JP2010502937A

JP2010502937A - 検体検出のための多重標識法

Info

Publication number: JP2010502937A
Application number: JP2009517395A
Authority: JP
Inventors: エドワード・ブレア
Original assignee: アイティーアイ・スコットランド・リミテッド
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2007-06-28
Publication date: 2010-01-28
Also published as: US20100003667A1; WO2008001084A1; EP2032988A1; GB0612825D0; EP2032988B1; ATE491158T1; DE602007011064D1

Abstract

試料中の検体を検出するための方法における、検体の検出感度を高めるための標識の使用であって、検体が繰り返しタンパク質単位を有し、複数の標識物質が単一の検体物質に結合可能であることにより、複数の標識から単一の検体について得られるシグナルが、単一の標識を有する検体について得られるシグナルよりも強いことを特徴とする標識の使用が提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は検体を検出するための改良された方法に関し、詳細には全ウイルス、ウイルス粒子及びウイルス成分などのウイルス性検体を検出可能な方法に関する。本方法はＰＣＲのような複雑でコストの高い増幅法に頼ることなく検体の検出が可能であることから特に有用である。

ウイルスなどの病原体に特徴的な成分を標識と反応させることによってその病原体を検出する方法は広く知られている。この標識を検出することによって病原体の有無を判定することが可能である。方法によっては標識の量が病原体の量についての更なる情報を与えるものもある。こうした方法の例として、病原体の特定の遺伝子または配列に相補的な核酸プローブを用いて核酸を検出する方法がある。一般的な方法では更に、病原体の特定の抗原性領域（例えばウイルスの表面タンパク質）に結合することが可能な抗体を用いて特定の病原体を同定する。

一部の方法では、多重解析法を用いて複数の検体病原体を同じ手順で検出することが可能である。通常、これらの方法では２種類以上の特定の病原体に対して特異性を有するように設計された２種類以上の異なる標識を使用する。これらの標識は（例えば異なる蛍光団を有することにより）個々に識別が可能であるため、これらが同じ反応ゾーン内に存在する場合であっても異なる検体に関連付けることができる。

しかしながらこれらの方法はいずれも、特に病原体の濃度が低い場合に感度が低くなるという大きな問題を有している。過去においては、試料の濃度を高めて単位体積当りの試料中の病原体の量を大きくするか、あるいは（特に核酸の場合に）試料中の病原体成分を増幅することによってこの問題の解決が試みられた。これらの方法はいずれも検出感度が高くなるものの、方法が極めて複雑になってしまうという大きな難点がある。こうした方法は極めて高度な試料の調製を必要とし、より多くの試薬が必要であり、装置内に更なる反応または試料調製ゾーンを設ける必要がある。更に濃縮及び／または増幅過程で生じる不要物質を除去する必要がある。これらはいずれも方法ならびに方法を実施するために用いられる装置のコストを増大させるものである。更に、感度は上昇するものの、工程の数が増えることによって最終データに更なるシステムエラーが生じる可能性があり、これを解決するのに更なるデータ処理が必要となることから複雑さ及びコストの更なる増大につながる。

したがって診断方法及び病原体検出方法の感度を高めるためのより簡単かつ低コストの解決策が求められている。

本発明の目的は上記に述べた従来の方法の問題点を解決することにある。詳細には本発明の目的は、高い感度を有するが、従来の感度方法よりも簡単でコストが低い、検体の使用及び検出方法、ならびに標的検体または病原体の診断方法を提供することにある。

したがって本発明は、試料中の検体を検出するための方法における、検体の検出感度を高めるための標識の使用であって、検体が繰り返しタンパク質単位を含み、複数の標識物質が単一の検体物質に結合可能であることにより、複数の標識から単一の検体について得られるシグナルが、単一の標識を有する検体について得られるシグナルよりも強いことを特徴とする標識の使用を提供するものである。

こうした標識が用いられる方法には通常、
（ａ）試料を標識と接触させることと、
（ｂ）検体に結合した標識の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）これにより試料中の検体の有無及び／または量を検出することと、が含まれる。

本発明の使用は単一の検体物質が複数の標識物質に結合するという利点を有する。したがって単一の標識物質がより強いシグナル（例、蛍光検出が用いられる場合にはより輝度の高い放射光）を生じ、感度が高くなる。全ウイルスの場合では、タンパク質の殻はその大部分がｎ回（３、４、５、６回）対称軸に基づいた繰り返し幾何学構造からなっている。多数の標識物質がタンパク質カプシドに付着する（特定の場合におけるような立体障害がない場合には最大で数百個）ことが可能であることから、通常の感度の何倍もの感度が得られる。複数の類似または同じ物質がウイルスのタンパク質殻（カプシド）に結合できることはヒトライノウイルス系におけるモデリングによって確認されている（スタインドルＴＭ，クランプＣＥ，ヘイデンＦＧ，ランジャーＴ，J. Med. Chem. １０月６日号；４８（２０）６２５０〜６０頁「クラスタリングに基づいたファーマコフォアモデリング、ドッキング、及び主要成分分析：ヒトライノウイルス外殻タンパク質の新規阻害物質を同定するための複合計算機支援的手法」）（Steindl TM, Crump CE, Hayden FG, Langer T, J Med. Chem. 2005, Oct. 6; 48(20), pp6250-60 “Pharmacophore modelling, docking, and principal component analysis based clustering: combined computer-assisted approaches to identify new inhibitors of the human rhinovirus coat protein）。国際特許公開第ＷＯ０３／０６８２２２号では「ライノウイルス感染病原体及び関連組成物を低減させるための方法（methods of reducing rhinovirus contagion and related compositions）」を開示している。ライアン（ＲｙａｎＪ）らはAntivira Research 2005, 65(3) (Abs LB11)において新規な経口ライノウイルス阻害剤ＢＴＡ７９８を開示している。しかしながらこれらの開示は専ら疾患の治療のための抗ウイルス的方法に関したものである。検出及び診断方法における感度を向上させる目的で上記に述べたような特定の化学種の結合能を利用したものはこれまでになかった。

本発明は更に、試料中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体に結合することが可能な標識と試料を接触させることと、
（ｂ）検体に結合した標識の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）これによって試料中の検体の有無及び／または量を検出することと、を含み、
前記検体が繰り返しタンパク質単位を含み、複数の標識物質が単一の検体物質に結合可能であることにより、複数の標識から単一の検体について得られるシグナルが、単一の標識を有する検体について得られるシグナルよりも強いことを特徴とする方法を提供する。

好ましくは検体は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、パルボウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、及びレトロウイルスから選択されるウイルスの繰り返しタンパク質単位を含む。

本発明は更に、患者における病原体の有無を診断する方法であって、
（ａ）患者から試料を得ることと、
（ｂ）請求項１〜１１のいずれかに記載の方法にしたがって前記試料中の病原体タンパク質の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）前記病原体の有無及び／または量に基づいて患者の診断を行うことと、を含む方法を提供する。

本発明を以下の図面を参照しながらあくまで例として下記により詳しく説明する。

典型的なウイルス粒子の対称的な繰り返し単位を示す図である。ウイルス粒子の表面への小分子物質の結合を示す図である。ウイルス粒子に結合した分子ビーコンとこれから検出される放射光を示す図である。

本発明では検体は繰り返しタンパク質単位を含む。繰り返し単位は複数（好ましくは多数）の標識物質が検体に結合するために必要である。しかしながらタンパク質の種類は繰り返し単位が存在するものであれば特に限定されない。したがって検体には、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、及び哺乳動物タンパク質（例、ヒトタンパク質）から選択されるタンパク質が含まれる。

本発明の特定の好ましい実施形態では、検体にウイルスタンパク質が含まれる。こうした実施形態では、検体にはウイルスの表面タンパク質の全体または一部が含まれる。ただし、検体は複数の標識物質が結合できるものであればその他の点において特に限定されない。したがって検体は全ウイルス、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、未成熟ウイルス粒子、及びプロトウイルス複合体から選択することができる。ウイルスはバクテリオファージなどの任意の種類であってよい。

複数の標識物質が単一の検体物質に付着可能なものであれば標識自体は特に限定されない。使用される標識の種類は研究対象となる検体に応じて選択することができる。したがって全ウイルスでは、立体障害の観点から単一のウイルス外殻タンパク質分子で使用されるものよりも大きな標識を使用することができる。こうした標識には、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸、または有機化合物若しくは分子が含まれる。一実施形態では、標識はカプシド機能の阻害物質を含むことが好ましい。この実施形態では標識はオキサジアゾール化合物を含むことがより好ましい。こうした化合物としてはプレコナリルまたはプレコナリル誘導体が最も好ましい。

通常、標識は放射光の波長とは異なる波長で励起される蛍光基などのレポーター基を有する。好ましくはレポーター基は図２に示されるように標識が検体に結合すると変化する。その際、結合していない構造２の立体配座が変化して伸びた形態の構造１となる。特定の実施形態ではリポーター基は伸びた形態では異なる蛍光を発する蛍光基からなる。こうした実施形態では標識は内部消光し、検体（例、ウイルス粒子）への結合によって消光が解除されて検出可能なシグナルが発生する。

病原体はウイルス及び細菌から選択されることが好ましい。本発明はあらゆるウイルスに適用することができる。好ましいウイルスとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、パルボウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス（例、ＨＣＶ）、及びレトロウイルス（例、HIV）が挙げられる。更に動物ウイルス、植物ウイルス、ならびにλ、ＰｈｉＸ１７４、ＰＲＤ１、ＭＳ２及びＴ−ｅｖｅｎなどの細菌ウイルス（バクテリオファージ）も挙げられる。

最も好ましい実施形態では、ウイルスは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、インフルエンザウイルス、及びヒト以外の生物種のウイルス病原体から選択される。

本発明の方法では患者は一般に哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

上記に簡単に述べたように、本発明の一態様では、本発明の実施に当って特に本発明の使用及び方法によって実現されるシグナル増強効果を最大限利用するために協同的結合を利用している。こうした結合は一般に「分子ビーコン」技術と呼ばれる。

分子ビーコンには２つの側面があるがそれらのいずれも本発明に適用することが可能である。すなわち第一に協同的結合であり、第二に協同的シグナル増幅である。

協同的結合はあるリガンドの結合が同じ標的巨大分子に対する別のリガンドの結合を促進するというものであり、自然界でしばしば見られる。最もよく知られた例は、「Ｓ字状」の結合曲線を有するヘモグロビンの酸素飽和度である。核酸に対するタンパク質の結合（例、ｌａｃリプレッサー及びｌａｃオペレーター）も知られている。その本発明における意義は、小分子のリガンドは過剰量となるためにこうした協同性によって少量の標的であっても検出されることにある。

本発明では協同的シグナリングも容易に利用できる。あるタグ付加リガンドが別のタグ付加リガンドの近傍に結合すれば双方のタグが発生するシグナルを増強するうえで充分である。これは上記に述べた、やはり広く知られるシグナル消光システムと逆の状況である。このことは検出用リガンドが、同じリガンド上に存在するか（逆分子ビーコンにおける場合、http://www.molecular-beacons.org/を参照）あるいは別々のリガンド上に存在しうる２以上の異なるタグからなっていることを意味しうる。

本発明を以下の具体的実施形態を参照しながらあくまで例として下記に更に詳しく説明する。

特定の一実施形態では、全血、血漿もしくは血清、尿または脳脊髄液などのウイルスを含んだ体液を特定量の内部消光された検出剤と反応させる。

所定時間のインキュベーションの後、特定の波長（励起波長）の光を反応液に照射して所定の波長の蛍光放射を測定する。光放射のレベルはフルオロフォアの結合量に比例し、結合していない、したがって消光されたフルオロフォアからはシグナルは得られない。

１個のウイルス粒子に１個の蛍光分子が結合することによってもシグナルは生ずるが、ウイルス粒子は多数の蛍光分子を結合することが可能であり、したがってさらなるレベルのシグナル増幅が可能である。

ウイルス粒子に結合した分子ビーコン及びこれから検出される放射光の一例を図３に示す。本実施形態では同様の放射光の検出グラフによってウイルスの有無が示されている。スペクトルのピーク強度によって更なる定量的情報が与えられる。

Claims

試料中の検体を検出するための方法における、検体の検出感度を高めるための標識の使用であって、検体が繰り返しタンパク質単位を有し、複数の標識物質が単一の検体物質に結合可能であることにより、複数の標識から単一の検体について得られるシグナルが、単一の標識を有する検体について得られるシグナルよりも強いことを特徴とする標識の使用。
前記方法が、
（ａ）試料を標識と接触させることと、
（ｂ）検体に結合した標識の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）これにより試料中の検体の有無及び／または量を検出することと、を含む請求項１に記載の使用。
前記検体がウイルスタンパク質、細菌タンパク質、及び哺乳類タンパク質から選択されるタンパク質を含む請求項１または２に記載の使用。
前記検体がバクテリオファージタンパク質またはヒトタンパク質から選択される検体である請求項３に記載の使用。
前記検体が全ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質、ウイルス様粒子、未成熟ウイルス粒子、及びプロトウイルス複合体から選択される請求項３に記載の使用。
前記標識が抗体、アプタマー、核酸、または有機化合物若しくは分子を含む請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
前記標識がカプシド機能阻害物質を含む請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
前記標識がオキサジアゾール化合物を含む請求項６または７に記載の使用。
前記標識がプレコナリルまたはプレコナリル誘導体を含む請求項８に記載の使用。
前記標識がレポーター基を有する請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
前記標識が検体に結合すると前記レポーター基の性質が変化する請求項１０に記載の使用。
前記レポーター基は蛍光基を含む請求項１０または１１に記載の使用。
分子ビーコンを用いて前記シグナルが発生される請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
前記検体が、ＨＣＶ、ＨＩＶ、または単純ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、インフルエンザ、またはヒト以外の生物種のウイルス病原体を含む請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
試料中の検体を検出するための方法であって、
（ａ）検体に結合することが可能な標識と試料を接触させることと、
（ｂ）検体に結合した標識の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）これによって試料中の検体の有無及び／または量を検出することと、を含み、
前記検体が繰り返しタンパク質単位を含み、複数の標識物質が単一の検体物質に結合可能であることにより、複数の標識から単一の検体について得られるシグナルが、単一の標識を有する検体について得られるシグナルよりも強いことを特徴とする方法。
前記検体が、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、パルボウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、及びレトロウイルスから選択されるウイルスの繰り返しタンパク質単位を含む請求項１５に記載の方法。
前記ウイルスが、ＨＣＶ、ＨＩＶ、または単純ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、インフルエンザ、またはヒト以外の生物種のウイルス病原体から選択される請求項１５または１６に記載の方法。
更に請求項３〜１３に記載される方法である請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
患者における病原体の有無を診断する方法であって、
（ａ）患者から試料を得ることと、
（ｂ）請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法にしたがって前記試料中の病原体タンパク質の有無及び／または量を検出することと、
（ｃ）前記病原体の有無及び／または量に基づいて患者の診断を行うことと、を含む方法。
前記病原体がウイルス及び細菌から選択される請求項１９に記載の方法。
前記ウイルスが、ＨＣＶ、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、インフルエンザウイルス、及びヒト以外の生物種のウイルス病原体から選択される請求項２０に記載の方法。
前記患者が哺乳動物である請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
前記患者がヒトである請求項２２に記載の方法。