JP2011024470A

JP2011024470A - 化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を用いた酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定法

Info

Publication number: JP2011024470A
Application number: JP2009172721A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Miyazaki; 修一宮崎; Masaru Hamaoki; 勝濱沖
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2011-02-10

Abstract

【課題】酵素活性測定法を用いて酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを測定する方法において、ＴＲＡＰを短時間に検出できる測定法および測定キットを提供する。
【解決手段】患者由来の試料と化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後に反応溶液をアルカリ条件とし、当該反応溶液における化学発光強度を測定する。当該方法によって、試料中の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を、室温条件下、１〜１０分程度というきわめて短時間の酵素反応によって検出・測定することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を基質として用いて酵素活性測定を行うことにより、試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定する方法および該方法のために使用するキットに関するものである。

酸性ホスファターゼは至適ｐＨが酸性であるホスファターゼの総称であり、当該酵素は有機モノリン酸エステルの加水分解反応を触媒する。酸性ホスファターゼには、前立腺由来酸性ホスファターゼ、破骨細胞由来酸性ホスファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼ、血小板由来酸性ホスファターゼなどの種々の由来のものが知られており、とくに、反応中に酒石酸を添加した場合も、その酵素活性が阻害されない血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼは、Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）と呼ばれる。

ＴＲＡＰはさらに、糖鎖へのシアル酸の結合が多いＴＲＡＰ５ａと、シアル酸の結合が少ないＴＲＡＰ５ｂとに分類され、ＴＲＡＰ５ａはマクロファージ等に、ＴＲＡＰ５ｂは破骨細胞に由来する。ＴＲＡＰ５ｂは破骨細胞の機能を評価するための指標、たとえば骨吸収のマーカーとして重要と考えられている（非特許文献１）。

従来、血清中におけるＴＲＡＰを測定する方法としては、酵素活性測定法やモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が知られており（特許文献１、非特許文献２、３及び４）、近年では、ＴＲＡＰ５ｂに特異的に反応を示す基質である２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸誘導体を用いて酵素活性を測定する方法などが報告されている（特許文献２、非特許文献５）。

しかしながら、従来の測定法では、十分な吸光度を得るために、酵素反応を長時間行うことが必要であった。たとえば、２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸誘導体を反応基質として用いた酵素活性測定法においては、酵素反応には３７℃の条件下で、６０分程度の時間インキュベーションすることが必要であった。

一方、化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物は、アルカリホスファターゼの化学発光用基質として周知であり、免疫学的測定法やＤＮＡ診断の基質として汎用されている（特許文献３）。当該化合物は、アルカリ性条件下でアルカリホスファターゼと反応することによりリン酸エステルが外れて当該化合物が不安定となり、下記［化１］で表される蛍光物質を放出し、化学発光を生じるものである。しかしながら、当該化合物を酸性ホスファターゼの検出に対して用いることについては、これまで全く検討されてこなかった。

特開２００２−３１６４０ＷＯ２００４／０７７０５９特開平１１−２１２８５

日本臨床５７，１８８−１９１，１９９９ＪＢｏｎｅＭｉｎｅｒＲｅｓ，１１，１４４４−１４５２，１９９６ＣｌｉｎＣｈｅｍ，４４，２２１−２２５１９９８ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ３２９，１０９−１１５，２００３ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ３７６，２０５−２１２，２００７

したがって本発明は、酵素活性測定法を用いて酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を測定する方法において、ＴＲＡＰ活性を短時間で検出可能な測定法および測定キットを提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵素活性測定法を用いてＴＲＡＰを測定する方法において、従来アルカリホスファターゼの化学発光用基質として知られていたものの、酸性条件下で基質として用いられた例は報告されていない化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を基質として用い、患者由来の試料と化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させてから、酵素反応終了後に反応溶液をアルカリ条件とし、当該反応溶液における化学発光強度を測定する方法により、ＴＲＡＰ活性を著しく短い時間で検出できることを見出した。

すなわち、本発明は以下のようなものである。

（１）生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと、化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後、反応溶液をアルカリ条件にして当該反応溶液における化学発光強度を測定することを特徴とする、生体由来試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性測定法。
（２）化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、アルカリ条件下において下記［化１］で表される蛍光物質を生じるものである、（１）に記載の測定法。

（Ｘは水素または塩素を表す）

（３）化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3.7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate(ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｔｒｏｐｉｘ社)またはDisodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社)のいずれかより選択される、（１）に記載の測定法。
（４）酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの基質として化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を構成試薬として含有し、当該基質と生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後、反応溶液をアルカリ条件にして当該反応溶液における化学発光強度を測定することにより、生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの酵素活性を測定することを特徴とする、生体由来試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性測定キット。
（５）化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、アルカリ条件下において下記［化１］で表される蛍光物質を生じるものである、（４）に記載の活性測定キット。

（Ｘは水素または塩素を表す）

（６）化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate(ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｔｒｏｐｉｘ社)またはDisodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社)より選択される、（４）に記載の活性測定キット。

本発明者らは、従来アルカリホスファターゼの化学発光用基質として知られていたものの、酸性ホスファターゼの基質として用いられたことがなかった化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、酸性ホスファターゼの基質としても使用することができ、ｐＨ条件を変動させるという簡便な方法で、酵素反応と発光強度測定を明確に区別しながら、連続的或いは非連続的に行うことが可能で、しかも、全体の測定時間も１０分以下の短時間で終了させることができることを初めて見出した。

すなわち、本願発明の方法またはキットを用いれば、酵素反応と発光強度測定を別途の工程として行うことができるという特質を利用することもできる。たとえば多数の試料について同時に発光強度を測定するとき、事前に酵素反応だけを終了させてから、発光強度測定の直前にアルカリ条件に変更し、それぞれ発光させてから強度を測ることが可能である。これらの方法を用いることによって、経時的な発光強度の減衰の影響等を考えずとも、多数の試料中の酵素活性を同時に測定することができるなど、本発明の方法またはキットは、産業利用上で非常に有用なものである。

また、本願発明の測定法は、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂのいずれか一方のみに対しても十分な直線性を示すものであるため、たとえば、免疫学的な手法を組み合わせることによって、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂのいずれか一方をマーカーとする疾患の診断等に応用することも可能である。このように、本願発明は実用上きわめて優れた酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの測定系を提示するものである。

図１は、ヒトリコンビナント酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ溶液を用いて酸性条件下で基質（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）添加後の時間での化学発光強度を示したものである。図中●は、酵素反応時間を５分とした場合、○は反応時間を１０分とした場合の結果を示す。図２は、ＣＳＰＤを基質として用いたときのＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂの酵素活性と化学発光強度の関係を示したものである。図中●は、ＴＲＡＰ５ａを用いて反応させた場合、○はＴＲＡＰ５ｂを用いて反応させた場合の結果を示す。

本発明方法で使用する試料は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを含有するものであれば特に制限されない。具体的には、尿、血清等を例示することができ、特に血清サンプルが使用に好適である。

本願における試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定法は、酸性条件下、試料中に化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を添加して酵素反応させた後、反応溶液をアルカリ条件に変化させることによって化学発光を生じさせることを特徴とする。

試料に添加する化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物としては、ホスファターゼの基質となり、かつアルカリ条件下において化合物が開裂して、下記［化１］で表されるような蛍光物質を生じるものであれば、特に制限されない。

（Ｘは水素または塩素を表す）

具体的には、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate(ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｔｒｏｐｉｘ社)、Disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社)などを挙げることができる。

このような基質の使用量は、小規模試験により決定すればよく、具体的には０．１〜０．５ｍＭ、好ましくは０．２〜０．３ｍＭの範囲から適宜選定される。

試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定は酸性条件下で行う。具体的には、緩衝液としてクエン酸緩衝液や酢酸緩衝液など使用し、ｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ５〜６の条件下、１５〜３７℃、好ましくは２０〜３０℃で１〜１０分程度反応させることにより実施することができる。

反応終了後、化学発光を生じさせるため、反応溶液をアルカリ性にする。アルカリ条件に変化させるには、たとえば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液など任意の強塩基を反応溶液に添加すればよく、添加量としては化学発光が生じる程度、具体的には反応溶液のｐＨが１０以上になるまで強塩基を添加することで、化学発光を誘導することができる。

化学発光の測定は、通常用いられている方法を使用することができ、たとえば汎用のルミノメーターでの測定が可能である。

また、本願発明の測定法は、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂのいずれか一方だけに対しても優良な直線性を示すものであることから、上記の酵素活性測定を行うにあたって、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに関する免疫学的手法を組み合わせることで、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂのいずれか一方をマーカーとする疾患の診断等に応用することもできる。

たとえば、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂに特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの活性フラグメントを任意の固相に固相化し、目的試料と反応させることで試料中のＴＲＡＰ５ａまたは５ｂを捕捉し、当該捕捉したＴＲＡＰに対して化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を反応させ、反応条件をアルカリ条件として発光を生じさせてから、化学発光強度を測定すればよい。このような組み合わせ方法を用いれば、ＴＲＡＰ５ａまたは５ｂの活性を、より特異的にかつ短時間に測定することが可能となる。

本発明のキットは、生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの酵素活性を測定するためのものであって、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの基質として化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を構成試薬として含有し、当該基質と試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後、反応溶液をアルカリ条件として当該反応溶液における化学発光強度を測定することにより、生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの酵素活性を求めることが可能である。

キットに添付する化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物としては、前述のものを例示することができ、その他の試薬としては、酵素反応後の反応溶液をアルカリ条件下にするための強塩基など本発明を実施するための必要な試薬を適宜添付すればよい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は何ら限定されるものではない。

（実施例１）
試料として、ヒトリコンビナントＴＲＡＰ溶液を用いた。まず、測定用試料を９０μＬ／ウェルずつ分注し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈した２．５ｍＭＣＳＰＤ１０μＬ／ウェルを加え、室温で５分または１０分間反応させた。反応後、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１００μＬ加えて反応溶液をｐＨ１０程度まで十分アルカリ条件にした後、ルミノメーター（ベルトルード社ＬＢ９５３）で化学発光強度を測定した。

上記測定手順に従い、ヒトリコンビナントＴＲＡＰ溶液を用いて反応曲線を作成した（図１）。時間依存的に化学発光強度は増加し、酵素活性と化学発光強度は良好な直線性を示した。したがって、本願発明を用いることでＴＲＡＰの酵素反応を良好に測定できることが明らかになった。

（実施例２）ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂそれぞれに対する直線性
ヒト血清よりカラム部分精製したＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂ溶液を用いて、実施例１と同様に酵素反応を生じさせて発光強度を測定し、その結果をもとに反応曲線を作成した。酵素反応時間は５分とした。結果、ＴＲＡＰ５ａ、ＴＲＡＰ５ｂのいずれか一方のみに対しても、酵素活性当たりの化学発光強度は良好な直線性を示していた（図２）。したがって、本願発明の方法およびキットは、ＴＲＡＰ５ａ、またはＴＲＡＰ５ｂのいずれか一方のみを含む試料に対しても有効に使用できるものであることが明らかになった。

Claims

生体由来の試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと、化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後、反応溶液をアルカリ条件にして当該反応溶液における化学発光強度を測定することを特徴とする、生体由来試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性測定法。
化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、アルカリ条件下において下記［化１］で表される蛍光物質を生じるものである、請求項１に記載の測定法。

（Ｘは水素または塩素を表す）
化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate(ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｔｒｏｐｉｘ社)またはDisodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社)のいずれかより選択される、請求項１に記載の測定法。
酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの基質として化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物を構成試薬として含有し、当該基質と生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼを酸性条件下で反応させ、酵素反応終了後、反応溶液をアルカリ条件にして当該反応溶液における化学発光強度を測定することにより、生体試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの酵素活性を測定することを特徴とする、生体由来試料中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの活性測定キット。
化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、アルカリ条件下において下記［化１］で表される蛍光物質を生じるものである、請求項４に記載の活性測定キット。

（Ｘは水素または塩素を表す）
化学発光性１，２−ジオキセタン系化合物が、Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tricyclo [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＣＳＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社）、Disodium 4-chloro-3-(methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo [3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate(ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、Ｔｒｏｐｉｘ社)またはDisodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decan}-4-yl)phenyl phosphate（ＡＭＰＰＤ、Ｔｒｏｐｉｘ社)より選択される、請求項４に記載の活性測定キット。