JP2658113B2 - 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 - Google Patents
発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，発光バクテリアのルシフェラーゼを用いる
高感度な過酸化水素の定量法に関する。
高感度な過酸化水素の定量法に関する。
（従来の技術） 近年，特に臨床検査の分野において，疾病の診断およ
び治療のために生体由来の微量物質を高感度で測定する
ことが必要とされている。これらの微量物質のうち，例
えば，尿酸，グルコース，ポリアミン，乳酸，コレステ
ロールなどの測定には，各種オキシダーゼを利用して過
酸化水素（H2O2）を生成させ，この過酸化水素を測定す
る方法が広く用いられている。上記過酸化水素を測定す
る方法としては，光学的に測定する方法，および電気化
学的に測定する方法（例えば電極法）が知られており，
特に光学的測定法が汎用されている。光学的測定方法と
しては，吸光法，螢光法，化学発光法，および生物発光
法などが知られている。
び治療のために生体由来の微量物質を高感度で測定する
ことが必要とされている。これらの微量物質のうち，例
えば，尿酸，グルコース，ポリアミン，乳酸，コレステ
ロールなどの測定には，各種オキシダーゼを利用して過
酸化水素（H2O2）を生成させ，この過酸化水素を測定す
る方法が広く用いられている。上記過酸化水素を測定す
る方法としては，光学的に測定する方法，および電気化
学的に測定する方法（例えば電極法）が知られており，
特に光学的測定法が汎用されている。光学的測定方法と
しては，吸光法，螢光法，化学発光法，および生物発光
法などが知られている。
上記吸光法としては，例えば過酸化水素を含む試料に
発色剤の存在下でペルオキシダーゼなどの酵素を作用さ
せ，該発色剤を酸化することによって発色させ，その吸
光度を測定する方法がある。螢光法は，上記吸光法にお
ける発色剤の代わりに発螢光物質を用い，生じた螢光を
測定する方法である。化学発光法としては，過酸化水素
を含む試料をルミノール−ペルオキシダーゼ系，ルシゲ
ニン−ペリオキシダーゼ系，またはシュウ酸ジエステル
−螢光物質系の試薬と反応させることにより生成する発
光量を測定する方法などがある。生物発光法としては，
ジョージア産ミミズであるディプロカーディア（Diploc
ardia）のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いた
方法が報告されている。これらの方法のうち，吸光法に
よる過酸化水素の検出感度は10-6M,螢光法では10-7M,そ
して化学螢光法および生物発光法では約10-8Mであり，
体液中の微量成分を対象とする臨床検査に応用するには
充分な感度であるとはいえない。
発色剤の存在下でペルオキシダーゼなどの酵素を作用さ
せ，該発色剤を酸化することによって発色させ，その吸
光度を測定する方法がある。螢光法は，上記吸光法にお
ける発色剤の代わりに発螢光物質を用い，生じた螢光を
測定する方法である。化学発光法としては，過酸化水素
を含む試料をルミノール−ペルオキシダーゼ系，ルシゲ
ニン−ペリオキシダーゼ系，またはシュウ酸ジエステル
−螢光物質系の試薬と反応させることにより生成する発
光量を測定する方法などがある。生物発光法としては，
ジョージア産ミミズであるディプロカーディア（Diploc
ardia）のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いた
方法が報告されている。これらの方法のうち，吸光法に
よる過酸化水素の検出感度は10-6M,螢光法では10-7M,そ
して化学螢光法および生物発光法では約10-8Mであり，
体液中の微量成分を対象とする臨床検査に応用するには
充分な感度であるとはいえない。
これに対して，本発明者らは生物発光法のうち，発光
バクテリアのルシフェラーゼを用いて過酸化水素を感度
よく定量する方法を開発した（特開昭60−218070号公
報）。その定量法の原理は以下の反応式で示される： この方法によれば，まず，過酸化水素にメタノールの
存在下でカタラーゼを作用させ，生じたホルムアルデヒ
ドにNAD（Ｐ）＋（NAD+またはNADP+を示す）の存在下
で，ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させる。
これにより生じるNAD（Ｐ）Ｈ（NADHまたはNADPHを示
す）にFMNの存在下で，フラビンレダクターゼを作用さ
せる。ここで生じるFMNH2に長鎖アルデヒドの存在下で
ルシフェラーゼを作用させるとFMNおよびカルボン酸が
生成し，同時に光（ｈν）が生じる。この光を測定する
ことにより,10-9Mという高感度での過酸化水素の定量が
可能である。
バクテリアのルシフェラーゼを用いて過酸化水素を感度
よく定量する方法を開発した（特開昭60−218070号公
報）。その定量法の原理は以下の反応式で示される： この方法によれば，まず，過酸化水素にメタノールの
存在下でカタラーゼを作用させ，生じたホルムアルデヒ
ドにNAD（Ｐ）＋（NAD+またはNADP+を示す）の存在下
で，ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させる。
これにより生じるNAD（Ｐ）Ｈ（NADHまたはNADPHを示
す）にFMNの存在下で，フラビンレダクターゼを作用さ
せる。ここで生じるFMNH2に長鎖アルデヒドの存在下で
ルシフェラーゼを作用させるとFMNおよびカルボン酸が
生成し，同時に光（ｈν）が生じる。この光を測定する
ことにより,10-9Mという高感度での過酸化水素の定量が
可能である。
このように，過酸化水素を高感度で測定することが可
能となったが，この方法においては，（II）式で用いる
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼが（IV）式のＲ−CH
Oにも作用するため，反応を２段階に分けて行う必要が
ある。高感度で，かつ，測定法のより簡便な過酸化水素
の定量法の開発が望まれる。
能となったが，この方法においては，（II）式で用いる
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼが（IV）式のＲ−CH
Oにも作用するため，反応を２段階に分けて行う必要が
ある。高感度で，かつ，測定法のより簡便な過酸化水素
の定量法の開発が望まれる。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり，その
目的とするところは，より簡単な反応系を用いて試料中
の過酸化水素を高感度で精度よく定量する方法を提供す
ることにある。
目的とするところは，より簡単な反応系を用いて試料中
の過酸化水素を高感度で精度よく定量する方法を提供す
ることにある。
（課題を解決するための手段） 本発明の発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸
化水素の定量法は，過酸化水素を含む試料にアルキルア
ルコールの存在下でカタラーゼを作用させ，生成したア
ルデヒドに長鎖アルキル化合物およびFMNH2の存在下で
発光バクテリアのルシフェラーゼを作用させ，生じる光
を測定することにより過酸化水素を測定することを特徴
とする。
化水素の定量法は，過酸化水素を含む試料にアルキルア
ルコールの存在下でカタラーゼを作用させ，生成したア
ルデヒドに長鎖アルキル化合物およびFMNH2の存在下で
発光バクテリアのルシフェラーゼを作用させ，生じる光
を測定することにより過酸化水素を測定することを特徴
とする。
本発明の方法による試料中の過酸化水素の測定系は，
次の反応系（１）および（２），そして必要に応じて
（３）により説明される： この方法において，測定されるべき試料は，過酸化水
素そのものを含有する試料，または各種オキシダーゼを
作用させることなどにより過酸化水素を生成しうる成分
を含有する試料，特に生体試料（例えば，血液または
尿）などである。上記試料の測定すべき成分としては，
例えば，尿酸，コレステロール，グルコース，クレアチ
ニン，ポリアミン，コリン，ピルビン酸，乳酸，グリセ
ロール，アミノ酸などが挙げられる。
次の反応系（１）および（２），そして必要に応じて
（３）により説明される： この方法において，測定されるべき試料は，過酸化水
素そのものを含有する試料，または各種オキシダーゼを
作用させることなどにより過酸化水素を生成しうる成分
を含有する試料，特に生体試料（例えば，血液または
尿）などである。上記試料の測定すべき成分としては，
例えば，尿酸，コレステロール，グルコース，クレアチ
ニン，ポリアミン，コリン，ピルビン酸，乳酸，グリセ
ロール，アミノ酸などが挙げられる。
（１）式で用いられるアルキルアルコール（ROH）は
短鎖アルキルアルコールであり，例えば，メタノール，
エタノール，プロパノールなどの炭素数１〜３個のアル
キルアルコールが好適である。これらのアルキルアルコ
ールは通常0.1〜10Mの濃度となるように反応系に加えら
れる。この反応で用いられるカタラーゼは特に制限され
ず，動物の肝臓，腎臓または赤血球，または微生物のい
ずれの由来のものでもよい。カタラーゼの使用濃度は，
通常10〜5000U/mlである。
短鎖アルキルアルコールであり，例えば，メタノール，
エタノール，プロパノールなどの炭素数１〜３個のアル
キルアルコールが好適である。これらのアルキルアルコ
ールは通常0.1〜10Mの濃度となるように反応系に加えら
れる。この反応で用いられるカタラーゼは特に制限され
ず，動物の肝臓，腎臓または赤血球，または微生物のい
ずれの由来のものでもよい。カタラーゼの使用濃度は，
通常10〜5000U/mlである。
（２）式で用いられる長鎖アルキル化合物（長鎖アル
キル基の有する化合物）とは，炭素数が８〜14個の範囲
にあるカルボン酸，アルコール，または直鎖炭化水素化
合物を指していう。これらの長鎖アルキル化合物の炭素
鎖中には水酸基，アミノ基，スルフヒドリル基，スルフ
ォン基，硫酸基，またはリン酸基が付加されていてもよ
い。長鎖アルキル化合物は，好ましくは1nM〜10mMの濃
度となるように反応系に加えられる。ルシフェラーゼと
しては，例えば，発光バクテリアであるビブリオハーベ
イ（Vibrio harveyi），ビブリオ フィッシャライ（Vi
brio Fischeri），フォトバクテリウム フォスフォレ
ウム（Photobacterium phosphoreum），またはフォトバ
クテリウム レイオグナシ（Photobacterium leiognath
i）の菌体から得られる粗酵素を精製して得られる精製
ルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは，通常
５〜100μg/mlとなるような範囲で反応系に加えられ
る。
キル基の有する化合物）とは，炭素数が８〜14個の範囲
にあるカルボン酸，アルコール，または直鎖炭化水素化
合物を指していう。これらの長鎖アルキル化合物の炭素
鎖中には水酸基，アミノ基，スルフヒドリル基，スルフ
ォン基，硫酸基，またはリン酸基が付加されていてもよ
い。長鎖アルキル化合物は，好ましくは1nM〜10mMの濃
度となるように反応系に加えられる。ルシフェラーゼと
しては，例えば，発光バクテリアであるビブリオハーベ
イ（Vibrio harveyi），ビブリオ フィッシャライ（Vi
brio Fischeri），フォトバクテリウム フォスフォレ
ウム（Photobacterium phosphoreum），またはフォトバ
クテリウム レイオグナシ（Photobacterium leiognath
i）の菌体から得られる粗酵素を精製して得られる精製
ルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは，通常
５〜100μg/mlとなるような範囲で反応系に加えられ
る。
FMNとは電子伝達体であるフラビンモノヌクレオチド
を指している。ここで使用される還元型のFMN（FMNH2）
は，例えば、嫌気的条件下で反応系内に供給される。あ
るいは，（３）式に示されるように，酸化型のFMNからN
AD（Ｐ）Ｈの存在下でNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダク
ターゼまたはジアフォラーゼを作用させて得られる。FM
NH2（またはFMN）は，通常１〜100μＭとなるように反
応系に加えられる。
を指している。ここで使用される還元型のFMN（FMNH2）
は，例えば、嫌気的条件下で反応系内に供給される。あ
るいは，（３）式に示されるように，酸化型のFMNからN
AD（Ｐ）Ｈの存在下でNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダク
ターゼまたはジアフォラーゼを作用させて得られる。FM
NH2（またはFMN）は，通常１〜100μＭとなるように反
応系に加えられる。
上記（３）式で使用されるNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシド
レダクターゼとしては,NAD（Ｐ）ＨおよびFMNに高い特
異性を有する発光細菌ビブリオハーベイ由来の酵素が挙
げられる。該酵素はJablonskiおよびDeluca（Biochem.1
6,2932−2936,1977），またはWatanabeおよびHastings
（Mol.Cell.Biochem.44,181−187,1982）に従って，発
光細菌ビブリオハーベイから精製することができる。該
酵素は使用量は，通常0.001〜10単位/mlである。
レダクターゼとしては,NAD（Ｐ）ＨおよびFMNに高い特
異性を有する発光細菌ビブリオハーベイ由来の酵素が挙
げられる。該酵素はJablonskiおよびDeluca（Biochem.1
6,2932−2936,1977），またはWatanabeおよびHastings
（Mol.Cell.Biochem.44,181−187,1982）に従って，発
光細菌ビブリオハーベイから精製することができる。該
酵素は使用量は，通常0.001〜10単位/mlである。
上記酵素および試薬類は，適当な緩衝液に溶解して使
用することが望ましい。このような緩衝液としては,pH
6.0〜8.0の範囲の緩衝液であれば特に種類は限定され
ず，リン酸緩衝液またはグッドバッファーなどを用いる
ことができる。緩衝液の使用濃度は，通常0.05〜0.2Mの
範囲である。
用することが望ましい。このような緩衝液としては,pH
6.0〜8.0の範囲の緩衝液であれば特に種類は限定され
ず，リン酸緩衝液またはグッドバッファーなどを用いる
ことができる。緩衝液の使用濃度は，通常0.05〜0.2Mの
範囲である。
本発明方法により過酸化水素の定量を行うには，例え
ば，上記（１），（２）および必要に応じて（３）の反
応に用いられる試薬および酵素を含む系を調製し，これ
に過酸化水素を含む試料を加える。あるいは，上記
（１），（２）および必要に応じて（３）の反応に用い
られる試薬および酵素からカタラーゼを除いた系を調製
し，これに過酸化水素を含む試料を加えておき，最後に
この系にカタラーゼを加えて反応を開始させる。本発明
方法における反応温度は酵素の至適温度を考慮して選択
され，通常,20〜40℃程度に設定される。
ば，上記（１），（２）および必要に応じて（３）の反
応に用いられる試薬および酵素を含む系を調製し，これ
に過酸化水素を含む試料を加える。あるいは，上記
（１），（２）および必要に応じて（３）の反応に用い
られる試薬および酵素からカタラーゼを除いた系を調製
し，これに過酸化水素を含む試料を加えておき，最後に
この系にカタラーゼを加えて反応を開始させる。本発明
方法における反応温度は酵素の至適温度を考慮して選択
され，通常,20〜40℃程度に設定される。
上記反応系においては，まず，試料中の過酸化水素が
カタラーゼにより分解され,H2Oおよび該アルキルアルコ
ールに対応するアルデヒドが生じる（（１）式）。一般
に，比較的長鎖のアルデヒド（例えば，デカナール）
は，下記式のように，還元型フラビンモノヌクレオチド
（FMNH2）および酸素の存在下において発光バクテリア
ルシフェラーゼ（混在機能の酸素添加酵素として機能す
る）の作用により光（ｈν）を生じることが知られてい
る。
カタラーゼにより分解され,H2Oおよび該アルキルアルコ
ールに対応するアルデヒドが生じる（（１）式）。一般
に，比較的長鎖のアルデヒド（例えば，デカナール）
は，下記式のように，還元型フラビンモノヌクレオチド
（FMNH2）および酸素の存在下において発光バクテリア
ルシフェラーゼ（混在機能の酸素添加酵素として機能す
る）の作用により光（ｈν）を生じることが知られてい
る。
この発光を測定すれば，アルデヒド量，さらには該ア
ルデヒドを生じる過酸化水素の測定が可能である。しか
し，本発明に使用されるような比較的短鎖のアルデヒド
においては発光効率が悪い。例えばChoらは，ビブリオ
フィッシャライ由来のルシフェラーゼを用いて,0.2mM
ノナナールを基質にした場合と0.1Mという高濃度のアセ
トアルデヒドを基質にした場合との比較を行い，この濃
度条件下においてアルデヒドはノナナールの1/3程度の
発光を生じたことを報告している（Photochem.Photobio
l.vol 43,477−480,1986）。ホルムアルデヒドを基質と
した場合には発光効率はさらに低く，アルデヒドを基質
とした場合の10％程度である。しかし，アルデヒドとし
て長鎖アルデヒドを用いれば，高感度の測定が可能であ
るというわけではない。HolzmanおよびBaldwinは，ビブ
リオ ハーベイのルシフェラーゼは，長鎖アルデヒドを
基質として用いると基質阻害により活性の低下が起こる
ことを示している（Biochem.22,2838−2846,1983）。
ルデヒドを生じる過酸化水素の測定が可能である。しか
し，本発明に使用されるような比較的短鎖のアルデヒド
においては発光効率が悪い。例えばChoらは，ビブリオ
フィッシャライ由来のルシフェラーゼを用いて,0.2mM
ノナナールを基質にした場合と0.1Mという高濃度のアセ
トアルデヒドを基質にした場合との比較を行い，この濃
度条件下においてアルデヒドはノナナールの1/3程度の
発光を生じたことを報告している（Photochem.Photobio
l.vol 43,477−480,1986）。ホルムアルデヒドを基質と
した場合には発光効率はさらに低く，アルデヒドを基質
とした場合の10％程度である。しかし，アルデヒドとし
て長鎖アルデヒドを用いれば，高感度の測定が可能であ
るというわけではない。HolzmanおよびBaldwinは，ビブ
リオ ハーベイのルシフェラーゼは，長鎖アルデヒドを
基質として用いると基質阻害により活性の低下が起こる
ことを示している（Biochem.22,2838−2846,1983）。
ルシフェラーゼによるこの系の発光の機構は，完全に
は解明されていないが，一般に，次のような過程を経て
発光が生じると考えられている。次式においてはルシ
フェラーゼを示す。
は解明されていないが，一般に，次のような過程を経て
発光が生じると考えられている。次式においてはルシ
フェラーゼを示す。
上記・FMNHOOHにRCHOが結合するときには，ルシフ
ェラーゼ（）が有するスルフヒドリル基が関与するこ
とが知られている。これは,FriedおよびTuにより，α−
ブロム〔１−14C〕−１−デカナールをアルデヒドと結
合させる実験により明らかにされている（J.Biol.Che
m.,259,10754−10759,1984）。
ェラーゼ（）が有するスルフヒドリル基が関与するこ
とが知られている。これは,FriedおよびTuにより，α−
ブロム〔１−14C〕−１−デカナールをアルデヒドと結
合させる実験により明らかにされている（J.Biol.Che
m.,259,10754−10759,1984）。
本発明方法においては，上記（２）式のように，反応
系内に長鎖アルキル化合物が存在する。この長鎖アルキ
ル化合物は，上記・FMNHOOHにアルデヒドが結合する
際に，上記ルシフェラーゼの基質結合部位に疎水的環境
を与える。そのため，スルフヒドリル基が関与するアル
デヒドの結合効率が上昇し，短鎖のアルデヒドであって
も充分に結合反応が進行する。その結果， からFMNおよびRCOOHが生じ，この反応により放出された
エネルギーは光（ｈν）に変化する。つまり，長鎖アル
キル化合物が反応系内に存在することにより発光効率が
高くなり，その結果，より高感度の測定が可能となる。
系内に長鎖アルキル化合物が存在する。この長鎖アルキ
ル化合物は，上記・FMNHOOHにアルデヒドが結合する
際に，上記ルシフェラーゼの基質結合部位に疎水的環境
を与える。そのため，スルフヒドリル基が関与するアル
デヒドの結合効率が上昇し，短鎖のアルデヒドであって
も充分に結合反応が進行する。その結果， からFMNおよびRCOOHが生じ，この反応により放出された
エネルギーは光（ｈν）に変化する。つまり，長鎖アル
キル化合物が反応系内に存在することにより発光効率が
高くなり，その結果，より高感度の測定が可能となる。
本発明方法において,FMNH2の代わりにFMNが使用され
る場合には，（３）式に示すように,NAD（Ｐ）Ｈの存在
下でNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼを作用させ
れば,FMNH2およびNAD（Ｐ）＋が生じる。このFMNH2によ
り上記（２）式の反応が円滑に進行する。さらに，上記
方法の他に，試料にカタラーゼを加えて上記（１）式の
反応を完了させた後，（２）式および必要に応じて
（３）式の反応を進めるのに必要な酵素および試薬を順
次加えて測定を行う方法もまた，有効である。
る場合には，（３）式に示すように,NAD（Ｐ）Ｈの存在
下でNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼを作用させ
れば,FMNH2およびNAD（Ｐ）＋が生じる。このFMNH2によ
り上記（２）式の反応が円滑に進行する。さらに，上記
方法の他に，試料にカタラーゼを加えて上記（１）式の
反応を完了させた後，（２）式および必要に応じて
（３）式の反応を進めるのに必要な酵素および試薬を順
次加えて測定を行う方法もまた，有効である。
反応により生じた光は，ルミフォトメーターなどの通
常の発光測定装置を用いて測定される。例えば，反応時
間あたりの発光強度の増加の割合（反応速度）を測定す
ることにより精度よく定量される。別法としては，発光
強度のピーク値を測定する方法が，または所定時間の発
光量の積分値を測定する方法が採用され得る。この測定
値から試料中の過酸化水素量が算出され,10-9Mのオーダ
ーで過酸化水素の定量が可能である。
常の発光測定装置を用いて測定される。例えば，反応時
間あたりの発光強度の増加の割合（反応速度）を測定す
ることにより精度よく定量される。別法としては，発光
強度のピーク値を測定する方法が，または所定時間の発
光量の積分値を測定する方法が採用され得る。この測定
値から試料中の過酸化水素量が算出され,10-9Mのオーダ
ーで過酸化水素の定量が可能である。
（実施例） 以下に本発明を実施例により説明する。
実施例１ 以下の組成の試薬を調製し，過酸化水素の検量線を作
成した。試薬組成 （終濃度） カタラーゼ 1000U/ml メタノール 0.1M NADH−FMNオキシドレダクターゼ 0.01U/ml NADH 1mM FMN 2.5μＭ デカン＊ １μＭ ルシフェラーゼ 100μg/ml （ビブリオ ハーベイ由来）リン酸緩衝液（pH7.0） 0.1M （＊）溶解剤として0.5％牛血清アルブミンおよび0.05
％トリトンＸ−100を添加した0.1Mリン酸バッファー100
mlにデカン酸を溶解させた。
成した。試薬組成 （終濃度） カタラーゼ 1000U/ml メタノール 0.1M NADH−FMNオキシドレダクターゼ 0.01U/ml NADH 1mM FMN 2.5μＭ デカン＊ １μＭ ルシフェラーゼ 100μg/ml （ビブリオ ハーベイ由来）リン酸緩衝液（pH7.0） 0.1M （＊）溶解剤として0.5％牛血清アルブミンおよび0.05
％トリトンＸ−100を添加した0.1Mリン酸バッファー100
mlにデカン酸を溶解させた。
上記の組成の試薬0.9mlに既知濃度（10-9〜10-7M）の
過酸化水素水0.1mlを添加し,25℃で60秒間反応させた。
生成した光の強度をルミフォトメーターTD−4000（ラボ
・サイエンス社製）で測定した。測定値は，発光強度
（Io）〔時間当りの最大勾配（反応速度の微分値）〕を
過酸化水素濃度に対してプロットした。結果を第１図に
示す。
過酸化水素水0.1mlを添加し,25℃で60秒間反応させた。
生成した光の強度をルミフォトメーターTD−4000（ラボ
・サイエンス社製）で測定した。測定値は，発光強度
（Io）〔時間当りの最大勾配（反応速度の微分値）〕を
過酸化水素濃度に対してプロットした。結果を第１図に
示す。
第１図から，この定量法により過酸化水素を10-9Mま
で感度良く定量することが可能なことが明らかである。
で感度良く定量することが可能なことが明らかである。
（発明の効果） 本発明方法により，過酸化水素を従来よりも簡単に，
試料中の妨害物質の影響を受けずに高感度（10-9M）に
定量することが可能となった。さらに，この方法を利用
して例えば，オキシダーゼ反応により過酸化水素を生じ
るような生体由来の種々の微量物質の定量も可能であ
る。例えば，生体試料中の尿酸，コレステロール，グリ
コース，クリアチン，ポリアミン，ピルビン酸およびア
ミノ酸の定量がなされ得る。そのため本法は，疾病の診
断および治療のための臨床検査などの分野に広く利用さ
れ得る。
試料中の妨害物質の影響を受けずに高感度（10-9M）に
定量することが可能となった。さらに，この方法を利用
して例えば，オキシダーゼ反応により過酸化水素を生じ
るような生体由来の種々の微量物質の定量も可能であ
る。例えば，生体試料中の尿酸，コレステロール，グリ
コース，クリアチン，ポリアミン，ピルビン酸およびア
ミノ酸の定量がなされ得る。そのため本法は，疾病の診
断および治療のための臨床検査などの分野に広く利用さ
れ得る。
第１図は，過酸化水素を含む試料中の過酸化水素を本発
明方法により定量したときの過酸化水素濃度と発光量と
の関係を示すグラフである。
明方法により定量したときの過酸化水素濃度と発光量と
の関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】過酸化水素を含む試料にアルキルアルコー
ルの存在下でカタラーゼを作用させ，生成したアルデヒ
ドに長鎖アルキル化合物およびFMNH2の存在下で発光バ
クテリアのルシフェラーゼを作用させ，生じる光を測定
することにより過酸化水素を測定することを特徴とする
発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定
量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP643988A JP2658113B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP643988A JP2658113B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01181800A JPH01181800A (ja) | 1989-07-19 |
| JP2658113B2 true JP2658113B2 (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=11638430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP643988A Expired - Lifetime JP2658113B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2658113B2 (ja) |
-
1988
- 1988-01-13 JP JP643988A patent/JP2658113B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01181800A (ja) | 1989-07-19 |
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