KR100259144B1 - 포스파타제와의 반응에 의해 화학발광을 생성하는 화합물, 조성물 및 방법 - Google Patents
포스파타제와의 반응에 의해 화학발광을 생성하는 화합물, 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
포스파타제 효소와 반응할 때 화학발광을 생성하는 새로운 헤테로사이클 화합물과 그 제조 방법 및 이에 유용한 중간체가 제공되어 있다. 본 화합물은 엑소사이클 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 질소, 산소 또는 황 함유 헤테로사이클 고리 시스템을 포함한다. 이중 결합은 말단의 탄소가 포스페이트기 및 산소나 황 원자 함유 기로 치환되어 있다. 또한, 헤테로사이클 포스페이트 화합물 이외에도 양이온성 방향족 화합물(CAC)를 포함하는 새로운 조성물이 제공되어 있다. 조성물중에 CAC를 부가하면, 화학발광의 생성이 크게 증가하여 검출 감도가 개선된다. 조성물중에 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 포함되어 있으면 검출 감도가 더욱 개선된다. 새로운 화학발광 화합물 및 조성물은, 광 생성을 위한 방법에, 포스파타제 효소 및 효소 억제제에 대한 분석법에 및 효소 표지형 특이적 결합쌍을 채용하는 분석법에 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
포스파타제와의 반응에 의해 화학발광을 생성하는 화합물, 조성물 및 방법
[기술분야]
[관련 출원]
본 출원은 동시 계류중인 본 출원인의 미국 출원 번호 제08/585/090호(1996년 1월 16일 출원) 및 제08/683/927호(1996년 7월 19일 출원)의 일부 계속 출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 포스파타제(phosphatase) 효소와 반응하여 광을 생성하는 화학발광 화합물(chemiluminescent compound)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 헤테로사이클 고리기(heterocyclic ring group), 및 포스파타제 효소를 이용하여 포스페이트기를 제거할 때 산소와 반응하여 화학발광 및 카르보닐기를 생성하는 에놀레이트를 형성하는 에놀 포스페이트기(enol phosphate group)를 함유하는 화학발광 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 포스파타제 효소와 반응하여 화학발광을 생성하는 조성물에 관한 것이다. 화학발광 조성물은 헤테로사이클 고리기 및 에놀 포스페이트기를 함유하는 제1화합물, 및 포스페이트 화합물과 포스파타제 효소의 반응에 의한 광 생성을 증가시키는 작용을 하는 제2화합물을 포함한다. 본 발명은 포스파타제 효소와 화학발광 조성물의 반응에 의한 광 또는 화학발광 생성 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 실질적으로 광 조사를 증가시킬 수 있도록 발광 방법을 개선하는 것에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 면역 분석법(immunoassay), 핵산 탐침 측정법 등과 같은 방법으로 포스파타제 효소를 검출하고 포스파타제 표지형(phosphatase-labeled) 특이적 결합 파트너를 검출하기 위한 분석 방법에 화학발광 반응 및 그 조성물을 이용하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 포스파타제 효소와 반응하여 화학발광을 생성하는 화학발광 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 방법에 유용한 새로운 중간체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 헤테로사이클 고리기, 및 포스페이트 보호기를 제거할 때 산소와 반응하여 화학발광 및 카르보닐 화합물을 생성하는 에놀 포스페이트기를 함유하는 화학발광 화합물을 제조하기 위한 방법 및 중간체에 관한 것이다.
[배경기술]
a. 포스파타제 효소의 화학발광 검출
알칼리 포스파타제(alkalined phosphatase)와 같은 가수분해 효소는 약, 호르몬 및 암 표지(cancer marker)와 같은 생물학적 분자 및 다른 분석 대상물에 대한 효소-연결 분석법(enzyme-linked assay)에서 표지 또는 라벨로서 종종 이용된다. 이외에도, 알칼리 포스파타제(AP) 및 산성 포스파타제(AcP)와 같은 포스파타제 효소는 인간 및 가축의 진단시 임상적으로 당연히 중요하다. 이러한 효소의 화학발광 검출은 안전하고, 편리하며 감도가 좋은 수단이 되어, 샘플에 있는 효소의 양 또는 효소로 레이블링된 분석물의 양이나 분석물에 대해 효소로 레이블링된 특이적 결합 파트너의 양을 정량적으로 측정할 수 있도록 한다. 여러 가지의 화학발광 반응법이 특정 가수분해 효소를 정량 분석하기 위하여 개발되어 왔다. 이러한 방법의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 들어, 복수개의 효소 또는 여러 가지 시약을 필요로 한다. 대용량 테스트(large volume testing)에 이러한 방법 대부분의 상업적 적용은 느리게 이루어지고 있다.
본 명세서에 참고로 전체로서 도입되어 있는 본 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 제08/585,090호에는, 에놀 포스페이트기를 특정 헤테로사이클 화합물과 포스파타제 효소의 화학발광 반응에 대해 개시되어 있다. 양이온 계면활성제가 존재할 경우 발광이 향상되어, 포스파타제를 10-18내지 10-19mol 수준까지 검출할 수 있다.
본 명세서에 참고로 전체로서 도입되어 있는 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 제08/683,927호에는, 에놀 포스페이트기를 갖는 특정 헤테로사이클 화합물과 포스파타제 효소의 화학발광 반응과 관련하여 양이온성 방향족 화합물(CAC)을 사용하여 발광 양을 실질적으로 증가시키는 것에 대해 개시되어 있다. 이에 따라, 포스파타제 효소의 검출 한계는 매우 낮아진다.
b. 화학적 및 효소학적으로 반응이 개시될 수 있는 디옥세탄
보호된 페놀기 트리거링기(triggering group)를 갖는 안정한 1,2-디옥세탄은 보호기가 제거될 때 화학발광적으로 분해된다[A. P. Schaap, T. S. Chen, R. S. Handley, R. DeSilva, and B. P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155(1987); A. P. Schaap, R. S. Handley, and B. P. Giri, Tetrahedron Lett., 935(1987); A. P. Schaap, M. D. Sandison, and R. S. Handley, Tetrahedron Lettt., 1159(1987); and a. P. Schaap, Photochem. Photobiol., 47S, 50S(1988)]. 효소에 의해 반응이 개시될 수 있는 디옥세탄은 효소적으로 제거될 수 있는 보호기에 의해 블록킹되어 있는 아릴록사이드(aryloxide) 치환기를 갖는다. 수용성 완충액에서 가수분해 효소와 반응하면, 디옥세탄의 화학발광적 분해를 수백배, 수천배, 수만배 등으로 가속화시키는 아릴옥사이드 음이온이 생성된다. 화학적으로 반응이 개시될 수 있는 디옥세탄은 간단한 화학제에 의해 제거되는 보호기에 의해 블록킹되어 있는 아릴옥사이드 치환기를 갖는다. 일예로서, 하이드록사이드를 이용한 아세톡시 디옥세탄의 탈보호 또는 플루오로라이드를 이용한 실릴옥시 디옥세탄의 탈보호가 있다. 이와 같이 반응이 개시될 수 있는 디옥세탄의 여러 가지 예가 미국 특허 제4,857,652호, 5,068,339호, 4,952,707호, 5,112,960호, 5,220,005호, 5,326,882호 및 PCT 출원 공개 번호 제WO96/24849호, WO94/10258호 및 WO94/26726호에 개시되어 있다. 그러나, 반응이 개시될 수 있는 몇몇 디옥세탄의 고유 단점은 효소가 없는 상태에서 느린 열분해 또는 비효소적 가수분해(non-enzymatic hydrolysis)를 통하여 자연 화학발광이 일어나는 경향이 있다는 것이다.
c. 루미놀 유도체
루미놀의 포스페이트 및 NAG 유도체가 공지되어 있다[K. Sasamoto, Y. Ohkura, Chem. Pharm. Bull., 38, 1323-5(1991); M. Nakazono, H. Nohta, K. Sasamoto, Y. Ohkura, Ana. Sci., 8, 779-83(1992)]. 루미놀 유도체를 적절한 효소로 처리하면, 후속 단계에서 페리시안화물과 반응하여 광을 생성하는 루미놀이 유리된다.
d. 루시페린 유도체
개똥벌레 루시페린의 포스페이트 및 갈락토사이드 유도체가 공지되어 있다[N. Ugarova, Y. Vosny, G. Kutuzova, I. Dementieva, Biolum. and Chemilum. New Perspectives, P. Stanley and L. J. Kricka, eds., Wiley, Chichester, 511-4(1981); W. Miska, R. Geiger, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 119-28(1989)]. 개똥벌레 루시페린 유도체를 적절한 효소로 처리하면 제2단계에서 루시페라아제 및 ATP와 반응하여 광을 생성하는 개똥벌레 루시페린이 유리된다.
e. 환원제의 생성과 관련된 반응
알칼리 포스파타제가 촉매로 작용하여 포스페이트 에스테르로부터 환원제를 생성하는 것과 관련된 화학발광 방법이 보고되어 있다[M. Maeda, A. Tsuji, K.H. Yang, S. Kamada, Biolum. and Chemilum. Current Status, 119-22(1991); M. Kitamura, M. Maeda, A. Tsuji, J. Biolumin. Chemilumin., 10, 1-7(1995); H. Sasamoto, M. Maeda, A. Tsuji, anal. Chim. Acta, 306, 161-6(1995)]. 환원제는 산소와 루시제닌(lucigenin) 사이의 반응을 일으켜 루시제닌으로부터 광을 생성시킨다. 대표적인 환원제는 아스코르빈산, 글리세롤, NADH, 디하이도록시아세톤, 코르티솔 및 페나실 알콜이 있다. 이러한 방법은 루시제닌이 아닌 탈보호된 형광 화합물로부터 광을 생성시키는 것과 관련된 본 발명과 구별된다. 루시제닌과의 반응을 위한 환원제를 효소적으로 생성시키는 공지된 방법은 모두 효소와 포스페이트 화합물간의 전처리 단계를 필요로 한다. 이로 인해 더욱 복잡해지고 분석 시간도 많이 걸린다.
마한트(Mahant)의 미국 특허 제5,589,328호에는 인독실 에스테르(indoxyl ester), 티오인독실(thioindoxyl) 에스테르 및 벤조퓨란(benzofuran) 에스테르가 효소에 의해 가수분해되어 초과산화물을 생성하는 화학발광 반응이 개시되어 있다. 발광은 루시제닌과 같은 화학발광을 생성하는 시약의 부가에 의해 증폭된다. 루시제닌은 초과산화물과의 반응에 의해 화학발광을 생성한다.
f. 효소 연관법(coupled-enzyme method)
효소 연관 반응을 통하여 포스파타제 효소와 같은 가수분해 효소를 측정하기 위한 여러 가지 화학발광 방법 및 분석 방법이 공지되어 있다. 이러한 방법은 모두 A. Tsuji, M. Maeda, H. Arakawa, Anal. Sci., 5, 497-506(1989)에 집대성 되어 있다. 이중 효소(dual enzyme) 화학발광 반응의 다른 예는 미국 특허 제5,306,367 및 공동 양도된 미국 출원 번호 제08/300,367호에 개시되어 있다. 미국 특허 제5,306,367호에는 과산화효소 인핸서(peroxidase enhancer)를 효소에 의해 생성하여, 과산화효소에 의한 루미놀의 화학발광성 산화를 증가시키는 것에 대해 기재되어 있다. 미국 출원 번호 제08/300,367호에는 과산화효소 인핸서를 효소에 의해 생성하여, 과산화효소에 의한 아크리단카르복실산(acridancarboxylic acid) 유도체의 화학발광 산화를 증가시키는 것에 대해 기재되어 있다.
효소에 의해 반응이 개시되는 디옥세탄을 제외하면, 진술한 방법 각각은 발광 신호를 생성하기 위하여 여러 가지 시약 또는 여러 가지 효소를 필요로 한다는 결점이 있다. 이러한 방법은 검출 감도가 매우 우수한 것으로 증명되었음에도 불구하고 부가되는 비용이나 조작상의 복잡성으로 인해 상용화가 어려웠다. 따라서, 이러한 레벨의 감도를 달성하면서도 효소 기질 이외에 추가의 효소나 보조 시약을 필요로 하지 않는 가수분해 효소를, 검출 및 정량화하기 위한 화학발광 방법이 바람직하다. 본 발명은 이러한 방법 및 화합물을 제공하고자 하는 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 구성]
본 발명의 목적은 실온에서 장시간에 걸쳐 열 및 가수분해에 대해 안정하며 포스파타제 효소에 의해 포스페이트기가 분리되는, 포스파타제 효소의 화학발광 검출을 위한 화합물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 이중결합의 일단부가 질소, 산소 또는 황을 함유하는 헤테로사이클 고리기로 치환되어 있으며 이중결합의 다른 일단부가 광을 생성하면서 분해 반응이 개시될 수 있는 효소적으로 분리가능한 포스페이트기(O-PO3 -2)로 치환되어 있는 새로운 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포스파타제 효소에 의해 반응이 개시될 수 있는 이러한 새로운 화합물을 함유하여 화학발광을 생성하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우수한 광 생성 능력을 갖고 포스파타제 효소의 검출을 위해 사용될 때 큰 장점이 있으며, 면역 분석법 및 분석 대상물의 검출을 위하여 포스파타제 라벨을 채용하는 일반적으로 공지된 방법에 의해 효소-연결 핵산, 항체, 합텐 및 항원을 검출하는데 이용가능한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 상기 목적 및 잇점은 화학식 I로 표시되는 화합물에 의해 달성된다.
[화학식 I]
여기에서, Het는 질소, 산소 및 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이며, Z는 산소 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, R6은 유기기(organic group)이고, 각각의 M은 독립적으로 수소 및 양이온 중심(cationic center)으로부터 선택된 것이며, n은 전기적으로 중화상태를 만족시킬 수 있는 숫자이다.
본 발명에 따른 상기 다른 목적 및 잇점은 수용액 내에 화학식 I의 화합물, 및 화학발광을 향상시키는데 효과적인 양만큼의 계면활성제 인핸서를 적어도 하나 포함하며, 포스파타제 효소의 존재하에 화학발광을 생성하는 시약 조성물에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 상기 다른 목적 및 잇점은 포스파타제 효소를 화학식 I로 표시되는 적어도 하나의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는, 화학발광 방법에 의해서도 달성된다.
본 발명에 따른 상기 목적 및 잇점은, 포스파타제 효소를 적어도 하나의 화학식 I로 표시되는 화합물과 반응시켜 분석 대상물을 검출하기 위한 화학발광을 생성하는 단계; 상기 화학발광을 검출하는 단계; 및 상기 화학발광의 양으로 분석 대상물의 양을 정량하는 단계를 포함하는 화학발광 분석 방법에 의해, 샘플에 있는 분석 대상물을 검출하는 방법에 의해서도 달성된다.
본 발명에 따른 상기 목적 및 잇점은, 포스파타제 효소와 반응하는 화학식 I로 표시되는 적어도 하나의 화합물 및 화학발광을 증가시키는데 효과적인 양만큼의 계면활성제 인핸서를 수용액 내에 포함하고 있으며, 포스파타제 효소의 존재하에 화학발광을 생성하는 시약 조성물을 제공하는 단계; 포스파타제 효소를 상기 조성물과 반응시켜 분석 대상물을 검출하기 위한 화학발광을 생성하는 단계; 및 화학발광 양을 이용하여 분석 대상물의 양을 정량하는 단계를 포함하는, 화학발광 반응에 의한 분석 방법으로 분석 대상물을 검출하는 방법에 의해 달성된다.
또한, 본 발명의 목적은 양이온성 방향족 화합물, 및 광을 생성하면서 분해되는 반응이 개시될 수 있는 화학식 I로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포스파타제 효소와 시약 조성물의 반응에 의해 화학발광을 생성하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포스파타제 효소와 반응할 때 효과적인 화학발광을 빠르게 생성하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 상기 다른 목적 및 잇점은 양이온성 방향족 화합물 및 화학식 I로 표시되는 화합물을 포함하는 시약 조성물에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 상기 다른 목적 및 잇점은, 양이온성 방향족 화합물, 포스파타제 효소와 반응하는 화학식 I로 표시되는 화합물, 및 효과적인 화학발광의 빠른 생성을 제공하는데 유효한 양만큼의 적어도 하나의 음이온 계면활성제 및 적어도 하나의 비이온성 표면활성제를 수용액 내에 포함하고 있으며, 포스파타제 효소의 존재하에 화학발광을 생성하는 시약 조성물에 의해서도 달성된다.
본 발명의 또 다른 목적은 포스파타제 효소와 반응하여 광을 생성하는 화학 발광 화합물을 제조하는데 유용한 합성 방법 및 중간체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 헤테로사이클 고리기, 및 포스페이트 보호기를 제거할 때 산소와 반응하여 광 및 카르보닐 화합물을 생성하는 에놀 포스페이트기를 함유하는 화학식 I로 표시되는 화학발광 화합물을 제조하기 위한 방법 및 중간체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에스테르 또는 티오에스테르 화합물의 에놀레이트를 인산화시켜, 포스페이트 모노에스테르 염으로 탈보호되는 포스포디에스테르 또는 트리에스테르 중간체 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 0.1M 트리스 버퍼(tris buffer)(pH 8.5)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 1[9-(페녹시포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염]용액 및 폴리비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드-코-폴리비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드(트리부틸기와 트리옥틸기의 비율은 약 3:1)(Enhancer A) 0.01mg/㎖로 이루어져 있으며, 24℃에서 알칼리 포스파타제(AP) 8×10-16mol의 부가에 의해 반응이 개시된, 시약 100㎕에 의해 방출되는 화학발광 세기의 시간에 따른 프로파일을 나타내는 그래프이다. 제1도에는 또한 1 대신에 에스테르를 함유하는 유사한 시약 조성물중의 에스테르 페닐 10-메틸아크리단-9-카르복실레이트의 화학발광 프로파일이 비교군으로서 나타나 있다.
제2도는 실온에서 2.4×10-12mol의 AP와 1을 함유하는 시약 조성물 3㎖를 함유하는 반응 혼합물의 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 곡선 A-F는 각각 효소를 부가하고 0, 5, 10, 20, 40 및 60분이 지난 후에 취해진 스캔닝 그래프이다.
제3도는 실온에서 1을 함유하는 시약 조성물 200㎕와 8×10-13mol의 AP의 반응에 의해 생성된 화학발광 스펙트럼을 나타낸다.
제4도는 실온에서, 아크리단 포스페이트 1을 함유하는 시약 100㎕에 의해 방출된 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 화학발광은 실온에서 8×10-15내지 8×10-20mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕를, 백색 마이크로플레이트의 웰(well)에 미리 주입되어 있는 0.88mM Mg2+및 0.01mg/㎖의 인핸서 A를 함유하는 0.1M 트리스 버퍼(pH 8.5)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 1 용액 100㎕에 부가함으로써 개시되었다. S-B는 AP가 없을 때의 자연적인 화학발광(B)을 고려하여 보정된, AP 존재하의 상대적 광단위(Relative Light Unit, RLU)로 표시되는 화학발광 신호(S)를 의미한다. 그래프에는 알칼리 포스파타제의 선형적인 검출 그래프가 나타나 있다. 계산된 검출 한계(자연발광의 표준 편차의 두배)는 이러한 조건하에 8×10-19mol로 결정되었다.
제5도는 0.88mM MgCl2를 포함하는 0.1M 트리스 버퍼(pH 9)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 1을 포함하는 시약 조성물 100㎕에 의해 방출되는 총 화학발광 세기와 AP의 양과의 관계를 나타내는 그래프이다. 상기 조성물을 흑색 마이크로플레이트의 웰에 주입하고 주위 온도하에 8×10-15내지 8×10-20mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕ 또는 시약 블랭크(blank)로서 물 10㎕를 첨가하여 4분 동안 반응시켰다. 1N NaOH(100㎕)에 용해된 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 함유하는 용액을 주입하고, 10초 동안의 광 세기를 가산하였다. 도면에는 알칼리 포스파타제의 선형적인 검출 그래프가 나타나 있다.
제6도는 화학발광 시약 조성물을 이용하여, PVDF 멤브레인 상에서 AP-레이블링된 항체를 매개로 하여 인간의 트랜스페린을 검출하는 웨스턴 블롯 실험(Western blot experiment) 결과 얻은, 디지털방식으로 주사된 X-레이 필름 사진이다. 각각 5000, 1000, 180, 30 및 5pg의 단백질을 함유하는 트랜스페린 희석액을 전기영동을 통해 멤브레인으로 이동시켰다. 0.88mM MgCl2및 0.66mM 아크리단 포스페이트 1을 함유하는 0.2M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 완충 용액(pH 9.6)에 용해된 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 함유하는 시약 조성물에 블롯을 담근 다음, 10분 후에 1분 동안 X-레이 필름에 노출시킴으로써 단백질이 간단하게 검출되었다.
제7도는 루시제닌을 반응 용액에 부가하여 5와 알칼리 포스파타제(AP)를 반응시킴으로써 생성되는 화학발광에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 완충액에 용해된 5를 함유하는, 동일한 양의 2가지 용액을 각각 8×10-16mol의 알칼리 포스파타제(AP)와 반응시켰다. 하나의 용액에는 6.4μM의 루시제닌도 함유되어 있었다.
제8도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8), 6.4μM 루시제닌, 0.66mM 아크리단 포스페이트 5(0.066M 메탄올 용액의 1:100 희석액), 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.01mg/㎖ Na3SO3, 0.033%(w/v) 트윈 20(TWEEN 20) 및 0.88mM MgCl2로 이루어져 있으며, 실온에서 8×10-16mol의 AP의 부가에 의해 반응이 개시되는 시약 A 100㎕에 의해 방출되는 화학발광 세기의 시간에 따른 프로파일을 나타내는 그래프이다. 또한, 제8도에는 5 및 양이온성 폴리머인 계면활성제 인핸서(0.25TB/TO)를 함유하는 시약 조성물을 이용하여 얻은 화학발광 프로파일이 비교군으로 나타나 있다.
제9도는 아크리단 포스페이트 5, 루시제닌, SDS 및 TWEEN 20을 함유하며, 25℃에서 반응이 개시된, 본 발명의 시약 조성물(시약 A) 100㎕에 의해 방출되는 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 비교를 위하여, 유사한 그래프가, 동일한 아크리단 포스페이트 및 0.25TB/TO를 함유하지만 루시제닌이 함유되지 않으며 37℃에서 반응이 개시된, 시약 조성물(시약 B)을 이용하여 얻은 실험 결과가 제시되어 있다. 화학발광은 8×10-13내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕를, 백색 마이크로플레이트의 웰(well)에 미리 주입된 각각의 시약 조성물에 부가함으로써 개시되었다. S-B는 AP가 없을 때의 자연적인 화학발광(B)을 고려하여, 보정된 AP 존재하의 상대적 광단위(Relative Light Unit, RLU)로 표시되는 화학발광 신호(S)를 나타낸다. 그래프에는 루시제닌을 포함하는 시약 A를 이용하면 AP의 검출 한계가 100배 낮아지는 것으로 나타나 있다.
제1도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해된 0.66mM 아크리단 포스페이트 7, 6.4μM 루시제닌, 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.01mg/㎖ Na3SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 0.88mM MgCl2를 포함하는 시약 조성물 100㎕에 의해 방출되는 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 주위 온도에서 흑색 마이크로플레이트의 웰에 상기 조성물을 주입하고 8×10-15내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 반응시킨 다음, 75초 후에 측정하였다.
제11도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해된 0.66mM 아크리단 포스페이트 8, 6.4μM 루시제닌, 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.01mg/㎖ Na3SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 0.88mM MgCl2를 포함하는 시약 조성물 100㎕에 의해 방출되는 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 주위 온도에서 흑색 마이크로플레이트의 웰에 상기 조성물을 주입하고 8×10-15내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 반응시킨 다음, 75초 후에 측정하였다.
제12도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8), 6.4μM 루시제닌 0.66mM 아크리단 포스페이트 7(0.066M 메탄올 용액의 1:100 희석액), 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트 0.01mg/㎖ Na3SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 0.88mM MgCl2를 함유하며, 실온에서 8×10-16mol의 AP의 부가에 의해 반응이 개시된, 시약 100㎕에 의해 화학발광이 빠르게 생성되는 것을 나타내는 그래프이다.
제13도는 본 발명의 검출 시약을 이용한 인간의 융모막성 생식선 자극 호르몬에 대한 화학발광 면역 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
제14도는 본 발명의 검출 시약을 이용한 갑상선 자극 호르몬에 대한 신속한 화학발광 면역 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
제15도는 본 발명의 검출 시약을 이용한 갑상선 자극 호르몬에 대한 화학발광 면역 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
제16도는 본 발명의 검출 시약을 이용한 에스트라디올에 대한 화학발광 면역 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
제17도는 하나의 샘플에 존재하는 산 포스파타제 및 알칼리 포스파타제를 동시에 검출할 수 있음을 보여주는 그래프이다. 상부 곡선은 두가지 효소를 함유하는 샘플로부터 방출되는 광을 나타내고, 하부 곡선은 산 포스파타제만을 함유하는 샘플로부터 방출되는 광을 나타내며, 중간 곡선은 알칼리 포스파타제로 인한 차이를 나타내고 있다.
제18도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해된 0.66mM 아크리단 포스페이트 12, 6.4μM 루시제닌, 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.01mg/㎖ Na3SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 10μM MgCl2를 포함하는 시약 조성물 100㎕에 의해 방출되는 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 주위 온도에서 흑색 마이크로플레이트의 웰에 상기 조성물을 주입하고 8×10-15내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 반응시킨 다음, 75초 후에 측정하였다.
제19도는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 13, 3.2μM FTLWPSLS, 0.5mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.005μM MgCl2, 0.016%(w/v) TWEEN 20 및 5μM MgCl2를 포함하는 시약 조성물 100㎕에 의해 방출되는 최대 화학발광 세기와 AP의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 주위 온도에서 흑색 마이크로플레이트의 웰에 상기 조성물을 주입하고 8×10-15내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 용액 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 반응시킨 다음, 75초 후에 측정하였다.
[바람직한 실시예의 설명]
본 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 제08/585,090호에 기술되어 있는 바와 같이, 특정 부류의 새로운 화합물들이 포스파타제 효소와 반응하여, 쉽게 검출할 수 있는 화학발광을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 포스파타제 효소의 존재하에 화학발광을 생성하는 본 발명의 화합물은 다음 화학식 I로 표시된다.
[화학식 I]
여기에서, Het는 질소, 산소 및 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이며, Z는 산소 및 황 원자이며, R6은 상기 화학식 1의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 유기기이고, 각각의 M은 독립적으로 수소 및 양이온 중심으로부터 선택된 것이며, n은 전기적으로 중화상태를 만족시킬 수 있는 숫자이다. 산소의 존재하에 포스파타제와 화학식 I의 화합물이 반응하면 전자적으로 여기된 상태(VI*)의 카르보닐 함유 화합물 VI이 형성된다. VI*의 방사성 붕괴(radiative decay)에 의해 광이 조사된다.
화학식 I의 헤테로사이클 고리 시스템은 질소, 산소 및 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 함유하며, 엑소사이클 이중결합(exocyclic double bond)을 갖는 고리 탄소와 콘쥬게이션 되어 있다. 바람직한 헤테로사이클 화합물은 아래에 도시되어 있는 바와 같은 식 II 및 III의 화합물, 및 그 이중 결합 이성질체 또는 이성질체의 혼합물을 포함한다.
[화학식 II]
[화학식 III]
화학식 II, III에서 Z, M, n 및 R6은 앞에서 정의된 바와 같으며, R1-R5는 이후 정의될 것이다.
화학식 I을 다시 참조하면, Het기를 포함할 수 있는 고리 구조체의 예로는 아래의 구조체들이 포함되는데, 여기서 별표가 엑소사이클릭 이중결합을 나타낸다. 가능한 모든 치환 패턴을 일일이 나타내지 않아도, 각각의 고리 위치가 수소 이외의 치환기를 함유할 수 있다는 것이 이해될 수 있을 것이다. 구체적으로 열거되어 있지는 않지만 화학식 I의 범위 내에 속하는 다른 헤테로사이클 고리 화합물도, 당업자에게는 자명할 것이다.
상기 모든 화합물에 있어서, R1기는 R1기를 이루는 원자의 원자가를 만족시키기 위하여 요구되는 필요한 수의 수소 원자 이외에 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50인 유기기이다. 상기 유기기는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로부터 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 R1기는 C1-C4알킬기 및 벤질기를 포함한다.
상기 모든 화합물에 있어서, 동일하거나 다를 수 있는 R2-R5기 각각은, 수소 또는 광이 생성되도록 하는 치환기이며, 일반적으로 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 1 내지 50개 함유한다. 사용될 수 있는 대표적인 치환기의 예는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 할로겐, 아미노, 치환된 아미노기, 카르복실, 카르보알콕시, 카르복사미드, 시아노 및 설포네이트기이며, 이들로만 제한되는 것은 아니다. R2-R3또는 R4-R5와 같이 인접한 기중의 하나 또는 두 쌍은, 엑소사이클 이중결합을 갖는 고리에 결합되어 있는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리로서 상호 결합될 수 있다. 상기 결합된 헤테로사이클 고리는 하나 이상의 질소, 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있으며, 고리의 탄소 위치에서 전술한 바와 같은 수소 이외의 다른 기로 치환될 수 있다.
화합물의 성질을 개질하거나 최종 포스페이트 화합물 합성의 편의를 위하여, 치환기는 고리의 선택된 위치에 다양하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 성질로는 화학발광 양자비(quantum yield), 효소와의 반응율, 방출광의 최대 세기, 광방출 기간, 조사광의 파장 및 반응 매질에 대한 용해도가 있다. 특정 치환기 및 효과는 후술하는 상세한 설명에 기술되어 있지만, 이는 본 발명의 사상을 한정하려는 것은 아니다.
M기 각각은 독립적으로 수소 원자 또는 양이온 중심을 포함한다. 양이온 중심은 소듐 원자 Na+와 같이 양전하를 갖는 원자, 암모늄 이온 NH4 +와 같이 원자의 그룹 또는 하나 이상의 양전하 싸이트를 갖는 분자의 일부를 의미한다. 후자의 예로는 본 출원인의 미국 특허 제5,451,347호에 개시되어 있는 양이온이 두개인 화합물 및 본 출원인의 미국 특허 제5,393,469호에 개시되어 있는 바와 같이 여러개의 양이온기를 갖는 고분자 화합물이 있다. 양이온 중심 상의 양전하는 1, 2, 3등과 같이 어떠한 단위값도 가질수 있다. 양이온 중심의 예로는 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온, 4급암모늄 이온 및 4급포스포늄 이온을 들 수 있으나, 이들로만 제한되는 것은 아니며 각각의 원자가에 의해 요구되는 수만큼 존재한다. 전기적으로 중성이 되도록 하기 위해 화학식 I의 화합물에 두개의 기가 존재할 경우, 두개의 기는 서로 동일하거나 다를 수 있다. 바람직한 짝 이온은 알칼리 금속 이온이다.
상술한 바와 같이, 유기기 R6은 광 생성이 일어나도록 하거나 또는 광 생성을 방해하지 않는 기라면 어느 것이나 가능하며, 바람직하기로는 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 1 내지 50개, 및 자신에 함유된 원자의 원자가를 만족시키기 위하여 요구되는 필요한 수의 수소 원자를 포함한다. R6기로서 작용할 수 있는 기의 예로는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기를 들 수 있으나, 이들로만 제한되는 것은 아니다. 이온기 또는 극성기(polar group)와 같은 수소 원자 이외의 치환기는, 화합물의 성질을 개질하거나 최종 포스페이트 화합물의 합성의 편의를 위해 R6의 카본 체인 또는 고리 상의 선택된 위치에 여러개 도입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 성질로는 화학발광 양자비, 효소와의 반응율, 방출광의 최대 세기, 광방출 기간, 방출광의 파장 및 반응 매질에 대한 용해도가 있다. 특정 치환기 및 그 효과는 후술하는 상세한 설명에 기술되어 있지만, 이는 본 발명의 사상을 한정하려는 것은 아니다.
바람직한 종류의 화합물은 하기 식 IV의 화합물이다. 여기에서, Ar은 적어도 하나의 카르보사이클 또는 헤테로사이클 방향족 고리를 함유하며 추가로 치환될 수 있는 아릴 고리기이고, Z는 산소 및 황 원자로부터 선택되며, R1은 앞에서 정의된 바와 같고, M은 앞에서 정의된 바와 같이 수소 또는 1가 또는 2가 양이온 중심 이온이며, n은 2 또는 1이다.
[화학식 IV]
동일하거나 다를 수 있는 R7-R14기 각각은 수소, 또는 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50인 치환기이다. 치환기는 광이 생성되도록 하는 기로서, 그 예로는 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 할로겐, 아미노, 치환된 아미노기, 카르복실, 카르보알콕시, 카르복사미드, 시아노 및 설포네이트기가 있으나 이들로만 제한되는 것은 아니다. R7-R8또는R8-R9와 같이 인접한 기는, 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리로서 상호 결합될 수 있다. R7내지 R14는 메톡시, 에톡시, t-부톡시 등과 같은 알콕시기 및 할로겐으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 화합물은 식 V의 화합물이다. 여기에서, Z는 산소 또는 황이고, Ar은 페닐기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기이며, M 및 n은 앞에서 정의된 바와 같다.
[화학식 V]
본 발명의 다른 일면은 포스파타제 효소와의 반응에 의해 가시 영역의 화학발광을 생성하기 위한 방법으로서 화학식 I-V중 어느 하나의 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다. 완충 수용액에서 화학식 I-V의 화합물과 포스파타제 효소를 반응시키면, 쉽게 검출되는 화학발광이 생성된다. 알칼리 pH에서 반응을 수행할 경우, 실온에서 몇분 이내에 광 세기가 최고치에 도달한다. 상기 반응은 인핸서의 존재하에 수행될 수도 있다.
본 발명의 발견을 어떠한 특정 메카니즘에 의해 제한하려는 의도는 아니지만, 필요한 반응물은 산소 분자이고, 반응 생성물은 케톤 VI, 에스테르 또는 티오에스테르 VII, 식 R6ZH의 화합물 및 포스페이트 이온이다. 광은 전기적으로 여기된 상태의 VI으로부터 방출된다. 광 생성을 위해 필요한 조건은, 여기된 상태의 VI을 형성하기에 충분한 에너지가 반응을 통해 생성되는 것이다. VI이 형광성이 있다면, 화학발광은 반응에 의해 여기된 상태의 VI으로부터 직접 생성된다. 특히, 중간 정도의 염기성 pH에 화학식 I의 화합물을 포스파타제 효소와 반응시키면, 포스페이트기가 분리될 때 형성되는 것으로 기대되는 에놀레이트 중간체(VII의 음이온)의 자동산화에 의해 생성되는 것보다, 훨씬 강한 광이 방출된다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
화학발광을 생성하는 바람직한 방법에 있어서, 아크리단 고리를 함유하는 화합물은 알칼리 완충액(pH 약 8 내지 10)에서 알칼리 포스파타제와 반응하여, 효소와 포스페이트 화합물이 반응할 때 개시되는 연속적인 화학발광 신호를 생성한다. 더욱 상세하게 후술되는 바와 같이 적어도 하나의 계면활성제 인핸서의 도입에 의해, 광 세기는 어떠한 시점에서나 적어도 40배까지 증가될 수 있다.
화합물 IV와 포스파타제 효소의 반응에 의해 광을 생성하는 바람직한 방법에 있어서, 반응은 완충 수용액(pH 7 내지 10.5)에 5 내지 50℃의 온도하에 수행된다. 바람직하기로는 pH가 8.5 내지 10이고, 반응온도가 20 내지 40℃이다. 화합물 IV는 1μM 내지 20mM 사이의 농도, 바람직하게는 10μ 내지 1mM 사이의 농도로 사용된다. 효소는 알칼리 포스파타제 또는 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트인 것이 바람직하다. 광은 여기된 상태의 VIII로부터 방출된다.
본 발명의 화합물은 보통 100-200nm의 광대역 광을 방출하며, 전자기 스펙트럼의 근자외선 내지 가시광선 영역의 파장에서 최대 세기를 나타낸다. 최대 세기파장 λmax은 350-500nm 범위이다. 공유결합에 의해 결합되어 있으며 비닐 포스페이트기의 이중결합과 콘쥬게이션 되어 있지 않은 형광단을 갖는화학식 I의 포스페이트 화합물은, 여기된 생성물 VI*을 형성할 때, 분자내의 에너지 전이가 일어나 여기된 상태의 형광단으로부터 장파장의 광이 방출되는 것으로 생각된다.
포스파타제 효소의 작용에 의해 광을 생성하는 방법에서, 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 동시에 사용될 수 있다. 어떠한 경우에는 두 종류 이상의 화학식 I의 화합물을 포스파타제 효소와 동시적으로 반응시키는 것이 유리할 수 있다. 두 종류 이상의 화합물의 발광성 또는 물리적 성질이 서로 다른 경우, 어느 하나의 화합물만으로는 쉽게 얻을 수 없는 특징을 갖는 광 방출 반응을 일으키기 위해서는 둘을 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 화합물 I중에서 서로 다를 수 있는 발광 및 물리적 성질의 예로는 방출 스펙트럼, 광방출 기간, 효소 전환, 방출이 최대에 이르는 속도(rate of rise of emmision to maximum), 소수성/친수성 및 용해도를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서 특정 발광 성질이 화학식 I의 화합물 사이에서 다를 수 있다고 하더라도, 성질의 다양성으로 인해 화합물의 기본적인 이용성은 떨어지지 않는다. 본 명세서에 기술되어 있는 사상 및 방법에 의해, 바람직한 성질을 갖는 특정 화합물을 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에 의해 방출되는 광은 루미노미터(luminometer), X-레이 필름, 고속 현상 필름, CCD 카메라, 섬광 계수기, 화학 감광계 등과 같은 공지된 수단중 적절한 것을 이용하여 검출될 수 있다. 각각의 검출 수단은 스펙트럼 감도가 다르다. 인간의 눈은 녹색 광에 대해 적절한 감도를 나타내고, CCD 카메라는 적색광에 대해 최적의 감도를 나타내고, X-레이 필름은 UV 내지 청색광 또는 녹색 광에 대해 최적의 감도를 나타낸다. 검출 장치는 비용, 편리성, 및 결과물에 대한 영구기록의 필요성 여부에 따라 선택된다.
최대 방출을 장파장 쪽으로 이동(적색으로 이동)시키기 위해서는 형광 에너지 억셉터가 채용될 수 있다. 적색으로 이동하여 방출시키기 위한 여러 가지 기술은 화학발광 반응 및 분석 분야에 공지되어 있다. 상술한 바와 같이 공유결합에 의해 결합되어 있는 형광단은 일예이다. 형광제는 별도의 성분으로서 반응 용액에 부가될 수 있다. 형광제를 화합물에 밀접하게 접촉시키기 위해서는, 형광제를 양이온 폴리머와 같은 인핸서 물질에 연결시키거나, 또는 미셀(mecelle)이나 폴리머와 같은 인핸서 물질에 연결시킬 수 있다. 다른 방법으로는, 효소 반응 기간 동안의 포스페이트기의 제거에 의해 형광체로 전환될 수 있는 비형광체 형태로 형광제가 제공될 수 있다. 후자형 화합물의 예로는 플루오레신 디포스페이트, 4-메틸움벨리페론 포스페이트와 같은 쿠마린 포스페이트, 아토포스(ATTOPHOS)와 같은 벤조티아졸 포스페이트를 포함한다(JBL Scientific, San Luis Obispo, California).
또한, 광 방출량의 증가를 위해, 적어도 하나의 인핸서 화합물이 본 발명의 화학발광 반응에 채용될 수 있다. 본 발명의 방법에 있어 효과적인 인핸서는, 광을 방출하는 여기된 상태의 생성물 분자의 비율을 증가시키거나, 여기된 상태에서 형성되는 생성물 분자의 비율을 증가시키거나, 효소의 반응 또는 전환율을 증가시키거나, 후속 화학 반응 단계의 속도를 증가시키거나, 효소의 안정성을 향상시키거나, 화학식 I의 화합물과 효소의 결합을 촉진시키거나, 경쟁적인 비발광 부반응을 억제 또는 방해하는 작용을 하거나, 또는 상기 메카니즘들이 복합된 메카니즘에 따라 작용한다. 인핸서는 화학발광을 증가시키는데 효과적인 양만큼 사용되며, 바람직하기로는 최종 반응 용액에 대한 농도가 0.001 내지 5mg/㎖, 더욱 바람직하기로는 0.01 내지 2.5mg/㎖이다.
본 발명의 방법을 실시하는데 효과적인 인핸서 화합물은 표면장력 저하, 표면 습윤(wetting) 또는 표면 세정성과 같은 표면 활성을 나타내는 화합물인 계면활성제 화합물이 전형적이다. 계면활성제는 극성 및/또는 이온성 기를 함유하는 친수성 영역, 및 주로 탄화수소기나 알케녹시기 또는 두가지 모두를 함유하는 소수성 영역을 포함한다. 계면활성제는 양이온, 음이온, 비이온 및 쌍극성이온으로 분류되며, 모노머 또는 폴리머일 수 있다. 본 발명에 유용한 것으로 밝혀진 양이온성 계면활성제 인핸서는, 그 내용이 본 명세서에 참고로 기재되어 있는 미국 특허 제5,393,469호에 기술되어 있는 측쇄에 있는 4급포스포늄기를 갖는 폴리비닐 타입 폴리머를 포함한다. 이러한 유형의 폴리머 예로는 폴리비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드 및 폴리비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드와의 코폴리머를 포함한다. 또한, 4급암모늄 측기를 갖는 폴리비닐 타입 폴리머는 본 발명에서 인핸서로서 유용하다. 이러한 폴리머의 예는 그 내용이 본 명세서에 참고로 기재되어 있는 미국 특허 제5,112,960호에 기술되어 있으며, 폴리비닐벤질벤질디메틸암모늄 클로라이드 및 폴리비닐벤질트리부틸암모늄 클로라이드를 포함한다.
본 발명에 유용한 것으로 밝혀진 또 다른 범주의 양이온 계면활성제 인핸서는, 그 내용이 본 명세서에 참고로 기재되어 있는 미국 특허 제5,451,347호에 기술되어 있는 바와 같은 2가지의 4급암모늄 또는 4급포스포늄기를 갖는 양이온이 둘인 화합물이다. 예를 들어, 상기 화합물(1-트리옥틸포스포늄메틸-4-트리부틸포스포늄메틸벤젠 디클로라이드)은 본 발명에 따른 광 생성을 위한 방법에 사용될 경우 우수한 화학발광을 제공한다. 본 발명에 이용되는 또 다른 양이온성 계면활성제 인핸서는, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드나 브로마이드와 같은 모노4급암모늄염 및 세틸트리메틸암모늄 브로마이드와 같은 모노4급포스포늄 염이다.
음이온성 계면활성제 인핸서는 알킬 설페이트 및 알킬 설포네이트를 포함한다. 비이온 계면활성제 인핸서는 폴리옥시에틸렌화된 알킬페놀, 폴리옥시에틸렌화된 알콜, 폴리옥시에틸렌화된 에테르 및 폴리옥시에틸렌화된 소르비톨 에스테르를 포함한다. 쌍극성이온 계면활성제 인핸서는 4급암모늄알킬 포스페이트 및 설포네이트를 포함한다. 각 부류의 계면활성제에 대한 구조체의 예는 계면활성제에 대한 권위있는 논문 어디에서나 더욱 많이 찾아볼 수 있다. 대표적인 계면활성제의 대부분은 테스트에 의해, 계면활성제가 없을때 생성되는 양과 비교하여, 생성되는 광의 양이나 세기를 증가시키는데 상당히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 양이온성 계면활성제, 특히 4급암모늄 및 4급포스포늄 염은 가장 효과적인 인핸서에 속하는 것으로 밝혀졌다.
상술한 바와 같이, 계면활성제 인핸서는 정전기 또는 소수성 상호작용을 통하여 공유 결합에 의해 부착 또는 결합되어 있는 형광성 기를 포함할 수 있다.
본 발명의 화학발광 반응을 수행하는 또 다른 태양에 있어서, 인핸서가 없이 몇초에서 약 10분 미만 사이 범위의 제1기간 동안에 완충액(pH 5.0-9.5)에서 화학발광 화합물을 포스파타제 효소와 반응시킨다. 이러한 제1기간 동안에 생성되는 광은 무시할만한 수준이다. 그런 다음, 인핸서를 함유하는 강염기 트리거(trigger) 용액을 한번 부가한 다음, 피크 세기를 측정하거나, 또는 제2기 동안 또는 광 방출이 중단될 때까지 광량을 가산함으로써 광량을 측정한다. 모든 광이 짧은 시간 동안, 바람직하기로는 약 1분 이하의 기간 동안 방출되도록 인핸서의 pH 및 양을 선택하는 것이 바람직하다. 트리거 용액의 pH가 11보다 커야 하며, 12 이상인 것이 바람직하다. 바람직한 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨이다. 이러한 반응에 유용한 인핸서는 전술한 바와 같으며, 화학발광을 증강시키는데 효과적인 양, 바람직하기로는 최종 반응 용액에서 0.001 내지 1mg/㎖의 농도로 사용된다.
이러한 양상의 화학발광 생성은 많은 샘플을 동시에 처리해야 하는 분석에 유리하다. 또한, 산 포스파타제의 검출이 이러한 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 화학발광 반응 또는 분석에 도입될 수 있는 단계는, 제1기간 후에 추가적인 모든 효소 반응을 정지시키기 위하여 반응 시스템에 효소 억제제를 부가하는 것이다.
상기 반응이 포스파타제 효소에 의해 촉진되기 때문에, 검출 가능한 양의 광을 생성하는데는 극소량의 효소만으로도 충분하다. 1아토몰(attomol)(1×10-18mol8)의 감도가 달성되었다. 이렇게 소량의 포스파타제 효소를 검출할 수 있는 능력이 있기 때문에, 본 발명의 화학발광 기술은 효소를 이용하는 분석법에 따라 많은 유형의 분석 대상물을 분석하는데 적합하다.
본 발명의 화학발광 반응은 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인, 나일론 멤브레인, 및 니트로셀룰로스 필터 및 멤브레인 상에서 AP(알카라인 포스파타제) 콘쥬게이트를 검출하는데 특별히 효과적인 시약을 제공한다. 놀랍게도, PVDF 멤브레인 상에서 항체-AP 콘쥬게이트를 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 시약 조성물과 반응시키면, 거의 순식간에 최대치까지 증가하여 적어도 이틀동안 일정한 세기를 유지하는 강렬한 발광이 생성되는 것이 밝혀졌다. 따라서, 필름 상에 검출하여 이미지 세기를 적절하게 최적화시키기가 특히 편리하다.
[화학식 1]
놀랍게도, PVDF 멤브레인 상에서, 생성되는 광 방출이 1달 이상의 매우 장기간 동안 유용한 레벨로 유지되는 것으로 밝혀졌다. 멤브레인을 기초로 하는 검출법에 이용되는 공지된 화학발광 시약은, 루미놀과 과산화효소를 반응시키는 경우 시간에 따른 발광 신호가 3-4시간 이내에 감퇴하는 것처럼 급속한 감퇴를 보이거나, 또는 효소로 반응이 개시되는 디옥세텐의 경우에서 처럼 서서히 증가하여 점진적으로 감소한다.
또 다른 면에 있어서, 본 발명은 pH 7 내지 10.5인 완충 수용액 0.01-10mM 농도의 화학식 I 화합물, 및 필요에 따라 화학발광을 증강시키는데 효과적인 양만큼의 적어도 하나의 인핸서를 포함하는, 포스파타제 효소와의 반응에 의해 화학발광을 생성하기 위한 시약 조성물에 관한 것이다. 인핸서의 바람직한 양은 0.001 내지 10mg/㎖이다. 알칼리 포스파타제를 이용하여 화학발광 반응을 시키기 위한 배합물은 효소의 활성을 증가시키기 위하여 0.01-10mM 농도의 마그네슘 또는 아연 염을 추가로 포함할 수 있다.
포스파타제 효소와의 반응에 의한 화학발광을 생성하기 위한 바람직한 시약 조성물은 완충 수용액(pH 7 내지 10.5), 식 IV 또는 V의 아크리단 포스페이트(농도 0.01-10mM) 및 화학발광을 증강시키는데 효과적인 양(바람직하기로는 0.001 내지 10mg/㎖)만큼의 계면활성제 인핸서를 포함한다. 상기 배합물은 0.01-10mM 농도의 마그네슘 염을 추가로 포함할 수 있다.
시약 조성물에 있는 계면활성제 인핸서는 암모늄이나 포스포늄기를 함유하는 폴리머 양이온성 인핸서 및 암모늄이나 포스포늄기를 함유하는, 양이온이 둘인 인핸서로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다. 각각의 모노머 단위에 있는 트리알킬포스포늄 측기를 갖는 폴리비닐 폴리머 및 각각의 모노머 단위에 있는 트리알킬암모늄이나 벤질디알킬암모늄 측기를 갖는 폴리비닐 폴리머가 특히 바람직하다. 인핸서의 종류 및 양은 주어진 용도에 적합하도록 선택될 수 있다. 용액중의 AP 또는 콘쥬게이트의 검출에 바람직한 조성물은 아민 완충액(pH 8.5), 9-(페녹시포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단 화합물, 디소듐 염(0.1-1mM), 마그네슘염(0.1-1mM) 및 인핸서 A[폴리비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드 코-폴리비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드(트리부틸기 대 트리옥틸기의 비율 약 3:1)](0.01-0.1mM)를 포함한다. 멤브레인 상에서 AP 또는 콘쥬게이트의 검출을 위한 바람직한 조성물은 아민 완충액(pH 9.6), 9-(페녹시포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(0.1-1mM), 마그네슘염(0.1-1mM) 및 인핸서 A(0.1-1mM)를 포함한다.
본 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 제08/683,927호에는, 상기 반응 시스템에 양이온성 방향족 화합물(CAC)을 부가하면 생성되는 광의 양 및/또는 세기가 크게 증가한다고 기술되어 있다. 또한, 포스파타제 효소가 없는 상태에서는 화학식 I의 화합물에 CAC를 부가해도 자발적인(기본적인) 화학발광이 크게 증가하지 않는다. 이는 CAC가 화합물 I 그 자체에 대해서가 아니라 화합물 I로부터 유도되는, 탈인산화된 중간체에 대해서 효과를 나타내지 않기 때문인 것으로 생각된다. 포스파타제 효소의 검출에 대한 감도가 상당히 증가된 것은 기본 발광에 대해 신호값이 증가된 결과이다. 광 방출이 CAC로부터가 아니고 여기된 상태의 VI으로부터 연속적으로 일어나는 것이 중요하다.
여러 가지 CAC가 생성된 광의 양 및/또는 세기를 증가시키는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. CAC는 방향족 고리나 고리 시스템에 또는 고리중의 하나에 있는 치환기에 적어도 하나의 양전하를 갖는 방향족 화합물이다. 여기에서, 치환기는 불포화 고리 원자와 콘쥬게이션되어 있다.
본 발명의 CAC는 본 발명의 반응에서 화학발광을 증가시키는데 적합한 산화/환원 포텐셜을 갖는 화합물이다. 어떤 화합물이 CAC로서 적합한가는 상세하게 후술되어 있는 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 어떠한 특별한 메카니즘에 따른 설명에 구속되지 않고, I의 탈인산화된 중간체 생성물은 가역 또는 비가역적일 수 있는 레독스 반응을 거친다. 산소 분자는 CAC, CAC의 환원된 형태 또는 화합물 I의 탈인산화된 중간체나 그 산화 또는 환원된 형태로부터 선택되는 하나 이상의 반응종과 반응하여, 화합물 I로부터 유도된 산소 결합형 반응 생성물을 생성한다. 이 산소형 반응 생성물이 화학발광을 거치게 되는데, 이 반응은 O-O결합을 파괴하는 반응일 수 있다.
본 발명의 CAC는 탄소 이외에 적어도 하나의 원자(헤테로 원자)를 함유하는 하나 이상의 분리되어 있거나 결합되어 있는 방향족 고리를 포함하는 헤테로방향족 고리 화합물일 수 있다. 헤테로 원자는 양전하가 하나 이상의 헤테로원자 상에 실질적으로 위치하고 있는 하나 이상의 질소 원자인 것이 바람직하다. 이러한 부류의 CAC의 예로는 시아닌 염료, 티아시아닌 염료, 카르보시아닌 염료, 티아카르보시아닌 염료, 셀레나카르보시아닌 염료, 아조 염료 및 하기 식의 아크리디늄 유도체가 있다.
상기 식에서, Q는 전자흡인기이고, X-는 비간섭 음이온성 짝 이온이며, R은 각각이 비간섭 치환기를 선택적으로 함유할 수 있는 알킬 또는 아랄킬기이다. 또한, 고리 수소의 일부가 다른 치환성 기로 치환되어 있는 아크리디늄 유도체는 기능성 CAC의 사상내에 있다. 전자흡인기 Q의 예로는 염소, 시아노기, 또는 에스테르기(-COOR), 티오에스테르기(-COSR), 아미드기(-CONR1R2) 또는 설폰이미드기(-CON(R)SO2R′)와 같은 카르보닐기일 수 있다. 유사하게, CAC는 페난트리디늄 또는 페난트롤리늄 화합의 유도체일 수 있다.
본 발명의 CAC는 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 적어도 하나의 양이온성 치환기를 갖는 하나 이상의 분리되어 있거나 결합되어 있는 카르보사이클 방향족 고리를 포함하는 방향족 고리 화합물일 수 있다. 여기에서, 양이온성 싸이트는 방향족 고리와 콘쥬게이션되어 있다. 마지막 부류의 CAC에 있어서, 헤테로 원자는 질소 또는 황 원자인 것이 바람직하다. CAC의 예로는 메틸렌 블루(Methylene Blue) 및 나일 블루(Nile Blue)를 포함한다.
본 발명의 CAC는 둘 이상의 양전하를 가질수 있다. 예를 들면, 양이온이 둘인 화합물은 본 발명의 사상내에 포함된다. 이러한 유형의 화합물의 예로는 일반적으로 루시제닌으로 알려진 N,N′-디메틸바이아크리디늄 디나이트레이트 및 일반적으로 메틸 바이올로겐 디클로라이드(methyl viologen dichloride)로 알려진 1,1′-디메틸-4,4′-바이피리디늄 디클로라이드 또는 파라콰트(paraquat) 디클로라이드를 포함한다.
본 발명의 CAC 성분으로서 유용한 그 밖의 화합물의 예가 표 1에 기술되어 있다.
[표 1]
그러므로, 본 발명의 또 다른 면은 포스파타제 효소와의 반응에 의해 검출할 수 있는 화학발광을 생성하는 방법에 있어서 화학식 I-V중의 어느 하나의 화합물과 CAC를 사용하는 것에 관한 것이다. 완충 수용액에서 CAC의 존재하에 화학식 I-V의 화합물과 포스파타제 효소를 반응시키면, 여기된 상태의 VI로부터 쉽게 검출되는 화학발광이 생성된다. 알칼리 pH에서 반응이 일어날 경우, 광 세기는 실온에서 몇초 내지 몇분 이내에 최대치에 도달한다.
화학발광을 생성하는 바람직한 방법에 있어서, 아크리단 고리를 함유하는 식 VI의 화합물은 알칼리 완충액(pH 약 7 내지 10.5)에서 CAC의 존재하에 알칼리 포스파타제와 반응하여, 효소의 반응시 개시하여 피크 세기에 빠르게 도달하는 연속적인 화학발광 신호를 생성한다. 본 발명의 광 생성 반응은 상세하게 후술되는 바와 같이 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제의 도입에 의해 변형 및 개선될 수 있다.
화합물 IV와 포스파타제 및 CAC의 반응에 의해 광을 생성하는 바람직한 방법에 있어서, 반응은 완충 수용액(pH 7 내지 10.5)에서 5 내지 50℃의 온도하에 수행된다. 바람직한 반응 온도는 20 내지 40℃, 바람직한 pH는 8 내지 10이다. 특히, 주위 온도 부근에서는 광 세기에 대한 온도의 영향이 비교적 작기 때문에 온도를 정확하게 조절할 필요 없이, 주위 온도에서 반응을 수행하는 것이 편리하다. 화합물 IV는 1μM 내지 20mM 사이의 농도로 사용되며, 바람직하기로는 10μM 내지 1mM 사이의 농도로 사용된다. 효소는 알칼리 포스파타제 또는 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트인 것이 바람직하다.
CAC의 존재하에 포스파타제 효소의 작용에 의해 광을 생성하기 위한 방법에서, 화학식 I-V중 하나 이상의 화합물을 동시에 사용할 수 있다. 어떤 경우에는, 화학식 I-V중 둘 이상의 화합물을 포스파타제 및 CAC와 동시에 반응시키는 것이 유리할 수 있다. 둘 이상의 화합물의 발광성 또는 물리적 성질이 다른 경우, 어느 하나의 화합물만으로는 쉽게 달성할 수 없는 특징을 갖는 광 조사 반응을 형성하기 위해서는, 둘을 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 화합물 I-V 사이에 서로 다를 수 있는 발광 및 물리적 성질의 예로는 방출 스펙트럼, 광 방출 기간, 효소 전환, 방출이 최대에 이르는 속도, 소수성/친수성 및 용해도를 포함한다.
마찬가지로 방법으로, 하나 이상의 CAC가 포스파타제 효소의 작용에 의한 광 생성 반응에 동시적으로 사용될 수 있다. CAC는 10-2M 내지 10-9M 사이의 농도, 바람직하기로는 10-4M 내지 10-7M 사이의 농도로 사용된다. 본 발명의 방법에 이용하기에 바람직한 특정 CAC의 농도는 후술되는 방법에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
또 다른 면에 있어서, 본 발명은 완충 수용액(pH 7 내지 10.5), 화학식 I-V의 화합물 및 증가된 레벨의 화학발광을 제공하는데 효과적인 양만큼의 CAC를 포함하는, 포스파타제 효소와의 반응에 의한 화학발광 생성용 시약 조성물에 관한 것이다.
이외에도, 화학식 I-V의 화합물 및 CAC를 포스파타제 효소와 반응시키는데 어떠한 첨가제를 도입할 경우, 광 생성 반응이 바람직하게 개선되는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 면은 화학식 I-V의 화합물, CAC, 유효량의 음이온성 계면활성제 및 유효량의 비이온성 계면활성제를 포함하는 시약 조성물에 관한 것이다. 음이온성 계면활성제는 최대 화학발광 세기에 도달하는 속도를 실질적으로 증가시키는 역할을 한다. 비이온성 계면활성제는 생성되는 화학발광의 양이나 세기를 실질적으로 증가시키는 역할을 한다. 특히, 마지막 조성물을 이용하면 피크 광 세기에 빠르게 도달하여 유지되는, 증가된 광 방출을 제공하는 이점이 있다.
양이온성 계면활성제가 화학발광의 생성을 증가시키는, 본 출원인의 동시 계류중인 미국 특허 출원 번호 제08/5855,090의 방법과는 달리, 본 발명에서 있어서 양이온성 계면활성제(모노머 및 폴리머 모두)는, CAC를 필요로 하는 화학발광 반응을 촉진시키는데 효과적이지 않다. 어떤 경우에는, 양이온성 계면활성제를 도입하면 광 생성이 소멸하게 된다. 본 발명의 방법 및 조성물에 있어서, 양이온성 계면활성제의 상반되는 효과로 인해 CAC를 이용하는 화학발광 반응에 차이가 예견된다.
CAC를 함유하는 조성물에 유용한 음이온성 계면활성제는 탄소수가 적어도 10개인 알킬기를 갖는 알킬 설페이트 및 알킬 설포네이트를 포함한다. 바람직한 화합물은 소듐 도데실 설페이트(SDS)이다. 음이온성 계면활성제는 10mg/㎖ 내지 10㎍/㎖ 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
CAC를 함유하는 조성물에 유용한 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌화된 알킬페놀, 폴리옥시에틸렌화된 알콜, 폴리옥시에틸렌화된 에테르 및 폴리옥시에틸렌화된 소르비톨 에스테르를 포함한다. 바람직한 비이온성 계면활성제는 TWEEN 20 및 TRITON X-100를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 조성물중에 약 0.01% 내지 1.0% 농도로 이용되는 것이 바람직하다.
각 부류의 계면활성제에 대한 구조체의 예는 계면활성제에 대한 권위있는 논문 어디에서나 많이 찾아볼 수 있으며, 당업자들에게 공지되어 있다. 많은 대표적 계면활성제의 대부분은 테스트에 의해, 계면활성제가 없을때 생성되는 광의 양과 비교하여, 생성되는 광의 양이나 세기를 증가시키는데 상당히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 면은 화학식 I-V의 화합물, CAC, 유효량의 음이온성 계면활성제, 유효량의 비이온성 계면활성제, 및 포스파타제 효소가 없을 때 조성물에서 생성되는 화학발광(자연 화학발광)을 감소시키는 유효량의 백그라운드(background) 감소제를 포함하는 시약 조성물이다.
백그라운드 감소제는 포스파타제 효소가 없을 때 조성물에 의해 생성되는 화학발광을 감소시키는 화합물이다. 상기 감소제는 시간이 지나면서 자연 화학발광이 커지는 것을 방지하는 작용도 한다. 상기 감소제는 자연 화학발광에 대하여 조성물과 포스파타제 효소의 반응에 의해 생성되는 특정 신호의 비율을 크게 하는 작용도 한다. 자연 화학발광 양을 감소시키는데 효과적인 화합물은 아황산 리튬, 아황산 나트륨 및 아황산 칼륨과 같은 아황산염이 바람직하다.
용액에 있는 AP 또는 콘쥬게이트를 검출하는데 바람직한 조성물은 아민 완충액(pH 8.5-9), 0.1μM 루시제닌, 0.1-1.0mM 화합물 5, 0.1-5mg/㎖ SDS, 1-100㎍/㎖ Na2SO3, 0.01-0.1%(w/v) TWEEN 20 및 0.1-1.0mM 마그네슘염을 포함한다. 멤브레인 사에서 AP 또는 콘쥬게이트를 검출하는데 바람직한 조성물은 아민 완충액(pH 8.5-9), 0.1μM 루시제닌, 0.1mM 화합물 5, 0.1-5mg/㎖ SDS, 1-100㎍/㎖ Na2SO3, 0.01-0.1%(w/v) TWEEN 20 및 0.1-1.0mM 마그네슘염을 포함한다.
본 발명의 방법에 효과적인 조성물은, 광을 방출하는 여기된 상태의 생성물 분자의 비율을 증가시키고, 여기된 상태에서 형성되는 생성물 분자의 비율을 증가시키고, 효소의 반응 또는 전환율을 증가시키고, 후속 단계의 화학반응 속도를 증가시키고, 효소의 안정성을 개선하고, 효소와 화학식 I의 화합물의 결합을 촉진시키고, 경쟁적인 비발광 부반응을 저해 또는 방해하는 작용을 하거나, 또는 아직 알려지지 않은 다른 메카니즘에 의한 작용을 나타낼 수 있다.
형광 에너지 수용체는 최대 방출을 장파장 쪽으로 이동(적색 쪽으로 이동)시키기 위하여 채용될 수 있다고 알려져 있다. 방출을 적색 쪽으로 이동시키기 위한 여러 가지 기술은 화학발광 반응 및 분석 분야에 공지되어 있다. 형광제는 화학식 I-V의 화합물에 공유결합에 의해 연결될 수 있어서, 여기된 상태의 대응 화합물 VI은 분자내의 에너지 전이에 따른 장파장 방출을 일으킬 수 있다. 형광제는 별도의 성분으로서 반응 용액에 부가될 수 있다. 형광제는, 형광제를 광 방출제에 더욱 밀접하게 접촉시키기 위해 미셀을 형성할 수 있는 음이온성 또는 비이온성 계면활성제에 연결될 수 있다. 다른 방법으로는, 효소 반응 기간 동안 포스페이트기의 제거에 의해 형광체로 전환될 수 있는 비형광체 형태로 형광제가 제공될 수 있다. 후자형 화합물의 예로는 플루오레신 디포스페이트, 4-메틸움벨리페론 포스페이트와 같은 쿠마린 포스페이트, ATTOPHOS와 같은 벤조티아졸 포스페이트를 포함한다(JBL Scientific, San Luis Obispo, California).
본 발명의 화학발광 방법은 화학발광 반응에 의한 분석 방법에 있어서 분석 대상물의 존재나 그 양을 검출하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은, 분석 대상물을 함유하는 샘플을 본 발명의 화학발광 화합물 및 포스파타제 효소와 접촉시키는 단계, 생성된 광을 정성분석법으로 검출하는 단계, 및 정량분석이 요구되는 경우 생성된 광의 양을 이용하여 분석 대상물의 양을 정량하는 단계를 포함한다. 광 세기와 분석 대상물의 양 사이의 관계는 공지된 양의 분석 대상물을 이용하여 검정선을 작성함으로써 쉽게 인식될 수 있다. 화학발광 화합물은 보통 약 10-5M 내지 10-2M 농도로 사용되며, 바람직하기로는 약 10-4M 내지 10-3M 농도로 사용된다. 포스파타제 효소는 용액에서 검출될 때 10-9M 이하인 것이 바람직하다. 화학발광 방법에 의해 분석되는 전형적인 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 정액과 같은 체액이다.
본 발명에서 사용되는 분석 대상물은 샘플에서 그 존재 여부가 검출되거나 정량분석될 수 있는 물질이다. 본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 분석 대상물은 포스파타제 효소를 포함하며, 이 경우에 포스파타제 효소를 추가로 부가할 필요가 없다. 본 발명의 분석 대상물은 포스파타제 효소의 억제제일 수 있다. 분석 대상물은, 일반적으로 공지된 바와 같이 면역 분석법, 핵산 탐침 분석법, 세포 수용체 분석법 등을 포함하는 리간드-결합제 분석법으로 검출될 수 있는 여러 가지 부류의 유기 및 생체 분자중의 어느 것일 수 있다. 이러한 분석법에 있어서, 분석 대상물은 포스파타제 효소로 표지(labeling)되거나, 또는 포스파타제로 표지된 특이적 결합 파트너를 통하여 특이하게 검출될 수 있다. 포스파타제는 분석 대상물과 결합하는 화합물(이하, “결합 화합물”이라 함) 상에 표지로서 직접 결합될 수 있다. 다른 방법으로는, 결합 화합물은 결합 화합물에 대한 적어도 하나의 포스파타제 표지형 특이적 결합 물질과 결합할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 결합 화합물은 적어도 하나의 제2특이적 결합 물질로 표지될 수 있으며, 제2특이적 결합 물질은 이 결합물질에 대한 포스파타제 표지형 결합 파트너에 다시 결합될 수 있다. 포스파타제 효소는 경쟁 분석법에서 효소-합텐 콘쥬게이트와 같은 리간드 유사체상에 표지로서 제공될 수 있다.
화학발광 반응을 일으킬 수 있는 포스파타제 효소는 대장균(E. coli)과 같은 세균 소스로부터 얻어진 알칼리 포스파타제, 또는 식물이나 포유동물 소스로부터 얻어진 포유동물 알칼리 포스파타제나 산 포스파타제를 포함한다. 포스파타제 효소와 생체 분자의 콘쥬게이트는, 포스파타제 활성, 즉 포스페이트 모노에스테르를 가수분해시킬 수 있는 능력이 있다면, 화학발광을 생성하는데 이용될 수 있다. 하나 이상의 포스파타제 효소 분자와 콘쥬게이트될 수 있는 생체 분자는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 단편, 항체-DNA 키메라(chimeras), 항원, 합텐, 단백질, 렉틴, 아비딘, 스트렙타비딘(streptavidin) 및 바이오틴을 포함한다. 또한, 리포솜, 미셀, 액포 및 고분자와 같은, 포스파타제 효소를 포함하며 생체 분자에 부착하는 작용을 하는 복합체가, 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 포스파타제 효소와 반응시켜 화학발광을 생성하는 반응은, 포스파타제 효소의 존재 또는 그 양을 검출하는데 있어서 빠르고 감도가 뛰어난 방법이 된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 샘플을 화학식 I의 화합물과 반응시켜 생성되는 광의 양이나 세기를 측정함으로써 샘플에 있는 포스파타제 효소의 존재 또는 그 양을 측정하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 예를 들면, 환자의 간기능 상태의 인식 또는 어떠한 질병 상태의 지수로서, 혈청에 있는 알칼리 포스파타제의 수준을 측정하는 경우에 이러한 측정법이 이용될 수 있다. 또한, 전립선의 산 포스파타제는 전립선 암에 대한 임상적 진단 지수로서 유용하다.
본 발명의 조성물은 2-5초 내에 빠르게 최대 세기에 도달하여 짧은 기간 내에 감퇴하는, 산 포스파타제(AcP)에 의해 생성되는 광을 측정하는데 유용하다. 조성물의 pH가 AcP 활성에 적합한 pH 보다 훨씬 더 높다할지라도, 우수한 감도로 이러한 효소를 정량분석할 수 있다. 더군다나, AcP는 AP 존재하에 상기 검출 시약으로 측정될 수 있다. AcP 및 AP에 의해 유도되는 화학발광 신호는 효소반응 특징이 다르게 나타나기 때문에, 한번의 실험으로 동일한 샘플에 있는 AcP 및 AP 활성 모두를 동시에 측정할 수 있다.
포스파타제 활성의 화학발광 측정을 적용하는 제2분야는 효소 억제제를 검출 및 측정하는 것이다. 억제제는 본 발명의 화합물과 같은 제2기질과 경쟁관계에 있는 기질로서 가역적으로 작용할 수 있다. 자살 억제(suicide inhibition)로서 알려진 억제의 또 다른 양상은 효소를 비가역적으로 불활성화시키는 것이다. 알칼리 포스파타제의 억제제는 무기 포스페이트, 레바미솔과 그 라세믹 형태인 테트라미솔 및 그밖에 이미다조[1,2-b]티아졸, L-페닐알라닌 및 L-호모아르기닌을 포함하며, R. B. McComb, G.N. Bowers, S. Posen in Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York 1979, pp. 268-275, 332-334, 394-397, 410-413에 개시되어 있다. 산 포스파타제의 억제제는 불화물, 몰리브데이트, 오르토포스페이트 이온, 주석산염, 4-(플루오로메틸)페닐 포스페이트 및 4-(플루오로메틸)페닐 포스페이트를 포함한다[J.K. Myers, T.S. Widlanski, Science, 262, 1451-3(1993)]. 몇가지 물질은 일정 범위의 농도에서만 억제작용이 있으며 부분적으로만 억제작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.
억제 상수 Ki, 또는 억제 반감기 t1/2와 같은 억제제의 양이나 특징에 대한 측정은, 검출가능한 생성물을 생성하는 기질의 존재하에 문제의 효소를 함유하는 샘플의 효소 활성 및 억제제의 양을 측정함으로써 이루어진다. 본 발명에 따른 포스파타제 억제제의 검출 방법에 있어서, 화학식 I의 화합물은 검출가능한 생성물로서 광을 생성한다. 포스파타제 효소와 화학발광 화합물의 반응을 억제제 물질이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 각각 실시한 다음, 그 결과를 비교하여 억제제의 존재 또는 그 양을 결정한다. 억제제는 광 세기 상승의 둔화, 광 세기의 느린 상승률 또는 광 조사가 시작되기 이전의 지연 기간과 같은 세기가 효과중의 하나 이상을 가질 수 있다.
포스파타제 활성의 화학발광 측정이 적용되는 제3분야는 유전자 발현 분석법이다. 알칼리 포스파타제 및 특히 태반에서 생성 분비되는 이소 효소(isozyme)는 지시유전자(reporter gene)로서 유용하다[J. Alam, J. Cook, Anal. Biochem. 188, 245-54(1990)]. 이러한 유형의 분석법에 있어서, 리포터 효소(reporter enzyme)를 발현시키는 역할을 하는 유전자는 플라스미드를 통해 프로모터(promoter) 또는 인핸서 서열의 부근에서 생물체의 유전자 물질에 클로닝된다. 전사 활성면에서 프로모터 또는 인핸서 서열의 효과는 리포터 효소의 생성 수준을 측정함으로써 평가된다.
효소 분석을 수행하기 위한 기술을 잘 알려져 있다. 본 명세서의 실시예에 기재된 지침을 따르면, 샘플을 제조하기 위한 방법, 시약의 적절한 양 및 비율의 결정, 반응 시간, 검정선 작성 등의 변형과 같은 것은 당업자에게는 일상적인 실험의 문제일 것이다.
본 반응은 포스파타제 효소에 의해 촉진되기 때문에, 검출할 수 있는 양의 광을 생성하는데는 극소량의 효소로도 충분하다. 4제프토몰(4 zeptomol, 4×10-21mol)의 감도가 달성되었다. 이렇게 소량의 포스파타제 효소를 검출할 수 있는 능력으로 인해, 본 발명의 화학발광 기술이 효소-연관 분석법을 이용하는 많은 종류의 분석 대상 물을 분석하는데 적합하다. 이러한 분석 및 분석법에서는 분석 샘플에 있는 분석 대상물이 풍부하지 못하거나 또는 샘플량이 제한되어 있기 때문에 소량의 포스파타제 효소를 검출할 수 있는 능력이 요구된다. 이러한 유형의 분석법에 있어서, 알칼리 포스파타제는 특이적 결합 쌍의 하나에 콘쥬게이트되어 있다. 일예로는, 소위 효소-연관 면역흡착 분석법 또는 ELISA와 같은 화학발광 효소-연관 면역분석법이 있다. 이러한 분석법은 자동화된 다중 시험 면역분석 시스템(multi-test immunoassay system)에 대해서 뿐만 아니라 수동 방식에서도 일반적으로 이용된다. 전형적인 면역 분석법에 있어서, 분석 대상물 대한 효소-표지형 특이적 결합 파트너나 분석 대상물의 효소-표지형 유사체의 존재 또는 그 양을 검출함으로써, 분석 대상물인 합텐, 항원 또는 항체가 분석된다. 면역화학 반응을 수행하기 위한 여러 가지 분석 포맷 및 프로토콜(protocol)은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명 자체의 일부를 구성하지 않는다. 이러한 분석법은 두가지 부류로 대별된다. 경쟁적인 분석법은 특이 항체를 분석 대상물 및 검출 가능하게 레이블링된 분석 대상 분자와 같은 분석 대상물 유사체와 면역학적으로 결합시키는데 특징이 있다. 샌드위치 분석법은 두가지의 항체와 분석 대상물을 연쇄적 또는 동시에 결합시키는 방법으로서 그중의 하나가 검출 가능하게 레이블링되어 있다. 이렇게 하여 형성된 검출 가능한 효소 표지형 결합 파트너는, 본 발명의 화합물 및 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 비드(bead), 튜브, 마이크로웰(microwell), 자기 입자(magnetic particle), 시편(test strip), 멤브레인 및 필터를 포함하며 당분야에서 널리 이용되고 있는 고형 표면 또는 지지체에 부착되어 있는, 효소 표지형 물질을 이용하여 측정이 이루어질 수 있다. 검출가능한 효소 표지형 물질은 용액중에 유리 상태로 존재하거나, 또는 리포솜과 같은 조직체 내에 봉입된 상태로 존재할 수 있는데, 이 경우에는 리포솜을 용해하여 검출 효소를 유리상태로 방출하는데 용해제가 이용된다.
또 다른 사용에는 웨스턴 블로팅(Western blotting) 기술에 의한 단백질의 검출이다. 분석 대상물로서 단백질을 함유하는 샘플은 전기영동법으로 분리된다. 분리된 단백질은 모세관 작용에 의해서 또는 전기장의 도움으로 블로팅 멤브레인에 전사된다. 이와 같이 전사된 단백질은 특이적 1차 항체, 및 상기 1차 항체를 인식하여 1차 항체에 결합하는, 효소 표지형 2차 형태를 이용하여 검출되는 것이 일반적이다. 표지 효소 활성의 출현은 분석 대상 단백질의 존재에 따른 것이다. 웨스턴 블로팅 분석에 본 발명의 방법을 적용하기 위하여, AP와 콘쥬게이트되어 있는 2차 항체가 채용되고, 화학발광 시약으로서 본 발명의 화합물을 이용하는 화학발광에 의해 AP 활성이 측정될 수 있다. 바이오틴화된 항체(biotinylated antibody) 및 아비딘-AP를 이용하는 바와 같은 상기 기술에 대한 변형도 본 발명의 방법을 이용하여 수행될 수 있는 분석법의 범주에 포함될 수 있다.
전술한 항원-항체 이외에도, 합텐-항체 또는 항체-항체 쌍, 특이적 결합 쌍은 상보적인 올리고뉴클레오티드나 폴리뉴클레오티드, 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴, 호르몬-수용체, 렉틴-카르보하이드레이트, IgG-단백질 A, 핵산-핵산 결합 단백질 및 핵산-항핵산 항체(nucleic acid-anti-nucleic acid antibody)가 특이적 결합쌍에 포함될 수 있다.
본 발명의 검출법이 특히 유용하게 적용되는 분야는 효소 표지형 핵산 탐침을 이용하여 핵산을 검출하는 것이다. 혼성 분석법(hybridization assay), 서던 블로팅(Southern blotting)에 의한 DNA 검출, 노던 블로팅(Nothern blotting)에 의한 RNA, DNA 시퀀싱, DNA 핑거프린팅(fingerprinting), 콜로니 혼성(colony hybridization) 및 플라그 리프트(plaque lift)와 같이, 효소-표지를 이용한 핵산 분석 및 화학발광 검출법은 모두 잘 확립된 기술이다. 효소 표지(예를 들면, AP)는 탐침 올리고뉴클레오티드나 포획(capture) 올리고뉴클레오티드와의 직접적인 콘쥬게이트로서 존재할 수 있거나, 또는 공지된 방법을 이용하여 간접 연결 수단을 통하여 도입될 수 있다. 간접 연결 수단의 예로는 합텐-표지형 올리고뉴클레오티드 및 항합텐-AP 콘쥬게이트 또는 바이오틴화된 올리고뉴클레오티드 및 아비딘-AP 콘쥬게이트를 이용하는 방법을 포함한다. 공지되어 있는 바와 같이 비드, 튜브, 마이크로웰, 자기 입자 및 시편을 포함하는 고형물 표면에 부착되어 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 블로팅 멤브레인 상에서 또는 용액에서 이러한 핵산 분석법이 수행될 수 있다.
[화합물 I-IV의 제조 방법]
본 발명의 화학발광 포스페이트 화합물 I-IV를 제조하는데 유용한 방법 및 중간체가 동시 계류중인 출원 번호 제08/585,090호에 개시 및 구현되어 있다. 이하, 추가적인 방법 및 조건에 대한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
간단히 말하면, 본 발명의 방법은 헤테로사이클 에스테르 또는 티오에스테르 화합물 VIII을 염기와 반응시켜 VIII의 에놀레이트를 형성하는 단계, 상기 에놀레이트를 인산화제와 반응시켜 VIII의 에놀레이트를 인산화시킴으로써, 보호된 에놀 포스페이트 IX를 형성하는 단계, 및 양이온성 종이 탈보호제의 일부가 아닐 경우 양이온성 종 M의 존재하에, IX를 적어도 하나의 탈보호제와 반응시켜 에놀 포스페이트를 탈보호시킴으로써, 에놀 포스페이트 염 화합물 I을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 우선 보호된 에놀 포스페이트 IX는 화합물 VIII의 에놀레이트를 할로겐화 포스포릴 화합물(POW3)과 반응하여 에놀 디할로포스페이트 X를 형성한다. 여기에서, W는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 하나의 할로겐 원자이다. 중간체인 에놀 디할로포스페이트 X는 적어도 2당량의 수산화 화합물 Y-OH와의 반응에 의해, 보호된 에놀 포스페이트 IX로 전환된다. 그런 다음, 포스페이트 트리에스테르 IX는, 양이온성 종이 탈보호제의 일부가 아닐 경우 양이온성 종 M의 존재하에, 적어도 하나의 탈보호제와의 반응에 의해 포스페이트 염 I로 전환된다. 할로겐 W는 염소인 것이 바람직하다. 수산화 화합물 Y-OH로서 작용할 수 있는 화합물의 예로는 메탄올 및 에탄올과 같은 저급 알콜, 3-하이드록시프로피오니트릴(HOCH2CH2CN) 및 2-트리메틸실릴에탄올과 같은 치환된 저급 알콜, 페놀, 치환된 페놀, 벤질 알콜 등과 같은 공지된 알콜을 들 수 있으나, 이들로만 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서는, VIII의 에놀레이트를 보호기 Y를 함유하며 식 W-PO(OY2)를 갖는 인산화제와 반응시킴으로써, 보호된 에놀 포스페이트 IX가 VIII로부터 직접 제조될 수 있다.
상기 인산화제에서 O-Y기의 예로는 OCH3, OCH2CH3등과 같은 알콕시, 시아닌 에톡시(OCH2CH2CN) 또는 트리메틸실릴에톡시(OCH2CH2Si(CH3)3)와 같은 치환된 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 벤질옥시 등과 같이 유기화학자들에게 공지되어 있는 것들을 포함할 수 있다. 두개의 O-Y기는 시약에서 생기는 단일 기로서 상호 결합될 수 있다.
비반응성 유기 용매에서 -90 내지 25℃의 온도하에 에스테르 또는 티오에스테르 화합물 VIII을 강염기와 반응시킴으로써, 에놀레이트가 형성된다. 바람직한 태양에 있어서, 드라이 아이스/아세톤 배쓰(bath)의 온도(통상 -78℃)에서 잠시동안 상기 반응을 수행한 다음, 제2기간 동안 0 내지 25℃까지 온도를 높인다. 적절한 용매는 에놀레이트를 형성하는데 요구되는 강염기와 화합할 수 있으며, 에테르 및 탄화수소 용매를 포함하는 비프로톤성 용매(non-protic solvent)이다. 바람직한 용매는 테트라하이드로퓨란이다. 강염기 및 카르보닐 화합물 VIII은 반응 용기에 어떠한 순서로나 첨가될 수 있다.
인산화 공정은 동일한 용액에서 약 -78℃ 내지 25℃의 온도 범위하에 수행된다. 인산화제인 POW3또는 WPO(OY)2는 반응 용액이 뜨거워지지 않도록 조절하면서 부가된다. 인산화제는 아민 염기를 수반하는 것이 바람직하다. 아민 염기로는 피리딘이 바람직하다.
보호된 에놀 포스페이트 IX를 보호기를 제거시키기에 충분한 양만큼의 탈보호제와 반응시킴으로써, 탈보호 공정이 이루어진다. 이때, 양이온성 종이 탈보호제의 일부가 아닐 경우 양이온성 종 M의 존재하에 탈보호 공정이 이루어진다. 통상적으로 2당량의 탈보호제가 필요하지만, 편의상 탈보호제는 당량비를 초과하여 이용될 수 있다. 어떤 경우에는 보호기가 한번에 제거될 수 있다. 예를 들면, 두개의 Y기가 함께 단일기 -CH2CH2-기를 구성하여 5원자 고리를 형성하는 식 XI의 화합물에 있어서, 첫번째 O-CH2결합은 시아나이드 염 처리에 의해 분해될 수 있다. 그 결과 생성되는 화합물 XII는 다시 염기와 반응되어, 두번째 O-CH2결합을 분해하여 염 I을 생성한다.
탈보호제의 선택은 부분적으로는 제거될 Y기의 성질에 따라 결정된다. 또한, 탈보호제는 비닐 에스테르 또는 비닐 설파이드기의 가수분해와 같은 바람직스럽지 않은 부반응, 또는 헤테로사이클기로의 바람직스럽지 않은 변화를 일으키지 않아야 한다. 바람직한 탈보호제는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 소듐 메톡사이드, 소듐 에톡사이드, 포테슘 t-부톡사이드, 수산화암모늄 등과 같은 유기 및 무기 염기를 포함한다. 바람직한 탈보호제의 다른 예로는 실아나이드 이온, 플루오라이드 이온과 같은 친핵제를 들 수 있다.
본 출원인이 알고 있는 한, Het가 질소나 황-함유 헤테로사이클기인 경우의 화합물 IX, X, XI, XII는 제조된 적이 없다. 산소-함유 락톤 고리가 이중 결합에 부착되어 있는 에놀 포스페이트 에스테르 화합물은 미국 특허 제3,130,203호에 개시되어 있다. 그러나, 상기 화합물은 에스테르나 티오에스테르 에놀레이트의 인산화와 관련된 것이 아니라 다른 공정에 의해 제조되었다.
[실시예]
본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명하기 위하여, 아래에서는 다음과 같은 화학식 I의 화합물의 제조 및 화학발광 반응에 대하여 기술하기로 한다.
R7-R14는 별다른 언급이 없을 경우 수소이다.
화학식 1-13의 화합물 각각 다음과 같은 합성 방법에 의해 제조되었다. 화학식 I의 여러 가지 화합물을 제조하기 위하여, 상술한 합성 방법의 범위내에서 반응 조건에 대한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
[방법 1]
[실시예 1]
[아크리단 유도체 1의 합성]
[화학식 1]
a. 페닐 아크리딘-9-카르복실레이트
아크리딘-9-카르복실산(1g, 4.1mmol)을 티오닐 클로라이드(5㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 감압 상태에서 용매를 제거하여 노란색 고형분을 얻었으며, 얻어진 고형분을 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄(CH2CH2) 및 피리딘(350㎕)에 용해시켰다. 상기 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 페놀(0.78mg, 8.2mmol)의 디클로로메탄 용액을 한방울씩 떨어뜨렸다. 실온에서 밤새도록 반응 혼합물을 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 에틸아세테이트에 다시 용해시킨 다음, 물로 세척하였다. MgSO4를 이용하여 유기층을 건조시킨 다음, 농축시켜 조생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 조생물을 크로마토그래피시켜(30% 에틸 아세테이트/헥산) 노란색 고형분 형태의 순수 생성물을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 7.35-7.57(m, 5H), 7.63-8.37(m, 8H)
b. 페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트
페닐 아크리딘-9-카르복실레이트(530mg, 1.7mmol)을 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄(5㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(1mg, 8.8mmol)을 부가하였다. 실온에서 용액을 밤새도록 교반하여 탁한 노란색의 침전물을 수득하였다. 침전물을 여과하고, 에테르로 세척한 다음, 건조시켜 노란색 결정의 생성물을 얻었다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 5.22(s, 3H), 7.47-7.71(m, 5H), 8.23-9.07(m, 8H)
c. 페닐 10-메틸아크리단-9-카르복실레이트
페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트 (10mg, 0.0216mmol)을 순수 에탄올(10㎖)에 현탁시킨 다음, 혼합물을 15분동안 환류시켜 투명한 용액을 얻었다. 용액에 암모늄 클로라이드(88mg, 1.6mmol)을 조금씩 부가한 다음, 아연(108mg, 1.6mmol)을 부가하였다. 아연을 부가하자 용액의 노란색 칼라가 즉시 사라졌다. 무색의 용액을 2시간 동안 환류시켰다. TLC를 이용하여 반응 혼합물이 비극성 물질로 완전히 전환된 것을 확인하였다. 용액을 여과한 다음, 침전물을 에탄올(3×20㎖)로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 회색을 띤 흰빛의 고형분을 얻었다. 고형분을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 물(2×15㎖)로 세척하였다. Na2SO4를 이용하여 유기층을 건조시킨 다음, 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 30% 에틸:헥산을 이용하여 분취용 TLC(preparative TLC)로서 조생성물을 정제하였다. 순수 생성물을 회색을 띤 흰빛의 고형분으로서 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.38(s, 3H), 5.16(s, 1H), 6.89-7.37(m, 13H);
13C NMR(CDCL3) δ 33.29, 49.72, 112.93, 120.19, 121.36, 125.73, 128.67, 129.16, 129.26, 142.37, 1510.05, 170.22
d. 9-(페녹시포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸-아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
3구 플라스크에 아르곤을 퍼징한 다음, 무수 THF 5㎖ 및 디이소프로필아민(0.04㎖, 0.29mmol)를 충전하였다. 플라스크를 드라이 아이스-아세톤 배쓰에서 냉각시켰다. 상기 용액에 n-부틸 리튬(0.116㎖, 0.29mmol)을 부가하였다. 20분 후, (c) 단계에서 제조된 아크리단 에스테르(70mg, 0.22mmol)이 5㎖ THF에 용해되어 있는 용액을, 상기 용액에 부가한 다음, -78℃에서 30분 동안 교반하였다. POCl3(0.027㎖, 0.29mmol) 및 피리딘(0.023㎖, 0.29mmol)이 THF 3㎖에 용해되어 있는 용액을 부가한 다음, 드라이 아이스 배스를 제거하였다. 45분 후, 피리딘(0.039㎖, 0.58mmol) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(0.094㎖, 1.16mmol)을 부가한 다음, 밤새도록 교반하였다. 그런 다음, 여과하여 얻어진 여과액으로부터 용매를 제거하였다. 분취용 TLC(80% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여 잔류물로부터 순수 생성물을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.35-2.54(m, 4H), 3.47(s, 3H), 3.79-3.90(m, 2H), 3.98-4.08(m, 2H), 6.825-7.45(m, 12H), 7.80-7.83(dd, 1H);
13C NMR(CDCL3) δ 19.12, 19.24, 33.63, 62.19, 62.49, 88.72, 92.82, 112.40, 112.52, 115.83, 116.07, 119.68, 120.44, 120.71, 123.81, 126.69, 128.03, 128.37, 128.58, 130.09, 142.39, 143.06, 165.73, 202.09
e. 9-(페녹시포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(1)
50㎖ 아세톤에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(2.897g, 5.77mmol)을 용해시킨 용액을 아르곤으로 30분 동안 퍼징시켰다. 물 7.5㎖에 수산화나트륨 479mg(12mmol)을 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 용액을 상기 용액에 한방울씩 떨어뜨린 다음, 용액을 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 여과하고, 아르곤-퍼징된 아세톤 50㎖로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켰다. 약간의 물을 함유한 백색 고형분으로서 3.473g의 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 3.326(s, 3H), 6.825-7.45(m, 11H), 7.80-7.83(d, H);
13C NMR(D2O) δ 32.95, 102.86, 102.92, 112.30, 115.85, 120.68, 121.01, 122.35, 122.41, 122.62, 127.48, 127.66, 128.23, 129.66, 143.17, 143.32, 144.66, 156.01;
31P NMR(D2O) δ 0.581(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 2]
[아크리단 유도체 2의 합성]
[화학식 2]
a. 3′,5′-디플루오로페닐 아크리딘-9-카르복실레이트
아크리딘-9-카르복실산(0.25g)을 티오닐 클로라이드 10㎖에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 감압 상태에서 용매를 제거하여 노란색 고형분을 얻었다. 아르곤 분위기에서 고형분을 디클로로메탄 및 피리딘(0.22g)에 용해시켰다. 디클로로메탄에 3,5-디플루오로페놀(0.16g)이 용해되어 있는 용액을, 한방울씩 부가하였다. 용액을 실온에서 밤새도록 교반하고, 디클로로메탄(100㎖)으로 희석시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 농축시켜 생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산)시켜 생성물을 정제하여, 순수 생성물을 크림같은 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 6.84-7.09(m, 3H) 7.67-8.37(m,8H)
b. 3′,5′-디플루오로페닐 10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트
아르곤 분위기에서, (a) 단계에서 얻은 아크리딘 에스테르(0.20g)을 디클로로메탄(5㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(0.472㎖, 7당량)를 부가하였다. 실온에서 용액을 밤새도록 교반하여 탁한 노란색 침전물을 수득하였다. 상기 침전물을 여과하고 에테르로 세척한 다음, 건조하여 생성물을 노란색 결정으로서 얻었다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 5.25(s, 3H), 7.22-7.59(m, 3H), 8.23-9.09(m, 8H)
c. 3′,5′-디플루오로페닐 10-메틸아크리단-9-카르복실레이트
(b) 단계에서 얻은 아크리디늄 에스테르(0.10g)을 빙초산 10㎖에 용해시켜 노란색 용액을 얻었으며, 아연을 부가하자마자 용액이 탈색되었다. 실온에서 5분동안 교반한 후, TLC를 이용하여 반응 혼합물이 비극성 물질임을 확인하였다. 아세트산 상등액을 따라낸 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 유기 용액을 증발시켜 조생성물을 얻었다. 고체 조생성물을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 50㎖씩의 물을 이용하여 2-3회 세척하였다. 실리카 겔을 이용하여, 디클로로메탄을 증발시켜 얻어진 조생성물을 크로마토그래피(20-30% 에틸 아세테이트/헥산)시켜 순수 생성물을 백색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.44(s, 3H), 5.16(s, 1H), 6.49-6.65(m, 3H), 6.99-7.36(m, 8H)
d. 9-(3,5-디메틸페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
3구 플라스크에 아르곤을 퍼징시킨 다음, 무수 THF 4㎖ 및 디이소프로필아민(0.0494㎖, 0.35mmol)을 충전시켰다. 플라스크를 드라이 아이스-아세톤 배쓰에서 냉각시켰다. 상기 용액에, n-부틸리튬(0.141㎖, 0.35mmol)을 부가하였다. 20분 후, (c) 단계에서 얻은 아크리단 에스테르(75mg, 0.2mmol)가 THF 4㎖에 용해되어 있는 용액을, LDA에 한방울씩 떨어뜨렸다. 아르곤-퍼징 THF 4㎖를 이용하여 펀넬을 세척한 다음, 세척된 용액을 반응 용액에 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종적으로, THF 4㎖에 POCl3(0.034㎖, 0.34mmol) 및 피리딘(0.57㎖, 0.35mmol)이 용해되어 있는 용액을 부가하여 갈색 용액을 탈색시켰다. 드라이 아이스 배스를 제거한 다음, 15분 동안 교반을 계속하였다. THF 4㎖에 피리딘(0.095㎖, 1.17mmol) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(0.080㎖, 1.17mmol)이 용해되어 있는 용액을 부가한 다음, 밤새도록 교반하였다. 그런 다음, 여과하여 얻어진 여과액으로부터 용매를 제거하였다. 분취 TLC(55% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여, 잔류물로부터 소량의 순수 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 2.82(m, 4H), 3.51(s, 3H), 4.10-4.31(m, 4H), 6.75-7.93(m, 1H)
e. 9-(3,5-디메틸페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-10-메틸아크리단, 디소듐 염(2)
아이스 배쓰에서 냉각시키면서, 메탄올 5㎖에 (d) 단계로부터 얻은 비스(시아노에틸)포스페이트(5mg, 5.77mmol)가 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 30분간 퍼징시켰다. 물 0.5㎖에 Na2CO36m을 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 용액을 한방울씩 부가한 다음, 아르곤 분위기하에서 용액을 주말기간 동안 교반하였다. 용액을 증발시킨 다음, 진공하에 건조시켜 고형분 화합물(화학식 2)을 얻었다.
1H NMR(D2O) δ 3.34(s, 3H), 6.66-8.09(m, 11H)
[실시예 3]
[아크리단 유도체 3의 합성]
[화학식 3]
a. N-메틸-3-메톡시이사틴(N-methyl-3-methoxyisatin)
아르곤 분위기하에, 디클로로메탄 900㎖에 3-메톡시디페닐아민(250.2g, 1.26mmol)이 용해된 용액을, 디클로로메탄 1ℓ에 옥살일 클로라이드 140㎖(1.6mmol)이 용해되어 있는 뜨거운 용액에 부가하였다. 여기에서, 부가는 2시간에 걸쳐 이루어졌다. 반응에 의해 환류 상태를 유지하기에 충분한 열이 생성되기 때문에, 부가 공정에서는 가열을 중단하였다. 아민을 부가한 후, 환류 온도에서 30분 동안 교반하였다. 그 결과 형성된 갈색 용액을 증발시켜, 과량의 옥살일 클로라이드를 제거하였다. 갈색 고형분을 디클로로메탄 1.8ℓ에 다시 용해시킨 다음, 아르곤으로 퍼징시켰다. 상기 용액에 암모늄 클로라이드(359g, 2.59mol)을 45분에 걸쳐 분할하여 부가하였다. 부가 과정에서, 계속하여 혼합물을 교반하였다. 부가 과정에서 혼합물이 탁해졌으며, 환류 상태로 되었다. 모든 AlCl3가 부가된 후, 1시간 동안 환류 상태를 유지하였다. 진공에서 냉각된 혼합물을 증발시킨 다음, 4kg 아이스, 약 500㎖의 물 및 진한 염산 240㎖를 이용하여 냉각시켰다. 냉각 온도에서 2시간 동안 교반하면서 거무스름한 고형분을 주의깊에 분쇄하여 작은 입자로 제조하였다. 그런 다음, 고형분을 감압 여과한 다음, 8ℓ의 물로 세척하였다. 공기 건조를 통해 하나의 이성질체가 90%를 초과하는 이사틴 이성질체 혼합물인 오렌지색 고형분을 형성하였다.
b. 3-메톡시아크리딘-9-카르복실산
(a) 단계에서 얻은 이사틴 혼합물을 10% KOH 수용액에서 약 40시간 동안 환류시켰다. 용액을 60℃ 미만의 온도로 냉각시킨 다음, 글래스 울을 통하여 480㎖의 진한 염산 및 10ℓ의 냉각수로 이루어진 혼합액으로 여과시키고, 격렬하게 교반하였다. 1시간 후에, 고형분을 감압 여과한 다음, 8ℓ의 물로 세척하였다. 고형분을 밤새도록 공기중에서 건조시킨 다음, 진공하에 건조시켰다.
1H NMR(CD3OD/NaOH) δ 4.062(s, 3H), 7.25-8.18(m, 7H)
c. 페닐 3-메톡시아크리딘-9-카르복실레이트
3-메톡시아크리딘=9-카르복실산(0.50g)을 10㎖ 티오닐 클로라이드(3-10㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 감압 하에서 용매를 제거하여 노란색 고형분을 얻었다. 아르곤 분위기하에 고형분을 디클로로메탄 및 피리딘(0.44g)에 용해시켰다. 디클로로메탄에 2,6-디플루오로페놀(0.32g)이 용해되어 있는 용액을 한방울씩 부가하였다. 실온에서 상기 용액을 밤새도록 교반한 후, 디클로로메탄(100㎖)으로 희석시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. Na2SO4를 이용하여 유기층을 건조시킨 다음, 농축시켜 생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산)시켜 생성물을 정제하여, 크림 상태의 순수 생성물을 수득하였다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 4.08(s, 3H), 7.39-8.29(m, 12H)
d. 페닐 3-메톡시아크리단-9-카르복실레이트
(c) 단계에서 얻은 에스테르 0.85g(2.5mmol)이 에탄올 50㎖에 용해되어 있는 용액을 아르곤-퍼징시킨 현탁액에, 암모늄 클로라이드(3.45g, 64mmol) 및 아연(4.2g, 64mmol)을 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 여과한 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 용액을 증발시켜 백색 고형분을 얻었다. 고형분을 에틸 아세테이트에 다시 용해시킨 다음, 3×25㎖의 물로 세척하였다. 생성물을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.76(s, 3H), 5.29(s, 1H), 6.47-7.36(m, 12H), 821(br s, 1H)
e. 페닐 3-메톡시-10-메틸아크리단-9-카르복실레이트
전 단계에서 얻은 아크리단 화합물(0.77g, 2.3mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(3.8g, 23mmol)을 부가하였다. 밤새도록 교반한 후, 완전한 메틸화가 이루어졌음을 TLC로 확인하였다. 휘발 성분을 증발시킨 다음, 잔류물에 대해 18% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 크로마토그래피를 실시하여 정제하였다. 점착성의 고형분 0.75g을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.41(s, 3H), 3.84(s, 3H), 5.13(s, 1H), 6.52-7.38(m, 12H)
f. (E,Z)-9-(페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-3-메톡시-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
실시예 2d에 기술되어 있는 바와 같은 방법으로 LDA 용액을 제조하였다. -78℃에서 25분 동안 교반한 후, (3e) 단계에서 얻은 아크리단 에스테르(95mg, 0.26mmol)가 THF 4㎖에 용해되어 있는 용액을 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반하였다. THF 4㎖에 POCl3(0.04㎖) 및 피리딘(0.05㎖)이 용해되어 있는 용액을 부가하자, 노란색 용액이 탈색되었다. 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 105분 동안 교반하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, THF 4㎖에 피리딘(0.106㎖) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(0.090㎖)이 용해되어 있는 용액을 처리하였다. 실온에서 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 여과한 다음, 노란색 침전물을 THF로 세척하였다. 반응 용매를 진공에서 증발시켜 얻은 잔류물을 상기 침전물과 합쳤다. 분취 TLC(60% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여 합쳐진 재료로부터 이중결합 이성질체의 혼합물인 소량의 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 2.75-2.82(m, 4H), 3.52(s, 3H), 3.82(s), 3.91(s), 4.00-4.26(m, 4H), 6.47-7.96(m, 12H)
g. (E,Z)-9-(페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-3-메톡시-10-메틸아크릴단, 디소듐 염(3)
3(f) 단계에서 얻은 비스(시아노-에틸)포스페이트를 아르곤으로 퍼징된 메탄올 10㎖에 용해시킨 다음, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 물 1㎖에 Na2CO311mg을 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 용액을 한방울씩 부가한 다음, 용액을 19시간 동안 교반하였다. 메탄올 3㎖를 추가로 부가한 다음, 24시간 동안 교반하여 탈보호 반응을 종료하였다. 용매를 증발시키고, 고형분 화합물(화학식 3)을 디클로메탄으로 세척한 다음, 진공 건조시켰다.
1H NMR(D2O) δ 3.24(s, 3H), 3.66(s), 3.83(s), 6.35-8.07(m, 12H)
[실시예 4]
[아크리단 유도체 4의 합성]
[화학식 4]
a. 3-클로로이사틴
아르곤 분위기 하에, 디클로로메탄 250㎖에 3-클로로디페닐아민(20g, 0.98mol)이 용해되어 있는 용액을, 디클로메탄 150㎖에 옥살일 클로라이드 14.0g(0.11mol)이 용해되어 있는 용액에 부가하였다. 용액을 30분 동안 환류시켰다. 결과 용액을 증발시켜, 여분의 옥살일 클로라이드를 제거하였다. 고형분을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 아르곤으로 퍼징시켰다. 알루미늄 클로라이드(54.48g)을 45분간에 걸쳐 분할하여 상기 용액에 부가하였다. 이때, 혼합물을 지속적으로 교반하였다. 혼합물은 부가 과정에서 탁해지고 환류하기 시작하였다. 모든 AlCl3를 부가한 후, 1시간 동안 환류 상태를 유지하였다. 냉각된 혼합물을 진공에서 증발시킨 다음, 아이스 배쓰에서 1M HCl 900㎖로 냉각시켰다. 고형분을 감압 여과한 다음, 물로 세척하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 6.8-7.8(m, H)
b. 3-클로로아크리딘카르복실산
(a) 단계에서 얻은 이사틴 생성물을 10% KOH 수용액 300㎖에 첨가하여 약 48시간 동안 환류시켰다. 용액을 냉각시킨 다음, HCl을 이용하여 pH 2-3으로 산성화시켰다. 1시간 후에, 노란색 고형분을 감압 여과한 다음, 물로 세척하였다. 고형분을 밤새도록 공기중에서 건조시키고, 디클로로메탄으로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켜, 23.76g의 아크리딘 산을 수득하였다.
1H NMR(DMSO-d6) δ 7.72-8.30(m, H)
c. 2′,6′-디메틸페닐 3-클로로아크리딘카르복실레이트
디클로로메탄 약 100㎖에 2,6-디메틸페놀(2.24g, 1.5당량) 및 피리딘(1.98㎖, 2당량)이 용해되어 있는 용액을 이용하여, 실온에서 질소 분위기 하에 산(3.0g)을 에스테르화시켰다. 용매를 증발시킨 다음, 10-30% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 칼럼크로마토그래피시켜 잔류물을 정제하여, 1-클로로-(소량) 및 3-클로로-이성질체를 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.430(s, H), 7.20-7.28(m, H), 7.60-7.75(m, 3H), 8.28-8.50(m, 4H)
d. 2′,6′-디메틸페닐 3-클로로-10-메틸아크리디늄카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트
이전 단계에서 얻은 아크리딘 화합물(2.47g, 6.7mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(3.8㎖, 5당량)을 부가하였다. 밤새도록 교반한 후에, TLC를 이용하여 메틸화가 완전히 이루어졌음을 확인하였다. 휘발성 성분을 증발시킨 다음, 잔류물에 대해 5% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 크로마토그래피시켜 정제하였다. 디클로로메탄/헥산에 의해 생성물을 재결정하여, 1.7g의 백색 결정을 수득하였다.
e. 2′,6′-디메틸페닐 3-클로로-10-메틸아크리단카르복실레이트
암모늄 클로라이드(2.91g, 64mmol) 및 아연 3.56g(64mmol)을, (c) 단계에서 얻은 에스테르 2.00g(5.4mmol)을 에탄올 50㎖에 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 현탁액에 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 여과한 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 용액을 증발 건조시켜, 백색 고형분을 얻었다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 1.746(s, 6H), 3.400(s, 3H), 5.152(s, 1H), 6.88-7.04(m, 7H), 7.26-7.39(m, 3H)
f. (E,Z)-9-(2,6-디메틸페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-3-클로로-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
(e) 단계에서 얻은 아크리단 에스테르(0.100g, 0.29mmol)을 THF 10㎖에 LDA(0.44mmol)이 용해되어 있는 용액에 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반한 후, THF 4㎖에 POCl3(42㎕) 및 피리딘(47㎕)이 용해되어 있는 용액을 부가하였다. 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 30분 동안 교반하였다. TLC(30% 에틸 아세테이트/헥산)을 이용하여, 출발 물질의 반응이 완전히 이루어졌음을 확인하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, THF 4㎖에 피리딘(117㎕) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(94㎕)이 용해되어 있는 용액으로 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전물을 걸러낸 다음, 반응 용매를 증발시켰다. 분취 TLC(60% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여 잔류물로부터 이성질체 생성물을 분리해냈다.
i1H NMR(CD3OD) δ (1.91(s), 1.95(s), combined 3H), (3.02(s), 2.04(s), combined 3H), 2.69-2.76(m, 4H), (3.52(s), 3.59(s), combined 3H), 4.16-4.34(m, 4H), 6.97-7.65(m, 10H)
g. (E,Z)-9-(2,6-디메틸페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-3-클로로-10-메틸아크리단, 디소듐 염(4)
상기 단계에서 얻은 비스(시아노에틸)포스페이트를 아르곤으로 퍼징된 메탄올 10㎖에 용해시킨 다음, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 물 1㎖에 Na2CO311mg을 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 용액을 한방울씩 부가한 다음, 탈보호 반응이 완전히 이루어질 때까지 아르곤 분위기 하에 용액을 교반하였다. 용매를 증발시키고, 고형분을 디클로로메탄으로 세척한 다음, 진공에서 건조시켜 화합물(화학식 4)을 생성하였다.
[실시예 5]
[아크리단 유도체 5의 합성]
[화학식 5]
a. 9-(페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(70mg, 0.2mmol)을 THF에 LDA(0.24mmol)이 용해되어 있는 용액에 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반한 후, THF 4㎖에 POCl3(25㎕) 및 피리딘(21㎕)이 용해되어 있는 용액을 부가하였다. 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 30분 동안 교반하였다. TLC(30% 에틸 아세테이트/헥산)을 이용하여, 출발 물질의 반응이 완전히 이루어졌음을 확인하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, THF 4㎖에 피리딘(210㎕) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(44㎕)이 용해되어 있는 용액으로 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 걸러낸 다음, 반응 용매를 진공에서 증발시켰다. 분취 TLC(에틸 아세테이트)를 이용하여 잔류물로부터 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.4-2.6(m, 4H), 3.521(s, 3H), 3.8-4(m, 2H), 4.0-4.1(m, 2H), 6.9-7.2(m, 4H), 7.22-7.5(m, 7H), 7.75-8(dd, 2H)
b. 9-(페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(5)
아세톤 50㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(0.59g. 1.21mmol)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 30분 동안 퍼징시켰다. 물 10㎖에 수산화나트륨 104mg(2.6mmol)을 용해하여 아르곤으로 퍼징시킨 용액을 한방울씩 부가한 다음, 용액을 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과하고, 아르곤으로 퍼징된 아세톤 5㎖로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켰다. 소량의 아세톤을 함유하고 있는 노란색 계통의 고형분으로서 화합물(화학식 5) 0.50g을 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 3.36(s, 3H), 6.9-7.4(m, 1H), 7.75-7.8(d, 1H), 8.2-8.22(d, H);
31P NMR(D2O) δ 1.85(HP3O4를 외부 표본으로 이용)
[실시예 6]
벤즈[씨]아크리단(benz[c]acridan) 유도체 6의 합성
[화학식 6]
a. 벤즈[씨]아크리딘-7-카르복실산
아르곤 분위기하에, 옥살일 클로라이드 4.8㎖(55mmol)를 이용하여 CS225㎖에 용해되어 있는 1-나프틸-페닐아민(10g, 46mmol)을 환류시켰다. 결과로 얻어지는 갈색 용액을 증발시켜 과량의 옥살일 클로라이드를 제거하였다. 갈색 고형분을 CS260㎖에 용해시킨 다음, 아르곤으로 퍼징시켰다. AlCl3(21.47g, 160mmol)을 분할하여 상기 용액에 부가하였다. 이때, 혼합액을 계속하여 교반하였다. 혼합액이 부가 과정에서 탁해지고 환류하기 시작하였다. 모든 AlCl3를 부가한 후, 2시간 동안 환류시켰다. 냉각된 혼합액을 진공에서 증발시킨 다음, 1M, HCl 및 아이스를 이용하여 냉각시켰다. 거무스름한 고형분을 주의깊게 분쇄하여 작은 입자를 만든 다음, 고형분을 감압 여과해낸 후, 물로 세척하였다.
이사틴 생성물을 10% KOH 수용액에서 밤새도록 환류시켰다. 용액을 60℃ 밑으로 냉각시킨 다음, 6M HCl 및 아이스를 이용하여 중화시켰다. 고형분을 감압 여과해내고, 물로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켰다.
1H NMR(DMSO-d6) δ 7.80-8.13(M, 8H), 8.36-8.39(d, H), 9.38-9.40(m, 1H)
b. 페닐 벤즈[씨]아크리딘-7-카르복실레이트
벤즈[씨]아크리딘-7-카르복실산(6.0g)을 75㎖의 티오닐 클로라이드(3-10㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 4시간 동안 환류시켰다. 감압하에 용매를 제거한 다음, 생성물을 디클로로메탄 75㎖에 용해시켰다. 피리딘(8.9㎖) 및 페놀(2.27g)을 부가한 다음, 아르곤 분위기하에 실온에서 3일 동안 용액을 교반하였다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(50% 디클로로메탄/헥산)시켜 정제함으로써, 순수한 생성물 3.05g을 옅은 갈색 고형물로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 7.40(t, 1H), 7.48-74.59(m, 4H), 7.71-8.01(m, 7H), 8.259(d, 1H, J=7.8Hz), 8.465(d, 1H, J=7.8Hz), 9.54-9.57(m, 1H)
c. 페닐 벤즈[씨]아크리딘-7-카르복실레이트
(b) 단계에서 얻은 에스테르 1.0g을 에탄올에 현탁시킨 다음, 아르곤으로 퍼징시킨 현탁액에, 암모늄 클로라이드(10g) 및 아연(10g)을 부가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 여과한 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 증발 건조시켜 백색 고형분을 생성하였다. 고형분을 에틸 아세테이트에 용해시킨 다음, 3×25㎖ 물로 세척하였다. 10% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 크로마토그래피시킴으로써, 생성물을 정제해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 5.48(s, 1H), 5.69-7.27(m, 9H), 7.41-7.55(m, 5H), 7.83-7.88(m, 2H)
d. 페닐 12-메틸벤즈[씨]아크리단-7-카르복실레이트
이전 단계에서 얻은 아크리단 화합물(0.70g)을 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(2.3㎖)를 부가하였다. 밤새도록 교반한 후, TLC를 이용하여 메틸화가 완전히 이루어졌음을 확인하였다. 휘발성분을 증발시킨 다음, 5% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 크로마토그래피시킴으로써 잔류물을 정제하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.75(s, 3H), 5.21(s, 1H), 6.92-6.94(d, 2H), 7.09-7.62(m, 11H), 7.86-7.89(dd, 1H), 8.23-8.26(D, 1H);
13C NMR(CDCl3) δ 45.07, 49.99, 120.01, 121.23, 122.66, 123.51, 124.69, 125.30, 125.45, 125.84, 126.33, 126.97, 128.39, 128.64, 129.36, 134.89, 141.20, 147.09, 151.00, 170.89
e. (E,Z)-9-(페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-12-메틸벤즈[씨]아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
상술한 바와 같은 방법으로 LDA 용액을 제조하였다. -78℃에서 25분 동안 교반한 후, THF에 벤즈아크리단 에스테르(0.30g)이 용해되어 있는 용액을 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반하였다. THF에 POCl3(0.123㎖) 및 피리딘(0.107㎖)이 용해되어 있는 용액을 부가하였으며, 이때 진한 적색 용액이 오렌지색으로 변했다. 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 1시간 동안 교반하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, THF에 피리딘(0.123㎖) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(0.180㎖)이 용해되어 있는 용액으로 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 반응 혼합물을 여과한 다음, 침전물을 THF로 세척하였다. 반응 용매를 진공에서 증발시킨 다음, 잔류물을 상기 침전물과 합쳤다. 이것에 대해 분취 TLC(60% 에틸 아세테이트/헥산)를 실시하여, 이중 결합 이성질체의 혼합물로서 소량의 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.44-2.52(m, 4H), 3.81-4.10(m, 7H), 6.89-8.24(m, 15H)
f. (E,Z)-9(페녹시)포스포릴옥시메틸리덴-12-메틸벤즈[씨]아크리단, 디소듐 염(6)
상기 단계에서 얻은 비스(시아노에틸)포스페이트를 아르곤으로 퍼징시킨 아세톤 10ℓ에 용해시킨 다음, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 아르곤으로 퍼징된 용액(2M NaOH 수용액 0.1㎖)을 한방울씩 부가한 다음, 상기 용액을 아르곤 분위기 하에 밤새도록 교반하였다. 고형분을 여과한 다음, 생성 화합물(화학식 6)을 아세톤으로 세척한 후, 건조시켰다.
1H NMR(D2O) δ 3.52(s, 3H), 6.85-6.90(t, 1H), 7.03-7.06(d, 2H), 7.15-7.23(m, 3H), 7.33-7.48(m, 5H), 7.72-7.75(d, 1H), 7.87-7.89(d, 1H), 8.10-8.17(t, 2H)
[실시예 7]
[아크리단 유도체 7의 합성]
[화학식 7]
a. 4′-플루오로페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트
아크리딘-9-카르복실산(10g, 45mmol)을 티오닐 클로라이드(약 100㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 감압 상태에서 용매를 제거하여 노란색 고형분을 얻었다. 아르곤 분위기 하에서 고형분을 디클로로메탄 100ℓ에 용해시켰다. 4-플루오로티오페놀(5.25㎖, 49mmol)을 부가한 다음, 30㎖ 피리딘을 부가하였다. 반응 혼합물이 적색을 띤 갈색으로 변했으며, 거의 환류상태까지 데워졌다. 실온에서 아르곤 분위기하에 2일 동안 혼합물을 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 헥산 80㎖로 세척한 다음, 총 1ℓ의 물로 세척하였다. 잔류하는 고형분을 디클로로메탄 300㎖에 용해시킨 다음, Na2SO4/실리카 겔/Na2SO4의 플러그를 통과시켰다. 티오에테르를 노란색 고형분으로서 얻었다(11.55g).
1H NMR(CDCl3) δ 7.20(t, 2H), 7.60-7.68(m, 4H), 7.80-7.88(m, 2H), 8.129(d, 2H), 8.278(d, 2H)
b. 4′-플루오로페닐 10-메틸아크리디늄-9-티오카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트
아르곤 분위기 하에, 4′-플루오로페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트(11.36g, 34mmol)을 디클로로메탄(100㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(20㎖)를 부가하였다. 용액이 갈색으로 변했으며, 노란색 침전물이 생성되었다. 2일 후, 침전물을 여과하여 디클로로메탄 50㎖ 및 헥산 50㎖로 세척한 다음, 건조시켜, 생성물을 노란색 고형분으로서 얻었다(15.3g).
1H NMR(DMSO-d6) δ 4.93(s, 3H), 7.53(t, 2H), 7.97-8.37(m, 2H), 8.14(t, 2H), 8.54(t, 2H), 8.61(d, 2H), 8.92(d, 2H)
c. 4′-플루오로페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트
실내를 소등한 상태에서, 4′-플루오로페닐 10-메틸-아크리디늄-9-티오카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트(15.05g, 30mmol)을 2-프로판올(150㎖) 및 아세트산 2.1㎖에 현탁시켰다.
용액을 아르곤으로 30분 동안 퍼징시킨 다음, 아연 분말 10.0g을 부가하였다. 아연을 부가할 때, 용액의 노란색이 몇 분 이내에 사라졌다. 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 혼합물을 여과한 다음, 고형분을 2-프로판올로 세척한 후, 헥산으로 세척하였다. 잔류하는 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. TLC 분석에서 생성물이 두가지 용액에 용해되는 것으로 나타났기 때문에, 여과액들을 농축 및 합하여 갈색 고형분을 얻었다. 고형분을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 디클로로메탄을 용출용매로 이용하여 Na2SO4/실리카 겔/Na2SO4의 플러그를 통과시켰다. 에스테르 교환반응에 의해, 예상되는 아크리단 티오에스테르 및 아크리단 이소프로필 에스테르의 혼합물을 얻었다. 칼럼 크로마토그래피(50% 디클로로메탄:헥산)에 의해 두가지의 생성물을 분리해냈다. 그 하나가 백색 고형물 형태의 순수 아크리단 티오 에스테르 생성물(2.5g)이며, 나머지 하나는 이소프로필 에스테르와의 혼합물로서 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.45(s, 3H), 5.08(s, 1H), 6.94-7.06(m, 6H), 7.17-7.24(m, 2H), 7.31-7.39(m, 4H)
d. 9-(4-플루오로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
실내를 소등한 상태에서, 무수 THF 10㎖에 4-플루오로페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(1.00g, 2.87mmol))가 용해되어 있는 용액을, THF에 LDA가 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 60분 동안 교반한 후, 노란색 용액을 THF 10㎖에 PCCl3(0.79g) 및 피리딘(3.0㎖)이 용해되어 있는 용액으로 25분간에 걸쳐 처리하였다. 1시간 후, 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 2시간 동안 교반하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시키고, 3-하이드록시프로피오니트릴(0.71㎖)로 처리한 다음, 부가 완료 후 아이스 배쓰를 제거하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl를 여과해낸 다음, THF 50㎖로 세척하였다. 여과액을 진공에서 증발시켰다. 50-100% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피시켜, 잔류물로부터 0.658g의 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.44-2.64(m, 4H), 3.49(s, 3H), 3.86-4.16(m, 4H), 6.92-7.15(m, 6H), 7.26-7.46(m, 4H), 7.786(d, 1H), 7.906(d, 1H);
31P NMR(CDCl3) δ -9.49(p)(H3PO3를 외부 표준으로 이용)
e. 9-(4-플루오로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(7)
실내를 소등한 상태에서, 아세톤 20㎖에 비스(시아노에틸)포스페이트 화합물(0.658g)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 30분 동안 퍼징시켰다. 물 4.0㎖에 수산화나트륨 116.5mg이 용해되어 있는 용액을 부가한 다음, 용액을 아르곤 분위기하에 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과하고, 아세톤 100㎖로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켰다. 여과액중에 형성되어 있는 고형분을 여과시켜 얻어진 고형분과 혼합하였다. 옅은 노란색 고형분으로서 화합물(화학식 7) 0.545g을 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 3.16(s, 3H), 6.80-6.98(m, 4H), 7.06-7.14(m, 4H), 7.21(t, 1H), 7.32(t, 1H), 7.78(d, 1H), 8.19(d, 1H);
31P NMR(D2O) δ 1.22(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 8]
[아크리단 유도체 8의 합성]
[화학식 8]
a. 4′-메톡시페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트
상술한 바와 같이 제조된 아크리딘-9-카르보닐 클로라이드(2.0g)를, 디클로로메탄 20㎖에 용해시켰다. 4-메톡시티오페놀(1.27g)을 한방울씩 부가한 다음, 피리딘 1.96g을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3.5일 동안 교반하였다. 침전물을 수거하여 물로 세척한 다음, 건조시켜 제1생성물을 얻었다. 디클로로메탄 용액을 3×50㎖ 물로 세척하고, 건조시킨 다음, 증발시켜 조생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(에틸 아세테이트)시켜, 조생성물로부터 순수한 제2생성물을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.86(s, 3H), 7.01(d, 1H), 7.56(d, 2H), 7.62-8.28(m, 8H)
b. 4′-메톡시페닐 아크리단-9-티오카르복실레이트
메톡시페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트(2.0g)을 2-프로판올(150㎖)에 현탁시켰다. 암모늄 클로라이드(7.35g)를 분할하여 상기 용액에 부가한 다음, 아연(8.9g)을 부가하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 3시간 동안 데웠다. TLC를 이용하여, 반응 혼합물의 출발 물질이 완전히 소비되었음을 확인하였다. 용액을 여과한 다음, 침전물을 디클로로메탄으로 세척하였다. 여과액 및 세척액을 농축시켜, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. 유기층을 건조, 농축시켜, 소량의 아크리단 이소프로필 에스테르를 함유한 생성물을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.74(s, 3H), 5,19(s, 1H), 6.29(br s, 1H), 6.75-7.31(m, 12H)
c. 4′-메톡시페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트 트리플루오로메탄설포네이트
4′-메톡시페닐 아크리단-9-티오카르복실레이트(1.8g)을 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(6.3g)을 부가하였다. 실온에서 밤새도록 용액을 교반하여 메틸화 반응을 종료하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 다음, 칼럼 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산)시켜 잔류물에서 생성물 1.08g을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.45(s, 3H), 3.76(s, 3H), 5.07(br s, 1H), 6.81-7.36(m, 12H)
d. 9-(4-메톡시페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
THF 10㎖에 4-메톡시페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(700mg)이 용해되어 있는 용액을, THF 10㎖에 LDA(1.4당량)이 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, THF 4㎖에 POCl3(520mg) 및 피리딘(1.64g)이 용해되어 있는 용액을 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반을 계속한 후, 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 다시 냉각시킨 다음, 피리딘(1㎖) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(0.86㎖)을 한방울씩 부가하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 여과해낸 다음, 반응 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 취한 다음, 물(3×25㎖)로 세척하였다. 유기 용액을 건조 및 농축시킨 다음, 칼럼 크로마토그래피(300-100% 에틸 아세테이트/헥산)시켜 조생성물로부터 옅은 노란색 고형분으로서 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.44-2.62(m, 4H), 3.51(s, 3H), 3.82(s, 3H), 3.88-4.11(m, 4H), 6.53-7.41(m, 10H), 7.84-7.91(m, 2H);
31P NMR(CDCl3) δ -9.63(p)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
e. 9-(4-메톡시페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(8)
아세톤 11㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(0.42g)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 퍼징시켰다. 2.5M 수산화나트륨 수용액을 0.614㎕ 취하여 한방울씩 부가한 다음, 아르곤 분위기 하에 용액을 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과한 다음, 공기중에서 건조시켜, 정량할 수 있는 정도의 화학식 8로 표시되는 화합물을 옅은 노란색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 3.32(s, 3H), 3.70(s, 3H), 6.69-7.33(s, 10H), 7.80(d, 1H), 8.18(d, 1H)
[실시예 9]
[아크리단 유도체 9의 합성]
[화학식 9]
a. 2′,6′-디메틸페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트
아크리딘-9-카르복실산(2g)을 티오닐 클로라이드(25㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 환류시켰다. 감압 상태에서 용매를 제거하여 고형분을 제거하였다. 고형분을 디클로로메탄 50㎖에 용해시켰다. 얻어진 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 2,6-디메틸-티오페놀(1.22g)을 한방울씩 부가한 후, 피리딘 3.6㎖를 부가하였다. 적색을 띤 갈색 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시킨 다음, 3×50㎖ 물로 세척하였다. 유기층을 건조 및 농축시킨 다음, 오렌지색 생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(에틸 아세테이트)시켜, 오렌지색 생성물로부터 2.5g의 순수 생성물을 회색을 띤 흰빛의 고형분을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.68(s, 6H), 7.30-7.41(m, 3H), 7.63-8.31(m, 8H)
b. 2′,6′-디메틸페닐 아크리단-9-티오카르복실레이트
2′,6′-디메틸페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트(2.46g)을 2-프로판올(200㎖)에 현탁시켰다. 암모늄 클로라이드(9.5g)을 상기 용액에 분할하여 부가한 다음, 아연(11.65g)을 부가하였다. 용액을 2시간 동안 데웠다. TLC를 이용하여, 반응 혼합물의 출발물질이 완전히 소비되었음을 확인하였다. 용액을 여과한 다음, 침전물을 디클로로메탄으로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 백색 고형분을 얻었다. 고형분을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. Na2SO4를 이용하여 유기층을 건조, 농축시켜 2.46g의 생성물을 백색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.08(s, 6H), 5.24(s, 1H), 6.27(br s, 1H), 6.78-7.31(m, 11H)
c. 2′,6′-디메틸페닐 10-메틸아크리단티오카르복실레이트
2′,6′-디메틸페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(2.0g)을 아르곤 분기하에 디클로로메탄 30㎖에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(6.6㎖)를 부가하였다. 용액을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 증발건조시킨 다음, 칼럼 크로마토그래피(디클로로메탄)시켜 조생성물을 정제하여, 1.85g의 생성물을 백색 고형분으로서 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.09(s, 6H), 3.46(s, 3H), 5.09(s, 1H), 6.97-7.36(m, 11H)
d. 9-(2,6-디메틸페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
THF 12㎖에 2′,6′-디메틸페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(700mg)이 용해되어 있는 용액을, THF 10㎖에 LDA(1.4당량)이 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 부가하였다. 오렌지색 용액을 -78℃에서 60분 동안 교반하였다. THF 4㎖에 POCl3(280㎕) 및 피리딘(1.57㎖)이 용해되어 있는 용액을 한방울씩 부가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 드라이 아이스 배쓰를 제거하였다. 60분동안 교반을 계속하였다. TLC(30% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여, 출발 물질의 대부분이 반응되었음을 확인하였다.
용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 피리딘(1.0㎖) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(66㎕)로 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 여과한 다음, THF로 세척하였다. 유기 용액을 진공에서 증발시켰다. 유기층을 건조, 농축시켜 오렌지색 생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(에틸 아세테이트)시킴으로써, 오렌지색 생성물로부터 80mg의 순수 생성물을 노란색 오일로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.34-2.43(m, 4H), 2.47(s, 6H), 3.47(s, 3H), 3.42-3.71(m, 4H), 7.01-8.07(m, 11H);
31P NMR(CDCl3) δ -10.207(p)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
e. 9-(2,6-디메틸페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(9)
아세톤 6㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(0.80g)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 퍼징시켰다. 1M 수산화나트륨 수용액(293㎕)을 한방울씩 부가하고, 물 300㎕를 부가한 다음, 아르곤 분위기 하에 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과하고, 아세톤으로 세척하 다음, 공기중에서 건조시켰다. 0.60g의 화합물(화학식 9)을 백색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 2.13(s, 6H), 3.19(s, 3H), 6.60-8.19(m, 11H);
31P NMR(D2O) δ -1.653(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 10]
[아크리단 유도체 10의 합성]
[화학식 10]
a. 4-플루오로아세트아닐리드
4-플루오로아닐린(20g)을 아세트산 25㎖에 용해시킨 다음, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 아세트산 무수물(25㎖)을 상기 교반된 용액에 5㎖씩 부가하였다. 결과 용액을 냉각수 200㎖에 쏟아부은 다음, 침전된 생성물을 여과해냈다. 고형분을 물로 세척한 다음, 진공 건조시켰다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.175(s, 3H), 7.014(t, 2H), 7.15(br s, 1H), 7.43-7.48(m, 2H)
b. 4,4′-디플루오로디페닐아민
K2CO311.08g 및 CuI 1.61g 존재하에 190℃에서 4-플루오로아세트아닐리드(12.0g)을 1-브로모-4-플루오로벤젠(21㎖)와 90시간 동안 축합반응시켰다. 냉각후, 혼합물을 여과한 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 유기 용액을 진공에서 증발시켜 약 20g의 거무스름한 갈색 액체를 생성하였다. 갈색 액체를 에탄올 100㎖에 용해시킨 다음, KOH 9g과 함께 24시간 동안 환류시켰다. 에탄올을 증발시키고, 거무스름한 잔류물을 에테르에 취한 다음, 물(3×100㎖)로 세척하였다. 에테르 용액을 농축시켜 조생성물을 얻었다. 15% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하는 실리카 칼럼 크로마토그래피시켜 조생성물을 정제하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 5.46(br s, 1H), 6.947(s, 4H), 6.97(s, 4H),
13C NMR(CDCl3) δ 115.86, 116.16, 119.38, 119.47
c. 2,7-디플루오로아크리딘-9-카르복실산
아르곤 분위기하에, 디클로로메탄 50㎖에 4,4′-디플루오로페닐아민(5.4g)이 용해되어 있는 용액을, 디클로로메탄 30㎖에 옥살일 클로라이드 2.52㎖(0.11mol)이 용해되어 있는 용액에 환류 상태를 유지하기 위한 속도로 부가하였다. 혼합물을 35분 동안 더 환류시켰다. 결과 용액을 증발시켜 과량의 옥살일 클로라이드를 제거하였다. 고형분을 디클로로메탄 75㎖에 다시 용해시킨 다음, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 플라스크를 아르곤으로 퍼징시킨 다음, AlCl3(14.28g)를 분할하여 부가하였다. 이때, 혼합물을 계속하여 교반하였다. 혼합물이 부가 과정에서 탁해지고 환류하기 시작했다. 모든 AlCl3를 부간한 후에, 환류 상태를 1시간 동안 더 유지하였다. 냉각된 혼합물을 진공에서 증발시킨 다음, 3:1 아이스/5M HCl 300㎖로 급냉시켰다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 오렌지색 고형분(이사틴)을 감압 여과한 다음, 물로 세척하였다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 6.92-6.97(m, 1H), 7.35-7.61(m, 6H)
10% KOH 수용액 110㎖에서 이사틴 생성물을 밤새도록 환류시켰다. 거무스름한 녹색 혼합물을 냉각시킨 다음, 1:1 아이스/5M HCl 400㎖로 산성화시켰다. 고형분을 물로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켜 아크리딘산을 수득하였다.
1H NMR(DMSO-d6) δ 7.81-7.94(m, 4H), 8.31-8.36(m, 2H)
d. 페닐 2,7-디플루오로아크리딘-9-티오카르복실레이트
디플루오로아크리딘-9-카르복실산(1.0g)을 SOCl2(5㎖)에 현탁시킨 다음, 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 감압 상태에서 용매를 제거하여 갈색 고형분을 얻었다. 아르곤 분위기 하에, 갈색 고형분을 디클로로메탄 20㎖에 용해시켰다. 티오페놀(468mg)을 부가한 다음, 피리딘(2㎖)를 부가하였다. 실온에서 밤새도록 반응 혼합물을 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. MgSO4를 이용하여 유기층을 건조, 농축시켜 조생성물을 얻었다. 실리카 겔을 이용하여 크로마토그래피(40% 에틸 아세테이트/헥산)시켜, 조생성물로부터 1.2g의 순수 생성물을 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 7.52-7.75(m, 9H), 8.26-8.30(m, 2H)
e. 페닐 2,7-디플루오로아크리단-9-티오카르복실레이트
페닐 2,7-디플루오로아크리딘-9-티오카르복실레이트(1.2g)을 암모늄 클로라이드(4.57g)와 함께 2-프로판올(125㎖)에 현탁시켰다. 아연(5.5g)을 부가한 다음, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 데운 후, 실온에서 1.5시간 동안 방치하였다. TLC를 이용하여, 반응 혼합물이 새로운 물질로 완전히 전환되었음을 확인하였다. 용액을 여과한 다음, 침전물을 디클로로메탄으로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 얻어진 옅은 오렌지색 잔류물을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 물(2×100㎖)로 세척하였다. Na2SO4를 이용하여, 유기층을 건조, 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 조생성물을 추가 정제 없이 이용하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 5.12(s, 1H), 6.19(br s, 1H), 6.72-7.35(m, 11H)
f. 페닐 2,7-디플루오로-10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트
페닐 2,7-디플루오로아크리단-9-티오카르복실레이트(1.4g)을 아르곤 분위기하에 디클로로메탄(50㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플루오로메탄설포네이트(5.29g)를 부가하였다. 실온에서 밤새도록 용액을 교반하였다. TLC를 이용하여 전환율이 50%임을 확인한 다음, 메틸 트리플레이트 2㎖를 부가한 후, 40시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 농축시킨 다음, 20-50% 디클로메탄/헥산을 이용하여 크로마토그래피를 실시하여, 잔류물로부터 미량의 아크리단카르복실레이트의 이소프로필 에스테르를 부산물로서 함유하는 생성물을 얻었다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 3.41(s, 3H), 4.98(s, 1H), 6.89-7.34(m, 11H)
g. 9-(페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-2,7-디플루오로-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
페닐 2,7-디플루오로-10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(500mg, 1.3mmol)을, THF에 LDA(1.4mmol)이 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 부가하였다. 1시간 동안 교반한 후, THF 4㎖에 POCl3(313mg) 및 피리딘(1.07g)이 용해되어 있는 용액을 부가한 다음, 반응 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 유지하였다. 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 1시간 동안 교반을 계속하였다.
용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, THF 4㎖에 피리딘 및 3-하이드록시프로피오니트릴(484mg)이 용해되어 있는 용액을 한방울씩 떨어뜨리면서 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 여과해낸 다음, 반응 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 취한 다음, 4×25㎖ 물로 세척하였다. 에틸 아세테이트를 건조 및 증발시킨 다음, 크로마토그래피(75-80% 에틸 아세테이트/헥산)를 이용하여 잔류물로부터 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.48-2.65(m, 4H), 3.48(s, 3H), 4.02-4.16(m, 4H), 6.91-7.66(m, 11H);
31P NMR(CDCl3) δ 9.874(p)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
h. 9-(페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-2,7-디플루오로-10-메틸아크리단, 디소듐 염(10)
아세톤 17㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(0.28g)이 용해되어 있는 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 아르곤으로 퍼징시켰다. 수산화나트륨 수용액(1N) 1.02㎖를 한방울씩 부가한 다음, 아르곤 분위기 하에 16시간 동안 교반하였다. 형성되어 있는 침전물을 감압 여과하고, 아세톤으로 세척한 다음, 진공 건조하였다. 0.236g의 화합물(화학식 10)을 회색을 띤 흰색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(D2O) δ 3.28(s, 3H), 6.78-8.21(m, 11H);
31P NMR(D2O) δ 1,006(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 11]
[아크리단 11의 합성]
[화학식 11]
a. 2′,2′,2′-트리플루오로에틸 아크리딘-9-티오카르복실레이트
상술한 바와 같은 방법으로 제조된 아크리딘-9-카르보닐 클로라이드(1.89g)을 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄 302㎖에 용해시켰다. 얻어진 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 2,2,2-트리플루오로에탄티올(1.0)을 한방울씩 부가한 다음, 3.23g의 피리딘을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 물(20㎖)을 부가한 다음, 잔류하는 침전물을 여과하여 폐기하였다. 디클로로메탄 용액을 3×25㎖ 물로 세척하고, 건조 및 증발시켜 생성물을 회색을 띤 흰색 고형분으로서 얻었다. 생성물은 다음 반응에 사용되기에 충분한 정도로 순수했다.
1H NMR(CDCl3) δ 4.02-4.10(q, 2H), 7.61-8.31(m, 8H)
b. 2′,2′,2′-트리플루오로에틸 아크리단-9-티오카르복실레이트
2′,2′,2′-트리플루오로에틸 아크리딘-9-티오카르복실레이트(1.7g)을 암모늄 클로라이드(7.08g)와 함께 2-프로판올(150㎖)에 현탁시켰다. 아연(8.16g)을 부가한 다음, 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 교반하였다. TLC를 이용하여, 반응 혼합물이 새로운 물질로 완전히 전환되었음을 확인하였다. 용액을 여과한 다음, 침전물을 디클로로메탄으로 세척하였다. 여과액을 농축시켜 얻어진 옅은 오렌지색 잔류물을 디클로로메탄에 다시 용해시킨 다음, 물(3×50㎖)로 세척하였다. 유기층을 건조, 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 조생성물은 다음 반응에서 사용되기에 충분한 정도로 순수했다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.37-3.47(q, 2H), 5.206(s, 1H), 6.27(br s, 1H), 6.78-7.27(m, 8H)
c. 2′,2′,2′-트리플루오로에틸 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트
2′,2′,2′-트리플루오로에틸 아크리단-9-티오카르복실레이트(1.66g)을 아르곤 분위기하에 디클로로메탄(20㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(4.06㎖)를 부가하였다. 갈색 용액을 실온에서 1.5일 동안 교반하였다. 디클로로메탄을 농축시킨 후, 50% 디클로로메탄/헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피시킴으로써, 조생성물을 정제하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.39-3.43(q, 2H), 3.43(s, 3H), 5.04(s, 1H), 6.98-7.38(m, 8H)
d. 9-(2′,2′,2′-트리플루오로에틸티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
THF 10㎖에 2′,2′,2′-트리플루오로에틸 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(300mg)가 용해되어 있는 용액을, THF 10㎖에 LDA(1.4당량)가 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 60분 동안 교반한 후, THF 4㎖에 POCl3(239mg) 및 피리딘(703mg)가 용해되어 있는 용액을 천천히 부가하였다. 30분 후, 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 60분 동안 교반을 계속하였다. 용액을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 피리딘(㎕) 및 3-하이드록시프로피오니트릴(395㎕)로 처리하여, 갈색을 띤 노란색 침전물이 형성되었다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전물을 여과해낸 다음, 반응 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 취하여, 5×25㎖ 물로 세척한 다음, 건조 및 농축시켰다. 디클로로메탄을 먼저 칼럼에 흘려준 다음, 용출 용매를 60-100% 에틸 아세테이트/헥산으로 바꾸어 농도구배법으로 크로마토그래피시킴으로써 조생성물을 분리해냈다. 서로 근접하여 용출되는 두 종류의 분획을 분리하였는데 느리게 용출되는 생성물이 소량 성분이었다. 25% 에틸 아세테이트/헥산을 이용한 분취 TLC에 의해 각각의 분획을 추가로 정제하여 분리해냈다. 느리게 용출되는 성분은, 예상된 바와 같은 비스(시아노에틸)포스페이트 에스테르임이 증명되었다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.69(t, 4H), 3.41-3.54(q, 2H), 3.49(s, 3H), 4.04-4.24(m, 4H), 7.04-7.95(m, 8H);
31P NMR(CDCl3) -8.66(p)
동핵 및 이핵 디커플링 실험(homonuclear and heteronuclear decoupling experiment)뿐만 아니라1H NMR,13C NMR,19F NMR 및31P NMR에 의해, 다른 생성물은, SCH2CF3기로부터 HF의 제거 및 에놀레이트의 인산화에 의해 유도되는 9-(2′,2′-디플루오로에테닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르임이 확인되었다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.60-2.76(m, 4H), 3.49(s, 3H), 4.02-4.26(m, 4H), 5.17(d, 1H), 7.03-7.88(m, 8H);
19F NMR(CDCl3) δ -76.76(d, J=Hz), -78.88(t, J=Hz);
31P NMR(CDCl3) δ -8.83(p)
δ 5.17에서의 더블렛 피크가1H NMR 스펙트럼에서 어떠한 신호에도 영향을 미치지 않는다. δ 4.02-4.26에서의 멀티플렛 피크로 인해, δ 2.60-2.76에서의 멀티플렛이 붕괴되어 싱글렛으로 되고 인 신호가 붕괴되어 싱글렛으로 된다.1H NMR 스펙트럼에서 δ 5.17에서의 더블렛 피크로 인해,19F NMR 스펙트럼에서의 트리플렛 피크가 붕괴되어 더블렛 피크로 된다.
e. 9-(2′,2′,2′-트리플루오로에틸티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(11)
아세톤 4㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(15mg)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 퍼징시켰다. 수산화나트륨 수용액(1m) 58㎕를 한방울씩 부가한 다음, 물 100㎕를 더 부가한 후, 아르곤 분위기 하에 밤새도록 용액을 교반하였다. TLC를 이용하여, 탈보호 반응이 완료되었음을 확인하였다. 혼합물을 농축건조시켜, 회색을 띤 흰 빛의 고형분을 얻었다. 고형분을 20% 디클로로메탄/아세톤으로 세척한 다음, 공기중에서 건조시켰다.
1H NMR(D2O) δ 3.399(s, 3H), 3.45-3.61(m, 2H), 7.04-8.18(m, 8H)
31P NMR(D2O) δ 1.465(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 12]
[아크리단 유도체 12의 합성]
[화학식 12]
a. 4′-클로로페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트
4-클로로-티오페닐(4.75g) 및 아크리딘-9-카르보닐 클로라이드(7.22g)을 디클로로메탄 100㎖에 용해시킨 다음, 피리딘 12.1㎖를 부가하였다. 반응 혼합물이 오렌지색을 띤 갈색으로 변했다. 아르곤 분위기 하에 실온에서 반응 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 고형분을 헥산 100㎖로 세척한 다음, 여과하였다. 그런 다음, 물 500㎖로 세척하고, 여과한 다음, 공기중에서 건조시켰다. 티오에스테르를 옅은 갈색을 띤 노란색 고형분으로서 얻었다(8.71g).
1H NMR(CDCl3) δ 7.47-7.50(m, 2H), 7.58-7.67(m, 4H), 7.81-7.86(m, 2H), 8.12(d, 2H), 8.29(d, 2H),
. 4′-클로로페닐 아크리단-9-티오카르복실레이트
4′-클로로페닐 아크리딘-9-티오카르복실레이트(2.0g)을 디클로로메탄(25㎖)에 용해시켰다. 용액을 아르곤으로 퍼징시키고, 아연 분말(3.72g)을 부가한 다음, 아세트산 0.45㎖를 부가하였다. TLC를 이용하여, 120분이 지나자 출발물질이 소모된 것을 확인하였다. 혼합물을 여과한 다음, 고형분을 디클로로메탄으로 세척하였다. 디클로로메탄 용액을 물(3×50㎖)로 세척한 다음, 건조하였다. 분석적 특징을 알기 위하여, 소량의 생성물을 분취 TLC를 이용하여 정제하였다. 생성물중 나머지는 추가 정제 없이 이용하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 5.22(s, 1H), 6.28(s, 1H), 6.79-7.31(m, 12H)
c. 4′-클로페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트
클로로페닐 아크리단-9-티오카르복실레이트(2.0g)를 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄(30㎖)에 용해시킨 다음, 메틸 트리플레이트(6.5g)를 부가하였다. 갈색 용액을 증발시킨 다음, 30% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피시켜 조생성물을 정제하여, 순수한 생성물(1.8g)을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.47(s, 3H), 5.09(s, 1H), 7.02-7.39(m, 12H)
d. 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
무수 THF 10㎖에 4-클로로페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(0.70g)가 용해되어 있는 용액을, THF LDA(1.4당량)가 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 60분 동안 교반한 후, 노란색 용액을 THF 4㎖에 POCl3(0.517g) 및 피리딘(1.52㎖)이 용해되어 있는 용액으로 천천히 처리하였다. 30분 후에 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 용액이 노란색으로 변했으며 침전물이 형성되었다.
혼합물을 아이스 배쓰에서 냉각시킨 다음, 3-하이드록시프로피오니트릴(0.89g) 및 피리딘 1.0㎖로 처리하였다. 부가 후에, 아이스 배쓰를 제거하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 여과한 다음, THF로 세척하였다. 여과액을 진공에서 증발시켜 얻어진 갈색 물질을 에틸 아세테이트에 용해시킨 다음, 4×25㎖ 물로 세척하였다. 에틸 아세테이트 용액을 건조 및 농축시켰다. 80-100% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피시킴으로써, 잔류물로부터 0.325g의 생성물을 분리해냈다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.48-2.64(m, 4H), 3.53(s, 3H), 3.86-4.16(m, 4H), 6.94-7.94(m, 12H);
31P NMR(D2O) δ -9.48(p)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
e. 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(12)
아세톤 10㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(0.325g)이 용해되어 있는용액을 아르곤으로 퍼징시켰다. 2.5M NaOH 용액(473㎕)을 부가한 다음, 물 500㎕를 부가하였다. 용액을 아르곤 분위기 하에 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과한 다음, 공기중에서 건조시켰다. 모액(mother liquor)에 모노(시아노에틸)로 보호된 화합물(140mg)이 함유되어 있음을 확인하였다. 수산화나트륨 탈보호 반응용을 반복하여 제2의 디소듐 염을 얻었다.
1H NMR(D2O) δ 3.35(s, 3H), 6.92-7.36(m, 10H), 7.78(d, 1H), 8.20(d, 1H);
31P NMR(D2O) δ 1.22(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 13]
[아크리단 유도체 13의 합성]
[화학식 13]
a. 나프틸 아크리딘-9-티오카르복실레이트
아크리딘-9-카르복실산 65.17g으로부터 제조된 아크리딘-9-카르보닐 클로라이드 및 2-나프탈렌티올(48.81g)을 디클로로메탄 100㎖에 용해시킨 다음, 피리딘 120㎖를 부가하였다. 아르곤 분위기 하에 실온에서 밤새도록 혼합물을 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 고형분을 헥산 500㎖로 세척한 다음, 여과하였다. 헥산 500㎖를 이용하여 다시 세척하고, 여과한 다음, 물 600㎖로 세척하고 여과하여 공기중에서 밤새도록 건조하였다. 티오에스테르를 디클로로메탄 1500㎖에 용해시키고, 소듐 설페이트를 이용하여 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 건조시켰다. 티오에스테르를 갈색 고형분으로서 얻었다(94.67g).
1H NMR(CDCl3) δ 7.54-8.00(m, 11H), 8.17-8.31(m, 4H)
b. 나프틸 10-메틸아크리디늄-9-티오카르복실레이트 트리플레이트
나프틸 아크리딘-9-티오카르복실레이트(26.38g)을 디클로로메탄(200㎖)에 현탁시켰다. 메틸 트리플루오로메탄설포네이트(24.5㎖)를 부가한 다음, 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 혼합물을 여과한 다음, 디클로로메탄(300㎖) 및 헥산(500㎖)로 세척하였다. 공기중에서 건조시킨 후, 생성물(28.83g)을 노란색 고형분으로서 얻었다.
1H NMR(아세톤-d6) δ 5.20(s, 3H), 7.66-7.75(m, 2H), 7.88-7.92(m, 1H), 8.03-8.09(m, 2H), 8.15(d, 1H), 8.26(t, 2H), 8.48(s, 1H), 8.61-8.68(m, 2H), 8.80(d, 2H), 9.03(d, 2H)
c. 나프틸 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트
나프틸 10-메틸아크리디늄-9-티오카르복실레이트 트리플레이트(65.50g)을 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄(1000㎖)에 현탁시킨 다음, 빙초산(21.2㎖) 및 아연(40.43g)을 부가하였다. 밤새도록 교반한 후, TLC를 이용하여 출발물질이 사라지고 새로운 생성물이 형성되었음을 확인하였다. 실리카 겔 베드(bed)를 통하여 반응 혼합물을 여과한 다음, 진공에서 디클로로메탄을 제거하였다. 얻어진 옅은 노란색 고형분을 이소프로판올(500㎖)에 첨가하여 교반한 다음, 여과하였다. 이소프로판올 500㎖를 이용하여 다시 세척한 다음, 공기중에서 건조시켜 순수한 생성물(46.36g)을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 3.47(s, 3H), 5.13(s, 1H), 7.00-7.06(m, 4H), 7.25-7.49(m, 7H), 7.70-7.79(m, 4H)
d. 9-(나프틸티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 비스(시아노에틸)에스테르
무수 THF 600㎖에 나프틸 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트(17.32g)가 용해되어 있는 용액을, THF에 LDA(1.25당량)이 용해되어 있으며 -78℃로 유지되는 용액에 한방울씩 부가하였다. -78℃에서 90분 동안 교반한 후, THF 150㎖에 POCl3(20.80g) 및 피리딘(50㎖)이 용해되어 있는 용액을 이용하여 오렌지색을 띤 갈색 용액을 처리하였다. 60분 후에 드라이 아이스 배쓰를 제거한 다음, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 용액이 갈색으로 변하고 침전물이 형성되었다.
혼합물을 3-하이드록시프로피오니트릴(27.8㎖)로 처리하였다. 실온에서 밤새도록 교반한 후, 침전된 피리딘-HCl을 여과한 다음, THF로 세척하였다. 여과액을 진공에서 증발시킨 다음, 50-100% 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피시킴으로써 갈색 오일로부터 생성물을 분리해냈다. 노란색 오일을 디클로로메탄(300㎖)에 용해시키고, 물(450㎖)로 세척하고, 소듐 설페이트를 이용하여 건조시키고, 여과한 다음, 진공에서 건조시킴으로써, 생성물(17.76g)을 노란색 고형분으로서 수득하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.33-2.53(m, 4H), 3.53(s, 3H), 3.82-4.06(m, 4H), 6.93(t, 1H), 7.03(d, 1H), 7.10-7.18(m, 2H), 7.25-7.55(m, 5H), 7.79-7.92(m, 5H), 8.02(d, 1H);
31P NMR(CDCl3) δ -9.69(p)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
e. 9-(나프틸티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리단, 디소듐 염(13)
아세톤 200㎖에 비스(시아노에틸) 포스페이트 화합물(17.28g)이 용해되어 있는 용액을 아르곤으로 퍼징시켰다. 물 50㎖에 수산화나트륨(2.76g)이 용해되어 있는 용액을 부가한 다음, 용액을 아르곤 분위기 하에 밤새도록 교반하였다. 형성된 침전물을 감압 여과시키고, 20% 물/아세톤(300㎖)으로 세척한 다음, 진공하에 건조시켰다. 생성물(15.07g)을 옅은 노란색 고형분으로서 얻었다.
1H NMR(D2O) δ 43.22(s, 3H), 6.67(d, 1H), 6.87(t, 1H), 7.01(t, 1H), 7.08-7.15(m, 12H), 7.23(d, 1H), 7.31-44(m, 3H), 7.51(s, 1H), 7.59(d, 2H), 7.73(d, 1H), 7.86(d, 1H), 8.25(d, 1H);
31P NMR(D2O) δ 1.30(s)(H3PO4를 외부 표준으로 이용)
[실시예 14]
[화합물 1을 이용한 알칼리 포스파타제의 화학발광 검출]
알칼리 포스파타제의 화학발광 검출에 효과적인 시약 조성물은, 0.1M 트리스 완충액(pH 8.5), 0.88mM 마그네슘 염, 0.33mM 아크리단 포스페이트 1(0.033M 메탄올 용액을 1:100으로 희석한 것) 및 0.01mg/㎖의 인핸서 A(폴리비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드 코-폴리비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드, 트리부틸기:트리옥틸기 3:1)를 포함하였다. 루미노메터(Turner TD-20e)에 내장되어 있는 시험관에서 25℃의 온도하에 상기 조성물 100㎕와 AP 10-13mol을 반응시킨 결과, 2분만에 최대치에 도달하였다. 쉽게 측정할 수 있는 청색 화학발광을 생성하였다.
[실시예 15]
[화합물 2-13을 이용한 화학발광 검출]
실시예 14에서와 같은 방법으로, 화학식 2-13의 화합물 각각을 함유하는 조성물을 25℃에서 AP와 반응시켰다. 각각의 경우 AP가 없을때 측정되는 자연발광보다 식별이 잘되며 쉽게 측정할 수 있는 화학발광을 생성하였다.
본 명세서에 상세하게 기술되어 있는 화합물 이외에도 화학식 I의 다른 화합물이 본 발명의 방법에서처럼 기능할 것이라는 것은 당업자에게 자명하다.
[실시예 16]
[화합물 5를 이용한 알칼리 포스파타제의 화학발광 검출]
알칼리 포스파타제의 화학발광 검출에 효과적인 시약 조성물은, 0.2M 2-메틸-2-아미노-1-프로판올 완충액(pH 9.6), 0.88mM Mg2+, 0.66mM 아크리단 포스페이트 5(0.033M 메탄올 용액을 1:100으로 희석한 것) 및 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 포함하였다. 루미노메터(Turner TD-20e)에 내장되어 있는 시험관에서 25℃의 온도하에 상기 조성물 100㎕와 AP 10-13mol을 반응시킨 결과, 2분만에 최대치에 도달하였으며 쉽게 측정할 수 있는 청색 화학발광을 생성하였다. 1분에서 10분 사이에 측정되는 광의 세기는 8×10-14mol 내지 8×10-18mol 사이 범위의 효소 양과 상관 관계를 나타냈다.
[실시예 17]
[화학발광 세기의 동역학 프로파일]
아크리단 포스페이트 1을 함유하는 조성물에 의한 신속한 검출 효과는 제1도의 그래프에 나타나 있다. 25℃에서 실시예 14의 시약 조성물 100㎕를 8×10-16mol의 AP와 반응시키자, 광이 방출되어 약 2분만에 최대 세기에 도달하였다. 또한, 도면에는 실시예 14에 기재되어 있는 바와 유사하지만 화학식 1로 표시되는 화합물 대신에 에스테르를 함유하는 시약 조성물중의 에스테르 페닐 10-메틸아크리단-9-티오카르복실레이트의 화학발광 프로파일이 비교군으로서 나타나 있다. 비교를 위해 사용되는 에스테르 용액에 AP를 부가하면 어떠한 효과도 생기지 않는다. 에스테르의 자발적인 자동 산화로 인해 나타나는 매우 작은 광 세기 및 느린 증가 시간은, AP에 의한 에스테르의 생성(에놀 포스페이트로부터 포스페이트 보호기가 제거됨으로써 나타남)에 이어 에스테르가 자동 산화됨으로써 나타나는 화합물(화학식 1)의 반응에 의한 방출효과는 비교가 되지 않는 수준이다.
[실시예 18]
[AP를 이용한 1의 반응에 대한 분광학적 연구]
실시예 14의 시약 조성물 3㎖ 및 AP 2.4×10-12mol 사이의 반응 진행은 다이오드 어레이 검출기(diode array detector)를 구비한 UV-가기광선 분광기를 이용하여 모니터링하였다. 스펙트럼은 5분 간격으로 관찰하였다. 제2도에 도시되어 있는 바와 같이, 스펙트럼은 여러 가지 중간 생성물 및 생성물로 이루어진 복잡한 패턴임을 알 수 있다. 곡선 A-F는 각각 효소를 부가하고 0, 5, 10, 20, 40 및 60분이 지난 후에 취해진 스캔닝 그래프이다.
[실시예 19]
[화학발광 스펙트럼]
루미젠(Lumigen)의 배리 쇼엔펠너 박사(Dr. Barry Schoenfelner)가 제조한 장치를 이용하여 화학발광 스펙트럼을 얻었다. 광이 새지 않는 박스(light tight box) 내에 시험관이 들어 있는 샘플 홀더에서 실시예 14의 시약 조성물(200㎕)을 AP(8×10-13mol)와 반응시켰다. 렌즈를 이용하여 방출되는 광을 수집한 다음, 격자 모노크로메이터(grating monochromator)를 이용하여 CCD 카메라 장치 상에 분산시켰다. 이러한 시스템은 가시광선의 모든 파장을 동시에 영상화하기 때문에, 시간에 따른 세기의 변화에 대한 어떠한 보정도 필요하지 않다. 제3도에 도시되어 있는 방출 광의 스펙트럼은 약 430nm에서 최대 세기가 되며 방출 파장 영역이 넓다. 상기 스펙트럼은 N-메틸아크리돈의 형광에 필적한다. 상기 스펙트럼에서 미세한 피크는 장치 노이즈의 결과이다.
[실시예 20]
[알칼리 포스파타제와 화합물 1의 화학발광 반응에 대한 pH 효과]
넓은 범위의 pH에 대하여 본 발명의 아크리단을 이용한 알칼리 포스파타제의 화학발광 검출을 수행하였다. 0.1M 트리스(트리스 또는 2-메틸-2-아미노-1-프로판올, 221)(pH 7-10.5), 0.88mM Mg2+, 0.33mM 아크리단 포스페이트 1(0.033M 메탄올 용액을 1:100으로 희석한 것) 및 0.01mg/㎖의 인핸서 A를 포함하는 용액을 제조한 다음, 25℃에서 10분 후에 자연적인 광 방출을 측정하였다. 효소 8×10-16mol을 함유하는 AP 용액을 일정양씩 주입하여, 최대 세기에 도달할 때까지 광 세기를 모니터링하였다. S/B는 효소가 없을 때의 광 세기 대한 최대 광 세기의 비율을 의미한다.
[표 2]
[실시예 21]
[계면활성제에 의한 화학발광의 증가]
시험 물질이 없을 때의 수준으로 기준으로 광 세기의 증가로서 정의되는 화학발광의 증가에 대해, 여러 가지 계면활성제 화합물의 존재하에 아크리단 1과 AP의 반응을 표준 세트의 시험 조건으로 평가하였다. 최대로 증가시키는 각각의 계면활성제의 농도를 독립적으로 결정하였다. S/B로 표시된 칼럼의 값은 효소를 함유하지 않은 경우에 대한 AP 10-16mol을 함유하는 경우의 광 세기 비율을 나타낸다. Rel.로 표시된 칼럼은 인핸서 없이 얻어진 결과를 기준으로 하여 얻은 광 세기 비율을 의미한다(샘플 번호 11).
[표 3]
*2분 시점에서 측정
A:폴리(비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드)-코-폴리(비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드)(트리부틸기:트리옥틸기의 비율 3:1)
B:폴리비닐벤질벤질디메틸암모늄 클로라이드
C:폴리(비닐벤질트립틸포스포늄 클로라이드)-코-폴리(비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드)-코-폴리(비닐벤질플루오레신)(75:25:1)
D:폴리(비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드]
E:1-트리옥틸포스포늄메틸-4-트리부틸포스포늄메틸벤젠 디클로라이드
F:TweenTM20, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트
G:브로마이드 클로라이드 염과 혼합된 1-트리옥틸포스포늄메틸-4-트리부틸암모늄메틸벤젠
H:SDS, 소듐 도데실 설페이트
I:CTAB, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드
J:1-트리옥틸암모늄메틸-4-트리부틸암모늄메틸벤젠 디클로라이드
인핸서가 사용되지 않는 경우에 광 세기가 1시간 이상 동안 계속하여 증가하기 때문에, 샘플 번호 4-11에서의 S/B 값은 얻을 수 있는 최대 증가치를 의미하는 것은 아니다.
[실시예 22]
[아크리단 포스페이트 1을 이용하는 경우의 광세기 및 동역학에 대한 인핸서 A의 농도 효과]
아크리단 포스페이트 1과 AP의 화학발광 반응에서 최대 신호/자연발광(S/B) 수준을 생성하는 인핸서 A의 양을 결정하기 위하여, 농도 의존성에 대한 연구를 수행하였다. 화학식 1로 표시되는 화합물 및 0.88mM Mg2+를 함유하는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.5)에 및 0.5, 0.25, 0.1, 0.05 또는 0.025mg/㎖의 인핸서 A로 이루어진 용액을 25℃에서 평형화시킨 다음, AP 8×10-16mol과 반응시켰다. 표 4에 나타나 있는 S/B 값으로부터, 인핸서 농도가 0.005-0.01g/ℓ인 경우에 광 증가가 최대로 되는 것을 알수 있다.
[표 4]
[실시예 23]
[아크리단 포스페이트 1을 이용한 알칼리 포스파타제의 검출에 대한 선형성 및 감도]
아크리단 포스페이트 1을 함유하는 본 발명의 시약 조성물을 이용하여 AP의 검출에 대한 감도 및 선형성을 측정하였다. 96-웰 백색 마이크로플레이트의 3개 웰에 각각, 8×10-15mol 내지 8×10-20mol의 효소를 함유하는 AP 희석액 10㎕를 부가하였다. 0.1M 트리스 완충액(pH 8.5)에 용해되어 있는 0.33mM 아크리단 포스페이트(화학식 1) 용액 0.88mM Mg2+, 0.01mg/㎖의 인핸서 A 및 1% 메탄올을 포함하는 검출 시약을 100㎕씩 주입하였다. 2.5분 후에 광 세기를 측정하였다. 제4도에는 알칼리 포스파타제의 선형 검출 특성이 나타나 있다. S-B는 AP가 없을 때의 자연적인 화학발광(B)을 고려하여 보정된, AP 존재하의 RLU로 표시되는 화학발광 신호(S)를 의미한다. 이러한 조건하에 계산된 검출 한계(자연발광의 표준 편차의 두배)는 1.2×10-19mol로 결정되었다. 10분 후에 측정된 광 세기를 이용하여 유사한 결과를 얻었다.
[실시예 24]
[AP의 화학발광 검출에 대한 pH 변화의 효과]
AP와 1의 반응에 의해 방출되는 광을 검출하기 위한 또 다른 방법은, 인핸서가 없을때 제1pH에서 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 시약 조성물과 AP를 반응시킨 다음, 인핸서를 함유하는 강염기 용액을 주입하여 pH를 급속하게 상승시킴으로써 광 방출을 일으키는 것이다. 10-18mol 미만의 AP를 검출할 수 있는 일련의 조건이 마련되어 있다.
0.88mM MgCl2를 포함하는 0.1M 트리스 버퍼(pH 9)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 1을 포함하는 시약 조성물(100㎕)을 흑색 마이크로플레이트의 웰에 주입하고 주위 온도에서 AP(8×10-15내지 8×10-20mol) 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 첨가하여 4분 동안 반응시켰다. 1N NaO에 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 함유하는 용액(100㎕)을 주입하고, 10초 동안의 광 세기를 가산하였다. 제5도에 도시되어 있는 바와 같이, 8×10-15내지 8×10-19mol의 AP 범위에서 광 세기가 선형적으로 나타냈다.
[실시예 25]
[산성 포스파타제의 화학발광 검출 및 주석산염에 의한 억제]
산성 포스파타제(AcP)의 화학발광 검출을 위한 시약 조성물은 0.1M 트리스 완충액(Ph 7), 0.33mM 아크리단 포스페이트 1(0.033M 메탄올 용액을 1:100으로 희석한 것) 및 .01-0.1% 인핸서 A를 포함했다. 루미노미터(Turner TD-20e)에 내장된 시험관에서 주위 온도 하에 본 발명의 시약 조성물 100㎕과 AcP(Sigma AcP LIN-TROL, 2.0㎖로 재구성됨, 83U/L)를 반응시켜, 거의 순식간에 최대 세기에 도달하고 몇분 동안 거의 일정하게 유지되는 화학발광을 생성하였다. 검출 시약에 단백질인 소의 혈청 알부민(BSA)을 0.1% 부가하여 광 방출 기간을 상당히 연장시켰다.
구연산 완충액(0.09M, pH 4.8)에 용해된 0.04M 주석산염 용액 5㎕를 부가하자, 전립선의 산성 포스파타제에 대한 특이 억제제인 주석산염에 의해 효소 활성이 억제되어 광 방출이 완전히 소멸되었다. 구연산 완충액 10㎕를 부가한 경우에는 광 세기가 오로지 25%만 감소한 것으로 볼때, 광 방출의 급속한 소멸은 pH의 감소로 인한 것은 아니었다.
[실시예 26]
[AcP의 화학발광 검출에 대한 pH 변화의 효과]
AcP와 화학식 1로 표시되는 화합물의 반응에 의해 방출되는 광을 검출하기 위한 또 다른 방법은, 화학식 1로 표시되는 화합물 및 인핸서를 함유하는 시약 조성물을 제1pH에서 AcP와 반응시킨 다음, 강염기 용액을 주입하여 pH를 급속하게 증가시킴으로써 광 방출을 일으키는 것이다. 0.1M 트리스 버퍼(pH 7)에 용해된 0.33mM 아크리단 포스페이트 1, 0.1% BSA 및 0.01% 인핸서 A를 포함하는 시약 조성물(100㎕)을 시험관에서 주위 온도하에 AcP(Sigma AcP LIN-TROL, 2.0㎖로 재구성됨, 83U/L) 3㎕와 반응시켰다. 1N NaOH 용액(50㎕)을 주입하고 4분 동안의 광 세기를 가산하였다. 광 세기는 시약 블랭크에 비해 3배였다.
[실시예 27]
[PVDF 멤브레인을 이용한 웨스턴 블롯 분석법]
본 발명의 조성물을 이용하여, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 상에서 AP 표지형 항체를 이용한 웨스턴 블롯 실험으로 단백질인 인간의 트랜스페린을 검출하여 정량화하였다. 각각 5000, 1000, 180, 30 및 5pg의 단백질을 함유하는 트랜스페린 희석액을 전기영동을 통해 PVDF 멤브레인(Millipore, 베드포드, 메사추세츠)으로 이동시켰다. 트랜스페린 밴드를 블로킹시킨 다음, 염소 항인간 트랜스페린(goat anti-human transferrin) 및 토끼 항염소-AP(rabbit anti-goat-AP) 콘쥬게이트와 순차적으로 반응시켰다. 0.88mM MgCl2를 함유하는 0.2M 221 완충액(pH 9.6), 0.66mM 아크리단 포스페이트(화학식 1) 및 0.1-1mg/㎖의 인핸서 A를 포함하는 시약에 멤브레인을 담구었다. 이어서, 상기 멤브레인을 투명한 플라스틱 쉬트 사이에 놓은 다음, X-레이 필름에 노출시켰다. 제6도는 0.1mg/㎖의 인핸서를 함유하는 시약 조성물을 이용하여 1분 동안 노출한 다음, 15분 후에 인간의 트랜스페린을 검출한 결과를 나타내고 있다. 인핸서의 양을 다양하게 하면서 상기 조성물을 이용하여 생성된 광은 적어도 2주일 동안 이지지화 되어 있을 정도로 세기가 강하다.
놀랍게도, 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 함유하는 조성물은 그 세기가 4일 동안 상대적인 밴드 세기의 변화가 없이 거의 일정한 광 방출을 생성하는 것으로 밝혀졌다. PVDF 멤브레인 상에서 생성되는 광 방출은 1달 이상의 장기간 동안 유용한 수준으로 계속되었다. 5pg 밴드는 5주 후에 20분간의 노출만으로 상이 형성될 수 있었다. 유용한 수준의 방출이 이와 같이 장기간 지속되는 것은 전례가 없는 것이다.
[실시예 28]
[니트로셀룰로오스 멤브레인을 이용한 웨스턴 블롯]
고상으로서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 이용하여, 실시예 27에서와 같은 방법에 따라 웨스턴 블롯 분석법을 수행하였다. 5000-30pg 범위의 트랜스페린 표준액을 이용하였다. 모든 레벨의 단백질을 검출할 수 있는 검출 시약은 0.2M 22 완충액(pH 9.6), 0.88mM MgCl2, 0.33mM 아크리단 포스페이트(화학식 1) 및 0.5mg/㎖의 인핸서 A를 포함하는 것이었다. 검출은 몇시간에 걸쳐 수행될 수 있었다.
[실시예 29]
[화학발광 검출을 이용한 서던 블롯 분석법]
서던 블롯 기술에 의해 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서 DNA를 화학발광 검출하기 위하여 본 발명의 조성물을 이용하는 방법에 대한 실시예이다.
아비딘-AP 콘쥬게이트를 카펠 프러덕츠(Cappel Products)(Durham, 노쓰 캐롤라이나)로부터 구입하였다. (열쇼크 처리된)소의 혈청 알부민을 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co.)(세인트루이스, 몬타나)로부터 구매했다. 인간의 게놈 DNA 및 인간의 트랜스페린 수용체 cDNA를 클론테크(Clontech)(팔로 알토, 캘리포니아)로부터 구매하고, 바이오틴화된 람다 DNA/HindIII 단편, 바이오틴-7-dATP 및 닉 트랜스레이션 키트(Nick Translation kit)를 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터, 제한 효소인 HindIII를 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim)(인디아나폴리스, 인디아나)로부터, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 쉴라이허 앤드 쉘사(Schleicher ＆ Schuell Inc.)(Keene, 뉴햄프셔)로부터 각각 구매하였다. 또한, X-레이 필름은 코닥사(로체스터, 뉴욕)에서 구매한 X-OMAT였다.
HindIII를 이용하여 인간의 게놈 DNA(19.5㎍)를 분리하여 13㎍ 단편 및 6.5㎍ 단편으로 나누었다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 이용하여, 분해된 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA에 대해, 트리스-아세테이트 40mmol/ℓ, EDTA 2mmol/ℓ를 포함하는 용출 완충액(pH 8.0)을 이용하여 0.75% 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 분리해냈다. 전기영동 후, 겔을 물로 세척한 다음, 0.25mol/ℓ HCl을 이용하여 12분 동안 평형화시키고, 다시 물로 세척하고, 0.5mol/ℓ NaOH 및 1.5mol/ℓ NaCl를 포함하는 용액으로 15분 동안 처리한 다음, 동일한 조성의 새로운 용액으로 30분 동안 처리하고, 물로 세척하고, 1mol/ℓ 트리스 및 1.5mol/ℓ NaCl을 포함하는 pH 7.5인 용액으로 15분씩 세번 처리하였다.
니트로셀룰로오스 멤브레인을 물에 2분 동안 담근 다음, 10X SSC에 30분 동안 담궜다. 10X SSC에서 밤새도록 모세관 블롯팅에 의해 DNA를 멤브레인으로 전달시켰다. 멤브레인을 10X SSC에서 실온하에 10분 동안 천천히 교반하여 세척하고, 와트만 3MM 블롯팅 페이퍼(Whatman 3MM blotting paper) 상에서 30분 동안 공기중에서 건조시킨 다음, 진공 분위기 하에 80℃에서 2시간 동안 베이킹시켰다.
멤브레인을 6X SSPE(20X SSPE는 30mol/ℓ NaCl, 0.2mol/ℓ NaH2PO4, 20mmol/ℓ, EDTA, pH 7.4)에 담근 다음, 예비 혼성화 용액(pre-hybridization solution)[6X SSPE, 50%의 즉석에서 탈이온화된 포름아미드, 여과처리한 5X 덴하르트 용액(Denhardt′s solution){50X는 1% Ficoll 400, 1% PVP, 1% BSA(열충격에 의한 최초 분획)}, 여과처리한 1% SDS, 200㎍/㎖의 전단, 변성된 청어 전자 DNA]에서 42℃ 하에 3시간 동안 예비 혼성화시켰다. 제조업자의 지시서에 따라, 닉 트랜슬레이션에 의해 혼성화 탐침인 인간의 트랜스페린 수용체 cDNA에 바이오틴-7-dATP를 레이블링시켰다. 6X SSPE, 45% 포름아미드, 여과처리한 5X 덴하르트 용액, 1% SDS, 200㎍/㎖ 청어 정자 DNA를 이용하여 42℃에서, 300㎍/㎖의 변성된 바이오틴화 탐침과 게놈 DNA를 밤새도록 혼성화시켰다. 바이오틴화된 탐침의 변성화는 4분 동안 끓인 다음, 0℃에서 10분 동안 냉각시킴으로써 이루어졌다. 멤브레인을 25℃에서 0.5X SSC, 0.4% SDS를 이용하여 5분 동안 2번, 55℃에서 0.5X SSC, 0.4% SDS를 이용하여 10분 동안 3번, 25℃에서 2X SSC를 이용하여 5분 동안 한번, TBS(50m mol/ℓ 트리스-HCl, pH 7.4, 0.15mol/ℓ NaCl)를 이용하여 3분 동안 두 번 세척하였다. 세척 후, 멤브레인을 여과처리한 3% BSA, 100mmol/ℓ 트리스-HCl(pH 7.4), 0.15mol/ℓ NaCl를 포함하는 용액에서 63℃하에 1시간 동안 블로킹시킨 다음, T-TBS(TBS에 0.05% Tween 20이 용해되어 있는 용액)로 1분 동안 세척하였다.
블로킹된 멤브레인을 T-TBS에 아비딘-AP가 용액의 1:2000 희석액으로 12분 동안 처리한 다음, T-TBS를 새로이 제조된 것으로 교환하면서 5, 10, 15 및 20분 동안 처리한 후, 마지막으로 TBS를 이용하여 5분 동안 처리하였다. 여분의 완충액을 제거한 다음, 실시예 27에 기술된 바와 같은 검출 시약에 블롯을 3분 동안 담궜다. 여분의 시약을 제거한 다음, 투명한 쉬트 사이에 블롯을 놓고 X-레이 필름에 노출시켰다.
멤브레인을 검출 시약에 적신 다음, 시간을 변화시키면서 X-레이 필름에 노출시킴으로써, 10.5 및 5.2kbp에서 단일 본 유전자를 검출하였다. 12분 동안의 처리 기간 후에, 본 발명의 시약을 이용하여 필름에 5분 동안 노출시킴으로써, 두가지 단편에서 단일 본 유전자에 대응하는 밴드가 관찰되었다. 또한, 처리 시간이 짧을 경우에도 탁월한 이미지를 만들어냈다. 1일 동안에 여러번의 노출을 용이하게 수행할 수 있었다.
[실시예 30]
[화학발광 프로파일에 대한 루시제닌의 효과]
아크리단 포스페이트 5와 AP의 반응에 루시제닌을 부가하여 얻어지는 광 세기 증가 효과는 제7도의 그래프로부터 알 수 있다. 6.4μM 루시제닌이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에 대하여, 0.88mM MgCl2를 함유하는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 5가 용해된 용액 100㎕와 8×10-16mol의 AP를 25℃에서 반응시켰다. 제7도에는 루시제닌이 첨가된 용액의 경우 광 세기가 훨씬 증가하는 것으로 나타나 있다.
[실시예 31]
[화합물 5를 이용한 알칼리 포스파타제의 화학발광 검출]
알칼리 포스파타제의 화학발광 검출을 위하여 매우 효과적인 시약 조성물은 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8), 6.4μM 루시제닌, 0.66mM 화학식 5의 화합물, 1mg/㎖ SDS, 0.01mg/㎖ Na2SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 0.88mM MgCl2를 포함하는 용액이었다. 25℃에서 상기 조성물 100㎕와 8×10-16mol의 AP를 반응시킨 결과 2분만에 최대 세기에 도달하는 화학발광을 생성하였다. 제8도에는 화학식 5로 표시되는 화합물 및 양이온성 계면활성제 폴리머로된 인핸서[폴리(비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드)-코-폴리(비닐벤질트리옥틸포스포늄 클로라이드)(트리부틸기:트리옥틸기 약 3:1)(0.25TB/TO)]를 함유하는 시약 조성물을 37℃에서 반응시킨 것이 비교군으로 나타나 있다. 전에는, 계면활성제를 함유하는 조성물은 CAC가 없는 경우에 화학발광이 최대치에 도달하는 것으로 알려져 있었다.
[실시예 32]
[알칼리 포스파타제의 검출에 대한 선형성 및 감도]
화학식 5로 표시되는 화합물 및 루시제닌을 함유하는 시약 조성물(시약 A)을 이용하여 AP의 검출에 대한 감도 및 선형성을 측정한 다음, 화학식 5로 표시되는 화합물 및 0.25TB/TO(시약 B)을 함유하는 시약 조성물(시약 B)를 이용하여 얻은 결과와 비교하였다. 시약은 다음과 같은 조성으로 이루어져 있다.
96-웰 백색 마이크로플레이트의 3개의 웰에 각각, 8×10-13mol 내지 8×10-22mol의 AP를 함유하는 AP 희석액 10㎕를 부가한 다음, 검출 시약 A 또는 B 100㎕를 부가하였다. 2.5분 후에, 광 세기를 측정하였다. 제9도로부터, 알칼리 포스파타제에 대한 선형적인 검출 특성을 알 수 있다. 계산된 검출 한계(자연발광의 표준 편차의 두배)는 시약 A에 대하여 3.5×10-21mol 및 시약 B에 대하여 1.2×10-19mol로 결정되었다.
[실시예 33]
[화합물 1-13을 이용한 화학발광 검출]
실시예 30에서와 같은 방법으로, 25℃에서 화학식 1-13으로 표시되는 화합물 각각 0.66mM 함유하며 0 및 6.4μM 루시제닌을 포함하는 조성물과 8×10-16mol의 AP를 반응시켰다. 루시제닌이 반응 용액에 존재할 경우에, 훨씬 더욱 센 화학발광을 생성하는 것으로 나타났다.
[실시예 34]
[화합물 7-12를 이용한 AP의 검출에 대한 선형성 및 감도]
실시예 32에서와 같은 방법으로, 화학식 5로 표시되는 화합물 대신에 화학식 7-12로 표시되는 화합물 각각 0.66mM 포함시키는 것을 제외하고는, 시약 A의 조성에 따라 시약 제조하였다. 상기 각각의 시약 100㎕, 8×10-16mol 내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 희석액 10㎕ 또는 시약 블랭크로서 물 10㎕를 부가하였다. 각각의 경우에, 8×10-21mol의 효소를 함유하는 반응 용액이 약 2분 이내에 블랭크보다 높은 피크 신호를 생성하였다. 제10, 제11도 및 제18도에는 화학식 7, 8 및 12로 표시되는 화합물 각각에 대한 결과가 도시되어 있다.
[실시예 35]
[화합물 7을 이용한 화학발광의 시간 프로파일]
화학식 7의 화합물을 함유하는 시약 조성물에 의해 방출되는 화학발광의 급속한 생성은 다음 실험에서 증명되었다. 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8), 6.4μM 루시제닌, 0.66mM 아크리단 포스페이트 7, 1mg/㎖ 소듐 도데실 설페이트, 0.01mg/㎖ Na2SO3, 0.033%(w/v) TWEEN 20 및 0.88mM MgCl2를 함유하는 시약 100㎕를 실온에서 8×10-16mol의 AP와 반응시켰다. 화학발광 세기는 제12도에서 나타난 바와 같이 5초만에 일정치에 도달했다.
[실시예 36]
[여러 가지 CAC를 이용한 화학발광 세기의 증가]
DMSO에 21mM의 CAC 1-11을 용해하여 시험 용액을 제조하였다. 상기 용액을 0.88mM MgCl2를 함유하는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 아크리단 포스페이트 화합물(화학식 5)이 용해된 용액에 1:1000의 희석비율로 첨가하였다. 최종 시약 조성물을 각각 백색 마크로웰 플레이트의 3개의 웰에 100㎕씩 주입하고 실온에서 4×10-16mol의 AP와 반응시켰다. 표 5에는 36분 시점에서 측정된 안정 신호 및 신호/자연발광(S/B)에 대한 각각의 CAC의 효과가 나타나 있다. CAC가 존재하는 경우에는, CAC가 없는 대조군에 비해 더욱 높은 피크 신호 S 및 S/B를 생성하였다.
[표 5]
1:루시제닌
2:베이식 레드 29
3:베이식 블루 66
4:베이식 블루 41
5:3,3′-디에틸티아디카르보시아닌 아이오다이드
6:3,3′-디에틸-9-메틸티아카르보시아닌 아이오다이드
7:3,3′-디에틸셀레나카르보시아닌 아이오다이드
8:3,3′-디에틸티아시아닌 아이오다이드
9:IR-1040
10:5-[3-에톡시-4-(3-에틸-5-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)-2-부테닐리덴]-3-에틸-2-[(3-에틸-4,5-디페닐-2(3H)-티아졸릴리덴)메틸]-4,5-디하이드로-4-옥소티아졸륨 아이오다이드
11:IR-786 퍼클로레이트
[실시예 37]
[AP와 화합물 5의 화학발광 반응에 대한 CAC의 농도 효과]
본 발명의 조성물을 이용한 AP의 화학발광 검출은 넓은 범위의 CAC 농도에 대하여 이루어질 수 있다. 0.88mM MgCl2를 함유하는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해되어 있는 0.66mM 화학식 5의 화합물을 포함하며, 루시제닌 스톡 용액을 10배 단위로 희석시킴으로써 농도가 6.4mM 내지 6.4nM 범위인 루시제닌을 포함하는 조성물을 제조하였다. 대조군은 루시제닌을 함유하지 않았다. 6.4mM 내지 6.4nM의 루시제닌을 함유하는 시험 용액(100㎕, 5개씩 준비)과 4×10-16mol의 AP를 반응시킨 결과, 실온에서 3.5분 후에 대조군보다 더 센 신호(S)가 생성되었다.
[실시예 38]
[AP와 화합물 5의 화학발광 반응에 대한 음이온성 계면활성제의 농도 효과]
본 발명의 조성물을 이용한 AP의 화학발광 검출은 넓은 범위에 걸친 음이온성 계면활성제 SDS의 농도에 대하여 이루어질 수 있다. 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8)에 용해된 0.66mM 화학식 5로 표시되는 화합물 및 0.88mM MgCl2와 10mg/㎖ 내지 10㎍/㎖의 SDS를 포함하는 조성물을 제조하였다. 대조군에는 SDS가 함유되지 않았다. 시험 용액(100㎕, 5개씩 준비)과 4×10-16mol의 AP를 반응시킨 결과, 실온에서 피크 신호가 대조군보다 더욱 빠르게 상승하였다.
[실시예 39]
[AP와 화합물 5의 화학발광 반응에 대한 비이온성 계면활성제의 농도 효과]
본 발명의 조성물을 이용한 AP의 화학발광 검출은 넓은 범위에 걸친 비이온성 계면활성제 TWEEN 20의 농도에 대하여 이루어질 수 있다. 실시예 32의 시약 A에 따르되, 21μM 루시제닌을 함유하고 1.0% 내지 0.001% 범위의 다양한 농도의 비이온성 계면활성제를 함유하며 Na2SO3가 없는 조성물을 제조하였다. 대조군에는 비이온성 계면활성제가 함유되지 않았다. 실온에서 시험 용액(100㎕, 5개씩 준비) 및 대조군을 4×10-16mol의 AP와 반응시켰다. 각각의 시험 용액은 최대 세기 또는 그 근처에서 화학발광의 기간을 연장시키는데 효과적이었다.
[실시예 40]
[AP와 화합물 5의 화학발광 반응에 대한 아황산 나트륨의 농도 효과]
본 발명의 조성물을 이용한 AP의 화학발광 검출을 넓은 범위의 아황산 나트륨(Na2SO4)의 농도에 대하여 이루어질 수 있다. 실시예 32의 시약 A에 따르되, 1.0mg/㎖ 내지 1.0㎍/㎖ 범위의 다양한 농도의 Na2SO3를 포함하는 조성물을 제조하였다. 대조군에는 Na2SO3가 함유되지 않았다. 각각의 시험 용액(100㎕, 5개씩 준비)은 AP가 없을 경우에 낮은 자연발광 신호(B)를 생성하며, 실온에서 4×10-16mol의 AP와 반응시킨 경우에는 3.5분간의 처리 후에 대조군보다 더욱 센 신호(S)를 생성하였다. 이러한 실험에 있어서, 최대 S/B는 1.0mg/㎖를 이용하여 얻어지는 반면, 최대 신호는 1.0㎍/㎖를 이용하여 얻어졌다./
[실시예 41]
[웨스턴 블롯 분석법]
본 발명의 조성물을 이용하여, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 상에서 AP 표지형 항체를 이용한 웨스턴 블롯 실험으로 단백질인 인간의 트랜스페린을 검출하여 정량화했다. 각각 5000, 1000, 180, 30 및 5pg의 단백질을 함유하는 트랜스페린 희석액을 전기영동을 통해 PVDF 멤브레인(Millipore, 베드포드, 매사추세츠)으로 이동시켰다. 트렌스페린 밴드를 블로킹시킨 다음, 염소 항인간 트랜스페린 및 토끼 항염소-AP 콘쥬게이트와 순차적으로 반응시켰다. 0.88mM MgCl2를 함유하는 0.1M 트리스 완충액(pH 8.8), 0.66mM 아크리단 포스페이트(화학식 5) 및 64μM 루시제닌을 포함하는 시약에 멤브레인을 담구었다. 이어서, 상기 멤브레인을 투명한 플라스틱 쉬트 사이에 놓은 다음, X-레이 필름에 노출시켰다. 2.5분간 노출한 다음, 10분 후에 인간의 트랜스페린에 대한 밴드를 검출하였다. 상기 조성물을 이용하여 생성된 광은 몇시간 동안 이미지화 될 수 있을 정도로 세기가 강했다.
PVDF 멤브레인 대신에 니트로셀룰로오스 블롯팅 멤브레인을 이용하여 유사한 결과를 얻었다.
[실시예 42]
[서던 블롯 분석]
본 발명의 시약을 서던 블롯 분석에 이용한 대표적인 방법에 대한 실시예이다.
아비딘-AP 콘쥬게이트를 카펠 프러덕츠(Cappel Products)(Durham, 노쓰 캐롤라이나)로부터 구입하였다. (열쇼크 처리된)소의 혈청 알부민을 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Co.)(세인트루이스, 몬타나)로부터 구매했다. 쥐의 게놈 DNA를 클론테크(Clontech)(팔로 알토, 캘리포니아)로부터 구매하고, 바이오틴화된 람다 DNA/HindIII 단편, 바이오틴-7-dATP 및 닉 트랜스레이션 키트(Nick Translation kit)를 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터, 제한 효소인 EcoRI를 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim)(인디아나폴리스, 인디아나)로부터, 나일론 멤브레인을 마이크론 세퍼레이션사(Micron Separations Inc.)(Westborough, 매사추세츠)로부터 구매하였다. X-레이 필름은 코닥사(로체스터, 뉴욕)에서 구매한 X-OMAT였다.
EcoRI를 이용하여 쥐의 게놈 DNA(30㎍)를 분리하였다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 이용하여, 2㎍ 및 4㎍ 단편을 정제하였다. 트리스-아세테이트 40mmol/ℓ이고 EDTA 2mmol/ℓ인 용출 완충액(pH 8.0)를 이용하여 0.75% 아가로스 겔 상에 전기영동시켜 정제된 DNA를 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 물로 세척한 다음, 0.25mol/ℓ HCl을 이용하여 12분 동안 평형화시키고, 다시 물로 세척하고, 0.5mol/ℓ NaOH 및 1.5mol/ℓ NaCl을 포함하는 용액으로 15분 동안 처리한 다음, 동일한 조성의 새로운 용액으로 30분 동안 처리하고, 물로 세척하고, 1mol/ℓ 트리스 및 1.5mol/ℓ NaCl을 포함하는 pH 7.5인 용액으로 15분씩 세번 처리하였다.
나이론 멤브레인을 물에 2분 동안 담근 다음, 10X SSC에 30분 동안 담궜다. 10X SSC에서 밤새도록 모세관 블롯팅에 의해 DNA를 멤브레인으로 전달시켰다. 멤브레인을 10X SSC에서 실온하에 10분 동안 천천히 교반하여 세척하고, 와트만 3MM 블롯팅 페이퍼 상에서 30분 동안 공기중에서 건조시킨 다음, 진공 분위기 하에 80℃에서 2시간 동안 베이킹시켰다.
멤브레인을 6X SSPE(20X SSPE는 3mol/ℓ NaCl, 0.2mol/ℓ NaH2PO4, 20mmol/ℓ EDTA, pH 7.4)에 담근 다음, 예비 혼성화 용액(pre-hybridization solution)[6X SSPE, 50%의 즉석에서 탈이온화된 포름아미드, 여과처리한 5X 덴하르트 용액(Denhardt′s solution){50X는 1% Ficoll 400, 1% PVP, 1% BSA(열충격에 의한 최초 분획)}, 여과처리한 1% SDS, 200㎍/㎖의 전단, 변성된 청어 정자 DNA]에서 42℃ 하에 3시간 동안 예비 혼성화시켰다. 제조업자의 지시서에 따라, 닉 트랜슬레이션에 의해 혼성화 탐침인 암 유전자 탐침 v-mosel(판베라 코포레이션, 매디슨, 위스콘신)에 바이오틴 7-dATP를 레이블링시켰다. 6X SSPE, 45% 포름아미드, 여과처리한 5X 덴하르트 용액, 1% SDS, 20㎍/㎖ 청어 정자 DNA를 이용하여 42℃에서, 500ng의 변성된 바이오틴화 탐침과 게놈 DNA를 밤새도록 혼성화시켰다. 바이오틴화된 탐침의 변성화는 4분 동안 끓인 다음, 0℃에서 10분 동안 냉각시킴으로써 이루어졌다. 멤브레인을 25℃에서 0.5X SSC, 0.4% SDS를 이용하여 각각 15분 및 25분 동안 2번, 55℃에서 0.5X SSC, 0.4% SDS를 이용하여 10분 동안 3번, 25℃에서 2X SSC를 이용하여 5분 동안 한번, TBS(50mmol/ℓ, 트리스-HCl, pH 7.4, 0.15mol/ℓ NaCl)를 이용하여 3분 동안 2번 세척하였다. 세척 후, 멤브레인을 여과처리한 3% BSA, 100mmol/ℓ 트리스-HCl(pH 7.4), 0.15mol/ℓ NaCl를 포함하는 용액에서 65℃하에 1시간 동안 블로킹시킨 다음, T-TBS(TBS에 0.05% Tween 20이 용해되어 있는 용액)로 1분 동안 세척하였다.
블로킹된 멤브레인을 T-TBS에 아비딘-AP가 용해된 용액의 1:2000 희석액으로 12분 동안 처리한 다음, T-TBS를 새로이 제조된 것으로 교환하면서 5, 10, 15 및 20분 동안 처리한 후, 마지막으로 TBS를 이용하여 5분 동안 처리하였다. 여분의 완충액을 제거한 다음, 실시예 41에 기술된 바와 같은 검출 시약에 블롯을 4분 동안 담궜다. 여분의 시약을 제거한 다음, 투명한 쉬트 사이에 블롯을 놓고 X-레이 필름에 노출시켰다.
멤브레인을 검출 시약에 적신 다음, 시간을 변화시키면서 X-레이 필름에 노출시킴으로써, 14.5kbp에서 단일 본 유전자를 검출하였다. 9분 동안의 처리 기간 후에, 필름에 5분 동안 노출시킴으로써, 두가지 단편에서 단일 본 유전자에 대응하는 밴드가 관찰되었다. 보다 길게 노출시킴으로써 1일 동안에 여러번의 노출을 용이하게 수행할 수 있었다.
[실시예 43]
[hCG의 화학발광 면역 분석]
다이아그노스틱 프러덕츠사(Diagnostic Products Corp.)(로스앤젤레스, 캘리포니아) 제품인 임뮬라이트 키트(IMMULITE kit)와 임뮬라이트 자동화 분석기(IMMULITE Automated Analyzer)를 이용하여, 화학발광 면역 분석에 의한 hCG의 검출 반응을 실시하였다. 본 키트에 딸린 검출 시약 대신 실시예 32의 시약 A를 이용하였다. 기질 처리 시간을 줄이기 위해 소프트웨어를 수정하였다. 샘플 희석액을 5번 시험하여 평균한 블랭크의 경우를 제외하면, 모든 데이터 값은 세번 시험 결과의 평균값이다. 키트에 딸린, 표준 희석액이 들어있는 특수한 캘리브레이터를 이용하여 순차적으로 희석함으로써, 분석 대상물을 준비하였다. 화학발광 측정은 기질 도입하여 1.5분이 지난 후에 이루어졌다. 튜브내에서의 화학발광 시약의 사용적(dead volume)을 최소화하기 위하여 주입 메카니즘을 약간 변경했다. 기질 히터를 분리시키고, 플레어식 단부(flared end)를 갖는 흑색 전기 테이프로 감싼 18″×1/16″ OD 크기의 투명한 테프론 튜브를 기질 펌프와 회색 기질 분배 장치 사이에 직접 연결시켰다. 유사한 길이의 동일한 테프론 튜브를 기질 펌프의 입구부에 부착시켰다. 상기 튜브의 입구는 기질이 들어있는 병안에 장착시켰다. 기질을 예열하거나 또는 기질 온도를 조절하기 위한 어떠한 시도도 이루어지지 않았다. 외부 기질 온도 조절을 하지 않은 경우에도 CV 값이 그다지 변하지 않는 것으로부터 상기 반응이 온도에 민감하지 않다는 것을 알 수 있다.
빠르게 판독하는 루미노미터를 이용한 별도의 시험 결과, 10초 정도로 작은 처리 시간으로도 기질을 판독할 수 있다는 것은 감도 또는 정확도의 손실이 없다는 것을 나타내는 것이다. 제13도에 도시되어 있는 분석 결과 및 표 6으로부터, 샌드위치 타입 면역 분석법에 본 발명의 조성물을 이용할 수 있는 것을 알 수 있다.
[표 6]
[실시예 44]
[TSH의 급속한 화학발광 면역 분석]
제조업자의 프로토콜을 실시예 43에 기술되어 있는 바와 같이 수정하여 다이아그노스틱 프러덕츠사 제품인 임뮬라이트 알티에이치 급속 TSH 분석 키트(IMMULITE RTH Rapid TSH Assay kit)와 임뮬라이트 자동화 분석기를 이용하여, 화학발광 면역 분석법에 의한 TSH의 검출 반응을 실시하였다. 본 키트에 딸린 검출 시약을 대신하여 실시예 32의 시약 A를 사용하였다.
제3세대 TSH 시험 웨지(wedge)로부터 항체 콘쥬게이트를 제거하는 단계, 상기 웨지를 주의깊게 세척하는 단계 및 내용물을 타입 1 물로 대체하는 단계에 의해 시약의 자연발광을 시험하였다. 관찰된 기질의 자연발광은 대략 초당 5000카운트이었다. 이는 비특이적 결합에 의한 자연발광에 비해 수배 높다는 것을 의미한다. 그러므로, 웨지내의 반응조건 등을 다시 최적화시키면, 분석 감도의 수배 향상 및/또는 생화학적 반응 시간의 감소 효과를 얻을 수 있다. 화학발광 측정은 기질을 도입한지 1.5분 후에 실시하였다.
[표 7]
제14도에 도시되어 있는 분석 결과 및 표 7로부터, 급속한 분석을 제공하는데 본 발명의 조성물이 이용될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 45]
[TSH의 화학발광 면역 분석]
제조업자의 프로토콜을 실시예 43에 기술되어 있는 바와 같이 수정하여 다이아그노스틱 프러덕츠사 제품인 임뮬라이트 TSH 제3세대 TSH 분석 키트(IMMULITE TSH Third Generation TSH Assa kit)와 임뮬라이트 자동화 분석기를 이용하여, 화학발광 면역 분석법에 의한 TSH의 검출 반응을 실시하였다. 본 키트에 딸린 검출 시약을 대신하여 실시예 32의 시약 A를 사용하였다. 화학발광 측정은 기질 도입한지 1.5분 후에 실시하였다.
[표 8]
제15도에 도시되어 있는 분석 결과 및 표 8로부터, 고감도 분석을 제공하는데 본 발명의 조성물이 이용될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 46]
[에스트라디올의 화학발광 변역 분석]
제조업자의 프로토콜을 실시예 43에 기술되어 있는 바와 같이 변경하여 다이아그노스틱 프러덕트사 제품인 키트와 임뮬라이트 자동화 분석기를 이용하여, 화학발광 면역 분석법에 의한 에스트라디올의 검출 방법을 실시하였다. 본 키트에 딸린 검출 시약을 대신하여 실시예 32의 시약 A를 사용하였다. 화학발광 측정은 기질 도입한지 1.5분 후에 실시하였다.
[표 9]
제16도에 도시되어 있는 분석 결과 및 표 9로부터, 경쟁형 면역분석법(competitive-type immunoassay)에 본 발명의 조성물이 이용될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 47]
[산 포스파타제(AcP)의 화학발광 검출]
실시예 32의 시약 A가 산 포스파타제를 검출하기 위한 실험에 이용되었다. 루미노미터(Turner TD-20e)에 내장되어 있는 시험관에서 주위 온도 하에 상기 조성물 100㎕와 AcP(Sigma AcP LIN-TROL, 2.0㎖로 재구성됨, 83U/L)를 반응시켜, 2-5초 이내에 최대 세기에 도달하고 10-15초 이내에 제로로 감퇴하는 화학발광을 생성하였다.
산 포스파타제는 알칼리 포스파타제의 존재하에 상기 검출 시약으로 측정될 수 있었다. AcP에 의해 유도되는 화학발광 신호는 몇초 이내에 거의 완전히 감퇴하기 때문에, 제17도에 도시되어 있는 바와 같이 약 15-20초 후에 안정한 광 세기를 측정하면 AP 활성을 알 수 있다. 상기 방법에 따르면, 동일한 샘플에 있는 AcP 및 AP 활성 모두를 한번의 실험으로 동시에 정량할 수 있다. AcP는 인간의 완전 혈액에서 쉽게 측정될 수 있다.
[실시예 48]
[화합물 13을 이용한 AP의 선형성 및 감도 측정]
실시예 32의 방법에서처럼, 하기 조성에 따라 시약을 제조하였다. 각각의 시약 100㎕에, 8×10-16mol 내지 8×10-22mol의 효소를 함유하는 AP 희석액 10㎕ 또는 시약 블랭크용 물 10㎕를 부가하였다. 75초 시점에서 광세기를 측정하였다. 제19도에는 그 결과가 도시되어 있다.
[시약]
화학식 13의 화합물, 0.33mM
0.1M 트리스 완충액, pH 8.8
MgCl2, 5μM
루시제닌, 3.2μM
SDS, 0.5mg/㎖
Na2SO3, 5㎍/㎖
TWEEN 20, 0.15mg/㎖(w/v)
[실시예 49]
다음 식의 화합물들:
상기 식에서, V는 t-부틸, CH3, OCH3, F, Cl, Br, I, COCH3, CN 및 NO2임; 및
상기 식에서, U는 p-I, p-CH3, m-OCH3, m-Cl, o-Br, m-Br, p-Br 및 p-NO2; 및 상기 식에서 3,4-디클로로-, 2,5-디클로로- 및 2,6-디클로로페닐기를 갖는 화합물을 합성하였으며, 이들은 AP와 반응할 경우 화학발광을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
이상의 상세한 설명 및 실시예는 단지 본 발명에 대한 설명을 위한 것일 뿐이며, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다. 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어남이 없이, 상세하게 기술되지 않은 특정 화합물 및 방법의 변경이 가능하다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.
Claims (62)
- 다음 화학식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.[화학식 1]
상기 식에서, Het는 질소, 산소 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이며, Z는 산소 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, R6은 포스파타제와 상기 화학식 1의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 유기기(organic group)이고, 각각의 M은 독립적으로 수소 및 양이온 중심(cationic center)으로부터 선택된 것이며, n은 전기적으로 중화상태를 만족시킬 수 있는 숫자임. - 제1항에 있어서, 상기 R6은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제2항에 있어서, 상기 R6은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항에 있어서, 하기 화학식 II로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 III으로 표시되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R1은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50인 유기기이며, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 것이고, R2내지 R5각각은 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이며, 인접한 기의 쌍은 상호 결합하며 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리 시스템을 형성할 수 있는 것임. - 제4항에 있어서, R1은 C1내지 C4알킬기 및 벤질기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 화합물.
- 제4항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R7내지 R14각각은 독립적으로 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이고, 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이며, Ar은 아릴 고리기임. - 제6항에 있어서, R7내지 R14중 적어도 하나는 알콕시기이고, R7내지 R14중 나머지는 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제6항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, Ar은 페닐기이고, Z는 황 또는 산소 원자로부터 선택된 것임. - 제6항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, Z는 황 원자이고, Ar은 2,6-디메틸페닐, 4-클로로페닐, 4-플루오로페닐, 2-나프틸 및 4-메톡시페닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. - 제6항에 있어서, Z는 황 원자이고, Ar은 페닐기이며, R7, R9, R10, R11, R12및 R14는 수소 원자이고, R8및 R13은 불소 원자이며, R1은 CH3기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제4항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- a) 포스파타제 효소와 반응하는, 제1항 내지 7항 및 제8항 내지 제11항중 어느 한 항 기재의 화합물; 및 b) 화학발광을 증가시키기에 효과적인 양만큼의 적어도 하나의 인핸서를 수용액중에 포함하며, 포스파타제 효소의 존재하에 화학발광을 생성하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 인핸서가 폴리머성 4급 암모늄 및 포스포늄염, 모노머성 4급 암모늄 및 포스포늄염, 및 양이온이 둘인 4급 암모늄 및 포스포늄염으로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제 인핸서인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 계면활성제 인핸서가 비닐벤질트리부틸포스포늄염 및 비닐벤질트리옥틸포스포늄염의 공중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 인핸서가 비닐벤질트리부틸포스포늄염과 비닐벤질트리옥틸포스포늄염을 약 3:1의 비율로 포함하는 공중합체인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, 반응을 촉진시키기에 효과적인 양만큼의 마그네슘 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 인핸서가 양이온성 방향족 화합물의 부재하에 발생하는 화학발광량보다 많은 화학발광을 발생시키는데 유효한 양만큼의 양이온성 방향족 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 양이온성 방향족 화합물이 시아닌 염료, 카르보시아닌 염료, 아조 염료, 아크리디늄 유도체, 메틸렌 블루, 나일 블루, IR-1040, 루시제닌 및 파라콰트 디클로라이드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 최대 화학발광 세기에 도달하는 속도를 증가시키기에 효과적인 양만큼의 음이온성 계면활성제 및 화학발광량을 증가시키기에 효과적인 양만큼의 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제19항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 적어도 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬설페이트 및 적어도 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌화된 알킬페놀, 폴리옥시에틸렌화된 알콜, 폴리옥시에틸렌화된 에테르 및 폴리옥시에틸렌화된 소르비톨 에스테르로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제가 소듐 도데실 설페이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제19항에 있어서, 포스파타제가 없을 경우에 조성물에 의해 생성되는 화학발광을 감소시키는데 효과적인 양만큼의 아황산염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제22항에 있어서, 상기 아황산염이 아황산나트륨인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 포스파타제 효소와 제1항 내지 제7항 및 제8항 내지 제22항 기재의 화합물중 적어도 하나의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학발광 생성 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 포스파타제 효소가 박테리아성 알칼리 포스파타제, 포유동물의 알칼리 포스파타제, 식물성 산 포스파타제, 포유동물의 산 포스파타제 및 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트가 합텐, 항체, 단백질, 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 분자에 연결되어 있는 알칼리 포스파타제를 포함하는 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, (a) 화학발광을 검출하는 단계; 및 (b) 상기 화학발광의 양을 이용하여 분석 대상물의 양을 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분석 방법에 의해 샘플중의 분석 대상물을 검출하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 화합물이 제12항 기재의 시약 조성물에 포함된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 인핸서가 제13항 기재의 계면활성제 인핸서인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, (a) 상기 화학식 I로 표시되는 화합물을 제1pH의 완충액중에서 포스파타제 효소와 제1시간 동안 반응시키는 단계; (b) 강염기성 트리거 용액을 상기 완충액에 부가하여, 상기 완충액의 pH를 상기 화학발광을 유도하기 위한 제2pH로 높이는 단계; 및 (c) 상기 화학발광을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 제1pH는 5.0-5.9의 범위이고, 상기 트리거 용액의 pH는 약 11 이상이며, 상기 제1시간은 약 1초 내지 약 1분 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 염기성 트리거 용액이 계면활성제 인핸서를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 계면활성제 인핸서가 비닐벤질트리부틸포스포늄염 및 비닐벤질트리옥틸포스포늄염의 공중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항, 25항 또는 26항중 어느 한 항에 있어서, 인핸서가 양이온성 방향족 화합물의 부재하에 발생되는 화학발광에 비하여 화학발광량을 증가시킬 수 있을 정도의 유효량만큼의 양이온성 방향족 화합물인 제12항 기재의 시약 조성물을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 제19항 내지 23항중 어느 한 항 기재의 시약 조성물을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 시약 조성물이 제17항 내지 23항중 어느 한 항 기재의 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 36항에 있어서, 상기 검출될 분석 대상물이 포스파타제 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 36항에 있어서, 상기 검출될 분석 대상물이 포스파타제 효소의 저해제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 제36항에 있어서, 분석 대상물과 특이적으로 결합하는 특성을 가지며 알칼리 포스파타제로 레이블링되어 있는 분석 대상물 결합성 화합물(analyte-binding compound)을, 샘플중의 상기 분석 대상물과 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 분석 대상물 결합성 화합물이 항체, 항원, 합텐 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 36항에 있어서, 분석 대상물과 특이적으로 결합하는 분석 대상물 결합성 화합물 및 상기 분석 대상물 결합성 화합물과 결합하는 특성을 가진 적어도 하나의 포스파타제 표지형 특이적 결합 물질을, 샘플중의 상기 분석 대상물과 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 또는 36항중 어느 한 항에 있어서, (a) 분석 대상물과 특이적으로 분석 대상물 결합성 화합물 및 적어도 하나의 제2특이적 결합 물질을 포함하는 레이블링된 분석 대상물 결합성 화합물; 및 (b) 상기 제2특이적 결합 물질에 대한 포스파타제 표지형 결합 파트너를, 샘플중의 분석 대상물과 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항 및 제36항 내지 42항중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출이 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 및 나일론 멤브레인으로 이루어진 군에서 선택된 멤브레인 상에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, (a) 초기 기간 동안에 화학발광의 양 또는 세기를 검출하는 단계; (b) 화학발광이 일정한 레벨에 도달할 때까지의 제2시간 동안 기다리는 단계; (c) 제3기간 동안 화학발광의 양 또는 세기를 검출하는 단계; (d) 초기 시간에서의 화학발광을 이용하여 산 포스파타제의 양을 정량하는 단계; 및 (e) 제3시간에서의 화학발광을 이용하여 알칼리 포스파타제의 양을 정량하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 화학발광 분석 방법에 의해 산 포스파타제 및 알칼리 포스파타제를 모두 함유하는 샘플중의 산 포스파타제 및 알칼리 포스파타제를 검출하는 방법.
- (a) 하기 화학식 VIII로 표시되는 헤테로사이클 에스테르 또는 티오에스테르 화합물을 염기와 반응시켜 하기 화학식 VIII로 표시되는 화합물의 에놀레이트를 형성하는 단계;[화학식 VIII]
상기 식 VIII에서, Het, Z 및 R6은 화합물 I에 대해서 정의된 바와 같음.(b) 상기 에놀레이트를 인산화제와 반응시켜, 하기 화학식 IX로 표시되는 보호된 에놀 포스페이트를 형성하는 단계; 및[화학식 IX]
상기 식 IX에서, Het, Z 및 R6은 화합물 전항에서 정의된 바와 같고, Y는 보호기임.(c) 양이온성 종이 탈보호제의 일부가 아닐 경우 양이온성 종 M의 존재하에 화학식 IX로 표시되는 화합물과 적어도 하나의 탈보호제를 반응시켜 에놀 포스페이트를 탈보호시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물의 제조방법.[화학식 I]
상기 식에서, Het는 질소, 산소 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로 원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이며, Z는 산소 및 황 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, R6은 포스파타제와 상기 화학식 1의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 유기기이고, 각각의 M은 독립적으로 수소 및 양이온 중심으로부터 선택된 것이며, n은 전기적으로 중화상태를 만족시킬 수 있는 숫자임. - 제44항에 있어서, 화학식 VII로 표시되는 화합물의 에놀레이트와 인산화제를 반응시켜 보호된 화학식 IX로 표시되는 에놀 포스페이트를 형성하는 단계는, (a) 상기 화학식 VIII로 표시되는 화합물의 에놀레이트를 할로겐화 포스포릴 화합물(POW3, W는 F, Cl, Br 및 I로부터 선택되는 할로겐 원자)과 반응시켜, 하기 식 화학식 X으로 표시되는 에놀 디할로포스페이트를 형성하는 단계; 및[화학식 X]
상기 식에서, Het, Z 및 R6은 화합물 VIII에서 정의된 바와 같음.(b) 상기 화학식 X으로 표시되는 화합물을 적어도 2당량의 수산화 화합물 Y-OH와 반응시켜 화학식 IX로 표시되는 보호된 에놀 포스페이트를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제45항에 있어서, 화학식 VIII로 표시되는 화합물의 에놀레이트와 인산화제를 반응시켜 화학식 IX로 표시되는 보호된 에놀 포스페이트를 형성하는 단계는, 보호기 Y를 함유하며 식 W-PO(OY)2(여기서, W는 불소, 염소, 붕소 및 요오드로부터 선택된 할로겐 원자임)로 표시되는 인산화제와 화학식 VIII로 표시되는 화합물의 에놀레이트를 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, Y기는 저급 알킬기, 치환된 저급 알킬기, 페닐, 치환된 페닐 및 벤질기로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, Y기는 단일기인 -CH2CH2-를 형성하도록 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 탈보호제는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 소듐 메톡사이드, 소듐 에톡사이드, 포타슘 t-부톡사이드, 수산화암모늄과 같은 유기 및 무기 염기, 및 시안화 이온 및 플루오라이드 이온과 같은 친핵제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 Y는 CHCH2N기이고, 탈보호제는 수산화나트륨 및 탄산나트륨으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 Y는 CHCH2N기이고, 탈보호제는 수산화나트륨 및 탄산나트륨으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기식 II로 표시되는 화합물 및 하기식 III으로 표시되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
상기 식에서, R1은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 유기기이고, R2내지 R5각각은 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이며, 인접한 기의 쌍은 상호 결합하여 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리 시스템을 형성할 수 있는 것이며, R6은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 것임. - 제53항에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 하기식으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
상기 식에서, R7내지 R14각각은 독립적으로 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이고, Ar은 아릴 고리기임. - 하기식 IX로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, Het는 적어도 하나의 질소 또는 황 원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이고, Z는 산소 및 황 원자로 이루어진 군에서 선택된 것이며, R6은 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 유기기이며, Y는 제거되면서 포스페이트 염 화합물을 형성하는 보호기임. - 제55항에 있어서, 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R1은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 유기기이고, R2내지 R5각각은 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이며, 인접한 기의 쌍은 상호 결합하여 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리 시스템을 형성할 수 있는 것이며, R6은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 것임. - 제56항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R7내지 R14각각은 독립적으로 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 상기 식의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이고, Ar은 아릴 고리기임. - 제55항 내지 57항중 어느 한 항에 있어서, Y는 CH2CH2CN기인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 하기식 X으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, Het는 적어도 하나의 질소 또는 황 원자를 함유하는 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 헤테로사이클 고리 시스템이고, Z는 산소 및 황 원자로 이루어진 군에서 선택된 것이며, R6은 포스파타제와 상기 식의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 유기기이며, W는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 할로겐 원자임. - 제59항에 있어서, 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R1은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 유기기이고, R2내지 R5각각은 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 상기 식의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이며, 인접한 기의 쌍은 상호 결합하여 하나 이상의 5원환 또는 6원환을 포함하는 카르보사이클 또는 헤테로사이클 고리 시스템을 형성할 수 있는 것이며, R6은 탄소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로 이루어진 군에서 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 아랄킬기로 이루어진 군에서 선택된 것임. - 제60항에 있어서, 하기식으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 화합물.
상기 식에서, R7내지 R14각각은 독립적으로 탄소, 수소, 질소, 산소, 황, 인 및 할로겐 원자로부터 선택되는 원자를 포함하고 상기 원자의 총 수가 1 내지 50이며 포스파타제와 상기 식의 포스페이트기 사이의 반응을 방해하지 않거나 일어나게 하므로써 화학발광을 방해하지 않거나 일어나게 하는 치환기이고, Ar은 아릴 고리기임. - 제59항 내지 61항중 어느 한 항에 있어서, W는 염소 원자인 것을 특징으로 하는 화합물.
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