JPH01181800A - 発光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は１発光バクテリアのルシフェラーゼを用いる高
感度な過酸化水素の定量法に関する。

（従来の技術） 近年、特に臨床検査の分野において、疾病の診断および
治療のために生体由来の微量物質を高感度で測定するこ
とが必要とされている。これらの微量物質のうち９例え
ば、尿酸、グルコース、ポリアミン、乳酸、コレステロ
ールなどの測定には。

各種オキシダーゼを利用して過酸化水素（Ｈ２０□）を
生成させ、この過酸化水素を測定する方法が広く用いら
れている。上記過酸化水素を測定する方法としては、光
学的に測定する方法、および電気化学的に測定する方法
（例えば電極法）が知られており、特に光学的測定法が
汎用されている。光学的測定方法としては、吸光法、螢
光法、化学発光法、および生物発光法などが知られてい
る。

上記吸光法としては２例えば過酸化水素を含む試料に発
色剤の存在下でペルオキシダーゼなどの酵素を作用させ
、該発色剤を酸化することによって発色させ、その吸光
度を測定する方法がある。

螢光法は、上記吸光法における発色剤の代わりに発螢光
物質を用い、生じた螢光を測定する方法である。化学発
光法としては、過酸化水素を含む試料をルミノール−ペ
ルオキシダーゼ系、ルシゲニンーベルオキシグーゼ系、
またはシュウ酸ジエステルー螢先物賞系の試薬と反応さ
せることにより生成する発光量を測定する方法などがあ
る。生物発光法としては、ジョーシア産ミミズであるブ
イプロカーブイア（Ｄｉｐｌｏｃａｒｄｉａ）のルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応を用いた方法が報告されて
いる。これらの方法のうち、吸光法による過酸化水素の
検出感度は１０−’Ｍ　、螢光法では１０−’Ｍ　、そ
して化学螢光法および生物発光法では約１０−　”Ｍで
あり９体液中の微量成分を対象とする臨床検査に応用す
るには充分な感度であるとはいえない。

これに対して９本発明者らは生物発光法のうち。

発光バクテリアのルシフェラーゼを用いて過酸化水素を
感度よく定量する方法を開発した（特開昭６０−２１８
０７０号公報）。その定量法の原理は以下の反応式で示
される： ＩＩ（ＭＯ＋　ＮＡＩＩ（Ｐ）”　＋　ｕ、ｏ　　　　
　　　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋　ＨＣＯＯＨ（ｎ　）この方法
によれば、まず、過酸化水素にメタノールの存在下でカ
タラーゼを作用させ、生じたホルムアルデヒドにＮＡＤ
（Ｐ）”　（ＮＡＤ”またはＮＡＤＰ”を示す）の存在
下で、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させる
。これにより生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤＰＨを示す）にＦＭＮの存在下で、フラビンレダク
ターゼを作用させる。ここで生じるＦＨＮＨｔに長鎖ア
ルデヒドの存在下でルシフェラーゼを作用させるとＦＭ
Ｎおよびカルボン酸が生成し。

同時に光（ｈν）が生じる。この光を測定することによ
り、　１０−９Ｍという高感度での過酸化水素の定量が
可能である。

このように、過酸化水素を高感度で測定することが可能
となったが、この方法においては、（■）式で用いるホ
ルムアルデヒドデヒドロゲナーゼが（ＩＶ）式のＲ−Ｃ
ＨＯにも作用するため９反応を２段階に分けて行う必要
がある。高感度で、かつ、測定法のより簡便な過酸化水
素の定量法の開発力（望まれる。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。

その目的とするところは、より簡単な反応系を用いて試
料中の過酸化水素を高感度で精度よく定量する方法を提
供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の発光バクテリアのルシフェラーゼによろ過酸化
水素の定量法は、過酸化水素を含む試料にアルキルアル
コールの存在下でカタラーゼをイ乍用させ、生成したア
ルデヒドに長鎖アルキル吻およびＦＦＩＮ）ｌ！の存在
下で発光バクテリアのＪレジフェラーゼを作用させ，生
じる光を測定することにより過酸化水素を測定すること
を特徴とする。

本発明の方法による試料中の過酸化水素の測定系は，次
の反応式（１）および（２）、そして必要に応じて（３
）により説明される： Ｒ−ＣＨＯ　＋　ＦＭＮＨｚ　＋　０□この方法におい
て，測定されるべき試料は．過酸化水素そのものを含有
する試料，または各種オキシダーゼを作用させることな
どにより過酸化水素を生成しうる成分を含有する試料，
特に生体試料（例えば、血液または尿）などである。上
記試料の測定すべき成分としては，例えば、尿酸，コレ
ステロール、グルコース、クレアチニン、ポリアミン、
コリン、ピルビン酸，乳酸，グリセロール、アミノ酸な
どが挙げられる。

（１）式で用いられるアルキルアルコール（ＲＯＭ　）
は短鎖アルキルアルコールであり，例えば、メタノ−ｎ
ｔ，ｘ）、／−ル，プロパツールなどの炭素数１〜３個
のアルキルアルコールが好適である。これらのアルキル
アルコールは通常０．１〜ＩＯＭの濃度となるように反
応系に加えられる。この反応で用いられるカタラーゼは
特に制限されず、動物の肝臓、腎臓または赤血球、また
は微生物のいずれの由来のものでもよい。カタラーゼの
使用濃度は。

通常１０〜５０００　Ｕ　／−である。

（２）式で用いられる長鎖アルキル化合物（長鎖アルキ
ル基を有する化合物）とは、炭素数が８〜１４個の範囲
にあるカルボン酸、アルコール、または直鎖炭化水素化
合物を指していう。これらの長鎖アルキル化合物の炭素
鎖中には水酸基、アミノ基。

スルフヒドリル基、スルフォン基、　硫酸＆、　または
リン酸基が付加されていてもよい。長鎖アルキル化合物
は、好ましくは１ｎＭ〜１０ｍＭの濃度となるように反
応系に加えられる。ルシフェラーゼとしては３例えば２
発光バクテリアであるとブリオバーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ
　　ｎ二ｕ辷）　、ビブリオ　フィッシャライ（Ｖｉｂ
ｒｉｏ　　Ｆｉｓｃｈｅｒｉ）　、フォトバクテリウム
　フォスフオレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋
　　庭旦吐虹ｒｅｕｍ）　、またはフォトバクテリウム
　レイオグナシ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｎ
１■止１ｊ１）の菌体から得られる粗酵素を精製して得
られる精製ルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラー
ゼは９通常５〜１００μｇｏｄとなるような範囲で反応
系に加えられる。

ＦＭＮとは電子伝達体であるフラビンモノヌクレオチド
を指している。ここで使用される還元型のＦＭＮ　（Ｆ
ＭＮＨｉ）は２例えば、嫌気的条件下で反応系内に供給
される。あるいは、（３）式に示されるように、酸化型
のＦＭＮからＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈの存在下でＮＡＤ　（
Ｐ）　Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼまたはジアフオ
ラーゼを作用させて得られる。ＦＭＮＴｏ（またはＦＭ
Ｎ）は２通常１〜１００μｉとなるように反応系に加え
られる。

上記（３）式で使用されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−Ｆ？ＩＮオ
キシドレダクターゼとしては、　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび
ＦＭＮ応高い特異性を有する宛先細菌ビブリオハーベイ
由来の酵素が挙げられる。該酵素はＪａｂｌｏｎｓｋｉ
およびＤｅｌｕｃａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６．２９３
２−２９３６．１９７７）、またはＷａｔａｎａｂｅお
よびＨａｓｔｉｎｇｓ　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　　４４＋　１８１−１８７、１９８２）に従
って９発光細菌ビブリオハーベイから精製することがで
きる。該酵素の使用量は。

通常０．００１〜１０単位／ｄである。

上記酵素および試薬類は、適当な緩衝液に溶解して使用
することが望ましい。このような緩衝液としては、　ｐ
Ｈ６，０〜８．０の範囲の緩衝液であれば特に種類は限
定されず、リン酸緩衝液またはグツドバッファーなどを
用いることができる。緩衝液の使用濃度は９通常０．０
５〜０．２Ｈの範囲である。

本発明方法により過酸化水素の定量を行うには。

例えば、上記（１）、　（２）および必要に応じて（３
）の反応に用いられる試薬および酵素を含む系を調製し
。

これに過酸化水素を含む試料を加える。あるいは。

上記（１）、　（２）および必要に応じ、て（３）の反
応に用いられる試薬および酵素からカタラーゼを除いた
系を調製し、これに過酸化水素を含む試料を加えておき
、最後にこの系にカタラーゼを加えて反応を開始させる
。本発明方法における反応温度は酵素の至適温度を考慮
して選択され９通常、　２０〜４０°Ｃ程度に設定され
る。

上記反応系においては、まず、試料中の過酸化水素がカ
タラーゼにより分解され、Ｈ２Ｏおよび該アルキルアル
コールに対応するアルデヒドが生じる（（１）式）。一
般に、比較的長鎖のアルデヒド（例えば、デカナール）
は、下記式のように、還元型フラビンモノヌクレオチド
（ＦＭＮＨｚ）および酸素の存在下において発光バクテ
リアルシフェラーゼ（混在機能の酸素添加酵素として機
能する）の作用により光（ｈν）を生じることが知られ
ている。

この発光を測定すれば、アルデヒド量、さらには該アル
デヒドを生じる過酸化水素の測定が可能である。しかし
２本発明に使用されるような比較的短鎖のアルデヒドに
おいては発光効率が悪い。例えばＣｈｏらは、ビブリオ
　フィッシャライ由来のルシフェラーゼを用いて、　０
．２１＋１Ｍノナナールを基質にした場合と０．１Ｍと
いう高濃度のアセトアルデヒドを基質にした場合との比
較を行い、この濃度条件下においてアルデヒドはノナナ
ールの１７３程度の発光を生じたことを報告している（
Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ。

Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、　ｖｏｌ　４３．４７？−４８０
，１９８６）　、ホルムアルデヒドを基質とした場合に
は発光効率はさらに低く、アルデヒドを基質とした場合
の１０％程度である。しかし、アルデヒドとして長鎖ア
ルデヒドを用いれば、高感度の測定が可能であるという
わけではない。）ｌｏｌｚｍａｎおよびＢａｌｄｗｉｎ
は、ビブリオ　ハーベイのルシフェラーゼは、長鎖アル
デヒドを基質として用いると基質阻害により活性の低下
が起こることを示している（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　２２
．２８３８−２８４６、１９８３）。

ルシフェラーゼによるこの系の発光の機構は。

完全には解明されていないが、一般に２次のような過程
を経て発光が生じると考えられている。次式において■
はルシフェラーゼを示す。

■十Ｆ？’ｌＮＨ！−→■・ＦＭＮＨ。

−〉■÷ＦＭＮ　＋　ＲＣＯＯ）ｌ　＋　ＨｚＯ＋　ｈ
ν上記■・ＦＭＮＨＯＯＨにＲＣＨＯが結合するときに
は。

ルシフェラーゼ（■）が有するスルフヒドリル基が関与
することが知られている。これは、　Ｆｒ１ｅｄおよび
Ｔｕにより、α−ブロム（１−Ｉ４Ｃ）−１−デカナー
ルをアルデヒドと結合させる実験により明らかにされて
いる（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５９　、１
０７５４−１０７５９．１９８４）。

本発明方法においては、上記（２）式のように２反応系
内に長鎖アルキル化合物が存在する。この長鎖アルキル
化合物は、上記■・ＰＭＮＨＯＯＨにアルデヒドが結合
する際に、上記ルシフェラーゼの基質結合部位に疎水的
環境を与える。そのため、スルフヒドリル基が関与する
アルデヒドの結合効率が上昇し、短鎖のアルデヒドであ
っても充分に結合からＦＭＮおよびＲＣＯＯＨが生じ、
この反応により放出されたエネルギーは光（ｈν）に変
化する。つまり、長鎖アルキル化合物が反応系内に存在
することにより発光効率が高くなり、その結果、より高
感度の測定が可能となる。

本発明方法において、　ＦＭＮＨｚＯ代わりにＦＭＮが
使用される場合には、（３）式に示すように、　ＮＡＤ
（Ｐ）Ｉ（の存在下でＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈ−ＦＭＮオキ
シドレダクターゼを作用させれば、　ＦＭＮＨｚおよび
ＮＡＤ　（Ｐ）　”が生じる。

このＦｒＩＮＨ２により上記（２）式の反応が円滑に進
行する。さらに、上記方法の他に、試料にカタラーゼを
加えて上記（１）式の反応を完了させた後、（２）式お
よび必要に応じて（３）式の反応を進めるのに必要な酵
素および試薬を順次加えて測定を行う方法もまた。有効
である。

反応により生じた光は、ルミフォトメーターなどの通常
の発光測定装置を用いて測定される。例えば９反応時間
あたりの発光強度の増加の割合（反応速度）を測定する
ことにより精度よく定量される。別法としては２発光強
度のピーク値を測定する方法が、または所定時間の発光
量の積分値を測定する方法が採用され得る。この測定値
から試料中の過酸化水素量が算出され、　１０−’Ｍの
オーダーで過酸化水素の定量が可能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例により説明する。

災旌■土 以下の組成の試薬を調製し、過酸化水素の検量線を作成
した。

試薬組成　　　　　　　　　　　（終濃度）カタラーゼ
　　　　　　　　　　１０００　　Ｌｌ／ｄメタノール
　　　　　　　　　　０．１ＭＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシ
ドレダクターゼ　０．０１υ／ｄＮＡＤ）Ｉ　　　　　
　　　　　　　　　　　ｌ　　＋ａＭＦＭＮ　　　　　
　　　　　　　　　　　２．５μ阿デカン０　　　　　
　　　　　　　　１　　μｎルシフェラーゼ　　　　　
　　　　１００　　μｇ／ｄ（ビブリオ　ハーベイ由来
） リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　　　　　０．Ｉ　Ｐ＋
（ネ）溶解剤として０．５％牛血清アルブミンおよび０
．０５％トリトンＸ−１００を添加した０、１Ｍリン酸
バッファー１００７ｄにデカン酸を溶解させた。

上記の組成の試薬０．９ＩＩ１１に既知濃度（１０−９
〜１０−’Ｍ）の過酸化水素水０．１−を添加し、２５
℃で６０秒間反応させた。生成した光の強度をルミフォ
トメーター　ＴＤ−４０００（ラボ・サイエンス社製）
で測定した。

測定値は９発光強度（Ｉｏ）　Ｃ時間当りの最大勾配（
反応速度の微分値）〕を過酸化水素濃度に対してプロッ
トした。結果を第１図に示す。

第１図から、この定量法により過酸化水素を１０−９Ｍ
まで感度良く定量することが可能なことが明らかである
。

（発明の効果） 本発明方法により、過酸化水素を従来よりも簡単に、試
料中の妨害物質の影響を受けずに高感度（１０−’Ｍ　
＞に定量することが可能となった。さらに、この方法を
利用して例えば、オキシダーゼ反応により過酸化水素を
生じるような生体由来の種々の微量物質の定量も可能で
ある。例えば、生体試料中の尿酸、コレステロール、グ
ルコース、クレアチン、ポリアミン、ピルビン酸および
アミノ酸の定量がなされ得る。そのため本性は、疾病の
診断および治療のための臨床検査などの分野に広く利用
され得る。

４　　゛　　の　　　な１゛■ 第１図は、過酸化水素を含む試料中の過酸化水素を本発
明方法により定量したときの過酸化水素濃度と発光量と
の関係を示すグラフである。

以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、過酸化水素を含む試料にアルキルアルコールの存在
   下でカタラーゼを作用させ、生成したアルデヒドに長鎖
   アルキル化合物およびＦＭＮＨ＿２の存在下で発光バク
   テリアのルシフェラーゼを作用させ、生じる光を測定す
   ることにより過酸化水素を測定することを特徴とする発
   光バクテリアのルシフェラーゼによる過酸化水素の定量
   法。