CN115298548A - 检测具有血凝素酯酶活性的病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种检测样本中具有血凝素酯酶活性的病毒的方法，该方法包括：将所述样本与用于冠状病毒的血凝素酯酶(HE)或丙型流感病毒的血凝素酯酶融合蛋白(HEF)的酶的底物接触；并检测所述酶的活性，活性检出指示所述样本含有冠状病毒或丙型流感病毒。

Description

检测具有血凝素酯酶活性的病毒的方法
技术领域
本公开涉及一种检测具有血凝素酯酶活性的病毒的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月17日提交的美国临时申请No.62/991,066的优先权和权益，该专利申请的公开内容在此通过引用全部并入本说明书中用于所有目的，如同在本文中完整阐述一样。
背景技术
冠状病毒是一组引起哺乳动物和鸟类疾病的相关病毒。在人类中，冠状病毒会导致轻度呼吸道感染，以及其他可能致命的感染，如SARS、MERS和COVID-19。
2019年冠状病毒疾病(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。世界卫生组织(WHO)于2020年3月11日将COVID-19认定为大流行病，迫切需要具备广泛而快速的检测能力。检测是至关重要的，因为其可以让感染者避免感染其他人，并迅速得到他们所需的护理，并且减缓疾病的传播。
检测冠状病毒有几种可用的方法，包括逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和冠状病毒特异性抗体(例如，IgM/IgG)测试。然而，这些方法是劳动密集型和时间密集型的。而且，使用冠状病毒特异性抗体的测试方法不能从感染清除后仍有抗体的治愈患者中区分主动感染患者(actively infected patient)。
一种从人体样本中即时、便宜和准确的检测冠状病毒(包括COVID-19)的方法尚未开发出来，但迫切需要。这样的检测可以从快速传播和潜在致命的疾病中挽救许多生命。
发明内容
本发明人认识到，与具有类似症状的其他病毒(例如，普通感冒的鼻病毒以及甲型流感和乙型流感)相比时，其表面存在的血凝素酯酶(HE)是冠状病毒(包括COVID-19和丙型流感)独有的特征之一，并完成了要求保护的发明，该发明提供了一种即时、便宜和准确的检测具有HE活性的病毒的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种检测样本中具有血凝素酯酶活性的病毒的方法，其包括：将所述样本与用于冠状病毒的血凝素酯酶(HE)或丙型流感病毒的血凝素酯酶融合蛋白(HEF)的酶的底物接触；并检测所述酶的活性，其中，活性检出指示所述样本含有冠状病毒或丙型流感病毒。
所述病毒可以是冠状病毒，所述酶可以是HE，更具体地，病毒可以是命名为COVID-19的冠状病毒。所述酶可以催化底物的水解或脱酰基。在所述方法中，可以检测水解的产物或脱酰基的产物。所述底物和所述酶之间的脱酰基或水解反应形成的产物，可以发出可检测的信号。该可检测的信号可以包括荧光或化学发光。该信号可以是荧光、1,1′-乙二酰基二咪唑(ODI)化学发光或过氧草酸酯化学发光(PO-CL)。所述底物可以选自4-甲基伞形酮乙酸酯、荧光素二乙酸酯和试卤灵乙酸酯(Resorufin acetate)。所述样本可以是来自人受试者的体液或组织样本，该样本是鼻咽部或鼻咽部痰液样本。样本和底物可以在室温下培养，结果从几乎立即至60分钟显示出来，例如，这取决于每个底物的样本量。培养可以进行约3分钟至60分钟。在所述方法中，可以将所述酶的活性的多个读数作为反应时间的函数。样本和底物的混合物的pH可以是4至10。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测样本中冠状病毒的方法，包括：将所述样本与冠状病毒的抗体接触；将接触的样本与底物混合，该底物是与具有血凝素酯酶(HE)活性的酶反应的底物；并且检测所述酶的活性，其中，活性检出指示所述样本中含有冠状病毒。冠状病毒的抗体可以是SARS-CoV-2的抗体或其特定变体。
根据本发明的又一方面，提供了一种用于检测来自样本的具有血凝素酯酶的病毒的试剂盒，该试剂盒包括容器，该容器装有与具有血凝素酯酶(HE)活性的酶反应的底物，其中，所述酶催化所述底物的水解或脱酰基，并且所述水解或脱酰基的产物发出可检测的信号。
在阅读和理解以下说明书后，本领域普通技术人员将理解这些和其他方面。
附图说明
通过参照附图详细描述本发明示例性实施方案，本发明的上述和其它目的、特征和优势对于本领域普通技术人员将变得更加明显，其中：
图1示出了SARS-CoV-2(COVID-19)结构(示出冠状病毒的剖视图模型，例如，维基百科中https://en.wikipedia.org/wiki/Coronavirus)。
图2示出了使用四种不同过氧草酸酯化合物的ODI-CL和PO-CL的反应机理。X：高能中间体，基态下的化学发光探针，以及激发态下的化学发光探针*。
图3示出了底物与冠状病毒的HE或丙型流感的HEF之间的水解反应。(1：4-甲基伞形酮乙酸酯、2：3-(2-苯并恶唑基)伞形酮乙酸酯、3：荧光素二乙酸酯、4：试卤灵乙酸酯、5：4-甲基伞形酮、6：3-(2-苯并恶唑基)伞形酮、7：荧光素、8：试卤灵(Resorufin))。
图4示出了由图3所示的水解反应形成的5：4-甲基伞形酮(4-MU)、6：3-(2-苯并恶唑基)伞形酮、7：荧光素、8：试卤灵的荧光发射。
图5示出了在过氧草酸酯(PO)或1,1′-乙二酰基二咪唑(ODI)化学发光(CL)反应中发射的发光体(5至8)的化学发光。
图6是能够使用荧光素二乙酸酯和冠状病毒的HE的水解反应和化学发光检测来定量样本中HE的校准曲线。(用LUMAT 9507光度计测量相对CL强度)。
图7示出了HE和试卤灵乙酸酯在不同HE浓度下随时间的水解反应。
图8是示出使用试卤灵乙酸酯与冠状病毒的HE的水解反应对冠状病毒感染早期诊断的肉眼观察照片。
图9是能够快速检测痕量水平冠状病毒的HE的校准曲线。
图10示出了由一个刺突抗体捕获的一个冠状病毒。
具体实施方式
基于底物与冠状病毒的血凝素酯酶(HE)或丙型流感的血凝素酯酶融合蛋白(HEF)之间的水解反应，开发了使用荧光和化学发光的检测方法，用于快速检测人体样本中的特定病毒。应该理解，除了本文提供的具体示例之外，还考虑了替代的信号方法。
如图1所示，冠状病毒有许多具有三种不同蛋白质(例如，刺突糖蛋白、核衣壳(N)蛋白、囊膜)的HE和RNA。此外，在冠状病毒的每个斑点(spots)上可以发现两个HE(二聚体)。丙型流感的HEF由三个HE(三聚体)构成。
HE和HEF的酯酶的化学和物理性质与催化化学反应木聚糖和木寡糖的脱乙酰化的乙酰(乙酰木聚糖)酯酶的化学和物理性质相同。因此，由于相同的化学和物理性质，本发明人使用了可以容易获得的乙酰(乙酰木聚糖)酯酶来示出本发明的结果。此外，如果使用HE或HEF，本发明人完全期望得到相同或相似的结果。
利用乙酰酯酶的性质，合成了4种不同的底物：4-甲基伞形酮乙酸酯、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮乙酸酯、荧光素二乙酸酯、试卤灵乙酸酯，并将其商品化，以监测样本中乙酰酯酶的活性。乙酰酯酶与底物脱乙酰化(或水解)反应形成的产物，发射荧光、1,1′-乙二酰基二咪唑(ODI)化学发光和过氧草酸酯化学发光(PO-CL)。
基于脱乙酰化(或水解)反应的机理，已经设计和开发了新的分析方法和试剂盒，用于早期诊断冠状病毒或丙型流感的感染。荧光、1,1′-乙二酰基二咪唑化学发光(ODI-CL)和过氧草酸酯化学发光(PO-CL)的检测被应用于本发明，是因为由非荧光和非化学发光的底物与冠状病毒的HE(或丙型流感的HEF)快速水解反应所形成的化学发光探针可以发光。如图2所示，由ODI-CL和PO-CL反应形成的高能中间体X作为光源(激光、LED、氙气)产生荧光。
如图3所示，由底物(1、2、3或4)和乙酰(乙酰木聚糖)酯酶(存在于痰液、鼻咽部、鼻咽部或唾液样本中的冠状病毒的HE或丙型流感的HEF)水解反应形成了三种不同的荧光化合物(5至8)。水解反应的产率取决于pH(4至10)、缓冲溶液的成分、底物的化学和物理性质以及底物与HE(或HEF)的反应(培养)时间。
由图3所示的水解反应形成的4-MU、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮、荧光素和试卤灵发出蓝色、绿色和红色荧光(见图4)。随着水解反应中HE(或HEF)浓度的增加，产物的相对荧光强度成比例地增加。使用荧光检测的简单方法，证实了新的分析方法可以快速诊断感染冠状病毒或丙型流感患者的疾病。荧光检测的诊断方法用带荧光检测的孔板读数仪或用比色皿或硼硅酸盐玻璃管操作的荧光计操作。基于荧光检测法设计开发了一种诊断试剂盒。底物与HE(或HEF)的最佳培养(反应)时间可能是在室温下3分钟至30分钟，以检测样本中低浓度的冠状病毒或丙型流感。分析方法的灵敏度取决于水解反应形成的荧光化合物的量子效率。此外，使用荧光检测的分析方法的灵敏度取决于底物的浓度。随着底物浓度的增加，分析方法的灵敏度增强。本发明使用的底物的范围为0.01mM至0.5mM。所述诊断试剂盒的组成是底物、反应缓冲液和微孔板(如96、384微孔板)或玻璃试管。
如图5所示，1,1′-乙二酰基二咪唑(ODI)和几种过氧草酸酯(PO)化合物已被用于发明使用化学发光检测的分析方法，该方法能够早期和快速感应痕量水平的冠状病毒和丙型流感。本发明中的过氧草酸酯化合物是双(2,4-二硝基苯基)草酸酯(DNPO)、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)、双[2-(3,6,9-三氧杂癸烷氧羰基)-4-硝基苯基]草酸酯(TDPO)和双-(2,4,5-三氯-6-(戊氧基羰基)苯基)草酸酯(CPPO)。为了获得快速的PO-CL反应，可以加入水杨酸钠、吡啶和咪唑衍生物如咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、2,4-二甲基咪唑或2-乙基咪唑作为碱或亲核催化剂。
完成测试所需的时间可能取决于图3所示的底物的化学和物理性质。因此，在室温下样本中冠状病毒(或丙型流感)的定量分析时间范围可能为1分钟至30分钟。此外，从图3所示的水解反应产生化学发光探针所需的时间取决于用于溶解底物的缓冲溶液的性质。此外，分析时间将取决于人样本采集方法，例如鼻咽部或口咽部拭子、鼻咽部或鼻腔吸出物和唾液采集。水解反应的反应性取决于温度。例如，37℃下的水解反应比室温下的水解反应快。
4-MU、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮、荧光素和试卤灵的亮度取决于样本中冠状病毒或丙型流感的浓度。随着病毒浓度的增加，相对CL强度成比例增加。该方法的灵敏度取决于底物和HE(或HEF)水解形成的化学发光探针的性质。使用试卤灵二乙酸酯和HE(或HEF)反应形成试卤灵的方法的灵敏度优于4-MU和荧光素。该方法可以用光度计或带有CL检测的孔板读数仪操作。
如图5所示，4-MU，5，在PO或ODI与H2O2的加入下发出蓝光或绿光。4-MU的发射光颜色取决于图3所示水解反应中使用的pH。4-甲基伞形酮乙酸酯和HE(或HEF)水解反应的最佳缓冲液是1×PBS(pH 7.4)。酸性条件下(<pH 7)形成的4-MU发出绿光，而中性和碱性条件下(pH 7以上)形成的4-MU发出明亮的蓝光。另外，碱性条件下的4MU比酸性条件下的更亮。在室温下，在PBS中完成分析所需的时间可以为30分钟。本发明用于水解反应的4-甲基伞形酮乙酸酯的浓度范围可以为0.05mM至0.5mM。
如图5所示，3-(2-苯并恶唑基)伞形酮，6，在PO或ODI与H2O2的加入情况下发出蓝光。使用荧光素的分析方法比使用4-MU的分析方法更灵敏。因此，使用荧光素二乙酸酯的分析时间(5分钟至10分钟)短于使用4-甲基伞形酮乙酸酯的分析时间。此外，该方法使用10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH 7至pH 8.5)。如图6所示，随着样本中HE的增加，荧光素的亮度增强。在本发明中，由水解反应产生荧光素的荧光素二乙酸酯的浓度范围为0.01mM至0.1mM。
如图5所示，荧光素7在PO或ODI与H2O2的加入时发出绿光。使用荧光素的分析方法比使用4-MU的分析方法更灵敏。因此，使用荧光素二乙酸酯的分析时间(10分钟至20分钟)比使用4-甲基伞形酮乙酸酯的分析时间短。此外，该方法使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)。如图6所示，随着样本中HE的增加，荧光素的亮度增强。在本发明中，由水解反应产生荧光素的荧光素二乙酸酯的浓度范围为0.01mM至0.2mM。
如图5所示，加入PO或ODI与H2O2后，试卤灵，8发出红光。使用试卤灵的分析方法的灵敏度优于使用4-MU、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮和荧光素的分析方法。因此，使用试卤灵乙酸酯的分析时间(1分钟至5分钟)比使用4-甲基伞形酮乙酸酯和荧光素二乙酸酯的分析时间快。该方法中的最佳缓冲溶液为1×TBS(pH 7.5)。用于水解反应的试卤灵乙酸酯的浓度范围(0.001mM至0.1mM)远宽于其他底物，如4-甲基伞形酮乙酸酯、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮乙酸酯和荧光素二乙酸酯的浓度范围。对使用鼻咽部拭子或口咽部拭子采集的样本中的HE(或HEF)定量所需的时间可能非常短。例如，在样本中定量乙酰(乙酰木聚糖)酯酶所需的时间短至3分钟。此外，对使用鼻咽部拭子采集的样本定量所需的时间可以少于10分钟。此外，对用1×TBS(pH 7.5)稀释了20倍的唾液样本定量所需的时间短至5分钟。用所述分析法测定的检测限(LOD＝3S)低至25pg/ml。S是重复测量背景20次后确定的标准差。化学发光检测的分析方法的LOD至少比荧光检测低10倍。见图6。此外，化学发光检测的分析方法比荧光检测的分析方法快至少30分钟，因为前者比后者灵敏得多。
随着病毒浓度的增加，相对CL强度按比例增加。该方法可以用光度计或带有CL检测的孔板读数仪进行操作。
如图7所示，试卤灵是由试卤灵乙酸酯与HE(或HEF)的快速水解反应形成的。在相对高浓度(>0.015mU/ml或>0.56ng/ml)HE存在下形成的试卤灵(粉红色)，肉眼有可能在60秒内观察到。这一结果表明有可能用肉眼快速观察患者是否感染了冠状病毒(或丙型流感)。作为证据，图4示出了0.004mU HE与不包含HE的阴性对照之间的色差。图8表明有可能用肉眼进行冠状病毒的早期诊断。
作为肉眼观察冠状病毒(或丙型流感)感染的工具，可以应用侧向流动分析(LFA)。本发明中应用的LFA比常规LFA如妊娠、癌症、感染检测试剂盒简单，因为前者不需要任何抗体，如捕获或检测抗体。例如，将稀释在1×TBS中的样本(5μl至100μl)加载在样本垫上。样本流向含有试卤灵乙酸酯的测试线。当样本中存在HE(或HEF)时，测试线的颜色随着快速水解反应而从白色(或淡黄色)变为深粉红色。
如图9所示，化学发光检测可以定量样本中HE的痕量水平。结果表明，利用试卤灵乙酸酯和HE的水解反应，在3分钟内进行化学发光检测的分析方法有可能早期诊断冠状病毒感染。
基于使用化学发光检测的分析方法设计的所述诊断试剂盒的组成是底物(例如，4-甲基伞形酮(4-MU)5，3-(2-苯并恶唑基)伞形酮6，荧光素7，试卤灵8)，反应缓冲液，化学发光试剂(例如，ODI或PO，H2O2)，以及96(或384)微孔板或硼硅酸盐玻璃管。例如，使用试卤灵乙酸酯制备的诊断试剂盒，可以方便和快速地诊断现场的冠状病毒或丙型流感感染，例如在机场、火车站、港口和公共汽车终点站等公共交通枢纽。
如图10所示，为了确认特定冠状病毒的感染，在本发明中应用了适当的抗体。该方法中使用的能够捕获冠状病毒的刺突糖蛋白或核衣壳(N)蛋白的抗体，有可能与图1所示的冠状病毒的蛋白质结合。使用该抗体捕获冠状病毒后，底物和与该抗体结合的冠状病毒的HE反应10分钟。最后，使用加入化学发光试剂的CL测量，可以确认患者是否被感染。
综上所述，所述荧光或化学发光检测的分析方法可以应用于快速检测样本中的冠状病毒或丙型流感。这是因为在统计上可接受的误差范围内，该方法的准确性、精密度和可靠性是良好的。
应当理解，上述方法仅仅是本公开的原理的说明性实施方案，并且本领域普通技术人员可以设计其他组合物和使用它们的方法，而不背离本发明的精神和范围。还应当理解，本公开涉及包括公开的部分并且由公开的部分组成的实施方案。

Claims (19)

1.一种检测样本中具有血凝素酯酶活性的病毒的方法，包括：
将所述样本与用于冠状病毒的血凝素酯酶(HE)或丙型流感病毒的血凝素酯酶融合蛋白(HEF)的酶的底物接触；并且
检测所述酶的活性，
其中，活性检出指示所述样本含有冠状病毒或丙型流感病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒是冠状病毒，所述酶是HE。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述病毒为COVID-19。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶催化所述底物的水解或脱酰基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，检测所述水解或脱酰基的产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，由所述底物和所述酶之间的脱酰基或水解反应形成的所述产物发出可检测的信号。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述信号是肉眼观察到的溶液颜色的变化，荧光，或者化学发光。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述信号是荧光、1,1′-乙二酰基二咪唑(ODI)化学发光或过氧草酸酯化学发光(PO-CL)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述底物选自4-甲基伞形酮乙酸酯、3-(2-苯并恶唑基)伞形酮乙酸酯、荧光素二乙酸酯和试卤灵乙酸酯。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本是来自人受试者的体液或组织样本。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述样本为鼻咽部、鼻咽部痰液、唾液样本。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本和底物在室温下培养小于1秒至60分钟。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述培养进行约3分钟至60分钟，用于化学发光检测。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述培养进行约20分钟至60分钟，用于荧光检测。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶的活性的多个读数作为反应时间的函数。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本和所述底物的混合物的pH为4至10。
17.一种检测样本中冠状病毒的方法，包括：
将所述样本与冠状病毒的抗体接触，
将接触的样本与底物混合，该底物是与具有血凝素酯酶(HE)活性的酶反应的底物；并且
检测所述酶的活性，
其中，活性检出指示所述样本含有冠状病毒。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述冠状病毒的抗体是SARS-CoV-2的抗体或其变体。
19.一种用于检测样本中具有血凝素酯酶的病毒的试剂盒，包括容器，该容器装有与具有血凝素酯酶(HE)活性的酶反应的底物，
其中，所述酶催化所述底物的水解或脱酰基，并且
其中，所述水解或脱酰基的产物发出可检测的信号。
CN202180022252.2A 2020-03-17 2021-03-16 检测具有血凝素酯酶活性的病毒的方法 Pending CN115298548A (zh)

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