CN102313732A - 增强和调节化学发光反应的光发射的方法 - Google Patents

增强和调节化学发光反应的光发射的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供通过使用属于N-唑类(即包含至少一个另外的氮原子的五元氮杂芳香环化合物的类型)的酰化催化剂(二级增强剂)增强和调节来自包括鲁米诺、过氧化物酶、氧化剂和电子介质(初级增强剂)的化学发光反应的光发射的方法。特别可用作二级增强剂的N-唑类为咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。本发明也描述了包含作为二级增强剂的所述N-唑类的化学发光底物在诊断分析中的用途。

Description

增强和调节化学发光反应的光发射的方法
技术领域
本发明涉及一种增强和调节由鲁米诺(luminol)、过氧化物酶、氧化剂和电子介质(electron mediator)的化学发光反应产生的光发射的新方法。
背景技术
由过氧化物酶催化的鲁米诺的化学发光氧化在抗原、抗体和核酸的分析测试，特别是印迹分析，例如斑点印迹、Western印迹(蛋白质)、Southern印迹和Northern印迹(核酸)中具有广泛应用。
已知，例如由L.J.Kricka在Clinical Chemistry 1991；37：1472-1481；或L.J.Kricka，J.C：Voyta和I.Bronstein在“Chemiluminescent Methods forDetecting and Quantitating Enzyme Activity”，Methods Enzymol.2000；305：370-390中所述，通过添加电子介质或增强剂可以使得过氧化物酶催化的鲁米诺的化学发光氧化更快和更有效。几种化合物已经用作电子介质，包括：G.H.G.Thorpe和L.J.Kricka，Methods Enzymol.1986；133：331描述的荧光素、6-羟基苯并三唑、对碘苯酚类、对香豆酸；美国专利4,279,950中描述的芳香胺类；欧洲专利申请603953(1994)中描述的乙酰苯胺类；美国专利5,171,688中描述的N-取代的吩噻嗪类；美国专利5,629,168中描述的硼酸类(boronic acids)。据信，在电子介质的存在下，过氧化物酶催化的鲁米诺氧化按照下列路线进行：
HRP+H2O2→HRP-I            (1)
HRP-I+LH-→HRP-II+L·-     (2)
HRP-II+LH-→HRP+L·-       (3)
HRP-I+E→HRP-II+E·-       (4)
HRP-II+E →HRP+E·-        (5)
E·-+LH-→E+L·-   (6)
L·-→L+LH-        (7)
L+H2O2→LO2 2-      (8)
LO2 2-→AP2-*       (9)
AP2-*→AP2-+hv     (10)
其中，HRP、HRP-I和HRP-II分别表示原生形式及其两种氧化形式的过氧化物酶；LH-、L·-、L和LO2 2-代表鲁米诺阴离子、鲁米诺自由基阴离子、diazaquinone和鲁米诺过氧化物；E和E·-代表电子介质(或初级增强剂)及其相应的自由基；最后，AP2-表示3-氨基邻苯二甲酸的二价阴离子，AP2-*表示其激发态。根据这一路线，过氧化物酶HRP被过氧化物氧化为HRP-I。鲁米诺阴离子和初级增强剂被HRP-I氧化为其相应的自由基，同时该酶转化为它的HRP-II形式。随之，HRP-II将另一分子的鲁米诺阴离子或初级增强剂氧化为其相应的自由基，同时再生为原生形式的HRP酶，原生形式的HRP酶可以参与另一氧化循环。
在电子介质E的存在下观察到的光输出的增加是由于关键中间体L·-的更快产生(参见，例如，S.B：Vlasenko，A.A.Arefeyev，A.D.Klimov，B.B.Kim，E.L.Gorovits，A.P.Osipov，E.M.Gavrilova，A.M.Yegorov，J.Biolumin.Chemilumin.1989；4：164-176)。一旦形成，L·-快速歧化为鲁米诺阴离子LH-和diazaquinone L。diazaquinone容易受到过氧化物对羰基(carbonilic)碳(C＝O)的亲核攻击，形成鲁米诺过氧化物。最后，鲁米诺过氧化物分解为其激发形式的3-氨基邻苯二甲酸根AP2-*，同时放出分子氮。激发状态的3-氨基邻苯二甲酸根然后发出425nm的蓝色光子。
如美国专利申请2008/0241686和在E.Marzocchi，S.Grilli，L.DellaCiana，L.Prodi，M.Mirasoli，A.Roda，Anal.Biochem.2008；277：189-194中描述的，通过使用某些酰化催化剂获得化学发光光发射的进一步的显著增加。只有在与电子传递类型的初级增强剂结合使用时，属于4-氨基吡啶类的这些化合物才提供光输出的进一步的提高。因此，它们可以被称为“二级增强剂”，参见，例如，以下参考文献：M.M.Vdovenko，L.DellaCiana，I.Yu.Sakharov，Anal.Biochem.2009；392：54-58。
虽然美国专利申请2008/0241686的4-氨基吡啶催化剂对于鲁米诺化学发光反应的效率具有强的作用，但它们难以进行调节。甚至非常少量的化合物也产生信号的大幅度增加。此外，与不存在这些化合物时相比，信号衰减快得多。但是，提供能够产生增加的光输出并具有相对较低的信号衰减率的配方是有利的。这些特征在需要重复读数时尤其是有价值的。
出于这个原因，与使用美国专利申请2008/0241686的4-氨基吡啶获得的信号放大相比，提供具有更好的信号放大调节水平的二级增强剂是现有技术的有价值的进步。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种增强和调节由鲁米诺、过氧化物酶、氧化剂和电子介质的化学发光反应产生的光发射的新方法。
根据本发明，在随后的权利要求中指定的组合物能够实现上述目标，这些权利要求应认为构成本说明的组成部分。
在一个实施方式中，本发明提供了属于N-唑类(N-azoles)的二级增强剂在化学发光组合物中的用途。本发明的二级增强剂特别包括以下N-唑类：咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。
N-唑被定义为包含至少一个另外的(非碳)氮原子的五元氮杂芳香环化合物。
虽然一般说来且无论目的如何，本发明涉及唑类增强和调节化学发光反应产生的光发射的用途，但是它主要适用于分析的场合。
术语“分析”指分析物的检测、半定量和定量。通常，分析的实施要求将光输出与过氧化物酶的使用量相关联，以使得过氧化物酶是直接测定的物质。虽然本发明可用于确定任何反应伴体(鲁米诺、过氧化物酶、氧化剂、电子介质、作为二级增强剂的N-唑)的存在或量，但反应伴体不一定是待测定的物质本身。例如，氧化剂可以由前一反应或先前的一系列反应产生。
过氧化物酶或鲁米诺可以以与能够结合感兴趣的分析物的配体(如，例如，用于免疫酶分析以确定抗原的抗体，或确定抗体的抗原)的偶联物的形式存在。或者在杂交分析中过氧化物酶可以与核苷酸、寡核苷酸或核酸偶联。因此，本发明适用于分析物的任何一种诊断分析方法，所述分析物的存在或量与在化学发光反应中共同反应的选自鲁米诺、过氧化物酶、氧化剂、初级增强剂、作为二级增强剂的N-唑的伴体反应的存在或量相关，检测或测量化学发光反应的光发射以使得待分析的分析物的存在或量与光的产生相关。本发明还包括用于进行分析的试剂盒，该试剂盒包括鲁米诺、氧化剂、作为初级增强剂的电子介质和作为二级增强剂的N-唑。该试剂盒还可以进一步包括过氧化物酶，该酶任选地标记到或适于标记到对于待分析的分析物特异性的配体上。
附图说明
下面参考附图只是以举例的方式描述本发明，其中：
图1显示以咪唑作为二级增强剂的化学发光信号(初始值和900秒时间后的信号衰减百分比)随pH变化的图。
图2显示以1-甲基咪唑作为二级增强剂的化学发光信号(初始值和900秒时间后的信号衰减百分比)随pH变化的图。
图3显示以1，2，4-三唑作为二级增强剂的化学发光信号(初始值和900秒时间后的信号衰减百分比)随pH变化的图。
图4显示化学发光信号随各种二级增强剂(MORP、咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑)的浓度变化的图。
具体实施方式
本发明的二级增强剂特别包括以下N-唑类：咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。这些化合物特别可用于需要高和稳定的光输出水平的化学发光分析，如印迹分析，包括Western、Southern和Northern印迹，以及斑点印迹和核酸杂交分析。
咪唑作为过氧草酸酯(peroxyoxalate)化学发光的催化剂是公知的(T.Jonsson和K.Irgum，Anal.Chim.Acta 1999；400：257-264；T.Jonsson和K.Irgum，Anal.Chem.2000；72：1373-1380)。然而，上述系统不能与本发明的目标相比。因此，被指定为不同的类型，如K.D.Gundermnann和F.McCapra在“Chemiluminescence in Organic Chemistry”，Springer1987中所说明的，即第IV类-过氧草酸酯化学发光对第V类-鲁米诺和相关化合物。特别地，已知某些有机草酸酯与过氧化氢反应以产生不稳定的过氧草酸酯，后者立即分解为CO2。将荧光团添加到混合物中，能够发生化学引发的电子交换的化学发光。已知酰化催化剂(如咪唑或4-二甲氨基吡啶)催化过氧草酸酯的形成，从而提高光输出。这些反应发生在极性非质子溶剂(如乙腈)中，且非常迅速，在大约几秒钟内结束。它们显然不是特别适于免疫酶学分析的开发。
N-唑增强剂的浓度一般为0.001至200毫摩尔/升，优选0.1毫摩尔至50毫摩尔/升。特别地，咪唑浓度一般为0.1毫摩尔至50毫摩尔/升。
在所有情况下，初始光输出的pH依赖性遵循钟形曲线。一般在低于9.1的pH下获得初始光输出方面的最好结果；特别地，在图1和2中，对于咪唑和1-甲基咪唑在8.3至8.6的pH范围内获得最好的结果，而在图3中，对于1，2，4-三唑，最佳条件偏移到较高的pH区间，优选为8.6至9.3。
另一方面，作为15分钟后初始光信号的降低百分比计算的光信号稳定性在所有情况下遵循S形曲线。该S形曲线的拐点出现在大约与初始信号的最大值相同的pH值处。
显示初始光输出对于二级增强剂浓度的依赖性的曲线图如图4中所示。与对于4-吗啉代吡啶(MORP)(一种典型的4-氨基吡啶催化剂)甚至在非常低的浓度下观察到的光输出的非常急剧的增加相反，当N-唑类用作二级增强剂时信号强度的上升更为和缓。此外，MORP在6mM浓度下达到最大效应，但是随着浓度进一步提高，其增强效应然后急剧减小，而N-唑类或者在非常高的浓度下开始缓慢降低它们的作用(例如，咪唑)，或者它们倾向于达到稳定水平(1-甲基咪唑、1，2，4-三唑和1，2，3-三唑)。
从这些数据可以清楚地看出，与之前已知的4-氨基吡啶类相比，基于N-唑类的二级增强剂的使用允许对于化学发光反应的控制达到高得多的水平。因此，可以通过使用N-唑类，紧密地调节初始光信号及其持续时间。这一特性是非常有价值的，因为它允许制备精细调节用于特定用途的化学发光HRP底物。例如，它可以用于获得更缓和的增强效应以及长得多的信号持续时间，以最大限度获得在给定的暴露窗口(window of exposure)产生的光的总量。因此，可以根据光检测的方法(例如，具有不一致的特性的胶片对电子设备，如电荷耦合器件(CCD))优化化学发光底物。
至于引起观察到的N-唑类二级增强剂的效应的反应机制，可能与对于4-氨基吡啶所提出的有一些相似，例如，对于diazaquinone L的亲核攻击，从而产生对于过氧化氢更具反应性的中间体。N-唑类和4-氨基吡啶之间的差异可能是由于它们的不同的亲核性。
至于本发明的酶底物的其他组分，可适用下面的说明。
使用的鲁米诺必须具有合适的纯度且适于发光分析。鲁米诺可以作为钠盐使用。化学发光底物中的鲁米诺的浓度一般为0.1毫摩尔/升至50毫摩尔/升，优选是0.5至10毫摩尔/升。
氧化剂可以是任何能够氧化鲁米诺以产生光的物质。优选为过氧化物源，如过氧化氢或过硼酸钠。用于化学发光底物中的氧化剂浓度是0.1至100毫摩尔/升，优选0.5至10毫摩尔/升。
初级增强剂(电子介质)可以是任何能够作为氧化剂和鲁米诺之间的电子介质的电活性物质。特别是属于以下化合物类型的增强剂：苯并噻唑类、酚类、芳香胺类、N-烷基吩噻嗪类、靛酚类、芳基硼酸类。优选的增强剂为对碘苯酚、对碘苯基硼酸、3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸盐或4-(吩噻嗪-10-基)丁烷-1-磺酸盐。初级增强剂必须具有足够和合适的纯度以用于化学发光分析。特别地，它不能含有可以抑制化学发光反应的杂质。按照本发明的过氧化物酶的化学发光分析中使用的初级增强剂的浓度为0.001至20毫摩尔/升，优选0.1至10毫摩尔/升。
过氧化物酶是适用于发光分析中的任何过氧化物酶。特别地，它可以是辣根过氧化物酶，例如Sigma型VI A或IX。它也可以是阴离子过氧化物酶，例如大豆过氧化物酶或甘薯过氧化物酶。过氧化物酶可以是游离的或与配体或者生物聚合物或者固相偶联。
本发明的化学发光反应适用于检测和定量分析物，例如，利用蛋白质或核酸与作为示踪剂的过氧化物和膜之间的键的形成。通过向膜加入化学发光底物开始发光反应。光发射被延长，并可以通过胶片、相机或其它仪器测量。
如本领域中已知，由鲁米诺、过氧化物源(氧化剂)、初级增强剂和作为二级增强剂的N-唑组成的化学发光底物可以方便地制备为试剂盒的形式。特别地，鲁米诺和过氧化物最好配制为单独的溶液(小瓶)，例如，A和B，以延长其保存期。初级和二级增强剂以及其他添加剂(如螯合剂和稳定剂)可以被添加到鲁米诺或过氧化物溶液/小瓶中或这两者中。这两个试剂盒溶液还含有缓冲物质，并以使得在混合时化学发光底物或“工作溶液”达到最佳的pH值的方式配制。过氧化物酶不与其底物组分一起存储，而是作为单独的成分，通常作为与用于感兴趣的物质/分析物的配体的偶联物，并且也可以由最终用户实行。
基于本发明的底物溶液的化学发光分析包括斑点印迹分析和用于蛋白质的Western印迹分析及用于核酸的Southern和Northern印迹分析。印迹分析使用凝胶电泳以将感兴趣的分析物(蛋白质或核酸分子)与存在于待测试样品中的其他组分(其他蛋白质或其他核酸分子)分离。分析物和其他组分然后被转移到膜上，在此使用对于分析物特异性的配体(抗体、寡核苷酸探针)探测(检测)它们。
本发明的化学发光底物的另一重要应用是用于ELISA免疫酶分析，特别是对于以极少量存在的分析物，如肿瘤标志物、甲状腺激素、蛋白质病毒(HIV、HCV、HPV)或类固醇激素(雌二醇、醛固酮)。进行用于检测分析物的ELISA分析，该分析包括对感兴趣的分析物具有特异性的至少一种配体(检测剂)。样品中的分析物非特异性地(通过吸附到表面)或特异性地(在“夹心”ELISA中，由对于相同分析物具有特异性的另一个配体捕获)固定在固体载体(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。在分析物固定后，加入检测剂，从而形成与分析物的复合物。检测剂可以共价连接到过氧化物酶，或本身可以由通过生物偶联(例如通过生物素或抗生物素蛋白链菌素)与过氧化物酶结合的第二检测剂检测。在各步骤之间，通常用温和的去污剂溶液洗涤板以除去未特异性结合的任何蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤之后，通过加入酶底物(本文所述的化学发光底物)使板显色以产生表明样品中分析物的量的光信号。
实施例
下面的实施例用于说明本发明的具体方面。然而，它们并不是为了限制本发明。
当然，只要本发明的原理保持相同，构建的细节和实施方式可以相对于已被描述和通过实施例说明的内容广泛地变化，而不会背离本发明的范围。
本申请中使用的所有试剂均购自Sigma-Aldrich。
使用Varian Eclipse分光荧光计和以下设置进行实施例中报告的所有测量：生物/化学发光模式，发射波长：425nm，发射狭缝：20nm；光电倍增管检测电压：中等。
实施例1：咪唑对于鲁米诺-过氧化物-3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠-过氧化物酶反应的pH依赖性
在0.15mM的Tris缓冲液，pH 9.0中，使用以下组成制备化学发光底物：
[鲁米诺钠盐]＝5mM
[过硼酸钠]＝4mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝3mM
[咪唑]＝10mM。
制备一系列的一次性聚甲基丙烯酸甲酯比色杯，各含有2mL的底物溶液。向每个比色杯添加少量的5M HCl或5M NaOH，以调节pH到8.0-10.0的范围内，而在任何情况下都没有导致总体积的显著变化。向每个比色杯添加10μL的2μg/mL的辣根过氧化物酶溶液(HRP-型VIA)，同时开始30秒的倒计时。用一方块parafilm封口膜封闭比色杯，并涡旋3秒。然后将比色杯插入分光荧光计中。在30秒倒计时结束时，开始发光信号的测量，并记录900秒的时间。在所有情况下，信号在加入过氧化物酶后30秒内达到稳定水平，然后开始缓慢下降。初始信号水平以及前900秒之内的信号减少百分比相对于pH值绘图，图1。
实施例2：1-甲基咪唑对于鲁米诺-过氧化物-3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠-过氧化物酶反应的pH依赖性
在0.15mM的Tris缓冲液，pH 9.0中，使用以下组成制备化学发光底物：
[鲁米诺钠盐]＝5mM
[过硼酸钠]＝4mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝3mM
［1-甲基咪唑]＝10mM。
使用如实施例2所述同样的实验程序。初始信号水平以及前900秒之内的信号减少百分比相对于pH值绘图，图2。
实施例3：1，2，4-三唑对于鲁米诺-过氧化物-3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠-过氧化物酶反应的pH依赖性
在0.15mM的Tris缓冲液，pH 9.0中，使用以下组成制备化学发光底物：
[鲁米诺钠盐]＝5mM
[过硼酸钠]＝4mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝3mM
[1，2，4-三唑]＝10mM。
使用如实施例2所述同样的实验程序。初始信号水平以及前900秒之内的信号减少百分比相对于pH值绘图，图3。
实施例4：3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠增强的鲁米诺-过氧化物-过氧化物酶反应对于二级增强剂浓度的依赖性
在0.15M，pH 9.00±0.05的Tris缓冲液中，使用以下组成制备一系列化学发光底物：
[鲁米诺钠盐]＝5mM
[过硼酸钠]＝4mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝3mM
二级增强剂：MORP、咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑，具有以下浓度：
[MORP]＝0.025mM，0.05mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1.5mM，3mM，5mM，6.5mM，8mM，10mM
[咪唑]＝1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，5mM，10mM，15mM，20mM，35mM，45mM，75mM
[1-甲基咪唑]＝1.5mM，3mM，5mM，15mM，25mM，35mM，45mM，75mM
[1，2，3-三唑]＝3mM，25mM，55mM，85mM.
[1，2，4-三唑]＝1.5mM，3mM，5mM，25mM，45mM，55mM，75mM，85mM。
制备一系列的一次性聚甲基丙烯酸甲酯比色杯，每个含有2mL的底物溶液。向每个比色杯添加10μL的2μg/mL的辣根过氧化物酶溶液(HRP-型VIA)，同时开始30秒的倒计时。用一方块parafilm封口膜封闭比色杯，并涡旋3秒。然后将比色杯插入分光荧光计中。在30秒倒计时结束时，开始发光信号的测量，并记录900秒的时间。在所有情况下，信号在加入过氧化物酶后30秒内达到稳定水平，然后开始缓慢下降。初始水平、稳定水平相对于二级增强剂浓度绘图，图4。可以看出，即使在非常低的浓度下，MORP对于信号强度的影响是相当强烈的。信号输出在大约1.5mM的MORP下急剧地达到最大值，然后突然下降。与之相反，N-唑类对于信号强度发挥缓和得多的效应，在高得多的浓度水平下达到稳定水平。因此，它们对于化学发光的光输出提供相当程度的调节，使用二烷基氨基吡啶二级增强剂(如MORP)无法获得这种调节。
实施例5：用于通过化学发光测量过氧化物酶的底物
为了确保长期稳定性，化学发光底物的成分可以作为单独的溶液提供，其在需要时可以混合以产生工作溶液。例如，可以通过混合等份的以下溶液获得用于过氧化物酶测量的工作溶液：
底物(1)：
溶液A：
在0.10M的Tris缓冲液，pH 9.6中，
[鲁米诺钠盐]＝2mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝0.3mM
[咪唑]＝0.25mM。
溶液B：
在50M，pH 5.0的醋酸盐缓冲液中，
[过硼酸钠]＝8mM。
混合溶液A和B后，工作溶液pH值是9.0。
底物(2)：
溶液A：
在0.25M的Tris缓冲液，pH 9.6中，
[鲁米诺钠盐]＝10mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝1.5mM
[咪唑]＝1.0mM。
溶液B：
在50M，pH 5.0的醋酸盐缓冲液中，
[过硼酸钠]＝8mM。
混合溶液A和B后，工作溶液pH值是9.0。
底物(3)：
溶液A：
在0.30M的Tris缓冲液，pH 9.3中，
[鲁米诺钠盐]＝10mM
[3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠]＝6mM
[咪唑]＝40mM。
溶液B：
在50M，pH 5.0的醋酸盐缓冲液中，
[过硼酸钠]＝8mM。
混合溶液A和B后，工作溶液pH值是8.6。
实施例6：总Akt Western印迹分析
H.Towbin等人Proc.Acad.Sci.76，4350-4353(1979)描述了所使用的印迹法。通过在12％十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳分离C2C12细胞裂解产物的连续稀释液。将凝胶转移至硝酸纤维素膜上进行Western印迹。用5％的奶粉溶液封闭非特异性结合位点1小时，然后用洗涤缓冲液(20mM Tris，137mM NaCl)洗涤几次。然后印迹与以1∶20,000稀释的兔抗总Akt一起温孵1小时，接着如上述洗涤以除去未与抗原连接的抗体。具有印迹的膜与以HRP(羊抗兔，1∶100,000稀释)标记的第二抗体一起温孵1小时。根据实施例5的底物(2)制备工作溶液。然后将工作溶液加入到膜，并温孵5分钟。以1分钟的曝光使用放射自显影胶片获得化学发光信号。放射自显影图像被扫描和数字化。结果与使用市售化学发光底物(SuperSignal Dura，ThermoScientific)获得的那些结果相当。
实施例7：人甲状腺球蛋白ELISA分析
这种免疫计量分析是基于捕获抗体、抗原(人甲状腺球蛋白，Tg)和大豆过氧化物酶(SbP)标记的抗体之间的免疫化学反应。通过用生物素化的捕获抗体的溶液温孵用抗生物素蛋白链菌素涂覆的微孔板制备具有捕获抗体的孔。然后用市售试剂盒的Tg校准剂温孵该孔。经过在37℃下的1小时温孵，用PBS-0.05％Tween-20洗涤板。然后向每孔加入200μL的过氧化物酶标记的抗-Tg抗体溶液。在室温下温孵该孔1小时，然后洗涤以除去过量的偶联物。将如实施例5底物3制备的化学发光工作溶液添加到孔中，并温孵10分钟。获得对于0.2ng/mL的Tg的检测下限(LOD)。该值与用基于碱性磷酸酶/二氧杂环丁烷(dioxetane)检测系统的市售试剂盒获得的LOD是相同的。

Claims (17)

1.一种增强由鲁米诺、过氧化物酶、氧化剂和初级增强剂的化学发光反应产生的光发射的方法，其特征在于，所述化学发光反应在二级增强剂的存在下发生，其中，所述二级增强剂选自N-唑类的化学类型。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述二级增强剂选自咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。
3.根据权利要求1或2的方法，其中，所述过氧化物酶选自辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶和甘薯过氧化物酶。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其中，所述过氧化物酶是游离的或与配体偶联的。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中，所述氧化剂选自过硼酸钠和过氧化氢。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中，所述初级增强剂是3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中，所述化学发光反应在8.0至10.0、优选8.3至9.3的pH下进行。
8.一种对于样品中的分析物进行印迹分析的方法，其中，所述方法采用权利要求1至7的任一项所述的增强由鲁米诺的化学发光反应产生的光发射的方法作为检测和定量所述分析物的手段。
9.一种对于样品中的分析物进行ELISA分析的方法，其中，所述方法采用权利要求1至7的任一项所述的增强由鲁米诺的化学发光反应产生的光发射的方法作为检测和定量所述分析物的手段。
10.用于进行确定样品中的分析物的分析的试剂盒，其中，所述试剂盒包括鲁米诺、氧化剂、电子介质形式的初级增强剂和唑形式的二级增强剂。
11.根据权利要求10的试剂盒，其中，鲁米诺存在于第一小瓶中，所述氧化剂存在于第二小瓶中，其中，所述初级增强剂和二级增强剂存在于第一小瓶中或第二小瓶中或者存在于两个小瓶中。
12.根据权利要求10或11的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括过氧化物酶。
13.根据权利要求10至12的任一项的试剂盒，其中，鲁米诺或所述过氧化物酶与能够结合分析物的配体偶联或适于与其偶联。
14.根据权利要求10至13的任一项的试剂盒，其中，所述二级增强剂选自咪唑、1-甲基咪唑、1，2，3-三唑和1，2，4-三唑。
15.根据权利要求12至14的任一项的试剂盒，其中，所述氧化物酶选自辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶和甘薯过氧化物酶。
16.根据权利要求10至15的任一项的试剂盒，其中，所述氧化剂选自过硼酸钠和过氧化氢。
17.根据权利要求10至16的任一项的试剂盒，其中，所述初级增强剂是3-(吩噻嗪-10-基)丙烷-1-磺酸钠。
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