JP2977895B2 - 増幅化学ルミネセントアッセイ - Google Patents
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- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明分野 本発明は診断法に関しており、より明確には、酵素活
性のアッセイに関するものであり、化学ルミネセント反
応（光放射を引き起こす化学反応）を用いる。特異的な
化学ルミネセント反応とは、酸化剤、特に過酸化水素を
加えた2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（DP
D）、特にルミノール又はイソルミノールと酸化剤によ
るDPDの酸化を触媒するペルオキシダーゼ酵素との間の
ものである。酸化は光放射を伴い、つまりはシグナルを
発生し、これにより酵素活性のアッセイ（検出あるいは
測定）が可能となる。
性のアッセイに関するものであり、化学ルミネセント反
応（光放射を引き起こす化学反応）を用いる。特異的な
化学ルミネセント反応とは、酸化剤、特に過酸化水素を
加えた2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（DP
D）、特にルミノール又はイソルミノールと酸化剤によ
るDPDの酸化を触媒するペルオキシダーゼ酵素との間の
ものである。酸化は光放射を伴い、つまりはシグナルを
発生し、これにより酵素活性のアッセイ（検出あるいは
測定）が可能となる。
2.従来の技術 酵素は、リガンド−結合体アッセイ（例えばイムノア
ッセイ、DNAハイブリダイゼーションアッセイ）におけ
るラベルとして広く用いられており、酵素触媒反応にお
けるシグナル増幅によりアッセイの感度が激的に上昇す
る。化学ルミネセント反応は非常に感度が良く、これま
でにも、従来の酵素アッセイに関する検出限度を改善し
て酵素活性測定にかなり用いられている、L.J.Kricka及
びT.P.Whitehead,Journal of Pharmaceutical and Biom
edical Analysis,5巻,829−833,1987年。
ッセイ、DNAハイブリダイゼーションアッセイ）におけ
るラベルとして広く用いられており、酵素触媒反応にお
けるシグナル増幅によりアッセイの感度が激的に上昇す
る。化学ルミネセント反応は非常に感度が良く、これま
でにも、従来の酵素アッセイに関する検出限度を改善し
て酵素活性測定にかなり用いられている、L.J.Kricka及
びT.P.Whitehead,Journal of Pharmaceutical and Biom
edical Analysis,5巻,829−833,1987年。
アルカリホスファターゼは、欧州特許出願公開公報N
o.254051A及びBronstein他、Journal of Bioluminescen
ce and Chemiluminescence,4巻,99−111,1989年に発表
されたリン酸エステル基質を用いることで化学ルミネセ
ンスで測定可能である。この酵素は、アダマンチル1,2
−ジオキシエタンホスフェートからリン酸基を切断し、
光放射を伴って分解する脱リン酸化中間体を産生する。
この酵素に対するバイオルミネセントアッセイは、更
に、ホタルルシフェリン−Ｏ−リン酸を使用しても可能
である（PCT出願公開公報W087/02667）。この酵素はリ
ン酸基を切断してホタルルシフェリンを遊離させるが、
ルシフェリンはルシフェリンリン酸とは異なり、ホタル
ルシフェラーゼにより触媒されるバイオルミネセント反
応における基質である。
o.254051A及びBronstein他、Journal of Bioluminescen
ce and Chemiluminescence,4巻,99−111,1989年に発表
されたリン酸エステル基質を用いることで化学ルミネセ
ンスで測定可能である。この酵素は、アダマンチル1,2
−ジオキシエタンホスフェートからリン酸基を切断し、
光放射を伴って分解する脱リン酸化中間体を産生する。
この酵素に対するバイオルミネセントアッセイは、更
に、ホタルルシフェリン−Ｏ−リン酸を使用しても可能
である（PCT出願公開公報W087/02667）。この酵素はリ
ン酸基を切断してホタルルシフェリンを遊離させるが、
ルシフェリンはルシフェリンリン酸とは異なり、ホタル
ルシフェラーゼにより触媒されるバイオルミネセント反
応における基質である。
ペルオキシダーゼ活性は基質としてルミノールを使用
すると化学ルミネセンスで測定可能であり、この反応の
分析的有用性は、ある増幅剤、とりわけある種のフェノ
ール類（米国特許4598044及び英国特許出願2205945
A）、又はアミン類（米国特許4729950）の添加により著
者に改善されるものであり、これらは全てNational Res
earch Development Corporationの名義である。
すると化学ルミネセンスで測定可能であり、この反応の
分析的有用性は、ある増幅剤、とりわけある種のフェノ
ール類（米国特許4598044及び英国特許出願2205945
A）、又はアミン類（米国特許4729950）の添加により著
者に改善されるものであり、これらは全てNational Res
earch Development Corporationの名義である。
このような増幅化学ルミネセントアッセイは、ペルオ
キシダーゼ酵素の利用が必要であり、リガンド又はその
結合相手がペルオキシダーゼでラベルされているアッセ
イにおいて元来使用されるということがこれまでの問題
点であった。リガンド又は結合相手が、異なる酵素、特
にアルカリホスファターゼでラベル可能である化学ルミ
ネセントアッセイの開発が望まれるところであった。
キシダーゼ酵素の利用が必要であり、リガンド又はその
結合相手がペルオキシダーゼでラベルされているアッセ
イにおいて元来使用されるということがこれまでの問題
点であった。リガンド又は結合相手が、異なる酵素、特
にアルカリホスファターゼでラベル可能である化学ルミ
ネセントアッセイの開発が望まれるところであった。
従来の技術につきその詳細は「発明の要約」の後に記
載したが、それにより関連事情が明解になるものと思わ
れる。
載したが、それにより関連事情が明解になるものと思わ
れる。
発明の要約 本発明は上述の現存するペルオキシダーゼを基礎とす
る化学ルミネセントアッセイのフェノール性増幅剤を利
用し、第２酵素の存在に対するアッセイの感度を上げる
という発想に基づいている。この発想に従い、ある種の
酵素がある種の非増幅的、あるいはほとんど増幅的でな
い化合物の反応を触媒する可能性が発見され、良質な増
幅剤を産生し、それにより増幅されたペルオキシダーゼ
触媒化学ルミネセント反応の進行を可能にし、更には、
この反応に由来する光放射が増幅剤産生反応において用
いられる酵素に依存することが明らかにされた。化学ル
ミネセント反応をもたらす試薬の存在下において非増幅
的あるいはほとんど増幅的でない化合物が酵素と反応す
るような、一つの試験管でのアッセイとしてこのような
アッセイが遂行可能であることも明らかにされている。
る化学ルミネセントアッセイのフェノール性増幅剤を利
用し、第２酵素の存在に対するアッセイの感度を上げる
という発想に基づいている。この発想に従い、ある種の
酵素がある種の非増幅的、あるいはほとんど増幅的でな
い化合物の反応を触媒する可能性が発見され、良質な増
幅剤を産生し、それにより増幅されたペルオキシダーゼ
触媒化学ルミネセント反応の進行を可能にし、更には、
この反応に由来する光放射が増幅剤産生反応において用
いられる酵素に依存することが明らかにされた。化学ル
ミネセント反応をもたらす試薬の存在下において非増幅
的あるいはほとんど増幅的でない化合物が酵素と反応す
るような、一つの試験管でのアッセイとしてこのような
アッセイが遂行可能であることも明らかにされている。
非増幅的又はほんど増幅的でない化合物とは、本文中
では「増幅剤前駆体」と呼称される。通常、それは増幅
剤の誘導体であり、増幅剤を産生するために酵素作用に
より切断可能である。増幅剤前駆体はリン酸エステル
（phosphate）であることが望ましく、切断に用いる酵
素はアルカリホスファターゼであることが好ましい。
では「増幅剤前駆体」と呼称される。通常、それは増幅
剤の誘導体であり、増幅剤を産生するために酵素作用に
より切断可能である。増幅剤前駆体はリン酸エステル
（phosphate）であることが望ましく、切断に用いる酵
素はアルカリホスファターゼであることが好ましい。
更に、ある種の「抗増幅剤」は、化学ルミネセントア
ッセイにおける増幅剤の効果を阻害することも発見され
た。例えば、パラ−ニトロフェノールはパラ−ヨードフ
ェノールの増幅効果を阻害する。光増幅剤を産生する目
的である酵素を非抗増幅的化合物に作用させることは、
つまりは都合よく切断することであるが、酵素に依存す
るアッセイの増幅を行うもう一つの方法である。つま
り、パラ−ニトロフェノールホスフェートをアルカリホ
スファターゼで切断し、パラ−ニトロフェノールを産生
し、これによりDPD−酸化剤−ペルオキシダーゼ−フェ
ノール性増幅剤の化学ルミネセント反応混合物由来の光
放射を低減させる。非光増幅剤又はほんと活性のない抗
増幅剤とは、通常抗増幅剤の誘導体であり、これらを本
文中では「抗増幅剤前駆体」と呼び。「抗増幅剤」とい
う言いまわしは「阻害剤」よりふさわしく、それは、そ
の言いまわしは増幅化の少なくとも一部分を中和するた
めの化合物に対してのみ必要なものであるという理由に
よる。抗増幅剤は増幅化されていない化学ルミネセント
反応を阻害する必要がなく、又、望ましくは阻害するべ
きではないのである。
ッセイにおける増幅剤の効果を阻害することも発見され
た。例えば、パラ−ニトロフェノールはパラ−ヨードフ
ェノールの増幅効果を阻害する。光増幅剤を産生する目
的である酵素を非抗増幅的化合物に作用させることは、
つまりは都合よく切断することであるが、酵素に依存す
るアッセイの増幅を行うもう一つの方法である。つま
り、パラ−ニトロフェノールホスフェートをアルカリホ
スファターゼで切断し、パラ−ニトロフェノールを産生
し、これによりDPD−酸化剤−ペルオキシダーゼ−フェ
ノール性増幅剤の化学ルミネセント反応混合物由来の光
放射を低減させる。非光増幅剤又はほんと活性のない抗
増幅剤とは、通常抗増幅剤の誘導体であり、これらを本
文中では「抗増幅剤前駆体」と呼び。「抗増幅剤」とい
う言いまわしは「阻害剤」よりふさわしく、それは、そ
の言いまわしは増幅化の少なくとも一部分を中和するた
めの化合物に対してのみ必要なものであるという理由に
よる。抗増幅剤は増幅化されていない化学ルミネセント
反応を阻害する必要がなく、又、望ましくは阻害するべ
きではないのである。
それゆえ、本発明は、増幅剤存在下で、ペルオキシダ
ーゼ、酸化剤及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）間
で化学ルミネセント反応を生起させ、当該反応が生起す
るのを可能とする物質がルミネセンスで検出又は測定さ
れる化学ルミネセントアッセイ法であって、増幅剤前駆
体の酵素触媒反応により増幅剤が産生されるか、又は、
増幅剤が既に存在して抗増幅剤前駆体の酵素触媒反応に
より増幅化作用を少なくとも部分的に阻害する抗増幅剤
が産生され、増感剤若しくは抗増幅剤の産生を触媒する
酵素（遊離若しくは結合体として）又は当該酵素に依存
する物質をアッセイすることを特徴とする化学ルミネセ
ントアッセイ法を供与する。
ーゼ、酸化剤及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）間
で化学ルミネセント反応を生起させ、当該反応が生起す
るのを可能とする物質がルミネセンスで検出又は測定さ
れる化学ルミネセントアッセイ法であって、増幅剤前駆
体の酵素触媒反応により増幅剤が産生されるか、又は、
増幅剤が既に存在して抗増幅剤前駆体の酵素触媒反応に
より増幅化作用を少なくとも部分的に阻害する抗増幅剤
が産生され、増感剤若しくは抗増幅剤の産生を触媒する
酵素（遊離若しくは結合体として）又は当該酵素に依存
する物質をアッセイすることを特徴とする化学ルミネセ
ントアッセイ法を供与する。
本発明はまた、増幅剤存在下において、ペルオキシダ
ーゼ、酸化剤、及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）
の間で化学ルミネセント反応が起こるアッセイを行うた
めのキットであって、当該DPDを含有し、そのキットが
更に（ａ）酵素触媒反応により増幅剤が産生され得る増
幅剤前駆体、又は（ｂ）（ｉ）増幅剤、及び（ii）酵素
触媒反応により増幅反応を少なくとも部分的に阻害する
抗増幅剤が産生され得る抗増幅剤前駆体、のいずれかを
含むことを特徴とする当該キットを包含する。
ーゼ、酸化剤、及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）
の間で化学ルミネセント反応が起こるアッセイを行うた
めのキットであって、当該DPDを含有し、そのキットが
更に（ａ）酵素触媒反応により増幅剤が産生され得る増
幅剤前駆体、又は（ｂ）（ｉ）増幅剤、及び（ii）酵素
触媒反応により増幅反応を少なくとも部分的に阻害する
抗増幅剤が産生され得る抗増幅剤前駆体、のいずれかを
含むことを特徴とする当該キットを包含する。
従来の技術の追記 測定されるべき酵素が基質をある産物へと変換し、そ
の産物が第２受酵素を活性化し、更にそれが基質を測定
可能な産物へと交換する組合せアッセイ（coupled assa
y）法により、酵素に対する検出限界が著者に改善され
得る。この種のアッセイの感度の上昇とは、連続的な酵
素増幅段階の累積効果に依るものである。
の産物が第２受酵素を活性化し、更にそれが基質を測定
可能な産物へと交換する組合せアッセイ（coupled assa
y）法により、酵素に対する検出限界が著者に改善され
得る。この種のアッセイの感度の上昇とは、連続的な酵
素増幅段階の累積効果に依るものである。
英国特許出願公開No.2156518A及びその分割2192889A
（London Biotechnology Ltd.社）は、プロステトゲン
の利用法を開示している。酵素がプロステトゲン（補因
子又は補欠分子族の不活性型）に作用して最終的に検出
される産物を産生する。プロステトゲンはＲ−Ｘの化学
式を有し、Ｒはピリミジン３′−ホスフェート残基であ
り、Ｘは例えばリボフラビンのようにＲを介してリン酸
基に結合した切断基である。その認識システムにより、
Ｒ−Ｘ結合を切断して化合物Ｘ−OH（リボフラビン）を
遊離する酵素リボヌクレアーゼＡを生産する。リボフラ
ビンはリボフラビンキナーゼによる作用を受けてフラビ
ンモノヌクレオチド（FMN）を産生し、これが検出のた
めの更なる反応を経てゆく。
（London Biotechnology Ltd.社）は、プロステトゲン
の利用法を開示している。酵素がプロステトゲン（補因
子又は補欠分子族の不活性型）に作用して最終的に検出
される産物を産生する。プロステトゲンはＲ−Ｘの化学
式を有し、Ｒはピリミジン３′−ホスフェート残基であ
り、Ｘは例えばリボフラビンのようにＲを介してリン酸
基に結合した切断基である。その認識システムにより、
Ｒ−Ｘ結合を切断して化合物Ｘ−OH（リボフラビン）を
遊離する酵素リボヌクレアーゼＡを生産する。リボフラ
ビンはリボフラビンキナーゼによる作用を受けてフラビ
ンモノヌクレオチド（FMN）を産生し、これが検出のた
めの更なる反応を経てゆく。
欧州特許出願公開27036A（C.H.Self）は、酵素が第２
酵素の調節因子を産生するか又は除去する組合せアッセ
イ法を記載している。調節因子とは、活性化因子、阻害
物質、基質、補因子、補酵素又は金属イオンであり得
る。
酵素の調節因子を産生するか又は除去する組合せアッセ
イ法を記載している。調節因子とは、活性化因子、阻害
物質、基質、補因子、補酵素又は金属イオンであり得
る。
PCT出願公開No.W081/00725（P.Duffy及びThe Prince
Charles Hospital Development Center Trust）は、他
の複雑なシステムを記載しており、これは以下の様に例
示され得る。検出されるリガンド、ジゴキシンは抗ジゴ
キシン抗体に対して酵素複合体化ジゴキシンと競合す
る。酵素はβ−ガラクトシダーゼである。遊離のあるい
は結合している複合体を検出するために、β−ガラクト
シダーゼをフェノールを産生するフェニルβ−ガラクシ
ド基質と反応させる。このフェノール産物をチロシナー
ゼと共に反応させてオルトキノンを産生させるが、これ
はNADHのNADへの酸化反応によりＯ−カテコールへと還
元される。
Charles Hospital Development Center Trust）は、他
の複雑なシステムを記載しており、これは以下の様に例
示され得る。検出されるリガンド、ジゴキシンは抗ジゴ
キシン抗体に対して酵素複合体化ジゴキシンと競合す
る。酵素はβ−ガラクトシダーゼである。遊離のあるい
は結合している複合体を検出するために、β−ガラクト
シダーゼをフェノールを産生するフェニルβ−ガラクシ
ド基質と反応させる。このフェノール産物をチロシナー
ゼと共に反応させてオルトキノンを産生させるが、これ
はNADHのNADへの酸化反応によりＯ−カテコールへと還
元される。
欧州特許出願公開No.49606A（C.H.Self）において
は、増幅システムは以下のごとく例証されている。クレ
アチンキナーゼはATPを産生させるクレアチンリン酸と
の反応により検出される。このATPは、「活性化剤」と
して記載されているが、これは、ATPのADPへの変換を伴
いながら酵素フルクトースホスホキナーゼにより触媒さ
れるフルクトース６リン酸のフルクトース２リン酸への
反応を促進するために用いられる。このADPはその後、
それ自身がATPへと変換される場である第２の酵素反応
を促進するのに用いられる。「促進剤」として記載され
ているこのATPはサイクルの最初へとフィードバックす
る。最終的には第２の酵素反応が検出可能な産物を産生
する。「活性化剤」とは、この酵素反応に必要な他の全
ての成分が存在する時に酵素反応を起こすのに必要な物
質であるとして定義される。
は、増幅システムは以下のごとく例証されている。クレ
アチンキナーゼはATPを産生させるクレアチンリン酸と
の反応により検出される。このATPは、「活性化剤」と
して記載されているが、これは、ATPのADPへの変換を伴
いながら酵素フルクトースホスホキナーゼにより触媒さ
れるフルクトース６リン酸のフルクトース２リン酸への
反応を促進するために用いられる。このADPはその後、
それ自身がATPへと変換される場である第２の酵素反応
を促進するのに用いられる。「促進剤」として記載され
ているこのATPはサイクルの最初へとフィードバックす
る。最終的には第２の酵素反応が検出可能な産物を産生
する。「活性化剤」とは、この酵素反応に必要な他の全
ての成分が存在する時に酵素反応を起こすのに必要な物
質であるとして定義される。
P.D.Mize他、Analytical Biochemistry,179巻,229−2
35,1989年は、カルボキシルエステラーゼの遮蔽された
阻害剤の利用につき記載してある。アルカリホスファタ
ーゼの作用による脱リン酸化は阻害剤を脱遮蔽化し、カ
ルボキシルエステラーゼの酵素活性を再生させる。
35,1989年は、カルボキシルエステラーゼの遮蔽された
阻害剤の利用につき記載してある。アルカリホスファタ
ーゼの作用による脱リン酸化は阻害剤を脱遮蔽化し、カ
ルボキシルエステラーゼの酵素活性を再生させる。
図面の簡単な説明 図１（実施例２参照）は、増幅剤前駆体を使用する本
発明の方法によるアルカリホスファターゼのアッセイに
対する標準曲線を示し、 図２（実施例３参照）は、増幅剤及び抗増幅剤前駆体を
使用する本発明の方法によるアルカリホスファターゼの
アッセイに対する標準曲線を示す。
発明の方法によるアルカリホスファターゼのアッセイに
対する標準曲線を示し、 図２（実施例３参照）は、増幅剤及び抗増幅剤前駆体を
使用する本発明の方法によるアルカリホスファターゼの
アッセイに対する標準曲線を示す。
好適実施態様の詳細 増幅化学ルミネセントアッセイは上述の従来の特許明
細書において充分に記載されている。それらに記載して
ある試薬、その濃度、インキュベーション条件及び他の
アッセイ条件は、必要な変更を加えて本発明に適用可能
であり、参照により本明細書内に援用する。
細書において充分に記載されている。それらに記載して
ある試薬、その濃度、インキュベーション条件及び他の
アッセイ条件は、必要な変更を加えて本発明に適用可能
であり、参照により本明細書内に援用する。
この反応は好適試薬を使用して以下のごとく例示され
得る。
得る。
反応の総光放射及び／又はシグナル対バックグランド
比が、増幅剤無しで行なわれる同一の反応において得ら
れるものよりも大きい値であるという意味で、化学ルミ
ネセントアッセイは「増幅された」として記載されてい
る。増幅化のメカニズムは充分には理解されていない
が、上述の従来の明細書ではかなりの数の増幅剤を同定
している。とりわけ好ましいとされているのは、ｐ−ヨ
ードフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸及びｐ−イミ
ダゾール−１−イルフェノールである。他の例として
は、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−フェニルフェノール、
２−ナフトール、６−ブロモ−２−ナフトール及び６−
ヒドロキシベンゾチアゾールがある。
比が、増幅剤無しで行なわれる同一の反応において得ら
れるものよりも大きい値であるという意味で、化学ルミ
ネセントアッセイは「増幅された」として記載されてい
る。増幅化のメカニズムは充分には理解されていない
が、上述の従来の明細書ではかなりの数の増幅剤を同定
している。とりわけ好ましいとされているのは、ｐ−ヨ
ードフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸及びｐ−イミ
ダゾール−１−イルフェノールである。他の例として
は、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−フェニルフェノール、
２−ナフトール、６−ブロモ−２−ナフトール及び６−
ヒドロキシベンゾチアゾールがある。
本発明においては増幅剤前駆体又は抗増幅剤前駆体が
用いられている。これらが相対的な言いまわしであるこ
とは理解されるものと思われる。増幅剤前駆体と増幅剤
との間の増幅化における違いは絶対的に必須なものであ
る。増幅剤前駆体のわずかな増幅効果は、その増幅剤前
駆体と増幅剤を用いて行なわれる増幅化における差異が
適度に大きい限り、差しつかえのないものである。同様
に、抗増幅剤前駆体は、抗増幅剤前駆体と抗増幅剤とを
用いて行なわれる増幅化の阻害における差異が充分に大
きい限り、増幅化に対して完全に阻害的である必要はな
い。通常では、前駆体化合物が増幅化又は増幅化の阻害
において何の効果も及ぼさないものであるか、又は微小
若しくは微弱な効果を示すかのいづれかであることが望
ましい。前駆体化合物はアルカリホスファターゼにより
切断されるリン酸エステル（phosphate）であることが
望ましく、それによってこの酵素を直接アッセイにかけ
ることが可能となる。（当然、例えばリガンド−酵素複
合体、それと競合するリガンド又はリガンドの結合相手
もまた間接的にアッセイすることが可能であり、アッセ
イ過程におけるラベルとしての酵素に依存するという理
由により、それらの物質の各々は測定可能である）。
用いられている。これらが相対的な言いまわしであるこ
とは理解されるものと思われる。増幅剤前駆体と増幅剤
との間の増幅化における違いは絶対的に必須なものであ
る。増幅剤前駆体のわずかな増幅効果は、その増幅剤前
駆体と増幅剤を用いて行なわれる増幅化における差異が
適度に大きい限り、差しつかえのないものである。同様
に、抗増幅剤前駆体は、抗増幅剤前駆体と抗増幅剤とを
用いて行なわれる増幅化の阻害における差異が充分に大
きい限り、増幅化に対して完全に阻害的である必要はな
い。通常では、前駆体化合物が増幅化又は増幅化の阻害
において何の効果も及ぼさないものであるか、又は微小
若しくは微弱な効果を示すかのいづれかであることが望
ましい。前駆体化合物はアルカリホスファターゼにより
切断されるリン酸エステル（phosphate）であることが
望ましく、それによってこの酵素を直接アッセイにかけ
ることが可能となる。（当然、例えばリガンド−酵素複
合体、それと競合するリガンド又はリガンドの結合相手
もまた間接的にアッセイすることが可能であり、アッセ
イ過程におけるラベルとしての酵素に依存するという理
由により、それらの物質の各々は測定可能である）。
本発明の２つの主な具体例を説明する。好適な増幅剤
前駆体であるパラ−ヨードフェノールホスフェート（PI
PP）はアルカリホスファターゼにより切断されてパラ−
ヨードフェノールを遊離し、これはペルオキシダーゼに
触媒される化学ルミネセントDPD−過酸化物反応の強力
な増幅剤である。PIPPは増幅剤としては作用せず、つま
り増幅化されていない環境に於いては化学ルミネセンス
のシグナルを発しない。限定された量のアルカリホスフ
ァダーゼの存在下では、光放射の量は酵素活性に依存す
る。このアッセイは段階法において行われ得るが、アル
カリホスファターゼを含むテストサンプルと共に全ての
アッセイ試薬（PIPP、ペルオキシダーゼ、DPD及び過酸
化物）を混ぜ合わせた単一段階において行うことが望ま
しい。
前駆体であるパラ−ヨードフェノールホスフェート（PI
PP）はアルカリホスファターゼにより切断されてパラ−
ヨードフェノールを遊離し、これはペルオキシダーゼに
触媒される化学ルミネセントDPD−過酸化物反応の強力
な増幅剤である。PIPPは増幅剤としては作用せず、つま
り増幅化されていない環境に於いては化学ルミネセンス
のシグナルを発しない。限定された量のアルカリホスフ
ァダーゼの存在下では、光放射の量は酵素活性に依存す
る。このアッセイは段階法において行われ得るが、アル
カリホスファターゼを含むテストサンプルと共に全ての
アッセイ試薬（PIPP、ペルオキシダーゼ、DPD及び過酸
化物）を混ぜ合わせた単一段階において行うことが望ま
しい。
別の方法としては、好適抗増幅剤前駆体、パラ−ニト
ロフェニルホスフェート（PNPP）は、アルカリホスファ
ターゼにより切断されてパラ−ニトロフェノールを遊離
するが、これはパラ−ヨードフェノールで増幅されるペ
ルオキシダーゼ触媒化学ルミネセントDPD−過酸化物反
応の阻害剤である。PNPPは弱い阻害剤として作用する
が、それはおそらくパラ−ニトロフェノールへの非酵素
的な加水分解によるものと思われる（R.B.McComb,G.H.B
owers及びPosen,Alkaline Phosphatase,Plenum Press,N
ew York,1979年p.234）が、これは酵素的に産生される
パラ−ニトロフェノールにより生じる阻害に比較すると
些細なものである。限定された量のアルカリホスファタ
ーゼ存在下では光放射の減少（％阻害）は酵素活性に逆
比例的に依存する。
ロフェニルホスフェート（PNPP）は、アルカリホスファ
ターゼにより切断されてパラ−ニトロフェノールを遊離
するが、これはパラ−ヨードフェノールで増幅されるペ
ルオキシダーゼ触媒化学ルミネセントDPD−過酸化物反
応の阻害剤である。PNPPは弱い阻害剤として作用する
が、それはおそらくパラ−ニトロフェノールへの非酵素
的な加水分解によるものと思われる（R.B.McComb,G.H.B
owers及びPosen,Alkaline Phosphatase,Plenum Press,N
ew York,1979年p.234）が、これは酵素的に産生される
パラ−ニトロフェノールにより生じる阻害に比較すると
些細なものである。限定された量のアルカリホスファタ
ーゼ存在下では光放射の減少（％阻害）は酵素活性に逆
比例的に依存する。
化合物前駆体に作用する酵素は本明細書の目的のため
便宜的に「産生化酵素」と呼ぶ。
便宜的に「産生化酵素」と呼ぶ。
本発明では産生化酵素としてのアルカリホスファター
ゼに関して特に興味があるが、これは酵素イムノアッセ
イにおける特に有用な酵素であり、また、他の種々の酵
素に関連しても使用可能である。置換フェノール増幅剤
は、例えば、そのβ−Ｄ−ガラクトピラノシド化物から
β−Ｄ−ガラクドシダーゼにより、そのグルコピラノシ
ド化物からβ−Ｄ−グルコシダーゼにより、その硫酸化
物（sulfate）からアリールスルファターゼにより、あ
るいはそのカルボキシレートエステルからカルボキシエ
ステラーゼにより、生産可能である。ラクト−Ｎ−バイ
オシド、つまり２−アセトアミド−２−デオキシ−３−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−グリコピラ
ノシドはフコシルトランスフェラーゼにより切断可能で
あり、又、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドはＮ
−アセチルグルコサミニダーゼ（「NAG」）により切断
可能であるが、これらのようなより複雑な誘導体も使用
可能である。
ゼに関して特に興味があるが、これは酵素イムノアッセ
イにおける特に有用な酵素であり、また、他の種々の酵
素に関連しても使用可能である。置換フェノール増幅剤
は、例えば、そのβ−Ｄ−ガラクトピラノシド化物から
β−Ｄ−ガラクドシダーゼにより、そのグルコピラノシ
ド化物からβ−Ｄ−グルコシダーゼにより、その硫酸化
物（sulfate）からアリールスルファターゼにより、あ
るいはそのカルボキシレートエステルからカルボキシエ
ステラーゼにより、生産可能である。ラクト−Ｎ−バイ
オシド、つまり２−アセトアミド−２−デオキシ−３−
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−グリコピラ
ノシドはフコシルトランスフェラーゼにより切断可能で
あり、又、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドはＮ
−アセチルグルコサミニダーゼ（「NAG」）により切断
可能であるが、これらのようなより複雑な誘導体も使用
可能である。
産生化酵素としてペルオキシダーゼを用いるのは当初
からの意図ではないにせよ、これは実行可能なことであ
り、本発明の範囲内に含まれる。化学ルミネセント反応
においては通常のペルオキシダーゼ、望ましくはシグマ
社のタイプVIのような塩基性の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼが意図される。ペルオキシダーゼのイソ酵素、例え
ばシグマ社のタイプVIIのような酸性の西洋ワサビペル
オキシダーゼが産生化酵素として使用可能である。
からの意図ではないにせよ、これは実行可能なことであ
り、本発明の範囲内に含まれる。化学ルミネセント反応
においては通常のペルオキシダーゼ、望ましくはシグマ
社のタイプVIのような塩基性の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼが意図される。ペルオキシダーゼのイソ酵素、例え
ばシグマ社のタイプVIIのような酸性の西洋ワサビペル
オキシダーゼが産生化酵素として使用可能である。
酵素により切断可能なある種のｐ−ニトロフェノール
誘導体が酵素反応のための基質として用いられてきてお
り、これによりｐ−ニトロフェノール（クロモゲン）を
産生する。ｏ−メトキシフェノール、ｐ−メトキシフェ
ノール及び４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸のよ
うなある種のフェノールは抗増幅剤である。これらの化
合物のリン酸エステル（phosphate）、ガラクトシド化
物等は、抗増幅剤を産生するために酵素により切断可能
な抗増幅剤前駆体である。それゆえ、本発明において抗
増幅剤前駆体としての使用に対して有効な市販の誘導体
が数多く存在する。
誘導体が酵素反応のための基質として用いられてきてお
り、これによりｐ−ニトロフェノール（クロモゲン）を
産生する。ｏ−メトキシフェノール、ｐ−メトキシフェ
ノール及び４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸のよ
うなある種のフェノールは抗増幅剤である。これらの化
合物のリン酸エステル（phosphate）、ガラクトシド化
物等は、抗増幅剤を産生するために酵素により切断可能
な抗増幅剤前駆体である。それゆえ、本発明において抗
増幅剤前駆体としての使用に対して有効な市販の誘導体
が数多く存在する。
増幅剤で最も成功したものは従来フェノール性化合物
（置換フェノール類及びナフトール類）であったが、ア
ミン類も使用可能である。一般的には、Ｎ−メチル化ア
ミン類が適切な増幅剤前駆体である。例えば、Ｎ−メチ
ル−ｐ−アニシジンはペルオキシダーゼの酸性イソ酵素
（先に説明した様に、これは通常のペルオキシダーゼと
は異なる）又はチトクロームＰ−450によりほとんどが
脱メチル化物へと化学的に変換され得る。酵素が化合物
前駆体に作用するという反応は通常は一種の切断である
が、例えば、パラ−ヨードフェノールへのフェノールと
ヨージナーゼ酵素との反応、又は上述の脱メチル化酵素
の存在下においてN,N′,N,N′−テトラメチルベンジジ
ンを生じさせるためのN,N−ジメチルアニリンの反応の
様な、他の種類の反応も予想される。
（置換フェノール類及びナフトール類）であったが、ア
ミン類も使用可能である。一般的には、Ｎ−メチル化ア
ミン類が適切な増幅剤前駆体である。例えば、Ｎ−メチ
ル−ｐ−アニシジンはペルオキシダーゼの酸性イソ酵素
（先に説明した様に、これは通常のペルオキシダーゼと
は異なる）又はチトクロームＰ−450によりほとんどが
脱メチル化物へと化学的に変換され得る。酵素が化合物
前駆体に作用するという反応は通常は一種の切断である
が、例えば、パラ−ヨードフェノールへのフェノールと
ヨージナーゼ酵素との反応、又は上述の脱メチル化酵素
の存在下においてN,N′,N,N′−テトラメチルベンジジ
ンを生じさせるためのN,N−ジメチルアニリンの反応の
様な、他の種類の反応も予想される。
Ｎ−メチル−パラ−アニシジンはDPD、酸化剤及びペ
ルオキシダーゼの当該化学ルミネセント反応を取りたて
て言及しなければならない程までに増幅しはしない。現
在までに、西洋ワサビペルオキシダーゼの酸性イソ酵素
がＮ−メチル−ｐ−アニシジンに作用する場合には、ｐ
−アニシジンを含む結果的産物は当該化学ルミネセント
反応に対する増幅剤として作用することが明らかにされ
ている。ペルオキシダーゼの酸性イソ酵素の存在下で
は、化学ルミネセント反応は微弱にのみ引き起こされ
る。しかしながら、このような酸性イソ酵素は産生化酵
素として、つまり適切なリガンドへのラベルとして使用
可能であり、更に、それは増幅剤前駆体であるＮ−メチ
ル−ｐ−アニシジンの増幅剤への反応を触媒するという
理由により、本発明のアッセイにより検出され得るので
ある。
ルオキシダーゼの当該化学ルミネセント反応を取りたて
て言及しなければならない程までに増幅しはしない。現
在までに、西洋ワサビペルオキシダーゼの酸性イソ酵素
がＮ−メチル−ｐ−アニシジンに作用する場合には、ｐ
−アニシジンを含む結果的産物は当該化学ルミネセント
反応に対する増幅剤として作用することが明らかにされ
ている。ペルオキシダーゼの酸性イソ酵素の存在下で
は、化学ルミネセント反応は微弱にのみ引き起こされ
る。しかしながら、このような酸性イソ酵素は産生化酵
素として、つまり適切なリガンドへのラベルとして使用
可能であり、更に、それは増幅剤前駆体であるＮ−メチ
ル−ｐ−アニシジンの増幅剤への反応を触媒するという
理由により、本発明のアッセイにより検出され得るので
ある。
産生化酵素は、酵素的触媒による増幅剤分子の産生に
光放射の増幅（あるいは増幅の低減）が依存するよう
に、増幅剤前駆体又は抗増幅剤前駆体の濃度に対して限
られた濃度において使用されるべきである。明らかに、
酵素が過剰に存在する場合には要求される依存性は確立
されないことになる。光放射（又はその低減）は、存在
する酵素の全ての濃度範囲において必ずしもその濃度に
直接比例するものではない。いかなる特異的な酵素に対
しても、標準曲線を確立することは必要であると思われ
る。
光放射の増幅（あるいは増幅の低減）が依存するよう
に、増幅剤前駆体又は抗増幅剤前駆体の濃度に対して限
られた濃度において使用されるべきである。明らかに、
酵素が過剰に存在する場合には要求される依存性は確立
されないことになる。光放射（又はその低減）は、存在
する酵素の全ての濃度範囲において必ずしもその濃度に
直接比例するものではない。いかなる特異的な酵素に対
しても、標準曲線を確立することは必要であると思われ
る。
フェノール類、ナフトール類、アミン類及びベンゾチ
アゾール類によるHRP−触媒ルミノール−過酸化物反応
の増幅は特異的な濃度依存性を有する。少量の増幅剤が
光放射の多大な増幅を生じさせるものの、増幅剤がより
高い濃度であると増幅効果は低減される。この濃度依存
性の典型的な例は以下のごとく発表されている。パラヨ
ードフェノール、G.H.G.Thorpe他、Clinical Chemistr
y,31巻,1335−1341,1985年、及び、６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール、G.H.G.Thorpe他、Analytical Biochemis
try,145巻,96〜100,1985年。
アゾール類によるHRP−触媒ルミノール−過酸化物反応
の増幅は特異的な濃度依存性を有する。少量の増幅剤が
光放射の多大な増幅を生じさせるものの、増幅剤がより
高い濃度であると増幅効果は低減される。この濃度依存
性の典型的な例は以下のごとく発表されている。パラヨ
ードフェノール、G.H.G.Thorpe他、Clinical Chemistr
y,31巻,1335−1341,1985年、及び、６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール、G.H.G.Thorpe他、Analytical Biochemis
try,145巻,96〜100,1985年。
酵素は増幅剤前駆体又は抗増幅剤前駆体と共にあらか
じめインキュベートすることが可能であるが、一段階法
を使用するようにするために酵素を化学ルミネセント反
応物及び増幅剤前駆体（又は増幅剤＋抗増幅剤前駆体）
へ添加することが望ましい。
じめインキュベートすることが可能であるが、一段階法
を使用するようにするために酵素を化学ルミネセント反
応物及び増幅剤前駆体（又は増幅剤＋抗増幅剤前駆体）
へ添加することが望ましい。
光放射は、10分から30分後に光電増倍管チューブを使
用して測定するのが望ましい。しかしながら、反応によ
っては赤熱が放射されるので希望であればそれを写真撮
影することも可能である。
用して測定するのが望ましい。しかしながら、反応によ
っては赤熱が放射されるので希望であればそれを写真撮
影することも可能である。
米国特許4598044及び英国特許出願2205945Aに記載さ
れているように、フェノール増幅化学ルミネセント反応
は、本来ペルオキシダーゼの検出に最適化されていた。
本発明の増幅剤前駆体に基づくアッセイは増幅剤の検出
を必要とし、それゆえ最初にこの反応を増幅剤パラ−ヨ
ードフェノールの検出のために再最適化したのである。
至適条件決定実験（ナトリウムルミノール1.25mmol/l〜
12.5μmole/l、過酸化物2.7mmole/l〜27μmole/l、ペル
オキシダーゼ10ng〜1pg、pH8.6）により、ナトリウムル
ミノール42μmole/l、過酸化物2mmole/l及びペルオキシ
ダーゼ1ngが含まれる0.01mole/lのトリスバッファ（pH
8.6）アッセイ用混合液を用いた場合、感度とルミノメ
ーターの測定域との間の至適条件が得られることが示さ
れた。このような条件下において、パラ−ヨードフェノ
ールに対するアッセイでは45ピコモルから4.5フェムト
モルにわたる範囲内で直線性が示された。対照の２倍の
シグナルを基にした検出限界は1.2フェムトモルであっ
た。
れているように、フェノール増幅化学ルミネセント反応
は、本来ペルオキシダーゼの検出に最適化されていた。
本発明の増幅剤前駆体に基づくアッセイは増幅剤の検出
を必要とし、それゆえ最初にこの反応を増幅剤パラ−ヨ
ードフェノールの検出のために再最適化したのである。
至適条件決定実験（ナトリウムルミノール1.25mmol/l〜
12.5μmole/l、過酸化物2.7mmole/l〜27μmole/l、ペル
オキシダーゼ10ng〜1pg、pH8.6）により、ナトリウムル
ミノール42μmole/l、過酸化物2mmole/l及びペルオキシ
ダーゼ1ngが含まれる0.01mole/lのトリスバッファ（pH
8.6）アッセイ用混合液を用いた場合、感度とルミノメ
ーターの測定域との間の至適条件が得られることが示さ
れた。このような条件下において、パラ−ヨードフェノ
ールに対するアッセイでは45ピコモルから4.5フェムト
モルにわたる範囲内で直線性が示された。対照の２倍の
シグナルを基にした検出限界は1.2フェムトモルであっ
た。
サンプル、増幅剤前駆体及び増幅化学ルミネセント試
薬が同時にインキュベートされる「試験管上でのアッセ
イ」法において、PIPP基質の濃度を数種の濃度（15.5mm
ole/l〜33mole/l）について検討したところ、シグナル
対ノイズ比に基づき3.3mmole/l（最終濃度0.33mmole/
l）という値が最適値であるとみなされた。アッセイの
反応は図１のような曲線型を描いた。対照の２倍のシグ
ナルに基づく検出限界は100アトモルであった。
薬が同時にインキュベートされる「試験管上でのアッセ
イ」法において、PIPP基質の濃度を数種の濃度（15.5mm
ole/l〜33mole/l）について検討したところ、シグナル
対ノイズ比に基づき3.3mmole/l（最終濃度0.33mmole/
l）という値が最適値であるとみなされた。アッセイの
反応は図１のような曲線型を描いた。対照の２倍のシグ
ナルに基づく検出限界は100アトモルであった。
本発明は、とりわけサンドウィッチ式及び競合式のEL
ISA法に適用可能であり、又、特異的結合の相互作用に
係わり、酵素ラベルによって測定可能な任意の化学的又
は生物学的物質を測定するアッセイに適用可能である。
ISA法に適用可能であり、又、特異的結合の相互作用に
係わり、酵素ラベルによって測定可能な任意の化学的又
は生物学的物質を測定するアッセイに適用可能である。
以下の実施例は本発明を例証するものである。一貫し
て、リン酸エステルはそれらの２ナトリウム塩の型をと
り、ルミノールはそのナトリウム塩である。光放射は一
貫して適当な単位で示される。
て、リン酸エステルはそれらの２ナトリウム塩の型をと
り、ルミノールはそのナトリウム塩である。光放射は一
貫して適当な単位で示される。
実施例１ パラ−ヨードフェニルホスフェート（PIPP）の合成 アルゴン存在下で、ｐ−ヨードフェノール（Aldrich
社,12.0mmol）をトリエチルアミン（12.9mmol）を含有
する乾燥THE（25ml）中に溶解した。氷浴中で冷却しな
がら、２−クロロ−２−オキソ−1,3,2−ジオキサホス
ホラン（Fluka,Chemical Co.社Hauppage,NY,U.S.A.,13.
0mmol）を注射針を通して添加した。懸濁液を室温にま
で暖め、４時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレー
ター上で除去し、ペーストを無水ジエチルエーテル（90
ml）で処理した。アルゴン下での濾過及び濾液の濃縮に
より油状物が得られ、それは後に固化した。粗ホスホラ
ンに乾燥DMFに溶解したNaCN（14.0mmol）を添加し、室
温で24時間成分を攪拌して開環化させた。真空下で溶媒
を除去し、無水エーテルで残留物を粉砕した後、ゴム質
の２−シアノエチルホスフェートジエステルを45℃下で
24時間、7M NH4OH（21ml）と共に攪拌してモノエステ
ルへとβ−脱離化した。その溶液を濃縮して湿潤残留物
にし、無水エタノール中に再溶解し、メタノール中の25
％ナトリウムメトキシド（Aldrich社,12.0mmol）で処理
した。無水エタノールの蒸発を数度繰り返して水の共沸
除去を行った。２ナトリウム塩としての標記化合物をそ
の後アセトンで沈殿させ、濾過により白色固体（水和
物）として分離したところ、高収率を得た。1HNMR（400
MHz,D2O,TMSを外部対照として使用）：δ4.65（S,HO
D）：δ6.83（d,2H）：δ7.50（d.2H）。IR（cm-1）124
0（Ｐ＝０）、1120及び1000（Ｐ−Ｏ−Ｃ芳香族）、100
0及び820（パラ−置換ベンゼン環）。
社,12.0mmol）をトリエチルアミン（12.9mmol）を含有
する乾燥THE（25ml）中に溶解した。氷浴中で冷却しな
がら、２−クロロ−２−オキソ−1,3,2−ジオキサホス
ホラン（Fluka,Chemical Co.社Hauppage,NY,U.S.A.,13.
0mmol）を注射針を通して添加した。懸濁液を室温にま
で暖め、４時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレー
ター上で除去し、ペーストを無水ジエチルエーテル（90
ml）で処理した。アルゴン下での濾過及び濾液の濃縮に
より油状物が得られ、それは後に固化した。粗ホスホラ
ンに乾燥DMFに溶解したNaCN（14.0mmol）を添加し、室
温で24時間成分を攪拌して開環化させた。真空下で溶媒
を除去し、無水エーテルで残留物を粉砕した後、ゴム質
の２−シアノエチルホスフェートジエステルを45℃下で
24時間、7M NH4OH（21ml）と共に攪拌してモノエステ
ルへとβ−脱離化した。その溶液を濃縮して湿潤残留物
にし、無水エタノール中に再溶解し、メタノール中の25
％ナトリウムメトキシド（Aldrich社,12.0mmol）で処理
した。無水エタノールの蒸発を数度繰り返して水の共沸
除去を行った。２ナトリウム塩としての標記化合物をそ
の後アセトンで沈殿させ、濾過により白色固体（水和
物）として分離したところ、高収率を得た。1HNMR（400
MHz,D2O,TMSを外部対照として使用）：δ4.65（S,HO
D）：δ6.83（d,2H）：δ7.50（d.2H）。IR（cm-1）124
0（Ｐ＝０）、1120及び1000（Ｐ−Ｏ−Ｃ芳香族）、100
0及び820（パラ−置換ベンゼン環）。
実施例２ 増幅剤パラ−ヨードフェニル（PIP）のそのリン酸エス
テル（PIPP）（増幅剤前駆体）からの解離に基づくアル
カリホスファターゼのアッセイ アルカリホスファターゼ（ウシ、1260単位/mg蛋白
質、Sigma社）を含有する10μｌのサンプルを、10μｌ
のPIPP（0.1mol/l pH8.6のトリスバッファー中0.1mg/m
l）及び100μｌのルミノール−HRP−過酸化物試薬を含
むアッセイチューブに添加した。ルミノール−HRP−過
酸化物試薬は以下のごとく調製した。ナトリウムルミノ
ール（12.5mg）を50mlのトリスバッファー（0.1mol/l,p
H8.6）に溶解した。3mlのアリコートを２μｌの過酸化
水素（30％V/V）と混合し、この混合液をトリスバッフ
ァー中に1:30で希釈した。100μｌのHRP（トリスバッフ
ァー中1mg/mlの保存液を1:50,000に希釈したもの）及び
ルミノール−過酸化物の1:30の希釈液mlを混合し、最終
的にルミノール−HRP−過酸化物アッセイ用試薬を得
た。このアッセイ用混液を、１時間室温でインキュベー
トし、ルミノメータ（LB9500,Berthold Laboratories
社,Nashua,NH）を利用して、時間間隔をおいて光強度を
測定した。「対照」、つまりルミノール、過酸化物、ペ
ルオキシダーゼ及びPIPPについても測定した。結果を以
下の表１に示す。
テル（PIPP）（増幅剤前駆体）からの解離に基づくアル
カリホスファターゼのアッセイ アルカリホスファターゼ（ウシ、1260単位/mg蛋白
質、Sigma社）を含有する10μｌのサンプルを、10μｌ
のPIPP（0.1mol/l pH8.6のトリスバッファー中0.1mg/m
l）及び100μｌのルミノール−HRP−過酸化物試薬を含
むアッセイチューブに添加した。ルミノール−HRP−過
酸化物試薬は以下のごとく調製した。ナトリウムルミノ
ール（12.5mg）を50mlのトリスバッファー（0.1mol/l,p
H8.6）に溶解した。3mlのアリコートを２μｌの過酸化
水素（30％V/V）と混合し、この混合液をトリスバッフ
ァー中に1:30で希釈した。100μｌのHRP（トリスバッフ
ァー中1mg/mlの保存液を1:50,000に希釈したもの）及び
ルミノール−過酸化物の1:30の希釈液mlを混合し、最終
的にルミノール−HRP−過酸化物アッセイ用試薬を得
た。このアッセイ用混液を、１時間室温でインキュベー
トし、ルミノメータ（LB9500,Berthold Laboratories
社,Nashua,NH）を利用して、時間間隔をおいて光強度を
測定した。「対照」、つまりルミノール、過酸化物、ペ
ルオキシダーゼ及びPIPPについても測定した。結果を以
下の表１に示す。
上述の方法及びアルカリホスファターゼの様々な希釈
液を用い、アルカリホスファターゼのアッセイ用の標準
曲線（図１）を作成し、アトモル単位で示したアルカリ
ホスファターゼの濃度に対して縦軸に適当な単位（カウ
ント数/10秒）による光放射をプロットした。アトモル
量の酵素を検出した。
液を用い、アルカリホスファターゼのアッセイ用の標準
曲線（図１）を作成し、アトモル単位で示したアルカリ
ホスファターゼの濃度に対して縦軸に適当な単位（カウ
ント数/10秒）による光放射をプロットした。アトモル
量の酵素を検出した。
PIPP基質はアッセイの条件下では安全であった。PIPP
は存在するがアルカリホスファターゼを省略した対照実
験により、非酵素的加水分解は微小であることが示され
た。
は存在するがアルカリホスファターゼを省略した対照実
験により、非酵素的加水分解は微小であることが示され
た。
実施例３ 抗増幅剤ｐ−ニトロフェノール（PNP）のそのリン酸エ
ステル（PNPP）（抗増幅剤前駆体）からの解離に基づく
アルカリホスファターゼのアッセイ 初期実験において、化学ルミネセント用反応混合液中
に存在する280ナノモル／リットルの濃度のPNPは90％以
上の放射を阻害することが示された。1.4マイクロモル
／リットルでは98％阻害が成された。
ステル（PNPP）（抗増幅剤前駆体）からの解離に基づく
アルカリホスファターゼのアッセイ 初期実験において、化学ルミネセント用反応混合液中
に存在する280ナノモル／リットルの濃度のPNPは90％以
上の放射を阻害することが示された。1.4マイクロモル
／リットルでは98％阻害が成された。
アルカリホスファターゼ保存液（トリス−MgCl2バッ
ファー中1mg/ml）の種々の希釈液の10μｌのサンプルを
PNPP（0.12mg/ml）を含有するルミノール−HRP−過酸化
物PIPアッセイ試薬100μｌに添加し、約3.2ミリモル／
リットル濃度のPNPPを生じさせ、２分後に光放射を測定
した。反応速度は以下の表２に示した。光放射における
放射低減はすみやかに起こり、アルカリホスファターゼ
の濃度に依存することが理解される。図２は、横軸のμ
g/ml単位でのアルカリホスファターゼ濃度に対して縦軸
に阻害パーセント率をプロットしたアルカリホスファタ
ーゼのアッセイに対する標準曲線を示す。
ファー中1mg/ml）の種々の希釈液の10μｌのサンプルを
PNPP（0.12mg/ml）を含有するルミノール−HRP−過酸化
物PIPアッセイ試薬100μｌに添加し、約3.2ミリモル／
リットル濃度のPNPPを生じさせ、２分後に光放射を測定
した。反応速度は以下の表２に示した。光放射における
放射低減はすみやかに起こり、アルカリホスファターゼ
の濃度に依存することが理解される。図２は、横軸のμ
g/ml単位でのアルカリホスファターゼ濃度に対して縦軸
に阻害パーセント率をプロットしたアルカリホスファタ
ーゼのアッセイに対する標準曲線を示す。
阻害パーセント率は以下のように決められる。
ここで、 Ａ＝増幅反応からのシグナル、つまり、アルカリホスフ
ァターゼが非存在であること以外はＢと同様であり、 Ｂ＝阻害反応由来のシグナルである。
ァターゼが非存在であること以外はＢと同様であり、 Ｂ＝阻害反応由来のシグナルである。
実施例４ アルカリホスファターゼ−ビオチン複合体のアッセイ アルカリホスファターゼ−ビオチン複合体（conjugat
e）（750単位/ml、6.2モルビオチン／モル蛋白質、Sigm
a社）の様々な希釈液の10μｌのサンプルを、PIPPを用
いて実施例２に記載のとうりアッセイした。結果を以下
の表３に示す。
e）（750単位/ml、6.2モルビオチン／モル蛋白質、Sigm
a社）の様々な希釈液の10μｌのサンプルを、PIPPを用
いて実施例２に記載のとうりアッセイした。結果を以下
の表３に示す。
実施例５ アルカリホスファターゼ−ポリエチレングリコール複合
体のアッセイ アルカリホスファターゼ−ポリエチレングリコール複
合体（98単位/ml、Sigma社）の種々の希釈液の10μｌの
サンプルを、PIPPを使用して実施例２に記載のとうりア
ッセイした。結果を上述の表３に示した。
体のアッセイ アルカリホスファターゼ−ポリエチレングリコール複
合体（98単位/ml、Sigma社）の種々の希釈液の10μｌの
サンプルを、PIPPを使用して実施例２に記載のとうりア
ッセイした。結果を上述の表３に示した。
実施例６ アルカリホスファターゼ−抗体複合体のアッセイ アルカリホスファターゼ−ヤギ抗ヒトIgG抗体複合体
（0.53mg/ml、Sigma社）の希釈液の10μｌのサンプル
を、PIPPを使用して実施例２に記載のとうりアッセイし
た。結果を上述の表３に示した。
（0.53mg/ml、Sigma社）の希釈液の10μｌのサンプル
を、PIPPを使用して実施例２に記載のとうりアッセイし
た。結果を上述の表３に示した。
実施例７ アガロース上に固定したアルカリホスファターゼのアッ
セイ アルカリホスファターゼ−アガロース調製品（4900単
位/ml、Sigma社）の懸濁液の種々の希釈液の10μｌのサ
ンプルを、PIPPを使用して、実施例２に記載のとうりア
ッセイした。結果を上述の表３に示した。
セイ アルカリホスファターゼ−アガロース調製品（4900単
位/ml、Sigma社）の懸濁液の種々の希釈液の10μｌのサ
ンプルを、PIPPを使用して、実施例２に記載のとうりア
ッセイした。結果を上述の表３に示した。
実施例８ 化学ルミネセント反応において酸化物として過ホウ酸塩
を用いたアルカリホスファターゼのアッセイ PIPPを用い、アルカリホスファターゼの種々の希釈液
の10μｌのサンプルを、過酸化物を過ホウ酸ナトリウム
（2mol/l,Aldrich社）に置き替えたことを除き実施例２
に記載してあるとうりアッセイした。
を用いたアルカリホスファターゼのアッセイ PIPPを用い、アルカリホスファターゼの種々の希釈液
の10μｌのサンプルを、過酸化物を過ホウ酸ナトリウム
（2mol/l,Aldrich社）に置き替えたことを除き実施例２
に記載してあるとうりアッセイした。
表４はその結果を示す。
実施例９ 化学ルミネセンス用反応物としてイソルミノールを用い
るアルカリホスファターゼアッセイ PIPPを用い、アルカリホスファターゼの種々の希釈液
の10μｌのサンプルを、DPDをイソルミノール（Sigma
社）に置き替えたことを除き実施例２に記載してあると
うりアッセイした。3mlのイソルミノール（トリスバッ
ファー240mg/l）、２μｌの過酸化水素（30％V/V）及び
ペルオキシダーゼの1:50,000希釈液30μｌを混合してア
ッセイ用混液を調製した。結果として生じた光量は既に
低くなっていたため、このイソルミノール溶液はこれ以
上希釈しなかった。（このことは、ルミノールと比較し
たイソルミノールの光放射おける既知の違いに一致す
る）。
るアルカリホスファターゼアッセイ PIPPを用い、アルカリホスファターゼの種々の希釈液
の10μｌのサンプルを、DPDをイソルミノール（Sigma
社）に置き替えたことを除き実施例２に記載してあると
うりアッセイした。3mlのイソルミノール（トリスバッ
ファー240mg/l）、２μｌの過酸化水素（30％V/V）及び
ペルオキシダーゼの1:50,000希釈液30μｌを混合してア
ッセイ用混液を調製した。結果として生じた光量は既に
低くなっていたため、このイソルミノール溶液はこれ以
上希釈しなかった。（このことは、ルミノールと比較し
たイソルミノールの光放射おける既知の違いに一致す
る）。
上記の表４はその結果を示す。
実施例10 α−フェトプロテインに対する化学ルミネセント酵素イ
ムノアッセイ α−フェトプロテイン（AFP）用のHybritech Tandem
酵素イムノアッセイ（EIA）（Hybritech社,San Diego,C
A）を使用し、一連の標準物質及び血清サンプル中のAFP
濃度を測定した。このアッセイは、ポリスチレンビーズ
上に固定化した抗AFP抗体及びアルカリホスファターゼ
−抗AFP複合体に基づくものである。EIAは製品付属の指
導書に従い遂行した。全てのサンプルに関して２反覆で
アッセイを行い、結合複合体を化学ルミネセンスを利用
して測定した。化学ルミネセントアッセイ用として、ビ
ーズを室温で30分間、20μｌのPIPP及び200μｌのルミ
ノール−HRP−過酸化物（実施例２参照）を含有するチ
ューブ中で振盪し、その後光強度を測定した。
ムノアッセイ α−フェトプロテイン（AFP）用のHybritech Tandem
酵素イムノアッセイ（EIA）（Hybritech社,San Diego,C
A）を使用し、一連の標準物質及び血清サンプル中のAFP
濃度を測定した。このアッセイは、ポリスチレンビーズ
上に固定化した抗AFP抗体及びアルカリホスファターゼ
−抗AFP複合体に基づくものである。EIAは製品付属の指
導書に従い遂行した。全てのサンプルに関して２反覆で
アッセイを行い、結合複合体を化学ルミネセンスを利用
して測定した。化学ルミネセントアッセイ用として、ビ
ーズを室温で30分間、20μｌのPIPP及び200μｌのルミ
ノール−HRP−過酸化物（実施例２参照）を含有するチ
ューブ中で振盪し、その後光強度を測定した。
表５はその結果を示す。シグナル対バックグラウンド
比は、そのアッセイと、アルカリホスファターゼ複合体
が存在していないことを除いては同一である化学ルミネ
セント反応における光放射比として算出される。
比は、そのアッセイと、アルカリホスファターゼ複合体
が存在していないことを除いては同一である化学ルミネ
セント反応における光放射比として算出される。
実施例11 増幅剤２−ナフトールの２−ナフチルホスフェートから
の解離に基づくアルカリホスファターゼのアッセイ アルカリホスファターゼ（Sigma社）の種々の希釈液
を含む10μｌのサンプルを、10μｌの２−ナフチルホス
フェート（Aldrich社,0.1mol/l,pH8.6のトリスバッファ
ー中0.1mg/ml）及び100μｌのルミノール−HRP−過酸化
物試薬を含有するアッセイ用チューブに添加した。その
アッセイ用チューブを室温で30分間インキュベートし、
ルミノメーター（LB9500,Berthold Laboratories社,Nas
hua,New Hampshire,U.S.A）を用いて光強度を測定し
た。
の解離に基づくアルカリホスファターゼのアッセイ アルカリホスファターゼ（Sigma社）の種々の希釈液
を含む10μｌのサンプルを、10μｌの２−ナフチルホス
フェート（Aldrich社,0.1mol/l,pH8.6のトリスバッファ
ー中0.1mg/ml）及び100μｌのルミノール−HRP−過酸化
物試薬を含有するアッセイ用チューブに添加した。その
アッセイ用チューブを室温で30分間インキュベートし、
ルミノメーター（LB9500,Berthold Laboratories社,Nas
hua,New Hampshire,U.S.A）を用いて光強度を測定し
た。
結果を表６に示す。アトモル単位の量の酵素が検出可
能であった。
能であった。
アルカリホスファターゼが高濃度であると高放射は低
減されるが、このことは化学ルミネセント反応における
高濃度の増幅剤に関する既知の効果に一致する。
減されるが、このことは化学ルミネセント反応における
高濃度の増幅剤に関する既知の効果に一致する。
実施例12 増幅剤６−ブロモ−２−ナフトールの６−ブロモ−２−
ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからの解離に基
づくβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのアッセイ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sigma社、22mg/ml、900
単位/mg蛋白）の種々の希釈液を含有する10μｌのサン
プルを、10μｌの６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド（Aldrich社、0.1mol/l,pH8.6のト
リスバッファー中約0.1mg/mlの飽和溶液）及び100μｌ
のルミノール−HRP−過酸化物試薬を含有するアッセイ
用チューブに添加した。そのアッセイ用チューブを実施
例11と同様にインキュベートして光強度を測定し、結果
を表７に示した。アトモル単位量の酵素が検出された。
ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからの解離に基
づくβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのアッセイ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Sigma社、22mg/ml、900
単位/mg蛋白）の種々の希釈液を含有する10μｌのサン
プルを、10μｌの６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド（Aldrich社、0.1mol/l,pH8.6のト
リスバッファー中約0.1mg/mlの飽和溶液）及び100μｌ
のルミノール−HRP−過酸化物試薬を含有するアッセイ
用チューブに添加した。そのアッセイ用チューブを実施
例11と同様にインキュベートして光強度を測定し、結果
を表７に示した。アトモル単位量の酵素が検出された。
高い酵素濃度においては光放射は低減され、このこと
はルミネセント反応における高濃度の増幅剤に関する既
知の効果に一致するものである。
はルミネセント反応における高濃度の増幅剤に関する既
知の効果に一致するものである。
実施例13 増幅剤６−ブロモ−２−ナフトールの６−ブロモ−２−
ナフチル−グルコピラノシドからの解離に基づくβ−Ｄ
−グルコシダーゼのアッセイ β−Ｄ−グルコシダーゼ（Sigma社,4.8単位/mg）の種
々の希釈液を含む10μｌのサンプルを、10μｌの６−ブ
ロモ−２−ナフチル−グルコピラノシド（Aldrich社,0.
1mol/l,pH8.6のトリスバッファー中10ng/ml）及び100μ
ｌのルミノール−HRP−過酸化物試薬を含むアッセイ用
チューブに添加した。そのアッセイ用チューブを実施例
11におけるのと同様にインキュベートして光強度を測定
し、結果を表８に示した。
ナフチル−グルコピラノシドからの解離に基づくβ−Ｄ
−グルコシダーゼのアッセイ β−Ｄ−グルコシダーゼ（Sigma社,4.8単位/mg）の種
々の希釈液を含む10μｌのサンプルを、10μｌの６−ブ
ロモ−２−ナフチル−グルコピラノシド（Aldrich社,0.
1mol/l,pH8.6のトリスバッファー中10ng/ml）及び100μ
ｌのルミノール−HRP−過酸化物試薬を含むアッセイ用
チューブに添加した。そのアッセイ用チューブを実施例
11におけるのと同様にインキュベートして光強度を測定
し、結果を表８に示した。
実施例14 増幅剤２−ナフトールの２−ナフチルスルフェートから
の解離に基づくアリールスルファターゼのアッセイ アリールスルファターゼ（Sigma社、12単位/mg）の種
々の希釈液を含む100μｌのサンプルを、100μｌの２−
ナフチルスルフェート（Aldrich社,10mmol/l,pH5のアセ
テートバッファー中0.1mg/ml）を含有するアッセイ用チ
ューブに添加した。30分間インキュベーションした後、
10μｌの混合液を採取し、100μｌのルミノール−HRP−
過酸化物試薬に添加した。このアッセイ用チューブを実
施例11にあるのと同様に、室温にて30分間インキュベー
トして光強度を測定し、結果を表９に示した。
の解離に基づくアリールスルファターゼのアッセイ アリールスルファターゼ（Sigma社、12単位/mg）の種
々の希釈液を含む100μｌのサンプルを、100μｌの２−
ナフチルスルフェート（Aldrich社,10mmol/l,pH5のアセ
テートバッファー中0.1mg/ml）を含有するアッセイ用チ
ューブに添加した。30分間インキュベーションした後、
10μｌの混合液を採取し、100μｌのルミノール−HRP−
過酸化物試薬に添加した。このアッセイ用チューブを実
施例11にあるのと同様に、室温にて30分間インキュベー
トして光強度を測定し、結果を表９に示した。
実施例15 Ｎ−メチル−パラ−アニシジンからの増幅剤の形成に基
づく西洋ワサビペルオキシダーゼ（酸性イソ酵素）のア
ッセイ ペルオキシダーゼの酸性イソ酵素（タイプVII及びVII
I）は、過酸化物又は酵素分子の存在下において、増幅
剤前駆体Ｎ−メチル−パラ−アニシジンの反応を触媒し
てルミノール−HRP（塩基性イソ酵素）−過酸化物反応
を増幅する産物を形成する。0.1mol/lのリン酸バッファ
ー、pH5.5中のタイプVIIの西洋ワサビペルオキシダーゼ
イソ酵素（117単位/mg蛋白、Rz＝3.7,Sigma社）又はタ
イプVIIIの西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素（100
単位/mg蛋白Rz＝3.4,Sigma社）を含む50μｌのサンプル
を、同一のリン酸バッファー中の50μｌのＮ−メチル−
パラ−アニシジン（0.01mg/ml）と共に室温で10分間イ
ンキュベートした。10μｌのサンプルを採取して100μ
ｌのナトリウムルミノール−HRP−過酸化物試薬に添加
した。その混合液を室温にて５分から30分インキュベー
トして光強度を測定した。過酸化水素（50mmol/l）を含
有するリン酸バッファーを用いて更にこのアッセイを行
った。タイプVII酸性HRPイソ酵素に対する容量反応関係
を以下の表10に示した。
づく西洋ワサビペルオキシダーゼ（酸性イソ酵素）のア
ッセイ ペルオキシダーゼの酸性イソ酵素（タイプVII及びVII
I）は、過酸化物又は酵素分子の存在下において、増幅
剤前駆体Ｎ−メチル−パラ−アニシジンの反応を触媒し
てルミノール−HRP（塩基性イソ酵素）−過酸化物反応
を増幅する産物を形成する。0.1mol/lのリン酸バッファ
ー、pH5.5中のタイプVIIの西洋ワサビペルオキシダーゼ
イソ酵素（117単位/mg蛋白、Rz＝3.7,Sigma社）又はタ
イプVIIIの西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素（100
単位/mg蛋白Rz＝3.4,Sigma社）を含む50μｌのサンプル
を、同一のリン酸バッファー中の50μｌのＮ−メチル−
パラ−アニシジン（0.01mg/ml）と共に室温で10分間イ
ンキュベートした。10μｌのサンプルを採取して100μ
ｌのナトリウムルミノール−HRP−過酸化物試薬に添加
した。その混合液を室温にて５分から30分インキュベー
トして光強度を測定した。過酸化水素（50mmol/l）を含
有するリン酸バッファーを用いて更にこのアッセイを行
った。タイプVII酸性HRPイソ酵素に対する容量反応関係
を以下の表10に示した。
タイプVIIの酸性イソ酵素に対する検出限界は５ピコ
グラム＝５×10-12グラム＝約125アトモル（シグナルは
アッセイ用対照値の２倍、ペルオキシダーゼの推定分子
量＝40,000）であった。
グラム＝５×10-12グラム＝約125アトモル（シグナルは
アッセイ用対照値の２倍、ペルオキシダーゼの推定分子
量＝40,000）であった。
シリカゲルクロマトグラフィー（Analtech Inc.社,Ne
wark,NJ）を用いて、Ｎ−メチル−パラ−アニシジニン
溶液及びパラアニシジン溶液のタイプVIIの酸性西洋ワ
サビペルオキシダーゼとの反応を調査した。プレートを
ヘキサン：エチルアセテート（88;12V/V）中で展開し、
紫外光下で査証した。タイプVIIの酸性イソ酵素で処理
してあるＮ−メチル−パラ−アニシジン溶液の薄層クル
マトグラフィー（TCL）により、増幅剤前駆体はパラ−
アニシジン（最初のＮ−脱メチル化産物）が同様に反応
した時に得られるのと同様の産物へと変換されているこ
とが示された。更に別の薄層クロマトグラフィー実験を
行い、イソ酵素を希釈した時得られる産物との関連性を
調べた。つまり、リン酸バッファー（0.1mol/l,pH5.5）
中のＮ−メチル−パラ−アニシジン（1.0mg/ml）溶液を
タイプVIIペルオキシダーゼの希釈液とを共にインキュ
ベートし、その後逆相TCLプレート（Si−C18,Baker Che
mical Co.社,Phillipsburg,NJ）上でその反応混合液（2
5μｌ）をクロマトグラフ的に分析した。展開は上述の
ものと同様に行い、分離した成分をヨウ素蒸気に30分間
さらして肉眼検査用にした。結果を以下の表11に示す
が、ここで、＋記号はスポットの出現を表す。いくつか
の実験においては他の産物に起因するかすかなスポット
が存在した。
wark,NJ）を用いて、Ｎ−メチル−パラ−アニシジニン
溶液及びパラアニシジン溶液のタイプVIIの酸性西洋ワ
サビペルオキシダーゼとの反応を調査した。プレートを
ヘキサン：エチルアセテート（88;12V/V）中で展開し、
紫外光下で査証した。タイプVIIの酸性イソ酵素で処理
してあるＮ−メチル−パラ−アニシジン溶液の薄層クル
マトグラフィー（TCL）により、増幅剤前駆体はパラ−
アニシジン（最初のＮ−脱メチル化産物）が同様に反応
した時に得られるのと同様の産物へと変換されているこ
とが示された。更に別の薄層クロマトグラフィー実験を
行い、イソ酵素を希釈した時得られる産物との関連性を
調べた。つまり、リン酸バッファー（0.1mol/l,pH5.5）
中のＮ−メチル−パラ−アニシジン（1.0mg/ml）溶液を
タイプVIIペルオキシダーゼの希釈液とを共にインキュ
ベートし、その後逆相TCLプレート（Si−C18,Baker Che
mical Co.社,Phillipsburg,NJ）上でその反応混合液（2
5μｌ）をクロマトグラフ的に分析した。展開は上述の
ものと同様に行い、分離した成分をヨウ素蒸気に30分間
さらして肉眼検査用にした。結果を以下の表11に示す
が、ここで、＋記号はスポットの出現を表す。いくつか
の実験においては他の産物に起因するかすかなスポット
が存在した。
Ｎ−メチル−パラ−アニシジンを精製することが望ま
しいが、これは以下のごとく遂行可能である。
しいが、これは以下のごとく遂行可能である。
Ｎ−メチル−パラ−アニシジン（500mg）をDMSO（250
μｌ）に溶解し、後にエタノール（5ml）で希釈する。
この溶液を「Norit」活性炭（American Norit Co.Inc.
社,Jacksonville,Florida）（25mg）と混合し、10分間
還流した。氷冷蒸留水（3ml）を濾液に添加し、この混
合液を一晩４℃下に放置した。Ｎ−メチル−パラ−アニ
シジンの沈殿を濾過法により回収した。
μｌ）に溶解し、後にエタノール（5ml）で希釈する。
この溶液を「Norit」活性炭（American Norit Co.Inc.
社,Jacksonville,Florida）（25mg）と混合し、10分間
還流した。氷冷蒸留水（3ml）を濾液に添加し、この混
合液を一晩４℃下に放置した。Ｎ−メチル−パラ−アニ
シジンの沈殿を濾過法により回収した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/28 C12Q 1/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】増幅剤存在下において、ペルオキシダー
ゼ、酸化剤及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）間で
化学ルミネセント反応を生起させ、当該反応が起ること
を可能にする物質をルミネセンスにより検出若しくは測
定するアッセイ法において、 増幅剤が増幅剤前駆体の酵素触媒反応により産生される
か、又は、増幅剤が既に存在しかつ増幅反応を少なくと
も部分的に阻害する抗増幅剤が抗増幅剤前駆体の酵素触
媒反応により産生されること、 増幅作用がそれぞれ増幅剤又は抗増幅剤の産生に依存す
る様に、酵素が増幅剤前駆体の濃度に対して限られた濃
度で依存すること、 及び、 増幅剤若しくは抗増幅剤のいずれかの産生を触媒する遊
離若しくは結合体としての酵素又は当該酵素に依存する
物質をアッセイすること、 を特徴とするアッセイ法。 - 【請求項２】ペルオキシダーゼ、酸化剤、DPD及び増幅
剤前駆体の反応混合液、又は、ペルオキシダーゼ、酸化
剤、DPD、増幅剤及び抗増幅剤前駆体の反応混合液のい
ずれかを調製し、増幅剤前駆体を加えて予じめインキュ
ベーションすることなく、増幅剤又は抗増幅剤産生触媒
酵素を当該混合液に添加することを特徴とする請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】増幅剤前駆体が増幅剤を産生するために切
断可能であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項４】増幅剤前駆体が、パラ−ヨードフェノー
ル、パラ−ヒドロキシケイ皮酸又はパラ−イミダゾール
−１−イルフェノール増幅剤を産生するために切断可能
であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方
法。 - 【請求項５】リン酸エステル増幅剤前駆体がアッセイさ
れるアルカリホスファターゼにより切断されることを特
徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項６】ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシ
ダーゼであり、酸化剤が過酸化水素であり、DPDがルミ
ノールであることを特徴とする請求の範囲第１〜５項の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】増幅剤存在下において、ペルオキシダー
ゼ、酸化剤及びジヒドロフタラジンジオン（DPD）の間
で化学ルミネセント反応が起こるアッセイを行うため
の、当該DPDを含有するキットであって、そのキットが
更に （ａ）酵素触媒反応により増幅剤が産生され得る増幅剤
前駆体、 又は （ｂ）（ｉ）増幅剤、及び（ii）増幅反応を少なくとも
部分的に阻害する抗増幅剤が酵素触媒反応により産生さ
れ得る抗増幅剤前駆体、 のいずれかを含むことを特徴とする当該キット。 - 【請求項８】（１）当該増幅剤若しくは抗増幅剤の産生
を触媒する酵素に結合したリガンドの複合体であって、
キットをテストするために含有されている当該複合体、
（２）当該ペルオキシダーゼ、及び（３）当該酸化剤、
から成る群から選択される少なくとも一つの成分を更に
含むことを特徴とする請求の範囲第７項に記載のキッ
ト。 - 【請求項９】増幅剤を産生するために増幅剤前駆体が切
断可能であることを特徴とする請求の範囲第７項又は第
８項に記載のキット。 - 【請求項１０】増幅剤前駆体が、パラ−ヨードフェノー
ル、パラ−ヒドロキシケイ皮酸又はパラ−イミダゾール
−１−イルフェノール増幅剤を産生するために切断可能
であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載のキッ
ト。
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