KR101960113B1 - 섬광 및 백열광 １,２-디옥세탄들 - Google Patents
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Abstract
화학발광성 섬광 및 백열광 성질들을 가지는 화합물들. 또한 광을 생성하고, 효소들을 검출하고/하거나 정량하도록 화합물들을 사용하는 방법들도 개시된다. 또한 이들 화합물들과 관련한 키트들도 개시된다.
Description
본 발명은 진단적 플랫폼들을 위한 검출 반응시약들에 관한 것이다.
화학발광 기술학들은 임상적 진단 플랫폼들에서 검출 반응시약들로서 광범위하게 사용된다. 아크리디움 에스테르들 또는 이소루미놀과 같은 직접적인 화학발광성 (chemiluminescent) 표지들은 반응 촉발 용액들의 첨가 직후에 생성되는 섬광 화학발광성 신호로 인해 더 짧은 검출 시간들을 제공한다. 1,2-디옥세탄들 또는 루미놀과 같은 효소-결합 화학발광성 기질들은 그들의 첨가 이후에 더 긴 배양 시간들을 가지지만, 초민감성 검출 및 더 큰 기질 반응시약 안정도를 제공한다. 섬광 화학발광성 신호 및/또는 초민감성 검출 그리고 더 큰 기질 반응시약 안정도를 제공하는 효소 기질에 대한 필요성이 존재한다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물들을 제공하고,
여기에서, A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬 및 다중고리헤테로알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있거나, A 및 B는 함께 할로겐으로 치환된 다중고리알킬을 형성하고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이고; R2는 T 상의 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기이고; R3는 수소 또는 전자-공여기이고; R1이 미치환될 때, R3는 전자-공여기가 되는 조건이고; 여기에서
이다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자들로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서,
일 수 있다.
일정 구현예들에서,
일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 (anchimeric) 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고; L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고; Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고; Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 25℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 37℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 화합물 [1]을 제공하는 단계; 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함하는 효소 복합체를 제공하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물이 광을 생성하도록 허용하는 단계;를 포함하는, 광을 생성하는 방법을 제공한다.
일정 구현예들에서, 25℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 가수분해 효소를 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 가수분해 효소는 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, β-글루쿠로니다제, 또는 뉴라미니다제일 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 효소일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 효소의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 효소의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 항원과 결합할 수 있는 첫 번째 항체 및 기질이 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 항체일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 첫 번째 항체는 효소와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 첫 번째 항체는 표지와 공유적으로 결합될 수 있고 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 두 번째 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 효소-결합된 항체를 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 항체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 효소 분체는 항원 및 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 항원일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 항원은 효소와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 항원은 표지와 공유적으로 결합될 수 있고, 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘인 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체이다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 효소-결합된 항원을 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 항원을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 올리고뉴클레오타이드는 효소와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 올리고뉴클레오타이드는 표지와 공유적으로 결합될 수 있고, 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합된다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘인 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체이다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 핵산을 고체상에 고정하는 단계; 고정된 핵산 및 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 핵산의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 핵산의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 반응 혼합물은 증진제 (enhancer)를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 증진제는 수여자 염료 (acceptor dye)를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 수여자 염료는 플루오레신, 로다민, 설포로다민, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 405, ALEXA FLUOR 430, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, 또는 ALEXA FLUOR 555일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서,
일 수 있는 한편; 다른 경우들에서,
일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다. 일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 시료에서 효소의 존재 및/또는 양을 결정하는 검정 방법으로서, 화합물 [1]을 제공하는 단계; 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 시료를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 포함하고, 광의 생성은 효소의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 효소의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다.
일정 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 시료에서 항원의 존재 및/또는 양을 결정하는 검정 방법으로서, 화합물 [1]을 제공하는 단계; 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원 및 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 항원을 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 효소-결합된 항원을 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 포함하고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다.
일정 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 시료에서 핵산의 존재 및/또는 양을 결정하는 검정 방법으로서, 화합물 [1]을 제공하는 단계; 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 핵산을 고체상 위에 고정하는 단계; 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 분해되어 광을 생성하도록 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 고정된 핵산 및 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 포함하고, 광의 생성은 핵산의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 핵산의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다.
일정 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 화합물 [1]; 및 완충액을 포함하는, 시료에서 분석물의 존재 및/또는 양을 검출하는 키트를 제공한다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서,
일 수 있다.
일정 구현예들에서,
일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다.
일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 키트는 증진제를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 증진제는 수여자 염료를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 수여자 염료는 플루오레신, 로다민, 설포로다민, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 405, ALEXA FLUOR 430, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, 또는 ALEXA FLUOR 555일 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 화합물의 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 25℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 화합물의 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 37℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물을 제공하고,
여기에서, A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기이고;
R3는 수소 또는 전자-공여기이다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다. 일정 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 25℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 37℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물을 제공하고,
여기에서,
A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기이고;
R3는 수소 또는 전자-공여기이고;
R4, 및 R5는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 시아노, 니트로, 설포네이트, 설페이트, 트리플루로메틸, 트리플루로에틸, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알콕시, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴옥시, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 에스테르, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬암모니움, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬포스포니움, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬카바모일, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴카바모일, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설폰아미도, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설폰아미도, 3 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬시릴, 18 내지 42개 탄소 원자들을 포함하는 트리아릴시릴, 7 내지 32개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아릴시릴, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도설포닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설포닐, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 및 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴티오로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X는 황 원자, 산소 원자, 또는 질소 원자이다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다. 일정 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 25℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 37℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물을 제공하고,
여기에서
A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기이고;
R3는 수소 또는 전자-공여기이다.
일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다.
일정 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다. 일정 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드이고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자이고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
이고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다.
일정 구현예들에서, 전자-공여기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 25℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 37℃에서 광의 생성을 유발한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물은
일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물
를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 화학식을 가지는 화합물
을 제공하는 단계; 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함하는 효소 복합체를 제공하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물이 광을 생성하도록 허용하는 단계;를 포함하고, 효소 복합체가 고체상을 포함할 때, 항원은 고체상 위에 고정되고, 항원은 단백질이고, 다음으로 고체상은 멤브레인 또는 마이크로검정법이 아닌 조건으로, 광을 생성하는 방법을 제공한다.
일정 구현예들에서, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 알칼라인 포스파타제의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 알칼라인 포스파타제의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 항원과 결합할 수 있는 첫 번째 항체를 포함하는 알칼라인 포스파타제-결합된 항체일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 첫 번째 항체는 알칼라인 포스파타제와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 첫 번째 항체는 표지와 공유적으로 결합될 수 있고 알칼라인 포스파타제는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 두 번째 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 알칼라인 포스파타제-결합된 항체를 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 알칼라인 포스파타제-결합된 항체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 항원을 포함하는 알칼라인 포스파타제-결합된 항원일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 항원은 알칼라인 포스파타제와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 항원은 표지와 공유적으로 결합될 수 있고, 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘인 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체이다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 알칼라인 포스파타제-결합된 항원을 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 알칼라인 포스파타제-결합된 항원을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 알칼라인 포스파타제-결합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 올리고뉴클레오타이드는 알칼라인 포스파타제와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 올리고뉴클레오타이드는 표지와 공유적으로 결합될 수 있고, 알칼라인 포스파타제는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 핵산을 고체상 위에 고정하는 단계; 고정된 핵산 및 알칼라인 포스파타제-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 핵산의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 핵산의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 반응 혼합물은 증진제를 더 포함할 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있는 한편; 다른 경우들에서, 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다.
일정 이들 구현예들에서, 증진제는 수여자 염료를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 수여자 염료는 플루오레신, 로다민, 설포로다민, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 405, ALEXA FLUOR 430, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, 또는 ALEXA FLUOR 555일 수 있다.
본 발명을 자세하게 기술하기 이전에, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 구현예들에 제한되지 않은 점이 이해되어야 한다. 또한, 방법들 및 키트들은 다양한 단계들 또는 구성성분들을 "포함하는 (comprising)" ("포함하지만 제한되지는 않는"을 의미하는 것으로 해석됨)의 견지에서 기술되는 한편, 방법들 및 키트들은 다양한 단계들 및 구성성분들로 "필수적으로 구성되는" 또는 "구성되는" 것일 수도 역시 있으며, 이러한 용어학은 필수적으로 폐쇄된-구성원 그룹들을 정의하는 것으로서 해석되어야 한다. 마지막으로, 본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 달리 문맥이 분명하게 진술하지 않는 경우라면 복수의 대상들을 포함한다.
정의들:
수여자 염료 (acceptor dye)는 에너지, 특히 광을 또 다른 광-방출 분자로부터 수여하고 다음 순서로 검출가능한 에너지, 즉 바람직하게 광을 방출할 수 있는 분자를 말한다.
분석물 (analyte)은 분석적 절차에서 결정되는 물질 또는 화학적 성분들을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 본 용어는 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원 또는 항체를 포함한다.
항원은 항체가 결합할 수 있는 물질을 말한다.
항체는 척추동물들의 혈액 또는 다른 체액들에서 발견되는 감마글로불린 단백질들을 말하고, 외래 물체들을 확인하고 중성화하도록 면역 체계에 의해 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 본 용어는 이에 제한되는 것은 아니지만, 항원이 결합할 수 있는 임의의 다중클론, 단일클론, 재조합 항체 또는 그들의 단편들을 포함한다.
증진제 (enhancer)는 1,2-디옥세탄 효소 기질의 효소적 절단 및 그의 연속적 분해로부터 유발되는 특이적 광 에너지 생산을 증가시키는 물-용해성 물질을 말하고, 관찰된 이러한 광 생산은 증진제의 부재 시 관찰되는 정도를 초과한다.
효소는 화학적 반응들을 촉매하는 단백질들을 말한다.
햅텐 (hapten)은 단백질과 같은 큰 담체 (carrier)에 부착될 때에만 면역 반응을 나타낼 수 있는 소분자를 말한다.
가수분해 효소 또는 하이드롤라제는 화학적 결합의 가수분해를 촉매하고 효소들의 EC 번호 분류에서 EC3로서 분류될 효소를 말한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, RNA 또는 그의 단편을 말한다.
올리고뉴클레오타이드는 짧은 핵산 중합체를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 본 용어는 이에 제한되는 것은 아니지만, 2 내지 1,000개 핵산들을 포함하는 핵산 중합체를 포함한다.
본 발명은 1,2-디옥세탄들 (1,2-dioxetanes)인 화합물들을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물들 하나 이상을 사용하는 방법들을 제공한다. 본 방법들은 광을 생성하기 위해 제공된다. 광의 생성은 효소, 항원, 또는 핵산을 포함하는 하나 이상의 분석물들의 시료에서 존재 및/또는 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 시료에서 하나 이상의 분석물들의 존재 및/또는 양의 검출을 위한 키트들을 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 광을 생성하기 위한 키트들을 제공한다. 본 키트들은 본 발명의 화합물들의 하나 이상을 포함한다. 이들 화합물들, 방법들 및 키트들은 기술분야-인지된 검정법들에서 유용성을 가진다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 1,2-디옥세탄들일 수 있는 화합물들을 제공한다. 이들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기에 기술된 바와 같은 그들의 각각의 치환기들을 가지는 구조들 [1] 내지 [4]를 가지는 화합물들을 포함하고,
여기에서,
A 및 B는 독립적으로 직쇄 알킬, 직쇄 알케닐, 분지된 알킬, 분지된 알케닐, 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알킬, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬, 및 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬 및 다중고리헤테로알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있거나, A 및 B는 함께 할로겐으로 치환된 다중고리알킬을 형성하고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬일 수 있고;
R2는 T 상의 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기일 수 있고;
R3는 수소 또는 전자-공여기일 수 있고; R1이 미치환될 때, R3는 전자-공여기가 되는 조건이고;
여기에서
일 수 있다.
여기에서,
A 및 B는 독립적으로 직쇄 알킬, 직쇄 알케닐, 분지된 알킬, 분지된 알케닐, 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알킬, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬, 및 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬일 수 있고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기일 수 있고;
R3는 수소 또는 전자-공여기일 수 있다.
여기에서,
A 및 B는 독립적으로 직쇄 알킬, 직쇄 알케닐, 분지된 알킬, 분지된 알케닐, 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알킬, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬, 및 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬일 수 있고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기일 수 있고;
R3는 수소 또는 전자-공여기일 수 있고;
R4, 및 R5는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 시아노, 니트로, 설포네이트, 설페이트, 트리플루오로메틸, 트리플루오로에틸, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알콕시, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴옥시, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 에스테르, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬암모니움, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬포스포니움, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬카바모일, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴카바모일, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설폰아미도, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설폰아미도, 3 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬시릴, 18 내지 42개 탄소 원자들을 포함하는 트리아릴시릴, 7 내지 32개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아릴시릴, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도설포닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설포닐, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 및 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴티오로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고;
X는 황 원자, 산소 원자, 또는 질소 원자이다.
여기에서,
A 및 B는 독립적으로 직쇄 알킬, 직쇄 알케닐, 분지된 알킬, 분지된 알케닐, 3고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알킬, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬, 및 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알킬 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고;
R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬일 수 있고;
R2는 산소 음이온을 수득하도록 효소 분체에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소-절단가능한 기일 수 있고;
R3는 수소 또는 전자-공여기일 수 있다.
화합물 [1]의 일정 구현예들에서, A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 고리헤테로알킬, 고리헤테로알케닐, 다중고리알케닐, 다중고리헤테로알킬 및 다중고리헤테로알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있거나, A 및 B는 함께 할로겐으로 치환된 다중고리알킬을 형성한다.
화합물 [2] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, A 및 B는 독립적으로 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이들 중 하나는 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있고, A 및 B는 함께 고리알킬, 고리알케닐, 다중고리알케닐, 또는 다중고리알케닐을 형성하고, 형성된 그룹은 미치환되거나 하나 이상의 전자-활성기들, 용해기들, 또는 광-증진기들로 치환될 수 있다.
전자-활성기들의 예들로는: H, F, Cl, Br, I, 시아노, 니트로, 설포네이트, 설페이트, 트리플루오로메틸, 트리플루오로에틸, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리알케닐, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 고리헤테로알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알킬, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리알케닐, 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알킬, 및 4 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 다중고리헤테로알케닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알콕시, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴옥시, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 에스테르, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬암모니움, 3 내지 30개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬포스포니움, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도, 2 내지 21개 탄소 원자들을 포함하는 알킬카바모일, 7 내지 15개 탄소 원자들을 포함하는 아릴카바모일, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설폰아미도, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설폰아미도, 3 내지 60개 탄소 원자들을 포함하는 트리알킬시릴, 18 내지 42개 탄소 원자들을 포함하는 트리아릴시릴, 7 내지 32개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아릴시릴, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬아미도설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴아미도설포닐, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬설포닐, 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴설포닐, 2 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 및 6 내지 14개 탄소 원자들을 포함하는 아릴티오를 포함한다.
전자 활성기들로는 전자-공여 및 전자-유인기들을 포함한다. 전자 공여기들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 알킬, 알콕시, 미치환 및 치환된 아미노기들 등을 포함한다. 전자-유인기들의 예들로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 할로겐, 시아노, 니트로, 카르복시, 에스테르, 카르복사아마이드기들 등을 포함한다. 용해기는 이에 제한되는 것은 아니지만, 카르복시, 설포네이트, 설페이트, 트리알킬암모니움, 트리알킬포스포니움기들 등을 포함한다. 용해기들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 하이드록시, 카르복시, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 트리알킬암모니움, 및 트리알킬포스포니움, 등을 포함한다.
용해기들의 예들로는: 카르복실산, 말론산, 하이드록실들, 설레이트들, 설포네이트들, 포스페이트들, 및 암모니움기들; 카르복실산, 말론산, 하이드록실들, 설레이트들, 설포네이트들, 포스페이트들, 및 암모니움기들에 의해 종결되는 n = 1 내지 30인 폴리(에폭시)n 기들 [-(O-CH2-CH2-)n]; 카르복실산, 말론산, 하이드록실들, 설레이트들, 설포네이트들, 포스페이트들, 및 암모니움기들에 의해 종결되는 n = 1 내지 30인 폴리[-O-(CH2-)n]을 포함한다.
광 증진기들의 예들로는: 알킬암모니움, 알킬포스포니움, 알킬설포니움기들;알킬아릴암모니움, 알킬아릴포스포니움, 알킬아릴 설포니움기들; 또는 아릴암모니움, 아릴포스포니움, 아릴설포니움기들; 및 폴리(알킬암모니움), 폴리(알킬포스포니움), 폴리(알킬설포니움) 기들; 폴리(알킬아릴암모니움), 폴리(알킬아릴포스포니움), 폴리(알킬아릴설포니움) 기들; 또는 폴리(아릴암모니움), 폴리(아릴포스포니움), 폴리(아릴설포니움) 기들과 같은 양이온성 또는 다중양이온성 분체들을 포함한다.
할로겐기들은 불소, 염소, 브롬 및 요오드 원자를 포함한다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, A 또는 B의 적어도 하나는
일 수 있다. 화합물 [1]의 일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다. 화합물들 [2] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, A 및 B는 함께
일 수 있다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자들로 선택적으로 치환될 수 있는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬일 수 있다. 다른 구현예들에서, R1은 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬 또는 1 내지 2개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 트리플루오로알킬일 수 있다. 다른 구현예들에서, R1은 메틸 또는 1,1,1-트리플루오로에틸일 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물 [1]은 광을 방출할 수 있는 아릴 또는, 이에 제한되는 것은 아니지만 헤테로아릴 고리를 포함하는 융합된 다중고리 고리 화합물일 수 있는 T를 가질 것이다. T는 이것이 광의 생산을 방해하지 않고 이것이 부착되는 디옥세탄 고리의 4번-탄소의 원자가를 만족시키도록 선택된다. T는 해당 디옥세탄 분해 단편들이 에너지를 흡수하도록 허용하고 그들이 기저 상태로 돌아오도록 이로부터 광학적으로 검출가능한 에너지를 방출하는 여기된 상태를 형성하는 많은 광-방출 형광단-형성 형광성 발색단기들의 임의의 것을 나타낸다. T는 디옥세탄 고리와 결합된 전자-농축 분체, 예를 들면 산소 음이온, 황 음이온 또는 질소 음이온을 직접적으로 또는 pH의 연속적 조절에 의해 수득하도록 효소에 의해 절단가능한 결합을 포함하는 효소 절단가능한 기로도 역시 치환된다.
일정 구현예들에서, T는 전자-활성기들, 용해기들 또는 광-증진기들로 치환될 수 있는, 페닐과 같은 아릴일 수 있다.
일정 구현예들에서, T는 효소에 의해 절단될 때 융합된 다중고리 분체를 전자-농축되게 하고 다음 순서로 디옥세탄 화합물을 광을 방출하도록 분해가능하게 하는 결합을 포함하는 효소적으로 절단가능한 불안정 고리 치환기를 가지는 융합된 다중고리 고리-포함 형광단 분체일 수 있다.
잔기들이 이러한 형광단 분체를 형성하는 데 사용될 수 있는 융합된 다중고리 고리 화합물들 중에는 다음의 나프탈렌과 같은, 9개로부터 약 30개까지의 고리 탄소 원자들을 포함하는 융합된 다중고리 방향족 탄화수소 고리 형광단 화합물들이 포함된다:
펜탈렌, 아주렌, 헵타렌, 아신다센, s-인다센, 비페닐렌, 페릴렌, 아세나프틸렌, 페난트렌, 안트라센, 아세페난트릴렌, 아세안트릴렌, 트리페닐렌, 파이렌, 크리센, 및 나프타센 등, 뿐만 아니라 예로 메틸, n-부틸, 또는 데실을 포함하는 1 내지 20개 탄소 원자들을 가지는 분지쇄 또는 직쇄 알킬기; 예로 메톡시, 하이드록시에틸, 또는 하이드록시프로필을 포함하는 1 내지 7개 탄소 원자들을 가지는 분지쇄 또는 직쇄 헤테로알킬기; 1 또는 2개 고리들을 가지는 아릴기, 예로 페닐; 1 또는 2개 고리들을 가지는 헤테로아릴, 예로 피롤릴 또는 피라졸릴; 예로 고리에 고리헥실을 포함하는 3 내지 7개 탄소 원자들을 가지는 고리알킬기; 예로 고리에 디옥산을 포함하는 3 내지 6개 탄소 원자들을 가지는 헤테로고리알킬기; 1 또는 2개 고리들을 가지는 아르알킬, 예로 벤질; 1 또는 2개 고리들을 가지는 알카릴, 예로토릴; 예로 트리플루오로메틸을 포함하는 1 및 7개 범위의 탄소 원자들을 가지는 퍼플루오로알킬기와 같은 전자-유인기; 할로겐; CO2H, Z'CO2H, SO3H, NO2, Z'NO2, CN, 또는 Z'CN, 여기에서 Z'는 예로 메틸을 포함하는 1 내지 7개 탄소 원자들을 가지는 분지쇄 또는 직쇄 알킬기, 또는 1 또는 2개 고리들을 가지는 아릴기, 예로 페닐; 전자-공여기, 예로 분지쇄 또는 직쇄 C1-C7 알콕시기, 예로 메톡시 또는 에톡시; 1 또는 2개 고리들을 가지는 아르알콕시기, 예로 펜옥시; 분지쇄 또는 직쇄 C1-C7 알콕시기, 예로 메톡시 또는 에톡시; 1 또는 2개 고리들을 가지는 아르알콕시기, 예로 펜옥시; 분지쇄 또는 직쇄 C1-C7 하이드록시알킬기, 예로 하이드록시메틸 또는 하이드록시에틸; 1 또는 2개 고리들을 가지는 하이드록시아릴기, 예로 하이드록시페닐; 분지쇄 또는 직쇄 C1-C7 알킬 에스테르기, 예로 아세테이트; 1 또는 2개 고리들을 가지는 아릴 에스테르기, 예로 벤조에이트; 또는 1 또는 2개 고리들을 가지는 헤테로아릴기, 예로 벤즈옥사졸, 벤즈티아졸, 벤즈이미다졸 또는 벤즈트리아졸이고, 이와 같은 하나 이상의 안정 치환기들로 치환된 그들의 유도체들.
또한, T에 의해 나타낸 형광단 분체의 융합된 다중고리 고리 부분은, 미치환되거나 상기 언급된 안정 치환기들의 하나 이상으로 치환되고, 9개로부터 약 30개까지 고리 원자들을 대부분이 탄소 원자들인 것을 포함하는, 융합된 다중고리 방향족 헤테로고리 고리 형광단 화합물, 예로 벤조[b]테오펜, 나프토[2,3-b]티오펜, 티안트렌, 벤조퓨란, 이소벤조퓨란, 크로멘, 잔텐, 펜옥사틴, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 페난트리딘, 페나진, 펜옥사진, 페노티아진, 펜안트롤린, 퓨린, 4H-퀴놀리진, 프탈라진, 나프틸리딘, 인돌, 인돌리진, 크로만, 이소크로만, 인돌린, 및 이소인돌린 등의 잔기일 수도 있다.
화합물 [1]의 일정 구현예들에서, 
는
일 수 있는 한편, 다른 구현예들에서 
는
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, OR2은 포스페이트, 아세테이트, 1-포스포-2,3-디아실글리세라이드, 아데노신 트리포스페이트, 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, α-D-갈락토사이드, β-D-갈락토사이드, α-D-글루코사이드, β-D-글루코사이드, α-D-만노사이드, β-D-만노사이드, β-플럭토퓨라노사이드, β-D-글루쿠로나이드, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직선상 알킬 (분지쇄 또는 직쇄), 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, R2는
일 수 있다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, R2, 효소적으로 절단가능한 치환기는 다음의 일반 화학식에 의해 나타낸 포스페이트 에스테르기일 수 있다:
여기에서 M+는 알칼리 금속, 예로 소듐 또는 포타슘과 같은 양이온, 암모니움, 또는 C1-7 알킬, 아르알킬 또는 방향족 사차 암모니움 양이온, 각각의 D3가 알킬, 예로 메틸 또는 에틸, 아르알킬, 예로 벤질, 또는 헤테로고리 고리 시스템의 형태 일부분, 예로 피리디니움, 및 상세하게는 디소듐 염일 수 있는 N(D3)4 +를 나타낸다. 이러한 사차 암모니움 양이온들은 그들의 사차화 기들의 하나를 통해 중합성 골격, 비즈 (viz)에도 역시 연결될 수 있다.
여기에서 n은 1 이상이거나, 다중사차 암모니움 염, 예로 이오넨 중합체의 일부분일 수 있다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, R2는 E-L-Nuc-Z일 수 있고, 여기에서 E는 전자친화성 원자를 포함하는 기이고, 원자는 Z기의 효소적 절단 시 Nuc기의 전자쌍에 의해 공격되고 비조합 조력에 의해 화합물 음이온을 방출하고; L은 연결기이고; Nuc은 핵친화성 원자이고; Z는 효소적으로 절단가능한 기이고;
여기에서 E는 카르복실, 카르보닐, 이탈기에 의해 치환된 메틸렌, 포스페이트, 카보네이트, 크산테이트, 설파이트, 설포네이트, 비설파이트 또는 비설파이드일 수 있고;
L은 메틸렌 또는 1 내지 4개 탄소 원자들, -(CH2)m-O-(CH2)n, -(CH2)m-S-(CH2)n-, 또는 -(CH2)m-NR6-(CH2)n-를 포함하는 폴리메틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기에서 m 및 n은 0 내지 3이고 m + n은 2 또는 3이고, 여기에서 R6는 1 내지 10개 탄소 원자들을 포함하는 알킬이고, 연결기는 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 알케닐, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알킬, 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하는 아실옥시로 단일- 또는 이중-치환된 알케닐, 6 내지 10개 탄소들을 포함하는 아릴, 1 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알킬, 또는 2 내지 24개 탄소 원자들을 포함하고 페닐, 하이드록시페닐, 인도릴, 머캅토, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 알킬티오, 하이드록시, 카르복시, 아미노, 구아니디노, 이미다졸 또는 카바밀로 치환된 알케닐에 의해 치환될 수 있고;
Nuc은 산소 원자 또는 황 원자일 수 있고;
Z는 포스포릴, 아세틸, 1-포스포-2,3-디아실글리세로실, 아데노신 트리포스포릴, 아데노신 디포스포릴, 아데노신 모노포스포릴, 아데노실, α-D-갈락토실, β-D-갈락토실, α-D-글루코실, β-D-글루코실, α-D-만노실, β-D-만노실, β-플럭토퓨라노실, β-D-글루코시듀란실, 또는
일 수 있고, 여기에서 B1, B2, 및 B3은 각각 독립적으로, H, 1 내지 4개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 3 내지 6개 탄소 원자들을 포함하는 분지쇄 알킬이다. 일정 이들 구현예들에서, Z는
일 수 있다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, 전자-공여기, R3는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지e된 알킬, 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시, 또는 3 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 분지된 알콕시일 수 있다. 다른 구현예들에서, R3는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 20개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다. 다른 구현예들에서, R3는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알킬, 또는 1 내지 5개 탄소 원자들을 포함하는 직쇄 알콕시일 수 있다. 다른 구현예들에서, R3는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 및 부틸옥시로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달하는 25℃에서 광의 생성을 유발할 수 있다. 다른 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 다른 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
화합물들 [1] 내지 [4]의 일정 구현예들에서, 효소 분체에 의해 절단가능한 결합의 절단은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달하는 37℃에서 광의 생성을 유발할 수 있다. 다른 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 다른 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물 [1]은:
을 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물 [2]는:
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물 [3]은:
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 화합물 [4]
는:
일 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 이에 제한되는 것은 아니지만:
도 역시 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은:
인 화합물을 제공한다.
본 명세서에서 개시된 임의의 본 발명의 화합물들은 하기에 또는 상기 본 발명의 요약에서 개시된 방법들 및 키트들에서 사용될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 방법들을 제공한다. 본 방법들은 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물을 제공하는 단계; 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함하는 효소 복합체를 제공하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물이 광을 생성하도록 허용하는 단계:를 포함할 수 있다.
이들 방법들의 하나의 단계에서, 본 발명의 화합물이 제공된다. 이러한 화합물은 화학식 [1], [2], [3], 또는 [4]를 가질 수 있고 상기에 또는 발명의 요약에서 개시된 바와 같은 임의의 그들의 구현예들을 포함할 수 있다.
이들 방법들의 또 다른 단계에서, 효소, 항원, 항체, 핵산 또는 분석물을 포함할 것으로 의심된 시료가 제공된다. 효소, 항원, 핵산 또는 분석물을 포함할 것으로 의심된 시료들은 검정될 수 있다. 시료는 생물학적 또는 비-생물학적 기원일 수 있다. 시료가 생물학적 기원인 곳에서, 이것은 혈액, 혈청, 소변, 대변, 타액, 점액, 정액, 조직, 조직 추출물, 세포 배양 배지, 세포들, 및 세포 추출물들 등일 수 있다.
이들 방법들의 또 다른 단계에서, 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함할 수 있는 효소 복합체가 제공된다. 효소 분체는 효소, 효소-결합된 항체, 효소-결합된 항원 또는 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 효소 분체는 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 효소는 가수분해 효소일 수 있다. 가수분해 효소는 에스테르 결합들을 절단하고 EC 3.1로서 분류되거나 당 결합들을 절단하고 EC 3.2로서 분류되는 효소들을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, β-글루쿠로니다제 또는 뉴라미니다제를 포함한다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 효소일 수 있다. 이들 구현예들에서, 시료에서의 효소는 효소 복합체를 포함한다. 효소 복합체는 반응 혼합물을 형성하도록 본 발명의 화합물과 접촉되고, 반응 혼합물은 광을 생성하도록 허용된다.
일정 구현예들에서, 광의 방출이 검출될 수 있고 이러한 방출은 효소의 존재를 가리킬 것이고, 방출된 광의 양은 시료에서 존재하는 효소의 양과 상관될 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 효소-결합된 항체일 수 있다. 효소-결합된 항체는 항원과 결합할 수 있는 첫 번째 항체 및 기질이 분해되어 광을 생성하도록 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함한다. 이들 구현예들에서, 효소-결합된 항체, 항원, 및 항원과 결합하고 고체상 위에 고정될 수 있는 두 번째 항체는 효소 복합체를 포함한다. 효소 복합체는 반응 혼합물을 형성하도록 본 발명의 화합물과 접촉되고, 반응 혼합물은 광을 생성하도록 허용된다.
일정 구현예들에서, 항원을 포함하는 것으로 의심된 시료는 첫 번째 항체 및 효소를 포함하는 효소-결합된 항체 및 두 번째 항체를 포함하는 고체상과 접촉될 수 있고, 여기에서 둘 다의 항체들은 항원과 결합할 수 있어 기질이 분해되어 광을 생성하도록 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소 복합체를 제공할 수 있다. 시료, 효소-결합된 항체 및 고체상은 임의의 순서로 조합될 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체를 세척하여 임의의 미결합 효소-결합된 항체를 효소 복합체로부터 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이것은 효소 복합체의 구성성분들과 양립가능한 완충액의 첨가 및 제거에 의해 수행될 수 있다. 이러한 완충액들은 진단적 기술분야에서 잘 알려져 있다. 고체상의 추가적인 세척 단계들이 수행될 수 있다.
첫 번째 항체, 두 번째 항체, 또는 둘 다는 다중클론, 단일클론 또는 재조합 항체일 수 있다.
고체상은 비드, 테스트 튜브, 다중-웰 플레이트, 마이크로어레이, 젤, 멤브레인, 미세입자들, 나노결정들, 및 퀀텀 도트들 등일 수 있다. 이들 고체상들이 만들어지는 재료들은 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
두 번째 항체는 진단적 기술분야에서 알려져 있는 기법들에 의해, 고체상에 항체의 비공유적 또는 공유적 부착에 의해 고체상 위에 고정될 수 있다.
첫 번째 항체는 공유적으로 또는 비공유적으로 효소와 연결될 수 있다. 비공유적으로 연결될 때, 첫 번째 항체는 표지와 공유적으로 연결될 수 있고 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 연결될 수 있다.
일정 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있다. 바이오틴 유도체는 치환들을 가지는 바이오틴 분자이다. 바이오틴 구조의 일부분이 소실된 바이오틴 분자도 역시 바이오틴 유도체라고 고려된다. 바이오틴 유도체들은 자연적으로-생기는 바이오틴뿐만 아니라 치환된 합성 바이오틴을 포함한다.
일정 구현예들에서, 표지는 햅텐일 수 있고 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 햅텐으로서 디옥시제닌 (digoxigenin), 및 분자로서 항-디옥시제닌의 사용이 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 효소-결합된 항원일 수 있다. 효소-결합된 항원은 항원 및 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함한다. 이들 구현예들에서, 효소 복합체는 항원을 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상에 결합된 효소-결합된 항원을 포함한다. 효소 복합체는 반응 혼합물을 형성하도록 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물과 접촉되고 반응 혼합물은 광을 생성하도록 허용된다.
일정 구현예들에서, 항원을 포함하는 것으로 의심된 시료는 효소-결합된 항체 및 항원과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상과 접촉될 수 있다. 시료, 효소-결합된 항체 및 고체상은 임의의 순서로 조합될 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체를 세척하여 임의의 미결합 효소-결합된 항원들을 효소 복합체로부터 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이것은 효소 복합체의 구성성분들과 양립가능한 완충액의 첨가 및 제거에 의해 수행될 수 있다. 이러한 완충액들은 진단적 기술분야에서 잘 알려져 있다. 고체상의 추가적인 세척 단계들이 수행될 수 있다.
항체는 다중클론, 단일클론 또는 재조합 항체일 수 있다.
고체상은 비드, 테스트 튜브, 다중-웰 플레이트, 마이크로어레이, 젤, 멤브레인, 미세입자들, 나노결정들, 및 퀀텀 도트들 등일 수 있다. 이들 고체상들이 만들어지는 재료들은 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
항체는 고체상에 항체의 비공유적 또는 공유적 부착에 의해 고체상에 고정될 수 있다.
항원은 공유적으로 또는 비공유적으로 효소와 연결될 수 있다. 비공유적으로 연결될 때, 항원은 표지와 공유적으로 연결될 수 있고 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 연결될 수 있다.
일정 구현예들에서, 표지는 상기에 기술된 바와 같이 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있다.
일정 구현예들에서, 표지는 햅텐일 수 있고 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 햅텐으로서 디옥시제닌, 및 분자로서 항-디옥시제닌의 사용이 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드는 소정의 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 본 발명의 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함한다. 이들 구현예들에서, 효소 복합체는 핵산을 포함하는 고체상에 혼성화된 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 효소 복합체는 반응 혼합물을 형성하도록 본 발명의 화합물과 접촉되고 반응 혼합물은 광을 생성하도록 허용된다.
일정 구현예들에서, 본 방법들은 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 핵산을 고체상 위에 고정하는 단계; 고정된 핵산 및 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 1,2-디옥세탄 효소 기질의 수용성 용액의 첨가 이후에 반응 혼합물로부터 방출된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 핵산의 존재를 가리키고, 방출된 광의 양은 시료에 존재하는 핵산의 양과 상관될 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체를 세척하여 임의의 미결합 효소-결합된 항원들 효소 복합체로부터 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이것은 효소 복합체의 구성성분들과 양립가능한 완충액의 첨가 및 제거에 의해 수행될 수 있다. 이러한 완충액들은 진단적 기술분야에서 잘 알려져 있다. 고체상의 추가적인 세척 단계들이 수행될 수 있다.
고체상은 비드, 테스트 튜브, 다중-웰 플레이트, 마이크로어레이, 젤, 멤브레인, 미세입자들, 나노결정들, 및 퀀텀 도트들 등일 수 있다. 이들이 만들어지는 재료들은 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
올리고뉴클레오타이드는 공유적으로 또는 비공유적으로 효소와 연결될 수 있다. 비공유적으로 연결될 때, 올리고뉴클레오타이드는 표지와 공유적으로 연결될 수 있고 효소는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 연결될 수 있다.
일정 구현예들에서, 표지는 상기에 기술된 바와 같이 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘일 수 있다.
일정 구현예들에서, 표지는 햅텐일 수 있고 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 햅텐으로서 디옥시제닌, 및 분자로서 항-디옥시제닌의 사용이 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
본 방법의 또 다른 단계에서, 시료는 단독으로 또는 효소 분체를 포함하는 복합체로서 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물과 접촉되어 반응 혼합물을 형성한다.
일정 구현예들에서, 시료는 본 발명의 화합물에 첨가될 수 있는 한편, 다른 구현예들에서 본 발명의 화합물을 포함하는 수용성 용액이 시료에 첨가될 수 있다.
일정 구현예들에서, 반응 혼합물은 증진제를 더 포함할 수 있다. 증진제는 CTAB (세틸트리메틸암모니움 브로마이드) 및 다른 미셀-형성 (micelle-forming) 물질들을 포함할 수 있다. 증진제는 소혈청 알부민과 같은 천연 물질 또는 유사한 형태의 생물학적 또는 단백질 기초 분자들 또는 화합물들, 무지방 소혈청 알부민, 또는 증진화 (enhancing) 물질에 의해 효과를 내는 검출된 화학발광성 방출의 증진을 개선하는 임의의 증진 첨가물일 수 있다. 증진제는 중합체일 수 있다. 대표적인 중합체들 및 그들의 증진제들로서의 효과들은 미국 특허 제 5,145,772호 및 제 5,547,836호에 개시되어 있고, 이들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 이들 중합체들은 단독으로, 또는 표면활성제 첨가물과 함께, 본 명세서에서 참고문헌으로 역시 통합되어 있는 미국 특허 제 5,994,073호에서 개시된 바와 같이, 증진 수치를 더 개선하는 데 사용될 수 있다. 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있다. 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다.
일정 구현예들에서, 증진제는 수여자 염료를 더 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중에서, 수여자 염료는 형광성 염료일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 형광성 염료는 플루오레신, 로다민, 설포로다민, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 405, ALEXA FLUOR 430, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, 또는 ALEXA FLUOR 555일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 형광성 염료는 플루오레신일 수 있다.
이들 방법들의 또 다른 단계에서, 반응 혼합물은 광을 생성하도록 허용된다.
일정 구현예들에서, 광은 육안으로 관찰되거나 생성된 광을 검출하고 측정할 수 있는 X-선 필름 또는 장치들을 사용하여 측정될 수 있다. 생성된 광을 검출하고 측정할 수 있는 장치들은 이에 제한되는 것은 아니지만, 루미노측정기 (luminometer), 필름을 가진 카메라 또는 전하-결합 (charge-coupled) 카메라를 포함할 것이다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 본 발명의 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서에서 개시된 다양한 구현예들에서 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물, 및 완충액을 포함하는 시료에서 분석물의 존재 또는 양을 검출하는 키트들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 키트들은 상기에 기술된 바와 같은 증진제를 더 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 키트들은 상기에 기술된 바와 같은 수여자 염료를 더 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물:
을 제공하는 단계; 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함하는 효소 복합체를 제공하는 단계; 효소 복합체를 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 반응 혼합물이 광을 생성하도록 허용하는 단계;를 포함하고, 효소 복합체가 고체상을 포함할 때, 항원은 고체상 위에 고정되고, 항원은 단백질이고, 다음으로 고체상은 멤브레인 또는 마이크로검정법이 아닌 조건으로, 광을 생성하는 방법을 제공한다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 알칼라인 포스파타제일 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 항원을 결합할 수 있는 알칼라인 포스파타제-결합된 항체일 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 알칼라인 포스파타제-결합된 항원일 수 있다.
일정 구현예들에서, 효소 분체는 항원을 결합할 수 있는 알칼라인 포스파타제-결합된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일정 구현예들에서, 알칼라인 포스파타제는 항체, 항원 또는 올리고뉴클레오타이드와 비공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 항체, 항원 및 올리고뉴클레오타이드는 표지와 공유적으로 결합될 수 있고 알칼라인 포스파타제는 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합될 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 표지는 바이오틴, 또는 바이오틴 유도체일 수 있고, 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘인 한편; 다른 이들 구현예들에서, 표지는 햅텐일 수 있고, 분자는 햅텐과 결합할 수 있는 항체이다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 두 번째 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 알칼라인 포스파타제-결합된 항체를 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 항체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 항원과 결합할 수 있는 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계; 시료 및 효소-결합된 항원을 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 항원의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 항원을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 방법은 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계; 핵산을 고체상에 고정하는 단계; 고정된 핵산 및 알칼라인 포스파타제-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및 화합물의 첨가 이후에 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있고, 광의 생성은 핵산의 존재를 가리키고, 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 핵산의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 광의 생성은 약 15분 미만 경과 시 최대에 도달한다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 10분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 광의 생성은 약 5분 미만 경과 시 최대에 도달할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 본 방법은 효소 복합체로부터 임의의 미결합된 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 고체상은 비드, 테스트 튜브, 다중-웰 플레이트, 마이크로어레이, 젤, 멤브레인, 미세입자들, 나노결정들, 및 퀀텀 도트들 등일 수 있다. 이들이 만들어지는 재료들은 진단적 기술분야에서 알려져 있다.
일정 구현예들에서, 반응 혼합물은 증진제를 더 포함할 수 있다. 증진제는 CTAB (세틸트리메틸암모니움 브로마이드) 및 다른 미셀-형성 물질들을 포함할 수 있다. 증진제는 소혈청 알부민과 같은 천연 물질 또는 유사한 형태의 생물학적 또는 단백질 기초 분자들 또는 화합물들, 무지방 소혈청 알부민, 또는 증진화 물질에 의해 효과를 내는 검출된 화학발광성 방출의 증진을 개선하는 임의의 증진 첨가물일 수 있다. 증진제는 중합체일 수 있다. 대표적인 중합체들 및 그들의 증진제들로서의 효과들은 미국 특허 제 5,145,772호 및 제 5,547,836호에 개시되어 있고, 이들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 이들 중합체들은 단독으로, 또는 표면활성제 첨가물과 함께, 본 명세서에서 참고문헌으로 역시 통합되어 있는 미국 특허 제 5,994,073호에서 개시된 바와 같이, 증진 수치를 더 개선하는 데 사용될 수 있다. 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있다. 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 증진제는 중합성 사차 암모니움 염, 중합성 사차 포스포니움 염, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 중합성 사차 암모니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸암모니움 클로라이드), 폴리[비닐벤질(벤질디메틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리부틸암모니움 클로라이드)], 폴리[비닐(벤질트리펜틸암모니움 클로라이드)], 또는 그들의 조합일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 중합성 사차 포스포니움 염은 폴리(비닐벤질트리메틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드), 폴리(비닐벤질트리부틸포스포니움 클로라이드) 및 폴리(비닐벤질트리옥틸포스포니움 클로라이드)를 포함하는 공중합체, 또는 그들의 조합일 수 있다.
일정 구현예들에서, 증진제는 수여자 염료를 더 포함할 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 수여자 염료는 형광성 염료일 수 있다. 일정 이들 구현예들에서, 형광성 염료는 플루오레신, 로다민, 설포로다민, ALEXA FLUOR 350, ALEXA FLUOR 405, ALEXA FLUOR 430, ALEXA FLUOR 488, ALEXA FLUOR 532, ALEXA FLUOR 546, 또는 ALEXA FLUOR 555일 수 있다.
도 1은 4-Me-3-OBn-벤즈알데하이드의 이-단계 합성을 나타낸 것이다.
도 2는 4-Me-Phe 포스포네이트의 이-단계, 일 용기 합성을 나타낸 것이다.
도 3은 탈벤질화가 이어지는 호너 에몬스 커플링 (Hormer Emmons coupling)에 의한 4-Me-Phe 에놀의 이-단계 합성을 나타낸 것이다.
도 4는 4-Me-Phe 에놀 에테르로 시작한 4-Me-Phe 에놀 에테르의 이-단계 합성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 섬광 기질들, 기질 A, 기질 B 및 기질 C의 구조들을 시판되는 CSPD® 및 CDP-Star® (캘리포니아주 샌디에고시 라이프 테크놀로지사 (Life Technologies))의 구조들과 함께 나타낸 것이다.
도 6은 25℃에서 수행된 기질들 A 및 B, CSPD 및 CDP-Star의 역학적 평가의 결과들을 나타낸 것이다.
도 7은 25℃에서 수행된 정제된 알칼라인 포스파타제의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다. 민감도는 신호-대-노이즈 비율이 2인 알칼라인 포스파타제 (AP)의 농도로서 정의된다.
도 8은 25℃에서 수행된 IL-6 면역검정법으로 기질 A, CSPD 및 CDP-Star의 역학적 평가를 나타낸 것이다.
도 9는 CDP-Star/사파이어-Ⅱ 및 기질 A을 위한 25℃에서 다양한 시간대들로 신호-대-노이즈 비율들을 나타낸 것이다.
도 10은 37℃에서 수행된 IL-6 면역검정법으로 기질들 A, B 및 C의 역학적 평가를 나타낸 것이다.
도 11은 면역검정 시스템으로 37℃에서 기질들 A, B, C 및 경쟁 기질을 위한 신호-대-노이즈 대비한 신호 역학들의 비교를 나타낸 것이다.
도 12는 IL-6 면역검정 시스템으로 민감도의 비교를 나타낸 것이다.
도 13은 기질 A를 위한 보관기간 안정도 연구의 결과들을 나타낸 것이다.
도 14는 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제로 결합된 토실활성화 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280로 기질들 A, B 및 C, CDP-Star/에머랄드-Ⅱ, 경쟁 섬광 기질 D, 경쟁 백열광 기질 E의 역학적 평가의 결과들을 나타낸 것이다.
도 15는 최적의 해독 시간으로 실온에서 토실활성화 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제의 다양한 양들로 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드들 M-280의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 16은 신호가 2분에서 해독되는 최적의 해독 시간으로 실온에서 토실활성화 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제의 다양한 양들로 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 17은 다이나비드 MyOne 카르복실산 및 기질 A/에머랄드-Ⅲ, 기질 B, 및 CDP-Star/에머랄드 Ⅱ를 사용하여 37℃에서 측정된 신호-대-노이즈 대비한 광 방출 역학들을 나타낸 것이다.
도 18은 기질 A/에머랄드-Ⅲ, 기질 B, 및 CDP-Star/에머랄드-Ⅱ를 사용하여 항-cTn1과 결합된 다이나비드 MyOne 카르복실산 비드들 상에서 37℃로 수행된 인간 심장 트로포닌 (cTnl) 면역검정법에서 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 기질 A를 사용한 다이나비드 MyOne 카르복실산, 다이나비드 M-280, 다이나비드 M-270 비드들을 기초로 하는 cTn1 면역검정법들을 위한 37℃에서 측정된 cTn1 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 20은 각각의 해독 시간대에서 기질들 A, B 및 C, CDP-Star/에머랄드-Ⅱ, 및 벤더 X의 기질 D로 다이나비드 M-270 에폭시 비드들을 기초로 한 cTn1 면역검정법의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 4-Me-Phe 포스포네이트의 이-단계, 일 용기 합성을 나타낸 것이다.
도 3은 탈벤질화가 이어지는 호너 에몬스 커플링 (Hormer Emmons coupling)에 의한 4-Me-Phe 에놀의 이-단계 합성을 나타낸 것이다.
도 4는 4-Me-Phe 에놀 에테르로 시작한 4-Me-Phe 에놀 에테르의 이-단계 합성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 섬광 기질들, 기질 A, 기질 B 및 기질 C의 구조들을 시판되는 CSPD® 및 CDP-Star® (캘리포니아주 샌디에고시 라이프 테크놀로지사 (Life Technologies))의 구조들과 함께 나타낸 것이다.
도 6은 25℃에서 수행된 기질들 A 및 B, CSPD 및 CDP-Star의 역학적 평가의 결과들을 나타낸 것이다.
도 7은 25℃에서 수행된 정제된 알칼라인 포스파타제의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다. 민감도는 신호-대-노이즈 비율이 2인 알칼라인 포스파타제 (AP)의 농도로서 정의된다.
도 8은 25℃에서 수행된 IL-6 면역검정법으로 기질 A, CSPD 및 CDP-Star의 역학적 평가를 나타낸 것이다.
도 9는 CDP-Star/사파이어-Ⅱ 및 기질 A을 위한 25℃에서 다양한 시간대들로 신호-대-노이즈 비율들을 나타낸 것이다.
도 10은 37℃에서 수행된 IL-6 면역검정법으로 기질들 A, B 및 C의 역학적 평가를 나타낸 것이다.
도 11은 면역검정 시스템으로 37℃에서 기질들 A, B, C 및 경쟁 기질을 위한 신호-대-노이즈 대비한 신호 역학들의 비교를 나타낸 것이다.
도 12는 IL-6 면역검정 시스템으로 민감도의 비교를 나타낸 것이다.
도 13은 기질 A를 위한 보관기간 안정도 연구의 결과들을 나타낸 것이다.
도 14는 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제로 결합된 토실활성화 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280로 기질들 A, B 및 C, CDP-Star/에머랄드-Ⅱ, 경쟁 섬광 기질 D, 경쟁 백열광 기질 E의 역학적 평가의 결과들을 나타낸 것이다.
도 15는 최적의 해독 시간으로 실온에서 토실활성화 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제의 다양한 양들로 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드들 M-280의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 16은 신호가 2분에서 해독되는 최적의 해독 시간으로 실온에서 토실활성화 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제의 다양한 양들로 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 17은 다이나비드 MyOne 카르복실산 및 기질 A/에머랄드-Ⅲ, 기질 B, 및 CDP-Star/에머랄드 Ⅱ를 사용하여 37℃에서 측정된 신호-대-노이즈 대비한 광 방출 역학들을 나타낸 것이다.
도 18은 기질 A/에머랄드-Ⅲ, 기질 B, 및 CDP-Star/에머랄드-Ⅱ를 사용하여 항-cTn1과 결합된 다이나비드 MyOne 카르복실산 비드들 상에서 37℃로 수행된 인간 심장 트로포닌 (cTnl) 면역검정법에서 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 기질 A를 사용한 다이나비드 MyOne 카르복실산, 다이나비드 M-280, 다이나비드 M-270 비드들을 기초로 하는 cTn1 면역검정법들을 위한 37℃에서 측정된 cTn1 민감도 곡선들을 나타낸 것이다.
도 20은 각각의 해독 시간대에서 기질들 A, B 및 C, CDP-Star/에머랄드-Ⅱ, 및 벤더 X의 기질 D로 다이나비드 M-270 에폭시 비드들을 기초로 한 cTn1 면역검정법의 측정 결과를 나타낸 것이다.
다음의 실시예들은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 설명하려는 것이다.
장치들
96/384-웰 하이드로스피드플레이트 (HydroSpeedplate) 세척기 (TecanGroup Ltd., 스위스), 오리온-Ⅱ 96/384-웰 마이크로플레이트 루미노측정기 (Titertek Instrument Berthold Technologies, Huntsville, AL)이 화학발광을 측정하기 위해 사용되었다.
비드들
및 마이크로플레이트
다이나비드® (Life Tech Dynal AS, 노르웨이), 편평바닥 높은 결합, 흰색 고형의 코닝 96-웰 폴리스티렌 마이크로플레이트 (코닝, 3922), 및 둥근바닥 흰색 고형의 코닝 96-웰 마이크로플레이트 (코닝, 3355)이 획득되었다.
화학발광성 기질들 및 증진제들
CSPD® 및 CDP-Star®은 캘리포니아주 샌디에고의 라이프 테크놀로지사로부터 획득되었다.
AP-5 화학발광성 기질 (알칼라인 포스파타제의 경우)는 미시건주 사우스필드의 루미겐사 (Lumigen, Inc.)로부터 획득되었다. 이것은 본 명세서에서 경쟁 기질 D 또는 경쟁 AP 기질 D, 경쟁 섬광 기질 D, 또는 벤더 X 기질 D라고 언급된다.
LumiGLO 리저브TM 화학발광성 기질 (HRP의 경우)은 KPL사 (Gaithersburg, Maryland)로부터 획득되었다. 이것은 본 명세서에서 경쟁 HRP 기질 또는 경쟁 백열광 기질 E이라고 언급된다.
사파이어-ⅡTM 화학발광성 증진제 (사파이어-Ⅱ), 사파이어-ⅢTM 화학발광성 증진제 (사파이어-Ⅲ), 에머랄드TM-Ⅱ 화학발광성 증진제 (에머랄드-Ⅱ), 및 에머랄드TM-Ⅲ 화학발광성 증진제 (에머랄드-Ⅲ)는 캘리포니아주 포스터시티의 어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems Inc.)로부터 획득되었다.
정제된
알칼라인
포스파타제
검정법
100 μL의 기질 제형물이 10 μL의 알칼라인 포스파타제 (BBI BioZyme, ALPI12G)의 일련 희석물에 첨가되었고 흰색 마이크로타이터 플레이트가 기질 첨가 이후 2분째 역학적으로 해독되었다.
스트렙아비딘
-코팅된 M-280
토실활성화된
다이나비드
®에
결합된
바이오틴화
-알
칼라인
포스파타제
10 μL의 세척된 비드들이 40 μL의 바이오틴화된 알칼라인 포스파타제 (BioLabs, N7022S)의 10배 일련 희석들과 40분 동안 25℃에서 배양되었다. 비드들은 도넛 자기 (라이프 테크 앰비온사 (Life Tech Ambion)의 자기 카탈로그 번호: AM10050)로 2 내지 3분 동안 분리되었고, 1% BSA를 포함하는 1× PBS로 3번 세척되었다.
100 μL의 기질 제형물이 첨가되었고 기질 첨가 이후 2분째 역학적으로 해독되었다.
항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 마이크로플레이트를 사용하는 샌드위치
엘라이자
인간 IL-6에 대한 단일클론 항체 (R&D Systems, MAB206)는 표준 인간 재조합 IL-6 (R&D Systems, 206-IL)과 결합하도록 96-웰 플레이트에 고정되었다. 플레이트 상에 결합된 인간 재조합 IL-6와 결합하는 바이오틴화된 항-인간 IL-6 (R&D Systems, BAF206)가 첨가되었고, 다음으로 스트렙아비딘 알칼라인 포스파타제 (Jackson ImmunoResearch,16-050-084)가 첨가되었다. 화학 검출과는 독립적으로 면역검정법 절차는 동일하였다. 기질 제형물이 세척된 웰들에 첨가되었고 플레이트들은 기질 첨가 이후 37초째에 역학적으로 해독되었다.
항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서
다이나비드
®를 사용하는
트로포닌
샌드위치
엘라이자
인간 혈청 (Sigma, S7023)에서 50 μL의 인간 심장 트로포닌 I (HyTest Ltd., 8T53)가 LYNX 래피드 알칼라인 포스파타제 항체 결합 키트 (AbDSerotec, LNK012AP)를 사용하여 알칼라인 포스파타제와 결합된 50 μL의 마우스 α-인간 심장 트로포닌 (α-cTn1), SDIX (클론 TPC6) 항체와 25℃에서 10분 동안 배양되었다.
α-인간 심당 트로포닌 I (α-cTnI) 단일클론 항체 (HyTest Ltd., 4T21, Mab560)와 결합된 100 μL의 다이나비드®가 상기 시료와 37℃에서 30분 동안 진탕하면서 배양되었다. 비드들은 도넛 자기 (라이프 테크 앰비온사의 자기 카탈로그 번호: AM10050)로 2 내지 3분 동안 분리되었고, TBS-트윈 세척 완충액으로 3번 세척되었다.
100 μL의 기질 제형물이 첨가되었고 기질 첨가 이후 2분째 역학적으로 해독되었다.
실시예 1
기질 A의 합성
기질 A가 도 1 내지 도 4에 정리된 반응 모식도에 의해 제조되었다.
4-Me-3-OBN-벤즈알데하이드가 도 1에 나타낸 바와 같이 제조되었다. 17.56 g의 시작 물질은 13.6 g의 최종 산물을 수득하였다. 4-Me-Phe 포스포네이트는 4-Me-3-OBN-벤즈알데하이드로 시작하여 도 2에 나타낸 바와 같이 제조되었다. 13.6 g의 시작 물질은 17.7 g의 최종 산물을 수득하였다. 기질 A의 에놀 에테르 전구체는 도 3에 나타낸 반응 모식도에 의해 4-Me-Phe 포스포네이트로 시작하여 제조되었다. 5.6 g의 시작 물질은 2.1 g의 최종 산물을 수득하였다. 기질 A는 도 4에 나타낸 바와 같이 기질 A의 에놀 에테르 전구체로 시작하여 제조되었다.
본 발명의 화합물들은 당업자들에게 알려진 변형들로 상기에 기술된 반응 모식도에 의해 제조될 수 있다.
실시예 2
25℃로 마이크로타이터 플레이트들에서 시행된 디옥세탄 기질들의 역학적 연구
CSPD, CSD-Star, 기질 A 및 기질 B에 의한 광 방출의 역학은 25℃에서 전개된 "정제된 알칼라인 포스파타제 검정법" 프로토콜을 사용하여 평가되었다.
도 6은 관찰된 광 방출의 시간 경과의 결과들을 나타낸다. 결과들은 기질들 A 및 B가 5 내지 10분 내에 최대 광 방출에 도달하였던 한편, CDP-Star는 30 내지 60분 이후에 도달하였던 점을 보여준다. 테스트된 모든 기질은 최대 광 방출에 도달한 이후 시간 경과 시의 신호 안정도를 보여주었다.
도 7은 특정된 시간에 전체 방출을 해독하여, CDP-Star, 기질 A, 기질 B 및 AP-5를 가진 다양한 농도들의 알칼라인 포스파타제의 민감도 곡선들을 나타낸 것이다. 민감도는 신호 대 노이즈 비율이 2인 알칼라인 포스파타제의 최저 농도로서 정의되었다. CDP-Star, 기질 A, 및 기질 B의 민감도는 AP-5의 민감도보다 10배 이상인 것으로 확인되었다.
실시예 3
25℃로 마이크로타이터 플레이트들에서 시행된 IL-6 면역검정법으로 기질 A, CSDP, 및 CDP-Star의 역학적 평가
기질 A, CSDP, 및 CDP-Star에 의한 광 방출의 역학은 25℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 마이크로플레이트를 사용한 샌드위치 엘라이자" 프로토콜로 평가되었다.
도 8은 사파이어-Ⅱ를 가진 CSPD, 사파이어-Ⅲ를 가진 CSPD, 및 사파이어-Ⅱ를 가진 CDP-Star를 비교할 때 기질 A로의 광 방출의 시간 경과를 나타낸다. 기질 A로의 최대 광 방출은 CSPD 및 CDP-Star로의 30 내지 60분 대비 약 5분에서 존재한다.
도 9는 사파이어-Ⅱ를 가진 CDP-Star 및 기질 A을 위한 25℃에서 신호 대 노이즈 비율들을 나타낸 것이다. CDP-Star로는 최대 측정 결과는 본 기질의 첨가 이후 15분을 기다리는 것을 요구한다. 기질 A로는, 조기 백열광 신호가 마이크로플레이트 엘라이자들의 이상 조건이 되는 관찰된 검정법의 시간 경과 시 안정한 신호-대-노이즈 비율들을 제공한다.
실시예 4
37℃로 마이크로타이터 플레이트들에서 시행된 IL-6 면역검정법으로 기질들 A, B, C 및 CDP-Star의 역학적 평가
기질들 A, B, C 및 CDP-Star에 의한 광 방출의 역학은 37℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 마이크로플레이트를 사용한 샌드위치 엘라이자" 프로토콜로 평가되었다.
도 10은 적절한 낮은 분석물 농도를 대표하는 24 pg/mL의 IL-6의 역학을 나타낸다. 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star의 경우 최대 광 방출에 도달하는 시간은 15 내지 30분인 한편, 기질들 A, B 및 C의 경우 시간은 각각 3분, 2분 및 즉시이다.
도 11은 경쟁 기질 D와 대비하여 기질들 A, B 및 C의 경우 신호 (광 방출) 및 신호-대-노이즈의 역학을 나타낸다. 기질들 A, B 및 C의 경우 관찰된 일정한 신호-대-노이즈 비율들은 이들 기질들을 사용한 면역검정법을 대부분의 장치 포맷들과 양립가능하게 만드는 검출 시간에서의 유연성을 가능하게 한다.
실시예 5
37℃로 마이크로타이터 플레이트들 상에서 시행된 면역검정법 시스템으로 기질 A, B, 및 C의 민감도 비교
기질 A, 기질 B, 기질 C, 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star, 경쟁 AP 기질 D, 및 경쟁 HRP 기질을 사용한 민감도가 37℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 마이크로플레이트를 사용한 샌드위치 엘라이자" 프로토콜로 평가되었다.
도 12는 기질들 A, B 및 C는 경쟁 AP 기질 D 및 경쟁 HRP 기질로 관찰된 민감도보다 5 내지 8배 더 큰 민감도를 제공하는 것을 나타낸다. 민감도는 신호-대-노이즈 2에서 검출된 hIL-6의 최저의 양으로 정의된다.
실시예 6
기질 A의 보관기간 안정도
-20℃, 4℃, 및 37℃에서 보관된 기질 A 시료들에 의한 최대 광 방출은 "정제된 알칼라인 포스파타제 검정법" 프로토콜을 사용하여 평가되었다. 이들 온도들에서 보관된 시료들은 80일 경과 시 동일한 날에 검정되었다.
도 13은 본 연구의 결과를 나타낸다. 37℃ 가속화 곡선의 외삽을 기초로 하여, 기질 A의 실시간 (4℃) 안정도는 14개월로 추정된다.
실시예 7
실온에서 다이나비드 M-280 상의 기질들 A, B 및 C의 역학적 평가
기질 A, 기질 B, 기질 C, 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star, 경쟁 섬광 기질 D, 및 경쟁 백열광 기질 E의 광 방출 및 신호-대-노이즈의 역학이 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제와 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280 토실활성화된 비드들을 사용하여 평가되었다. 20 μg의 스트렙아비딘-표지된 다이나비드들이 0.04 ng의 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제와 결합되었다. 평가는 실온에서 시행되었다.
도 14는 본 평가의 결과들을 나타낸다. 기질 B는 최대 광 방출까지 신속한 램프를 가지는 것으로 관찰되었고 관찰 시간의 경과 시 일정한 신호-대-노이즈를 유지하였다. 기질 A는 최대 광 방출까지 기질 B보다는 느리게 진행되었던 한편 기질 C는 최대 광 방출까지 매우 신속하게 진행되었다.
실시예 8
실온에서 다이나비드 M-280 비드들 상의 기질들 A, B 및 C의 민감도 곡선들
기질 A, 기질 B, 기질 C, 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star, 경쟁 섬광 기질 D, 및 경쟁 백열광 기질 E의 민감도가 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제와 결합된 스트렙아비딘-표지된 다이나비드 M-280 토실활성화된 비드들을 사용한 "스트렙아비딘-코팅된 M-280 토실활성화된 다이나비드®로 결합된 바이오틴화된-알칼라인 포스파타제" 프로토콜을 사용하여 평가되었다. 20 μg의 스트렙아비딘-표지된 다이나비드들이 다양한 양들의 바이오틴-표지된 알칼라인 포스파타제와 결합되었다. 평가는 각각의 기질들의 경우 최적의 해독 시간대에 실온에서 시행되었다.
도 15는 본 평가의 결과들을 나타낸다. 기질 A는 높은 신호 및 신호-대-노이즈 비율들을 제공한다. 기질 B는 가장 높은 신호 및 높은 신호-대-노이즈 비율들을 제공한다. 기질 C의 민감도는 경쟁 섬광 기질 D와 유사하였다. 기질 B는 평가된 디옥세탄과 유사하거나 더 나은 측정 결과를 준다.
기질 A, 기질 B, 기질 C, 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star, 경쟁 섬광 기질 D, 및 경쟁 백열광 기질 E의 민감도는 상기와 같이 신호가 2분에서 해독되는 곳에서 평가되었다.
도 16은 본 평가의 결과를 나타낸다. 기질 B는 다른 기질들보다 그들의 최적의 해독 시간대에서 낫거나 유사한 측정 결과를 준다.
실시예 9
37℃에서 다이나비드 MyOne 카르복실산 상의 기질 A, 기질 B 및 CDP-Star의 광 방출 역학 및 신호-대-노이즈
에머랄드-Ⅲ를 가진 기질 A, 기질 B, 및 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star의 광 방출 및 신호-대-노이즈 역학은 다이나비드 MyOne 카르복실산 비드들을 사용한 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 다이나비드®를 사용하는 트로포닌 샌드위치 엘라이자" 프로토콜을 사용하여 평가되었다. 프로토콜은 16 pg/mL cTn1을 사용하여 37℃에서 전개되었다.
도 17은 본 평가의 결과들을 나타낸다. 신호-대-노이즈 비율은 기질 제형물에 의존하여 시간 경과 시 변화되었다. 기질 B의 신호-대-노이즈 비율들은 첫 번째 10분 동안 일정하였다.
실시예 10
최적의 해독 시간대로 37℃에서의 면역검정법 측정 결과
에머랄드-Ⅲ를 가진 기질 A, 기질 B, 및 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star의 측정 결과는 37℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 다이나비드®를 사용하는 트로포닌 샌드위치 엘라이자" 프로토콜을 사용하여 평가되었다.
도 18은 본 평가의 결과들을 나타낸다. 기질 B는 가장 높은 신호를 제공하였고, 높은 기저값으로 인해 신호-대-노이즈 비율에서 다른 기질 제형물들과 유사하게 수행하고 있다.
실시예 11
기질 A를 사용한 면역검정법에서 비드들 및 발광 증진제들의 평가
토실활성화된 다이나비드 M-280, 다이나비드 MyOne 카르복실산, 및 다이나비드 M-270 에폭시는 α-인간 심장 트로포닌 I (α-cTnI) 모노클론 항체 (HyTest Ltd., 4T21, Mab560)와 결합되었다.
사파이어-Ⅲ를 가진 기질 A, 에머랄드-Ⅲ를 가진 기질이 37℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 다이나비드®를 사용하는 트로포닌 샌드위치 엘라이자" 프로토콜을 사용하여 검정 측정 결과를 위해 평가되었다.
도 19는 본 평가의 결과들을 나타낸다. 다이나비드 M-270 에폭시 비드들은 가장 높은 검정 측정 결과를 제공하였다. 에머랄드-Ⅲ 화학발광성 증진제는 더 높은 신호 및 약간 더 나은 민감도를 테스트된 모든 비드 유형들로 제공하였다. S-Ⅲ는 사파이어-Ⅲ를 말하는 한편 E-Ⅲ는 에머랄드-Ⅲ를 말한다.
실시예 12
트로포닌 샌드위치 비드들 면역검정법
다이나비드 M-270 에폭시는 α-인간 심장 트로포닌 I (α-cTnI) 모노클론 항체 (HyTest Ltd., 4T21, Mab560)와 결합되었다. 기질 A, 기질 B, 기질 C, 에머랄드-Ⅱ를 가진 CDP-Star, 및 벤더 X 기질 D의 면역검정법에서 측정 결과는 37℃에서 "항체들을 포획하기 위한 고체 지지체로서 다이나비드®를 사용하는 트로포닌 샌드위치 엘라이자" 프로토콜을 사용하여 평가되었다.
도 20은 본 평가의 결과들을 나타낸다. 신호-대-노이즈 2에서, 기질들 A, B 또는 C는 인간 혈청에서 0.1 ng/웰 정도의 인간 심장 트로포닌 I (cTn1)의 저점 검출 및 약 3 로그의 동적 범위를 제공하였다. 벤더 X 기질 D는 0.6 ng/웰의 cTn1의 저점 검출 및 약 3 로그의 동적 범위를 제공하였다.
Claims (93)
- 삭제
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- 하기 구조를 가지는 화합물
또는
,
여기서, M+는 알칼리 금속의 양이온; 암모니움; C1-7 알킬, 아르알킬 또는 방향족 사차 암모니움 양이온; 또는 각각의 D3가 알킬 또는 메틸 또는 에틸, 아르알킬 또는 벤질, 헤테로고리 고리 시스템 또는 피리디니움 또는 디소듐 염의 형태 일부분인 N(D3)4 +를 나타냄. - (a) 제7항의 화합물을 제공하는 단계;
(b) 상기 화합물을 절단할 수 있는 효소 분체를 포함하는 효소 복합체를 제공하는 단계;
(c) 상기 효소 복합체를 상기 화합물과 접촉시켜서 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 반응 혼합물이 광을 생성하도록 허용하는 단계
를 포함하는, 광을 생성하는 방법. - 제8항에 있어서, 25℃ 또는 37℃에서 상기 광의 생성이 15분 미만, 10분 미만 또는 5분 미만 경과 시 최대에 도달하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 효소 분체가 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, β-글루쿠로니다제 또는 뉴라미니다제로부터 선택된 가수분해 효소를 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 화합물의 첨가 이후에 상기 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계
를 더 포함하고, 상기 광의 생성은 상기 효소의 존재를 가리키고, 상기 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 상기 효소의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 상기 광의 생성이 15분 미만, 10분 미만 또는 5분 미만 경과 시 최대에 도달하는 것인 방법. - 제10항에 있어서, 상기 효소 분체가 항원과 결합할 수 있는 첫 번째 항체 및 기질이 분해되어 광을 생성하도록 상기 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 항체이고, 여기에서 상기 첫 번째 항체는 상기 효소와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 첫 번째 항체가 표지와 공유적으로 결합되고 상기 효소는 상기 표지와 비공유 결합을 할 수 있는 분자와 공유적으로 결합된 것이고, 상기 표지는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체이고 상기 분자는 아비딘 또는 스트렙아비딘이거나, 또는 상기 표지는 햅텐이고 상기 분자는 상기 햅텐과 결합할 수 있는 항체이며,
(a) 항원을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 항원과 결합할 수 있는 두 번째 항체를 포함하는 고체상을 제공하는 단계;
(c) 상기 시료 및 효소-결합된 항체를 상기 고체상과 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및
(d) 상기 화합물의 첨가 이후에 상기 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계
를 더 포함하고, 상기 광의 생성은 상기 항원의 존재를 가리키고, 상기 생성된 광의 양은 상기 시료에 존재하는 상기 항원의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 상기 광의 생성이 15분 미만, 10분 미만 또는 5분 미만 경과 시 최대에 도달하는 것인 방법. - 제10항에 있어서, 상기 효소 분체가 핵산과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 분해되어 광을 생성하도록 상기 화합물을 절단할 수 있는 효소를 포함하는 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드이며,
(a) 핵산을 포함할 것으로 의심된 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 핵산을 고체상에 고정하는 단계;
(c) 상기 고정된 핵산 및 상기 효소-결합된 올리고뉴클레오타이드를 접촉시켜서 효소 복합체를 형성하는 단계; 및
(d) 상기 화합물의 첨가 이후에 상기 반응 혼합물에 의해 생성된 광을 검출하는 단계
를 더 포함하고, 상기 광의 생성은 상기 핵산의 존재를 가리키고, 상기 생성된 광의 양은 시료에 존재하는 상기 핵산의 양과 상관될 수 있고, 25℃ 내지 37℃에서 상기 광의 생성이 15분 미만, 10분 미만 또는 5분 미만 경과 시 최대에 도달하는 것인 방법. - (a) 제7항의 화합물; 및
(b) 완충액
을 포함하는, 시료에서 분석물의 존재 및/또는 양을 검출하는 키트. - 삭제
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