DE10132405C2 - Verfahren zum Nachweis der Multimerisierung von retroviralen Strukturproteinen in vitro - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Multimerisierung von retroviralen Strukturproteinen in vitro, sowie die Verwendung eines solchen Verfahrens zur Charakterisierung der Kinetik und der biochemischen Parameter der Multimerisierung, sowie zur Entwicklung und Optimierung von Inhibitoren der Multimerisierung, insbesondere zur Entwicklung neuer Therapeutika zur Kontrolle retroviraler Infektionen, insbesondere der HIV-Infektion. Des weiteren soll die Verwendung eines solchen Verfahrens zur Untersuchung der Multimerisierung der Strukturproteine von Virusmutanten eingesetzt werden. Die genannten Verwendungen sollen so weit möglich als "High-Throughput-Verfahren" angewendet werden.

Das humane Immundefizienzvirus (HIV) ist der Erreger des erworbenen Immundefizienz Syndroms, AIDS ("acquired immune deficiency syndrom") (Barre-Sinoussi et al., 1983; "Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)". Science 220, Seiten 868-871). Alleine im Jahr 2000 starben weltweit ca. 3 Millionen Menschen an AIDS. Daher ist es nötig neue Wege für die antivirale Therapie zu ermöglichen. Nach dem derzeitigen Stand der Forschung kann eine dauerhafte Hemmung der HIV- Replikation nur über eine Mehrfachtherapie erreicht werden. Es ist dabei entscheidend, daß die verwendeten Therapeutika in verschiedene Schritte des viralen Replikationszyklus eingreifen. Außerdem sollte die spezifische Hemmung viraler Prozesse gewährleistet sein, um unerwünschte Nebenwirkungen durch den Eingriff in zelluläre Abläufe vermeiden zu können. Bisher werden ausschließlich Inhibitoren viraler Enzyme (Reverse Transkriptase und Protease) zur Therapie eingesetzt.

HIV gehört zu der großen und vielseitigen Familie der Retroviren. Retroviren sind membranumhüllte Viren, deren Genom aus zwei Kopien einer einzelsträngigen Plus-Strang RNA besteht (Coffin et al., 1996; "Retroviruses". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Alle Retroviren enthalten mindestens drei offene Leserahmen, Gag, Pol und Env, die für die inneren Strukturproteine (Gag), die viralen Enzyme (Pol) und die Glykoproteine (Env) kodieren. Komplexe Retroviren, denen auch HIV zuzuordnen ist, tragen zusätzlich die Information für regulatorische Proteine. Das Genom ist von äußeren und inneren Strukturproteinen umhüllt. Glykoproteine sind als äußere Strukturproteine in die äußere Lipidhülle inseriert.

Es ist bekannt, daß die Multimerisierung, d. h. die Assoziierung einzelner Monomere zu Multimeren, von bakteriell exprimierten und anschließend gereinigten (retro-)viralen inneren Strukturproteinen in vitro durch Anlagerung von Nukleinsäuren induziert werden kann. Dabei wird die Multimerisierung durch eine sterisch geeignete Anlagerung der Proteinmonomere an die Nukleinsäuren ausgelöst. Voraussetzung hierfür ist, dass die (retro-)viralen Strukturproteine in ausreichend hoher Konzentration vorliegen und eine Nukleinsäure bindende Domäne enthalten.

Ein Beispiel für ein solches Strukturprotein ist ΔMA- CA-NC-SP2, welches sich von dem Strukturprotein Gag des HI-Virus nur durch das Fehlen der Aminosäuren 16-99 aus MA und der C-terminalen p6-Domäne unterscheidet. In Fig. 1 sind das Gag-Protein und das Expressionsprodukt des Strukturproteins ΔMA-CA-NC-SP2 nebeneinander schematisch dargestellt. Letzteres lagert sich unter geeigneten Bedingungen in vitro zu sphärischen Partikeln zusammen. Die sphärischen Partikel weisen sehr große Ähnlichkeit zu unreifen HIV-Partikeln bezüglich der Form, Größe und der inneren Organisation auf, wie von Gross et al. in "A conformational switch controlling HIV-1 morphogenesis, (2000) EMBO J. 19, Seiten 103-113" gezeigt wurde. Fig. 2 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des zu sphärischen Partikeln assoziierten Strukturproteins ΔMA-CA-NC-SP2.

Bislang wurde die Multimerenbildung durch Dialyse der Stukturproteine in einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren enthaltenden Puffersystemen initiiert. Dabei werden die Proteine durch die Dialyse kontinuierlich in einen Zustand überführt, in dem sie zur Multimerisierung befähigt sind. Die Produkte der Multimerisierungen wurden anschließend durch Anfertigen einer elektronenmikroskopischen Aufnahme nachgewiesen.

Zwar ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme anschaulich und kann Informationen über die Struktur und Größe der gebildeten Partikel liefern, jedoch ist nachteilig, dass die Präparation der Proben und deren Analyse sehr zeitaufwändig ist. Dies gilt vor allem wenn umfangreiche Testreihen durchzuführen sind, beispielsweise bei der Entwicklung und Optimierung von Multimerisierungsinhibitoren. Der zeitliche Verlauf der Multimerisierung ist elektronenmikroskopisch grundsätzlich nicht zu verfolgen da nur zu diskreten Zeitpunkten stichprobenartig analysiert werden kann. Ferner ist eine optische Quantifizierung der Partikel nur sehr eingeschränkt möglich, da diese über eine visuelle Abschätzung eines zufällig gewählten Probenausschnitts durch den Experimentator erfolgen muss. Naturgemäß ist eine solche visuelle Abschätzung nur subjektiv. Schließlich erfordert ein elektronenmikroskopischer Nachweis der Multimerisierung von Strukturproteinen den Einsatz eines Elektronenmikroskops womit erhebliche Kosten verbunden sind. Die Elektronenmikroskopie ist daher als Methode zum Nachweis der gebildeten Partikel nur wenig geeignet.

Ferner verhindert der kontinuierliche Prozess der Dialyse (retro-)viraler Strukturproteine, welche dabei langsam in die zur Multimerisierung geeigneten Bedingungen überführt werden, eine Beobachtung des zeitlichen Verlaufs der Multimerisierungsreaktion der Strukturproteine.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein schnell, einfach und kostengünstig durchzuführendes Verfahren zu schaffen, welches die kinetische und quantitative Analyse der Multimerisierung von retroviralen (inneren) Strukturproteinen in vitro erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß wird ein Ein-Schritt-System verwendet, in welchem die Multimerisierung der retroviralen Strukturproteine zu einem bestimmten Zeitpunkt gestartet werden kann. Dadurch ist es möglich, den Reaktionsverlauf zu verfolgen.

Das im Rahmen der Erfindung eingesetzte Strukturprotein liegt in einer gereinigten Form vor.

Charakteristisch für die Erfindung ist, dass anstelle der Elektronenmikroskopie die Fluoreszenzspektroskopie zum Nachweis der Multimeren einsetzbar ist. Die Fluoreszenzspektroskopie liefert ein empfindliches Signal für Veränderungen der Tertiär- und Quartärstruktur von Makromolekülen, wodurch die Multimerenbildung beobachtet werden kann. Dabei gilt, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals, und gegebenenfalls auch die Lage des Emissionsmaximums fluoreszierender Gruppen (intrinsische oder extrinsische Fluorophore), durch deren direkte, insbesondere polare oder unpolare Umgebung stark beeinflußt ist.

Jedoch verhält sich die Fluoreszenz von mit zu hohen Konzentrationen gelösten Makromolekülen auf Grund von sekundären Absorptionseffekten nur über einen bestimmten Konzentrationsbereich linear. Daher muß derjenige Konzentrationsbereich für das jeweilige Strukturprotein bestimmt werden, in welchem sich Fluoreszenzintensität und Proteinkonzentration proportional zueinander verhalten. Die fluoreszenzspektroskopische Messung der Multimerisierung retroviraler Strukturproteine muß also innerhalb eines Konzentrationsbereichs mit linearem Fluoreszenzsignal, jedoch oberhalb des zur Multimerisierung nötigen Konzentrationslimits erfolgen.

Zudem ist über die Fluoreszenzspektroskopie der zeitliche Verlauf der Multimerenbildung zu beobachten.

Für die Bildung der Multimere ist nicht nur die Zugabe von Nukleinsäuren, sondern auch das Vorliegen eines geeigneten pH-Werts und einer geeigneten Ionenstärke nötig.

Als vorteilhaft hat sich für den Puffer zur Lagerung des Strukturproteins eine wäßrige Lösung mit einem pH- Wert im Bereich von 5,5 bis 8,0 und einer Salzkonzentration von 200 bis 700 mmol/l gezeigt. Die Konzentration des Strukturproteins im Puffer beträgt vorzugsweise 2-6 mg/ml.

Als Puffer für die Nukleinsäure hat sich eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0 und einer Salzkonzentration von weniger als 300 mmol/l als vorteilhaft erwiesen. Die Konzentration der Lösung der Nukleinsäure im Puffer beträgt vorzugsweise zwischen 2 und 10 Gew.-% bezogen auf die Menge an eingesetztem Strukturprotein. Es ist darauf zu achten, dass eine zu geringe Konzentration an Nukleinsäure keine vollständige Multimerisierung des Strukturproteins bewirkt, während eine zu hohe Konzentration die Multimerisierung zu stark beschleunigt und damit möglicherweise zu einer Aggregation des Strukturproteins führt.

Die herkömmlicherweise eingesetzte Dialyse des Strukturproteins wird durch ein Ein-Schritt-System ersetzt, bei dem eine Verdünnung der konzentrierten Lösung des Strukturproteins mit dem nukleinsäurehaltigen Puffer erfolgt. Hierdurch wird in Verbindung mit der Fluoreszenzspektroskopie der Zeitverlauf der Multimerisierungsreaktion beobachtbar. Dabei ist zu beachten, dass die Konzentration des Strukturproteins nach der Verdünnung oberhalb einer für die Assoziierung zu Multimeren nötigen kritischen Proteinkonzentration liegt. Erfolgt eine zu starke Verdünnung, kann keine Multimerisierung mehr initiiert werden. Hingegen führt eine zu geringe Verdünnung zum Verlust der Linearität des Fluoreszenzsignals und gegebenenfalls zu einer Aggregation des Strukturproteins. Die erforderliche Verdünnung ist abhängig vom eingesetzten Strukturprotein.

In vorteilhafter Weise liegt die Konzentration des Strukturproteins nach der Verdünnung im Bereich von 0.05 bis 0.5 mg/ml. Ein insbesonders bevorzugter Bereich hierfür ist 0.1-0.15 mg/ml.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Zeitverlauf der Fluoreszenz der verdünnten Lösung des Strukturproteins vorzugsweise für einen Zeitraum von bis zu 120 Minuten, insbesondere bevorzugt 60 Minuten gemessen.

Das eingesetzte Strukturprotein ist vorzugsweise ein retrovirales Gag, vorzugsweise das des HI-Virus, das eines dazu verwandten Retrovirus oder ein einem Strukturprotein des HI-Virus in seinem Aufbau nah verwandtes, beziehungsweise davon abgeleitetes Strukturprotein. Bei einem derartigen, vom Strukturprotein Gag des HI-Virus abgeleiteten Strukturprotein handelt es sich vorzugsweise um das Strukturprotein ΔMA-CA-NC-SP2 oder ΔMA-CA-NC.

Zur Messung der Fluoreszenz der verdünnten Lösung des Strukturproteins kann gegebenenfalls eine intrinsische Fluoreszenz des Strukturproteins, beispielsweise durch Anregung der fluoreszierenden Aminosäure Tryptophan, gemessen werden. Ebenso kann das Strukturprotein mit wenigstens einem extrinsischen Fluorophor versehen sein. Dabei ist das Fluorophor vorteilhaft aus der Gruppe von Fluoreszenzfarbstoffen gewählt, die eine kovalente Modifikation des Proteins über thiolreaktive Gruppen ermöglicht. Beispielsweise können hierfür Pyrenderivate, wie Pyren-Maleimid und Iodacetopyren, 8- Anilinonaphtalin-1-sulfonsäure (ANS)-Derivate, wie Maleimid-ANS und Iodacetamid-ANS, Nitro-benz-2-oxa-1,3- diazol (NBD)-Derivate, wie Iodaceto-NBD oder Dansyl- Aziridin verwendet werden.

Als Nukleinsäure wird vorzugsweise ein RNA- Oligonukleotid oder ein einzelsträngiges DNA- Oligonukleotid mit einer Länge von wenigstens 10 Nukleotiden verwendet. Die Nukleinsäure kann eine für das Nukleinsäure bindende Strukturprotein spezifische Sequenz - also diejenige Sequenz, welche der des natürlichen Bindungspartners des Strukturproteins entspricht - oder eine unspezifische Sequenz aufweisen. Ebenso kann die Nukleinsäure mit wenigstens einem extrinsischen Fluorophor versehen sein.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das Emissionsmaximum und/oder die Wellenlänge mit maximaler Intensitätsdifferenz zwischen nichtassoziiertem und assoziiertem Zustand des Strukturproteins erfasst. Dabei kann die Änderung des Fluoreszenzsignals auf Quenching, also der Absorption der Fluoreszenzemission eines Moleküls, oder auf FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer"), also der durch die Interaktion mindestens zweier Moleküle ausgelösten Übertragung der Fluoreszenzenergie eines Fluorophors auf einen zweiten Fluorophor, basieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll nun anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden, wobei Bezug auf die beigefügten Figuren genommen wird.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsproduktes des Strukturproteins ΔMA- CA-NC-SP2, im Vergleich zum HIV Gag Strukturprotein.

Fig. 2 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der durch Multimerisierung mittels Dialyse des Strukturproteins ΔMA-CA-NC-SP2 entstandenen sphärischen Partikel.

Fig. 3 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der relativen Fluoreszenz des Strukturproteins ΔMA- CA-NC-SP2.

Fig. 4 zeigt die zeitliche Veränderung der Fluoreszenzemission des Strukturproteins ΔMA- CA-NC-SP2 nach Initiation der Multimerisierungsreaktion durch Verdünnung.

Es wurde die Multimerisierung des Strukturproteins ΔMA- CA-NC-SP2 zu sphärischen Partikeln kinetisch und quantitativ charakterisiert. In Fig. 1 ist das Expressionsprodukt des Proteins ΔMA-CA-NC-SP2 schematisch dargestellt. Dieses Protein kann zu sphärischen Partikeln multimerisiert werden. In Fig. 2 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme der durch Multimerisierung des Strukturproteins ΔMA-CA-NC-SP2 entstandenen sphärischen Partikeln dargestellt.

Zunächst wurden die Bedingungen für die Verdünnung der konzentrierten ΔMA-CA-NC-SP2-Pufferlösung in einem nukleinsäurehaltigen Puffer mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen optimiert, so daß die Effizienz der Partikelbildung mit der der Dialyse- induzierten Multimerisierung vergleichbar war. Es bildeten sich Partikel, die in ihrer Morphologie etwas stärker variierten, als dies bei der Dialyse- induzierten Multimerisierung der ΔMA-CA-NC-SP2-Partikel der Fall ist, aber in ihrer Größe und Wandstärke vergleichbar waren.

Auf diese Weise wurde ebenfalls das Konzentrationslimit der ΔMA-CA-NC-SP2-Assoziation bestimmt. Es ergab sich, dass bei Proteinkonzentrationen von weniger als 0.1 mg/ml (entspricht 2.47 µM) keine Partikelbildung mehr erfolgte.

Dann wurde der Konzentrationsbereich bestimmt, in welchem sich die Fluoreszenzintensität und die Proteinkonzentration proportional zueinander verhalten. Hierzu wurde der lineare Konzentrationsbereich durch Extrapolation der Fluoreszenzmaxima von ΔMA-CA-NC-SP2- Lösungen unterschiedlicher Proteinkonzentration gegen Null auf 0 bis 0.15 mg/ml Protein (entspricht 0 bis 3.7 µmol/l) eingegrenzt. Als Puffer für das Strukturprotein wurde dabei eine wäßrige Lösung von 30 mmol/l 2-(N- Morpholin)-Ethansulfonsäure, 500 mmol/l Natriumchlorid, 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure und 2 mmol/l 1,4- Dithiothreitol mit einem pH von 6,0 verwendet. Dies ist in Fig. 3 dargestellt, wobei als Abszisse die zunehmende Menge an eingesetztem Protein, und als Ordinate die relative Fluoreszenz (rel. F.) bei 334 nm dargestellt ist. Es ist deutlich erkennbar, dass oberhalb von 0,15 mg/ml Protein keine Proportionalität zwischen Fluoreszenzintensität und der Proteinkonzentration mehr auftritt. Es wurde ausschließlich die intrinsische Fluoreszenz des in ΔMA- CA-NC-SP2 enthaltenen Tryptophans gemessen.

Als Verdünnungspuffer wurde 50 mmol/l N-2-Hydroxyethyl­ piperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) mit einem pH- Wert von 7.5 gewählt. Zusätzlich enthielt der Puffer 0.04% Polyethylenglykol (PEG) 20000, 2 mmol/l 1,4 Dithiothreitol und 180 mmol/l Natriumchlorid. Die Anwesenheit von PEG 20000 sollte das Benetzen der Küvettenwand mit Protein verhindern. In diesem Puffer wurde ferner ein einzelsträngiges DNA-Oligonukleotid mit einer Länge von 73 Basen (73mer: 5'-GGCTAGAAGGATCCATATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAA TTAGATCGACCTATAGTGCAG-3') bei 20°C vorinkubiert. Die Nukleinsäuremenge betrug 5 Gew.-% bezogen auf die Masse an Protein.

Da die maximale ΔMA-CA-NC-SP2-Konzentration für ein stabiles Fluoreszenzsignal 0.15 mg/ml, das minimale Proteinkonzentrationslimit der Multimerisierung 0.1 mg/ml beträgt, wurde die Reaktion mit der Verdünnung der konzentrierten ΔMA-CA-NC-SP2-Lösung auf eine Endkonzentration von 0.1 mg/ml Protein gestartet.

Der Reaktionsverlauf wurde durch die Aufnahme von Emissionsspektren zu verschiedenen Zeitpunkten nach Reaktionsstart bei 20°C verfolgt. Während der Wartezeiten zwischen der Aufnahme zweier Emissionsspektren wurde die Probe nicht angeregt, um ein Ausbleichen (Photobleaching) zu verhindern. Die Fluoreszenzmessungen wurden an einem Aminco Bowman Series 2 Fluorimeter (SLM, Urbana, IL, USA) vorgenommen. Die Emissionsspektren wurden nach Anregung bei einer Wellenlänge von 280 nm (Bandbreite 2 nm), mit 1 nm/s, einer Bandbreite von 4 nm in der Emission und einer Integrationszeit von 1 s in einem Bereich von 300 bis 440 nm aufgenommen. Die Spektren wurden um den Beitrag des Puffers korrigiert. Die Spektren sind in Fig. 4 (linke Abbildung) dargestellt, wobei als Abszisse die Wellenlänge (nm), und als Ordinate die relative Fluoreszenz (rel. F.) dargestellt ist. Eine zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommene Kurve kommt aufgrund einer durch die Interaktion der Moleküle ausgelösten Absorption der Fluoreszenz (Quenching) jeweils unterhalb der vorhergehenden Kurve zu liegen.

Trägt man die relative Fluoreszenz des Emissionsmaximums bei 334 nm gegen die Zeit (in Minuten) auf, wie in Fig. 4 (rechte Abbildung) dargestellt, wird deutlich, daß sich das Fluoreszenzsignal gemäß einer Exponentialfunktion verändert. Daher wurde die Kinetik unter Zuhilfenahme einer einfachen Exponentialfunktion ausgewertet:

y = A₀.exp(-kt) + V (1),

wobei durch Gleichung (1) eine exponentielle Abnahme mit der Rate k über die Zeit t beschrieben wird. Die Parameter V und A₀ dienen zur Anpassung des Untergrunds, beziehungsweise der Amplitude der Reaktion.

Aus der Reaktionsrate läßt sich die Zeitkonstante τ berechnen:

τ = 1/k (2),

die sich wiederum als Halbwertszeit t_½ ausdrücken läßt:

t_½ = τ.ln2 (3).

Eine dementsprechende Anpassung der Daten ergibt für die Verringerung der Fluoreszenzintensität eine Rate k von 0.11 min^-1. Dies entspricht einer Zeitkonstanten τ von 9.1 min bzw. einer Halbwertszeit t_½ von 6.3 min.

Die exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität spricht für die Spezifität des Signals als Maß für die Multimerisierung, da eine durch Ausbleichen der Probe induzierte Intensitätsabnahme über einen größeren Zeitraum zu einer linearen Abnahme der Fluoreszenzintensität führen würde.

Anstelle der eingesetzten Nukleinsäure können auch andere einzelsträngige Nukleinsäuren als Interaktionspartner eingesetzt werden. Diese können sich in ihrer Länge, ihrer Sequenz und ihrem Nukleinsäuretyp (DNA oder RNA) von dem oben genannten 73mer unterscheiden.

Des weiteren besteht die Möglichkeit das Fluoreszenzsignal durch gezieltes Einführen von fluoreszierenden Gruppen (Fluorophoren) in die Nukleinsäure und/oder in das Protein zu verstärken. Die Wellenlängen für Anregung und Emission sind dann an die jeweiligen Fluorophore anzupassen. Bei der Verwendung von Fluorophorpaaren deren Fluoreszenzintensität sich wärend der Interaktion durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) verstärkt, ist dann während der Assoziierung eine Zunahme der Intensität anstelle einer exponentiellen Abnahme zu erwarten.

Die Multimerisierungsreaktion kann alternativ auch bei anderen Temperaturen, oder in abweichenden Puffersystemen durchgeführt werden.

Weiterhin ist es möglich auf die Aufnahme von Emissionsspektren zu verzichten und die Multimerisierungsreaktion direkt durch Detektion des Emissionsmaximums, oder Detektion der spezifischen Wellenlänge mit maximaler Intensitätsdifferenz zwischen nichtassoziiertem und assoziiertem Zustand zu verfolgen. Insgesamt können mehrere Reaktionen auch parallel als "High-Throughput-Assay" in Mikrotiterplatten durchgeführt werden.

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Entwicklung und Optimierung von Inhibitoren der Multimerisierung und damit zur Entwicklung neuer Therapeutika zur Kontrolle viraler Infektionen, insbesondere der HIV-Infektion einsetzbar. Die Hemmung der Multimerisierung viraler Strukturproteine eignet sich grundsätzlich als antiviraler Therapieansatz, da die Interaktion der viralen Strukturproteine tatsächlich virusspezifisch ist und somit die Gefahr von Inhibitor-induzierten Nebenwirkungen gering ist. Des weiteren ist die Entwicklung von Inhibitoren der Multimerisierung viraler Strukturproteine besonders attraktiv, da die Multimere erst durch das Zusammenwirken einer Vielzahl von schwachen nicht- kovalenten Wechselwirkungen stabilisiert werden (ca. 1500 bis 2000 Moleküle). Deshalb führt schon die Störung einer geringen Anzahl dieser Wechselwirkungen zu erheblichen Verlusten in der Virusstabilität, weshalb Multimerisierungs-Inhibitoren aller Voraussicht nach in niedrigen Dosen verabreicht werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei einer Vielzahl von parallel durchgeführten Multimerisierungsreaktionen zum gleichzeitigen Nachweis der Multimerisierung als "High-Throughput"-Verfahren eingesetzt werden. Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Charakteri­ sierung der Kinetik der Reaktion oder der Bestimmung grenzwertiger Reaktionsbedingungen einsetzbar. Eine weitere mögliche Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Untersuchung der Multimerisierung von Virusmutanten, insbesondere zur Überprüfung von Resistenzentwicklungen einzelner Viren gegenüber Multimerisierungs-Inhibitoren.

Strukturproteine im Sinne der Erfindung sind alle viralen Proteine, die zu einer Multimerisierungs­ reaktion geeignet sind.

Claims (24)

1. Verfahren zum Nachweis der Multimerisierung von Nukleinsäuren bindenden, retroviralen Strukturproteinen in vitro, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• a) Herstellen einer konzentrierten Lösung des Strukturproteins in einem zur Lagerung des Strukturproteins geeigneten Puffer,
• b) Herstellen einer Lösung einer einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäure in Puffer,
• c) Verdünnen der konzentrierten Lösung des Strukturproteins mit dem Nukleinsäure haltigen Puffer durch Zugabe der konzentrierten Lösung des Strukturproteins zu dem Nukleinsäure haltigen Puffer,
• d) Messen der zeitlichen Änderung der Fluoreszenz der verdünnten Lösung des Strukturproteins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein in einem wäßrigen Puffer gelöst wird, dessen pH- Wert in einem Bereich von 5,5 bis 8,0 und dessen Salzkonzentration in einem Bereich von 200 bis 700 mmol/l liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffer für das Strukturprotein eine wäßrige Lösung von 30 mmol/l 2-(N-Morpholin)-Ethansulfonsäure, 500 mmol/l Natriumchlorid, 1 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäure und 2 mmol/l 1,4- Dithiothreitol, insbesondere mit einem pH von 6,0 verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Strukturproteins im Puffer 2-6 mg/ml beträgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in einem wäßrigen Puffer gelöst wird, dessen pH-Wert in einem Bereich von 6,5 bis 8,0 liegt und dessen Salzkonzentration weniger als 300 mmol/l beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Puffer für die Nukleinsäure eine wäßrige Lösung von 50 mmol/l N- 2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure und 180 mmol/l Natriumchlorid, insbesondere mit einem pH von 7,5 verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Lösung der Nukleinsäure im Puffer zwischen 2 und 10 Gew.-% bezogen auf die Menge an Strukturprotein beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit dem Nukleinsäure haltigen Puffer verdünnte Lösung des Strukturproteins 0,05-0,5, insbesondere bevorzugt 0,1-0,15 mg/ml Strukturprotein aufweist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitliche Änderung der Fluoreszenz der verdünnten Lösung des Strukturproteins für einen Zeitraum von bis zu 120 Minuten, insbesondere bevorzugt 60 Minuten, gemessen wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein ein retrovirales Gag Protein ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein ein Strukturprotein des HI-Virus, insbesondere HIV-1 und HIV-2, eines dazu verwandten Retrovirus, insbesondere SIV, HTLV-1 und HTLV-2 oder ein hierzu in seinem Aufbau verwandtes, beziehungsweise davon abgeleitetes Strukturprotein ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein das Gag Strukturprotein von HIV-1 oder ein davon abgeleitetes Protein, insbesondere ΔMA-CA-NC-SP2 und ΔMA-CA-NC ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein intrinsische Fluoreszenz aufweist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strukturprotein mit wenigstens einem extrinsischen Fluorophor versehen ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorophor aus der Gruppe der thiolreaktiven Fluoreszenzfarbstoffe gewählt ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Nukleinsäure ein RNA-Oligonukleotid oder ein einzelsträngiges DNA- Oligonukleotid mit einer Länge von wenigstens 10 Nukleotiden und mit einer für das Nukleinsäure bindende Strukturprotein spezifischen oder unspezifischen Sequenz verwendet wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure mit wenigstens einem extrinsischen Fluorophor versehen ist.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Fluoreszenzsignals auf Quenching oder FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer") basiert.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Emissionsmaximum und/oder die Wellenlänge mit maximaler Intensitätsdifferenz zwischen nichtassoziiertem und assoziiertem Zustand des Strukturproteins erfasst wird.

20. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Entwicklung und Optimierung von Inhibitoren der Multimerisierung.

21. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 20 zur Entwicklung neuer Therapeutika zur Kontrolle retroviraler Infektionen, insbesondere der HIV- Infektion und zur Therapie von AIDS.

22. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 19 zur kinetischen und biochemischen Charakterisierung der Multimerisierungsreaktion.

23. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 19 zur Untersuchung der Multimerisierung der Strukturproteine von Virusmutanten.

24. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 19 als "High- Throughput"-Verfahren.