片不同长短的时间可检测10.5和5.2kbp的单拷贝基因。用本发明的试剂培育12分钟后，暴露于胶片分钟即可在两侧见到对应于该单拷贝基因的带。稍短一些的培育时间也能产生出色的影像。在一天中，很容易进行多重暴光。

实施例30.光泽精对化学发光曲线的影响.

图7的曲线显示了通过将光泽精加入到磷酸9，10-二氢化吖啶酯5和AP的反应中获得了较高的光强度。含有0.8mM的MgCl₂的100微升的5(0.66mM)的0.1M tris缓冲溶液(pH8.8)和8×10^-16摩尔AP在25℃的反应在有或无6.4μM光泽精的条件下分别进行。图7表明加入光泽精到该溶液中可以产生出较高的光强度。

实施例31.用化合物5化学发光检测碱性磷酸酶.一种用于化学发光检测碱性磷酸酶的高效试剂组合物包括0.1M tris缓冲液，pH8.8，6.4μM光泽精，0.66mM化合物 5，1毫克/毫升SDS，0.01毫克/毫升Na₂SO₃，0.033％(w/v)TWEEN 20和0.88mM的MgCl₂。100微升的该组合物和8×10^-16摩尔的AP在25℃反应，产生出在2分钟内达到最大强度的化学发光。图8显示了含有 5和阳离子型聚合表面活性剂增强因子，聚(乙烯苄基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯苄基三辛基鏻氯化物)(三丁基∶三辛基基团的比率约3∶1)，的试剂组合物在37℃激发的光强度对比曲线。以前只是发现，含有后者的聚合表面活性剂的组合物所产生的是在无CAC存在时的最高水平的化学发光。

实施例32.检测碱性磷酸酶的线性和灵敏度.

AP的检测灵敏度和线性是通过使用含有化合物 5和光泽精(试剂A)的试剂组合物并将所得的结果和使用含有化合物 5及0.25TB/TO(试剂B)的试剂组合物的比较而测定的。该试剂具有如下组成：

试剂A                          试剂B

化合物 5，0.66mM              化合物 5，0.66mM

0.1M tris缓冲液，pH8.8         0.2M 221缓冲液，pH9.6

0.01或0.88mM MgCl₂            0.88mM MgCl₂

光泽精，6.4μM                 0.25TB/TO，0.5毫克/毫升

SDS，1毫克/毫升

Na₂SO₃，0.01毫克/毫升

TWEEN 20，0.033％(W/V)

在96孔白色微孔板的每3孔中，将10微升的分别含有8×10^-13摩尔到8×10^-22摩尔酶的AP稀释液加入到每份100微升的检测试A或B中。2.5分钟后，测定光强度。图9显示了碱性磷酸酶的线性检测。试剂A的理论检测限(本底标准差的两倍)测定为3.5×10^-21摩尔，试剂B的为1.2×10^-19摩尔。

实施例33.用化合物1-13进行化学发光检测.

按照实施例30的方法，分别含有0.66mM化合物1-13的且带有0及6.4μM光泽精的组合物，和8×10^-16摩尔的AP在25℃反应。它们的每个反应都显著地证明，加入光泽精到该反应液中时，可以产生出更为强烈的化学发光。

实施例34.用化合物7-12检测AP的灵敏度和线性.

除了以分别为0.66mM的化合物7-12代替化合物5外，按照实施例32的方法，根据试剂A的组成制备试剂。将10微升的含有8×10^-16摩尔到8×10^-22摩尔酶的AP稀释液或10微升的作为空白试剂的水加入到每份100微升的这些试剂中。在每个反应中，含有8×10^-21摩尔的酶的反应液在约两分钟内产生出比空白值更高的峰信号。图10、11和18分别描述了化合物7，8和12的结果。

实施例35.化合物7化学发光的时间曲线.

下列试验证明了含有化合物 7的试剂组合物所发射化学发光的快速产生。每份100微升的由0.1M tris缓冲液，pH8.8，6.4μM光泽精，0.66mM磷酸9，10-二氢化吖啶酯7，1毫克/毫升十二烷基硫酸钠，0.01毫克/毫升Na₂SO₃，0.033％(w/v)TWEEN 20和0.88mM的MgCl₂所组成的试剂，和8×10^-16摩尔AP在室温中反应。如图12所示，该化学发光强度在5秒内达到稳定的平台期。

实施例36.用各种CACs增强化学发光强度.

制备含有21mM的CAC 1-11的DMSO溶液的试验液。将它们按1∶1000稀释到含有0.88mM的MgCl₂的磷酸9，10-二氢化吖啶酯5的0.1M tris缓冲液溶液(pH8.8)中。在一白色微孔板中，一式三份每份100微升，所制备的试剂组合物和4×10^-16摩尔的AP在室温反应。表5显示了每个CAC在36分钟测定的平台强度(S)效应以及信号/背景(S/B)。每个CAC都产生出比没有CAC的对照组更高的峰信号S和S/B。

                        表5

          CAC                36分钟时的S

           1                  2602

           2                  45.3

           3                  5963

           4                  4645

           5                  34.7

           6                  72.3

           7                  61.6

           8                  19.1

           9                  781

           10                 21.1

           11                 9.3

           无                 2.8

1：光泽精

2：碱性红29

3：碱性蓝66

4：碱性蓝41

5：碘化3，3′-二乙基-9-甲基硫代二羰花青

6：碘化3，3′-二乙基-9-甲基硫代羰花青

7：碘化3，3′-二乙基硒代羰花青

8：碘化3，3′-二乙基硫代花青

9：IR-1040

10：碘化5-[3-乙氧基-4-(3-乙基-5-甲基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)-2-亚丁烯基]-3-乙基-2-[(3-乙基-4，5-二苯基-2(3H)-亚噻唑基)甲基]-4，5-二氢-4-氧代噻唑

11：IR-786高氯酸盐

实施例37.CAC浓度对5和AP化学发光影响反应的影响.

用本发明的组合物化学发光检测AP可在CAC的宽浓度范围内进行。通过10倍的系列稀释贮备光泽精溶液，制备带有从6.4mM到6.4nM的不同浓度光泽精的，且含有0.66mM化合物 5的0.1M tris缓冲液(pH8.8)溶液，0.88mM的MgCl₂的组合物。对照组不含光泽精。在室温中培育3.5分钟后，含有6.4mM到6.4nM的光泽精的试验液(100μl，一式五份)和4×10^-16摩尔的AP反应，产生出高于对照组的信号(S)。

实施例38.阴离子型表面活性剂的浓度对5和AP的化学发光反应的影响.

使用本发明的组合物化学发光检测AP可在阴离子型表面活性剂SDS的宽浓度范围内进行。制备带有从10毫克/毫升到10μg/毫升的不同浓度SDS的且含有0.66mM化合物的5和0.88mM的MgCl₂的0.1Mtris缓冲液溶液的组合物。对照组则不含SDS。试验液(100μl，一式五份)和4×10^-16摩尔的AP在室温中反应，比对照组更快地产生峰信号。

实施例39.非离子型表面活性剂对5和AP的化学发光反应的影响.

使用本发明的组合物化学发光检测AP可在非离子型表面活性剂TWEEN 20的宽浓度范围内进行。除了带有21μM的光泽精和从1.0％到0.001％的不同浓度的非离子型表面活性剂而没有Na₂SO₃外，按照实施例32中的试剂A制备组合物。对照组不含非离子型表面活性剂。试验液(100μl，一式5份)和对照组在室温和4×10^-16摩尔的AP反应。每个试验液都能有效地延长等于或接近于最大强度的化学发光的时间。

实施例40.Na₂SO₃ 的浓度对5和AP的化学发光反应的影响.

使用本发明的组合物化学发光检测AP可在宽的Na₂SO₃浓度范围内进行。除了带有从1.0毫克/毫升到1.0μg/毫升的不同浓度的Na₂SO₃外，按照实施例32中的试剂A制备组合物。对照组则不含Na₂SO₃。每个试验液(100μl，一式五份)在无AP时产生出比对照组更低的背景信号(B)，而在和4×10^-16摩尔AP在室温培育反应3.5分钟后则产生出更高的信号(S)。在该实验中，最强信号是使用1.0μg/毫升的浓度获得的，最大S/B则是使用1.0毫克/毫升的浓度获得的。

实施例41.Western Blot检测.

本发明的组合物在Western Blot中用标记的抗体检测和定量聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的蛋白质，人铁转移蛋白。将分别含有5000，1000，180，30和5pg蛋白质的铁转移蛋白稀释电泳并转移到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA)。该铁转移蛋白带分别先后用羊抗人铁转移蛋白和兔抗羊AP联接物封闭和反应。将该膜简短地浸于含有0.1M tris缓冲液(pH8.8)，0.88mM的MgCl₂，0.66mM化合物5和64μM光泽精的试剂中。再将该膜置于透明的塑料纸间并暴露于X-射线胶片。十分钟后，用2.5分钟的曝光时间检测人铁转移蛋白带。用该组合物产生的光导致了可在几小时内成像的强烈的光发射。

用硝酸纤维素吸渗(blotting)膜代替PVDF膜也可获得类似的结果。

实施例42.Sonthern Blot检测.

下面的实施例阐明了一个本发明的试剂在Southern blot检测中应用的典型的范例。

抗生物蛋白-AP联接物是来自CappelProducts(Durham，NC)。胎牛血清白蛋白(热激)购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。鼠基因组DNA购自Clontech(Palo Alto，CA)。生物素化的λDNA/Hind III片段，生物素-7-dATP和缺口平移试剂盒购自Life Technologies，限制性核酸内切酶EcoRI购自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)，而尼龙膜购自Micron Separation公司(Westborough，MA)。X-射线胶片是购自Kodak(Rochester，NY)的X-OMAT AR。

用EcoRI彻底地剪切鼠基因组DNA(30μg)。通过苯酚/氯仿萃取以及乙醇沉淀纯化二和四微克部分。该纯化的DNA用40mM Tris-乙酸盐，2mMEDTA(pH8.0)作为洗脱缓冲液，在0.75％的琼脂糖凝胶上电泳分离。电泳后，用水漂洗凝胶，在0.25M HCl中平衡12分钟，再用水漂洗，在0.5mMNaOH，1.5M NaCl中培育15分钟，然后换成新鲜的相同溶液培育30分钟，用水漂洗，再在1M tris，1.5M NaCl(pH7.5)中培育，换液三次，每次15分钟。

将该尼龙膜先后浸于水中两分钟，10X SSC中30分钟。DNA在10XSSC中通过毛细管吸渗作用而过夜转移到膜上。将该膜在轻轻振荡的条件下用10X SSC室温洗涤十分钟并在Whatan 3MM吸渗(blotting)纸上空气干燥30分钟并于80℃真空烘2小时。

将该膜浸于6X SSPE(20X SSPE是3M NaCl，0.2M NaH₂PO₄，20mMEDTA，pH7.4)，随后用预杂交液(6X SSPE，新鲜去离子的50％甲酰胺，过滤的5X Denhardt′s液(50X是1％ Ficoll 400，1％ PVP，1％BSA(热激的初始组分))，过滤的1％SDS和200μg/毫升切变鲱鱼精子DNA)在42℃预杂交。按照使用说明书的方法通过缺口平移技术用生物素-7-dATP标记该杂交探针，即v-mos DNA癌基因探针(Pan Vera公司，Madison，WI)。基因组DNA和500ng变性的生物素化探针在6X SSPE，45％甲酰胺，过滤5XDenhart′s，1％ SDS，200μg/毫升鲱鱼精子DNA中于42℃杂交过夜。该生物素化探针是通过煮沸4分钟再在0℃冷却十分钟而变性。将该膜在25℃的0.5X SSC，0.4％SDS中洗涤15和35分钟，在55℃的0.5X SSC，0.4％ SDS中洗涤三次，每次十分钟，在25℃的2X SSC中洗涤一次，5分钟，在TBS(50mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl)中洗涤两次，每次3分钟。然后，该膜在过滤的3％BSA，100mM Tris-HCl，pH7.4，0.15MNaCl中65℃封闭一小时并在T-TBS(0.05％ Tween 20的TBS溶液)中洗涤一分钟。

将该封闭膜的和1∶2000稀释的抗生物素蛋白-AP的T-TBS溶液共同培育12分钟，随后换成新鲜的T-TBS四次并分别培育5，10，15，20分钟，最后再用TBS洗涤5分钟。倾去过量的缓冲液并将核酸杂交斑浸入如实施例41所述的检测试剂中4分钟。倾去过量的试剂并将杂交斑点置于透明的纸间并暴露于X-射线胶片。

通过将膜浸入检测试剂并以不同的时间暴露于X-射线胶片可检测14.5kbp的单拷贝基因。培育9分钟后，暴露于胶片5分钟即可在两侧见到对应于该单拷贝基因的带。使用较长的曝光时间可在一天内进行多重曝光。

实施例43.hCG的化学发光检测.

通过化学发光免疫检测hcG的方法是在IMMULITE自动分析仪上，使用Diagnostic Product公司(Los Angeles，CA)供应的IMMULITE试剂盒，按照厂商提供的方案而进行的。实施例32的试剂A可以取代试剂盒中供应的检测试剂。调整软件后可以允许底物培育较短的时间。除了空白组读数是样品稀释液的5次试验的平均值外，其它全部数据值都是三次重复试验的平均值。通过特殊的校准器用试验盒供应的标准稀释液系列稀释而制备被分析物。在底物加入1.5分钟后进行化学发光检测。

对加样装置的小改进可以使管道系统中该化学发光试剂的死体积达到最小。该底物加热器是可拆的，外尺寸为18″×1/16″的，带有翻口末端且包裹于黑色绝缘胶布中的透明的聚四氟乙烯管道系统直接连接底物泵和半透明的底物分散喷头。一个近似长度的同样的聚四氟乙烯管道系统连接于底物泵的入口。此输入的管道系统置于含有底物的瓶中。无需预热或使底物恒温。即使在没有外部的底物恒温装置的情况下，用密封的CV′S也显示了温度的不敏感性。

在快速读数的发光计上的独立试验证明，该底物的读数可在少到10秒的培育时间的条件下进行而没有灵敏度或精确度上的损失。图13所示的检测结果和表6证明了本发明的组合物在三明治(夹心)型免疫检测中的应用。

                       表6

            IMMULITE hCG检测的表列数据

mIU/mL hCG         强度(脉冲/秒)       ％CV

   6675               47332040           3.8

   3000               29174720           1.2

   1000               11031867           1.5

   300                2906560            2.5

   100                977760             2.6

   30                 288883             0.7

   10                 133573             6.3

   3                  71507              5.9

   1                  54738              7.4

   空白               47634              9.0

实施例44.TSH的快速化学发光免疫检测.

通过化学发光免疫检测TSH的方法是，在IMMULITE自动分析仪上，使用Diagnostic Products公司的IMMULITE RTH快速检测TSH试剂盒，按照厂商的方案并稍作如实施例43中所述的改进进行的。实施例32中的试剂A可取代该试剂盒中提供的检测试剂。

该试剂的背景可通过从第三代TSH检测Wedge中除去抗体联接物，小心洗涤该Wedge并用1型水(Type 1 water)代替其内容物而检测。观察到的底物背景约为每秒5000个计数。这表明非特异性结合背景是该试剂背景的的几倍。因此，Wedge中的生物化学重新优化可能明显增加几个检测的灵敏度和/或允许该生化培育时间的降低。该化学发光检测是在加入底物后1.5分钟进行的。

                        表7

               IMMULITE RTH快速TSH检测数据

   uIU/mLTSH        强度(脉冲/秒)         ％CV

       75              17370000            0.9

       10              2263413             5.3

       1               202120              2.6

       0.3             72357               2.6

       0.1             36887               1.5

       0.03            25607               2.6

       0.01            22647               5.0

       空白            20810               2.0

图14所示的检测结果以及表7证明了本发明的组合物在所提供的快速检测中的实用性。

实施例45.TSH的化学发光免疫检测.

通过化学发光免疫检测TSH的方法是在IMMULITE自动分析仪上，使用Diagnostic Products公司的IMMULITE TSH第三代TSH检测试剂盒，按照厂商提供的方案并稍作如实施例43中所述的改进而进行的。实施例32中的试剂A可以取代该试剂盒中的检测试剂。该化学发光检测是在加入底物后1.5分钟时进行的。

                       表8

           IMMULITE第三代TSH检测数据

   uIU/mL TSH         强度(脉冲/秒)         ％CV

      75                25249293            1.6

      10                4265600             1.5

      1                 415363              0.8

      0.3               122580              4.3

      0.1               54070               0.3

      0.03              23810               3.7

      0.01              17240               0.4

      0.003             13900               1.7

      空白              12996               4.4

图15所示的检测结果和表8证明了本发明的组合物在提供高灵敏度检测中的实用性。

实施例46.雌二醇的化学发光免疫检测.

通过化学发光免疫检测雌二醇的方法是在IMMULITE自动分析仪上，使用Diagnostic Products公司供应的试剂盒，按照厂商提供的方案稍作如实施例43所述的改进而进行的。实施例32的试剂A可以取代试剂盒中提供的检测试剂。该化学发光检测在加入底物后1.5分钟进行。

                           表9

               IMMULITE E2雌二醇检测数据

        pg/mL  雌二醇       强度(脉冲/秒)         ％CV

             2000             500300              4.1

             1000             783877              3.3

             300              2521788             2.7

             100              5398650             2.9

             30               8808133             1.8

             10               10036147            2.1

             空白             10536776            3.9

图16所示的检测结果和表9证明了本组合物在竞争型免疫检测中的实用性。

实施例47.化学发光检测酸性磷酸酶(AcP).

实施例32中的试剂A可用于检测酸性磷酸酶的实验中。在置于TurnerTD-20e发光计的试管中，100微升的该组合物和AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重组到2.0毫升，83μ/L)在室温反应产生在2-5秒内达到最大强度并在10-15秒内衰变至零的化学发光。

利用本检测试剂还可在有碱性磷酸酶存在时检测酸性磷酸酶。由于AcP诱发的化学发光信号在数秒内几乎完全衰变，所以在大约15-20秒后测定的稳定光强度可，如图17所示，区分出AP的活性。此法可以在一个实验中对同一个样品同时进行AcP和AP的活性定量分析。AcP可在人全血中方便地检测。

实施例48.用化合物13检测AP的线性和灵敏度.

按照实施例32的方法，制备下列组合成分的试剂。将含有8×10^-16到8×10^-22摩尔酶的10微升AP稀释液，或10微升作为空白试剂的水，加入到每份为100微升的该试剂中。在75秒时检测光强度。图19显示了该结果。

                          试剂

                    化合物 13，0.33mM

                    0.1M tris缓冲液，pH8.8

                   MgCl₂，5μM

                    光泽精，3.2μM

                    SDS，0.5毫克/毫升

                   Na₂SO₃，5μg/毫升

                    TWEEN 20，0.15毫克/毫升(w/v)

实施例49

还合成了下列化合物，并发现其在和AP反应时也能产生化学发光：

其中的V是叔-丁基，CH₃，OCH₃，F，Cl，Br，I，COCH₃，CN和NO₂；和下式化合物：

其中的U是p-I，p-CH₃，m-OCH₃，o-Cl，m-Cl，o-Br，m-Br，p-Br和p-NO₂以及带有3，4-二氯-、2，5-二氯-和2，

6-二氯苯基的该式化合物。

上文的说明和实施例只是解释而不能认为是限制。应理解的是，在未脱离本发明的精神和范围下，可以进行那些没有详细公开的具体化合物和方法的改进。本发明的范围只通过附带的权利要求而限定。

Claims (109)

1.式I化合物：

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字。

2.按照权利要求1所述的化合物，其中Het是下式的基团：

3.按照权利要求1所述的化合物，其中的R₁选自C_1-4烷基；R₂-R₃或R₄-R₅形成苯环，该苯环可以被卤素、C_1-4烷基或烷氧基取代，或者其相邻的取代基可以联接成一个5-或6元环的碳环；

R₆为三氟乙基，苯基、被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

每个M是独立地选自H或碱金属阳离子；和

n是1或2。

4.按照权利要求1所述的化合物，其中所述的基团A是

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

5.按照权利要求4所述的化合物，其中

R₁选自C_1-4烷基；

R₇～R₁₄选自H、卤素或C_1-4烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基，被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃取代的苯基。

6.按照权利要求5所述的化合物，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，2-萘基、苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl，Br或I基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

7.按照权利要求6所述的化合物，其中R₇～R₁₄至少有一个是C_1-4的烷氧基或其余的R₇～R₁₄是氢。

8.按照权利要求6所述的化合物，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

9.按照权利要求8所述的化合物，其中R₆为苯基，3，5-二氟苯基，2，6-二甲基苯基，4-氟苯基，4-甲氧基苯基，三氟乙基、4-氯苯基或2-萘基。

10.按照权利要求4所述的化合物，其中为下式的化合物：

或

式中的Ph是苯基，每个M是一种碱金属离子而n是2。

11.按照权利要求10所述的化合物，其中的M是Na。

12.按照权利要求4所述的化合物，其具有分子式：

或

13.一种在磷酸酶存在时产生化学发光的试剂组合物水溶液，包括：

a)和磷酸酶反应的式I化合物：

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅，与其所连接的两个碳原子，形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；以及

b)至少一种有效剂量的用于增强化学发光的表面活性剂增强因子。

14.按照权利要求13所述的组合物，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

15.按照权利要求14所述的组合物，其中

R₁选自C_1-4烷基；

R₇～R₁₄选自H、卤素或C_1-4烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃取代的苯基。

16.按照权利要求15所述的组合物，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，2-萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br或I基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

17.按照权利要求16所述的组合物，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

18.按照权利要求17所述的组合物，其中R₆为苯基，3，5-二氟苯基，2，6-二甲基苯基，4-氟苯基，4-甲氧基苯基，三氟乙基、4-氯苯基或2-萘基。

19.按照权利要求14所述的组合物，其中所述的化合物为下式的化合物：

或

式中的Ph是苯基。

20.按照权利要求14所述的组合物，其中的化合物为

21.按照权利要求14所述的组合物，其中的表面活性剂增强因子选自聚合季铵或鏻盐，单体季铵或鏻盐以及二价阳离子季铵或鏻盐。

22.按照权利要求21所述的组合物，其中的表面活性剂增强因子是乙烯苄基三丁基鏻盐或乙烯苄基三辛基鏻盐的共聚体。

23.按照权利要求22所述的组合物，其中的共聚体包括比率为3∶1的乙烯苄基三丁基鏻盐或乙烯苄基三辛基鏻盐。

24.按照权利要求23所述的组合物，其中还含有有效剂量的促进该反应的镁盐。

25.一种产生化学发光的方法，包括将磷酸酶或至少一种式I化合物反应，

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字。

26.按照权利要求25所述的方法，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

27.按照权利要求26所述的方法，其中

R₁选自C_1-4烷基；

R₇～R₁₄选自H、卤素或C_1-4烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃取代的苯基。

28.按照权利要求27所述的方法，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，2-萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br或I基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

29.按照权利要求28所述的方法，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

30.按照权利要求26所述的方法，其中式I化合物具有通式：

或

式中的ph是苯基。

31.按照权利要求26所述的方法，其中的式I化合物具有通式：

32.按照权利要求25-31任一项的方法，其中的磷酸酶选自细菌碱性磷酸酶，哺乳动物碱性磷酸酶，植物酸性磷酸酶，哺乳动物酸性磷酸酶或碱性磷酸酶联接物。

33.按照权利要求32所述的方法，其中的碱性磷酸酶联接物包括或选自半抗原，抗体，蛋白质，核酸或寡聚核苷酸的生物分子相联接的碱性磷酸酶。

34.一种通过化学发光试验步骤检测样品中被分析物的方法，其包括：

(a)磷酸酶或至少一种式I化合物反应产生出用于检测被分析检测被分析物的化学发光，

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；

(b)检测该化学发光；以及

(c)使该化学发光量或被分析物的量相联系。

35.按照权利要求34所述的方法，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

36.按照权利要求35所述的方法，其中

R₁选自C_1-4烷基；

R₇～R₁₄选自H、卤素或C_1-4烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃取代的苯基。

37.按照权利要求36所述的方法，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，2-萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br或I基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

38.按照权利要求37所述的方法，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：           ；

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

39.按照权利要求35所述的方法，其中式I化合物具有通式：

或

式中的ph是苯基。

40.按照权利要求34所述的方法，其中的式I化合物具有通式：

41.按照权利要求34所述的方法，其中的被检测物是磷酸酶。

42.按照权利要求34所述的方法，其中的待检测物是磷酸酶抑制剂。

43.按照权利要求34所述的方法，其中还包括样品中的被分析物或能或该被分析物特异结合的被分析物结合化合物反应，而该被分析物-结合的化合物是用碱性磷酸酶标记的。

44.按照权利要求43所述的方法，其中的被分析物-结合的化合物选自抗体，抗原，半抗原或核酸。

45.按照权利要求34所述的方法，其还包括样品中的被分析物与能或其特异结合的被分析物结合化合物或至少一种用磷酸酶标记的被分析物结合化合物的特异结合物反应。

46.按照权利要求39或者40所述的任何一个方法，其中还包括样品中的被分析物与能或其特异结合的被分析物结合化合物或至少一种用磷酸酶标记的被分析物结合化合物的特异结合物反应。

47.按照权利要求34所述的方法，其中还包括样品中被分析物或

(a)一种标记的且含有能或被分析物特异结合的被分析物结合化合物的被分析物结合化合物以及至少一种第二个特异结合物；以及

(b)磷酸酶标记的第二个特异结合物的结合物反应。

48.按照权利要求34所述的方法，其中的检测在膜上进行。

49.按照权利要求48所述的方法，其中的膜选自硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜或尼龙膜。

50.按照权利要求34-40任一项所述的方法，其中还包括在试剂组合物中提供式I化合物，而该组合物是包括式I化合物或一种有效剂量的用于增强该化学发光的表面活性剂增强因子的水溶液。

51.按照权利要求50所述的方法，其中的表面活性剂增强因子是乙烯苄基三丁基鏻盐或乙烯苄基三辛基鏻盐的共聚物。

52.按照权利要求34所述的任一项的方法，其中还包括：

(a)该式I化合物或磷酸酶在第一个pH的缓冲液中反应第一段时间；

(b)加入强碱激发溶液到该缓冲液中以便升高其pH到第二个pH从而诱发该化学发光；以及

(c)检测该化学发光。

53.按照权利要求52所述的方法，其中的第一个pH是在5.0-9.5的范围内，而该激发溶液的pH高于11，并且第一段时间是从1秒到10分钟。

54.按照权利要求53所述的方法，其中的碱性激发溶液含有表面活性剂增强因子。

55.按照权利要求54所述的方法，其中的增强因子是乙烯苄基三丁基鏻盐或乙烯苄基三辛基鏻盐的共聚物。

56.一种能在有磷酸酶时产生化学发光的试剂组合物，该水溶液包括：

a)和磷酸酶反应的式I化合物：

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；以及

b)有效剂量的相对于无其存在时能增加化学发光的阳离子芳香族化合物。

57.按照权利要求56所述的组合物，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

58.按照权利要求57所述的组合物，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

59.按照权利要求5 7所述的组合物，其中Z为S。

60.按照权利要求58所述的组合物，其中的式I化合物具有通式：

61.按照权利要求52-60所述的任何一个的组合物，其中的阳离子芳香族化合物选自花青染料，羰花青染料，偶氮染料，吖啶衍生物，亚甲基蓝，尼罗蓝，IR-1040，光泽精或二氯百草枯。

62.按照权利要求56所述的组合物，其中还包含有一种有效剂量的用于提高达到最大化学发光强度的速度的阴离子型表面活性剂以及一种有效剂量的用于增加化学发光量的非离子型表面活性剂。

63.按照权利要求62所述的组合物，其中的阴离子型表面活性剂选自至少含有十个碳原子的烷基硫酸盐或至少含有十个碳原子的烷基磺酸盐。

64.按照权利要求62所述的组合物，其中的非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯烷基酚，聚氧乙烯醇，聚氧乙烯醚或聚氧乙烯山梨糖醇酯。

65.按照权利要求62所述的组合物，其中还包括有效剂量的用于在无磷酸酶时降低由该组合物产生的化学发光的亚硫酸盐。

66.按照权利要求63所述的组合物，其中的阴离子型表面活性剂是十二烷基硫酸钠。

67.按照权利要求65所述的组合物，其中的亚硫酸盐是亚硫酸钠。

68.一种产生化学发光的方法，其包括磷酸酶或下列物质反应：

a)至少一种式I化合物：

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、CH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；

b)有效剂量的相对于无其存在时能增加化学发光的阳离子芳香族化合物。

69.按照权利要求68所述的方法，其中的基团A是下式的结构：

其中R₁是C_1-4烷基；

R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

70.按照权利要求69所述的方法，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

71.按照权利要求68所述的方法，其中Z为S。

72.按照权利要求71所述的方法，其中的式I化合物具有通式：

73.按照权利要求68-72所述的任何一项方法，其中的磷酸酶选自细菌碱性磷酸酶，哺乳动物碱性磷酸酶，植物酸性磷酸酶，哺乳动物酸性磷酸酶或碱性磷酸酶联接物。

74.按照权利要求73所述的方法，其中的碱性磷酸酶联接物包括联接于那些选自半抗原，抗体，蛋白质，核酸或寡核苷酸的生物分子的碱性磷酸酶。

75.按照权利要求68-72所述的任何一项方法，其中还包括在试剂组合物中提供式I化合物或阳离子芳香族化合物，而该组合物的水溶液还包括一种有效剂量的用于提高达到最大化学发光强度的速度的阴离子型表面活性剂或一种有效剂量的用于增加化学发光的非离子型表面活性剂。

76.一种通过化学发光试验步骤检测样品中被分析物的方法，其包括：

(a)磷酸酶在有阳离子芳香族化合物存在的条件下或至少一种式I化合物反应产生出用于检测被分析物的化学发光，

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；

(b)检测该化学发光；以及

(c)使该化学发光的量或该被分析物的量相联系。

77.按照权利要求76所述的方法，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

78.按照权利要求77所述的方法，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

79.按照权利要求78所述的方法，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

80.按照权利要求79所述的方法，其中Z是S。

81.按照权利要求80所述的方法，其中的式I化合物具有通式：

82.按照权利要求76-81所述的任何一种方法，其中待检测物是磷酸酶。

83.按照权利要求76-81所述的任何一种方法，其中待检测物是磷酸酶抑制剂。

84.按照权利要求76-81所述的任何一种方法，其中还包括样品中的被分析物或其特异结合的标记的被分析物结合化合物反应，而该被分析物-结合的化合物是用碱性磷酸酶标记的。

85.按照权利要求84所述的方法，其中的被分析物-结合的化合物选自抗体，抗原，半抗原或核酸。

86.按照权利要求76-81所述的任何一种方法，其中还包括样品中的被分析物或能或其特异结合被分析物结合化合物以及至少一种用磷酸酶标记的该被分析物结合化合物的特异结合物反应。

87.根据权利要求76-81所述的任何一种方法，其中还包括样品中的被分析物或：

(a)一种标记的且含有一种能或该被分析物特异结合的被分析物结合化合物的被分析物结合化合物以及至少一种第二特异结合物；以及

(b)磷酸酶标记的第二特异结合物的结合物反应。

88.根据权利要求76所述的方法，其中的检测在膜上进行。

89.根据权利要求88所述的方法，其中的膜选自硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜或尼龙膜。

90.根据权利要求76-81所述的任何一种方法，其中还包括在试剂组合物中提供式I化合物或阳离子芳香族化合物，而该组合物水溶液又包括一种有效剂量的用于提高达到最大化学发光强度的速度的阴离子型表面活性剂或一种有效剂量的用于增加化学发光的非离子型表面活性剂。

91.一种通过化学发光试验步骤在可能同时含有酸性磷酸酶或碱性磷酸酶的样品中检测酸性磷酸酶或碱性磷酸酶的方法，该步骤包括：

(a)样品或含有至少一种式I化合物、一种阳离子芳香族化合物、一种有效剂量的用于提高达到最大化学发光强度的速度的阴离子型表面活性剂或一种有效剂量的用于增加化学发光的非离子型表面活性剂的试剂组合物反应，

式I中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；

(b)检测起始阶段的化学发光量或强度；

(c)暂停在第二段时间直到该化学发光达到稳定的水平；

(d)检测第三段时间内的化学发光量或强度；

(e)将起始阶段的化学发光或酸性磷酸酶的量相联系；以及

(f)将第三阶段的化学发光或碱性磷酸酶的量相联系。

92.按照权利要求91所述的方法，其中的基团A是下式的结构：

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

93.按照权利要求92所述的方法，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

94.按照权利要求92所述的方法，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团:

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

95.按照权利要求94所述的方法，其中Z是S。

96.按照权利要求95所述的方法，其中的式I化合物具有通式：

97.一个制备式I化合物的工艺：

式中的Het代表下式的基团A或B

式中的R₁是C_1-4烷基或苄基；

相邻的R₂-R₃或R₄-R₅形成5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基、CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基；

Z选自O或S原子；

每个M是独立地选自H或阳离子；和

n是可满足电荷中性的数字；

该工艺包括下列步骤：

(a)具有通式

的且其中的Het，Z或R₆如式I所定义的杂环酯或硫酯化合物VB或碱反应生成VB的烯醇酯；

(b)该烯醇酯和磷酸化试剂反应生成保护的磷酸烯醇酯IX，其具有通式：

式中的Het，Z或R₆如上文所定义而Y是一个保护基；以及

(c)如果该阳离子物质并非该脱保护剂的一部分，在阳离子型M存在的条件下，通过IX或至少一种脱保护剂反应将该磷酸烯醇酯脱保护成磷酸烯醇盐化合物I。

98.根据权利要求97所述的工艺，其中的烯醇酯化合物VB和磷酸化试剂反应生成保护的磷酸烯醇酯IX的步骤包括：

(a)该烯醇酯化合物VB或卤氧化POW₃，其中的W是选自F，Cl，Br或I的卤素，反应生成二卤化磷酸烯醇酯X，其具有通式：

式中的Het，Z或R₆如化合物VB中所定义；以及

(b)该化合物X或至少两个当量的氢氧化物Y-OH反应生成保护的磷酸烯醇酯IX。

99.根据权利要求97所述的工艺，其中的烯醇酯化合物VB和磷酸化试剂反应生成保护的磷酸烯醇酯IX的步骤包括该烯醇酯化合物VB和含有保护基Y并具有通式W-PO(OY)2的磷酸化试剂反应，式中的W是选自F，Cl，Br或I的卤原子。

100.根据权利要求97所述的工艺，其中的Y基选自低级烷基，取代的低级烷基，苯基，取代的苯基或苄基。

101.根据权利要求97所述的工艺，其中的Y基连接成单基-CH₂CH₂-。

102.根据权利要求97所述的工艺，其中的脱保护剂选自有机碱、无机碱或亲核剂。

103.根据权利要求102所述的工艺，其中所述的碱包括氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钾，甲醇钠，乙醇钠，叔丁醇钾，氢氧化铵。

104.根据权利要求103所述的工艺，其中所述的亲核剂包括氰离子，氟离子。

105.根据权利要求97或98所述的工艺，其中的Y是CH₂CH₂CN基而该脱保护剂选自氢氧化钠或碳酸钠。

106.根据权利要求105所述的工艺，其中所述的基团A是

其中R₇～R₁₄可以相同或不同，选自H、卤素、C_1-4烷基或烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的基团联接5或6元碳环；

R₆为三氟乙基，苯基，被叔-丁基，CH₃、OCH₃、F、Cl、Br、I、COCH₃、CN或NO₂取代的苯基，或萘基。

107.按照权利要求106所述的工艺，其中

R₁选自C_1-4烷基；

R₇～R₁₄选自H、卤素或C_1-4烷氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，萘基，苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br、I或OCH₃取代的苯基。

108.按照权利要求107所述的工艺，其中

R₇～R₁₄选自H、卤素、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基；或者R₇～R₁₄相邻的两个基团是

R₆为三氟乙基，2-萘基、苯基或被叔-丁基、CH₃、F、Cl、Br或I基团取代的苯基；

每个M是独立地选自H或碱金属离子；和

n是1或2。

109.按照权利要求108所述的工艺，其中

R₇，R₁₀或R₁₄独立地为H；

R₈或R₁₃独立为H或卤素；

R₉为H、卤素或甲氧基、乙氧基或叔丁氧基；

R₁₁-R₁₂下式的基团：

每个M是独立地为钠离子；和

n是2。

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