ITTO20100580A1 - Metodo per incrementare e regolare l'emissione di luce da una reazione chemiluminescente - Google Patents

Metodo per incrementare e regolare l'emissione di luce da una reazione chemiluminescente Download PDF

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ITTO20100580A1
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peroxidase
chemiluminescent
luminol
enhancer
chemiluminescent reaction
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IT000580A
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Ciana Leopoldo Della
Rossana Perciaccante
Federica Rodeghiero
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Cyanagen S R L
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Description

"Metodo per incrementare e regolare l'emissione di luce da una reazione chemiluminescente"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Area dell’invenzione.
La presente invenzione concerne un nuovo metodo per aumentare e regolare l’emissione di luce generata da una reazione chemiluminescente che comprende luminolo, un enzima perossidasi, un ossidante ed un mediatore elettronico.
Stato dell’arte.
L’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalle perossidasi trova largo impiego nel campo dei saggi analitici di antigeni, anticorpi e acidi nucleici ed in particolare nei saggi di blotting come Dot Blots, Western Blots (per le proteine), Southern e Northern Blots (per gli acidi nucleici).
E’ noto che l’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalla perossidasi può essere resa più veloce ed efficiente aggiungendo un mediatore elettronico, o enhancer, come mostrato per esempio da L.J. Kricka in Clinical Chemistry 1991; 37:1472-1481; o da L.J. Kricka, J.C: Voyta e I. Bronstein in “Chemiluminescent Methods for Detecting and Quantitating Enzyme Activity†, Methods Enzymol. 2000;305:370-390. Molti composti sono stati usati come mediatori elettronici, quali luciferina, 6-idrossibenzotriazoli, p-iodofenoli, acidi p-cumarici (G.H.G. Thorpe and L. J. Kricka, Methods Enzymol.
1986;133:331); ammine aromatiche (U.S. Pat. No. 4,279,950); acetalinidi (Eur. Pat. Appl. No. 603953 (1994)); fenotiazine N-sostituite (U.S. Pat. No. 5,171,688); acidi boronici (U.S. Pat. No. 5,629,168). Si ritiene che, in presenza di un mediatore elettronico, l’ossidazione catalizzata dalla perossidasi procede secondo il seguente schema:
HRP H2O2à HRP-I (1)
HRP-I LH- à HRP-II L<∙->(2)
HRP-II LH- à HRP L<∙->(3)
HRP-I E à HRP-II E<∙->(4)
HRP-II E à HRP E<∙->(5)
E∙-+ LH- à E L<∙->(6)
L<∙->à L LH<->(7)
L H2O2à LO2<2->(8)
LO2<2->à AP<2->* (9)
AP<2->* à AP<2->+ hÎ1⁄2 (10)
dove HRP, HRP-I e HRP-II indicano l’enzima perossidasi rispettivamente nella forma nativa e nelle due forme ossidate; LH-, L<∙->, L e LO2<2->indicano rispettivamente il luminolo anione, il radicale anione luminolo, il diazachinone e il perossido di luminolo; E e E<∙->indicano il mediatore elettronico, o enhancer primario, e il suo radicale corrispondente; infine AP<2->indica il dianione dell’acido 3-aminoftalico e AP<2-*>il suo stato eccitato. Secondo questo schema, l’enzima perossidasi HRP viene ossidato a HRP-I dal perossido di idrogeno. L’anione del luminolo e l’enhancer primario sono ossidati da HRP-I ai loro rispettivi radicali con conversione dell’enzima alla forma HRP-II. HRP-II, a sua volta, ossida un’altra molecola di luminolo anione o dell’enhancer primario ai loro rispettivi radicali, rigenerando simultaneamente la forma nativa dell’enzima HRP, che può ricominciare il ciclo di ossidazione. L’aumento dell’emissione di luce osservato in presenza di un mediatore elettronico E à ̈ attribuito alla generazione più veloce dell’intermedio chiave L<∙->(S.B. Vlasenko, A.A. Arefeyev, A.D. Klimov, B.B. Kim, E.L. Gorovits, A.P. Osipov, E.M. Gavrilova, A.M. Yegorov, J. Biolumin. Chemilumin. 1989;4: 164-176). L<∙->, una volta formato, dismuta rapidamente a luminolo anione LH<->e diazachinone, L. Il diazachinone à ̈ suscettibile all’attacco nucleofilo al carbonio del carbonile (C=O) da parte del perossido con formazione del perossido di luminolo. Infine, il perossido di luminolo collassa a AP<2-*>, la forma eccitata del 3-amminoftalato, con espulsione simultanea di una molecola di azoto. Lo stato eccitato del 3-amminoftalato emette quindi un fotone blu a 425 nm.
Un ulteriore significante incremento nell’emissione di luce chemiluminescente à ̈ stato ottenuto attraverso l’uso di alcuni catalizzatori di acilazione (US Pat. Appl.
2008/0241686; E. Marzocchi, S. Grilli, L. Della Ciana, L. Prodi, M. Mirasoli, A. Roda, Anal. Biochem. 2008; 277:189-194). Questi composti, appartenenti alla classe delle 4amminopiridine, forniscono un ulteriore incremento dell’emissione solo se utilizzati in contemporanea con enhancer primari, tipo trasferimento elettronico. Questi composti, quindi, possono essere descritti come “enhancer secondari†(M. M. Vdovenko, L. Della Ciana, I. Yu. Sakharov, Anal. Biochem. 2009; 392:54-58).
I catalizzatori appartenenti alla classe delle 4-amminopiridine descritti in US Pat. Appl. 2008/0241686, se da un lato mostrano un effetto molto potente sull’efficienza della reazione chemiluminescente del luminolo, dall’altro sono difficili da regolare. Anche piccole quantità di questi composti producono un grande aumento del segnale. Inoltre, il segnale decade molto più velocemente che in loro assenza. Naturalmente sarebbe molto vantaggioso avere formulazioni capaci di dare un incremento del segnale in combinazione con una cinetica relativamente lenta di decadimento del segnale. Queste caratteristiche sono particolarmente importanti in test dove sono necessarie ripetute letture.
Per questo motivo, sarebbe estremamente vantaggioso rispetto allo stato dell’arte offrire enhancer secondari con un miglior grado di regolazione dell’amplificazione del segnale rispetto a quello ottenuto con le amminopiridine di US Pat. Appl. 2008/0241686.
OGGETTO E RIASSUNTO DELL’INVENZIONE.
L’oggetto della presente invenzione à ̈ la descrizione di un nuovo metodo per incrementare e regolare l’emissione di luce generata da una reazione chemiluminescente di luminolo, un enzima perossidasi, un ossidante ed un mediatore elettronico.
In accordo con l’invenzione, l’obbiettivo sopra descritto à ̈ raggiunto grazie alle composizioni specificate nelle seguenti rivendicazioni, le quali sono parte integrante della presente descrizione.
In una forma di attuazione, l’invenzione descrive l’uso, in composizioni chemiluminescenti, di un enhancer secondario appartenente alla classe degli N-azoli. Gli enhancer secondari di questa invenzione comprendono i seguenti N-azoli: imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo e 1,2,4-triazolo.
Si definisce un N-azolo un composto composti ciclico eteroaromatico azotati a 5 membri contenente almeno un altro atomo di azoto.
Sebbene la presente invenzione riguardi l’utilizzo in generale, e per qualsiasi scopo, dell’aumento dell’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente con i reagenti sopra indicati, à ̈ applicabile nell’ambito di un saggio.
Con il termine “saggio†si intende la rivelazione, la semiquantificazione e la quantificazione di un analita. Tipicamente, l’esecuzione di un saggio richiede di rapportare l’emissione di luce alla quantità di perossidasi utilizzata, in modo che la perossidasi costituisca la sostanza determinata direttamente. Sebbene la presente invenzione sia utilizzabile per determinare la presenza o la quantità di uno qualsiasi dei partner di reazione(luminolo, perossidasi, ossidante, mediatore elettronico, N-azolo come enhancer secondario), tale partner non à ̈ necessariamente la sostanza da determinare.
Ad esempio, l’ossidante può essere prodotto da una reazione precedente o da una serie di reazioni precedenti.
La perossidasi o il luminolo possono essere presenti in forma di coniugato di un anticorpo, utilizzato in un saggio immunoenzimatico per determinare un antigene; oppure la perossidasi o il luminolo possono essere presenti in forma di coniugato ad un nucleotide, un oligonucleotide o un acido nucleico nei saggi di ibridazione. Pertanto la presente invenzione à ̈ applicabile a qualsiasi metodo di saggio diagnostico di una sostanza, la cui presenza o quantità à ̈ rapportabile alla presenza o alla quantità di un partner di reazione selezionato dal gruppo costituito da luminolo, un enzima perossidasi, un ossidante, un enhancer primario e un azolo come enhancer secondario, i quali reagiscono in una reazione chemiluminescente, la cui emissione di luce à ̈ rilevata o misurata in modo che la presenza o la quantità della sostanza da analizzare sia rapportata alla produzione di luce. La presente invenzione include inoltre un kit per l’esecuzione di un saggio comprendente luminolo, un ossidante, un mediatore elettronico come enhancer primario ed un azolo come enhancer secondario.
L’invenzione sarà adesso descritta, esclusivamente a livello di esempio, con riferimento alle tavole allegate, dove:
FIG. 1 mostra un grafico del segnale chemiluminescente in funzione della concentrazione di vari enhancer secondari (MORP, imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo).
FIG. 2 mostra un grafico del segnale chemiluminescente (valore iniziale e decadimento percentuale del segnale dopo un periodo di 900 secondi) in funzione del pH con l’imidazolo come enhancer secondario.
FIG. 3 mostra un grafico del segnale chemiluminescente (valore iniziale e decadimento percentuale del segnale dopo un periodo di 900 secondi) in funzione del pH con 1-metilimidazolo come enhancer secondario.
FIG. 4 mostra un grafico del segnale chemiluminescente (valore iniziale e decadimento percentuale del segnale dopo un periodo di 900 secondi) in funzione del pH con 1,2,4-triazolo come enhancer secondario.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Gli enhancer secondari di questa invenzione includono in particolare i seguenti N-azoli: imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo e 1,2,4-triazolo. Questi composti sono particolarmente utili in saggi chemiluminescenti che richiedono un livello alto e costante di emissione di luce, come saggi di blotting, comprendenti Western, Southern e Northern blot, Dot Blot e saggi di ibridazione di acidi nucleici.
L’imidazolo à ̈ riconosciuto essere un catalizzatore per la chemiluminescenza del perossiossalato (T. Jonsson and K. Irgum, Anal. Chim. Acta 1999; 400:257-264; T. Jonsson and K. Irgum, Anal. Chem. 2000;72:1373-1380.) I sistemi decritti sopra, tuttavia, non sono paragonabili a quelli oggetto della corrente invenzione. Di conseguenza essi sono assegnati a classi differenti, come illustrato in K.D.
Gundermnann e F. McCapra, in “Chemiluminescence in Organic Chemistry†, Springer 1987, in particolare Class IV – Peroxalate Chemiluminescence rispetto a Class V – Luminolo e composti correlati. In particolare, à ̈ risaputo che certi ossalati organici reagiscono col perossido di idrogeno per produrre perossiossalati instabili, i quali decompongono immediatamente a CO2. Si aggiunge alla miscela un fluoroforo in grado di produrre chemiluminescenza iniziata chimicamente tramite scambio elettronico. I catalizzatori di acilazione, come imidazolo o 4-dimetilamminopiridina sono riconosciuti come catalizzatori della formazione di perossalati, incrementando quindi l’emissione di luce. Queste reazioni avvengono in solventi polari aprotici come acetonitrile e sono molto veloci, di solito complete nel giro di secondi. Questi sistemi, ovviamente, non sono utili per lo sviluppo di saggi immunoenzimatici.
La concentrazione dell’enhancer N-azolo à ̈ compresa generalmente nell’intervallo tra 0,001 e 200 mmol/litro, preferibilmente tra 0,1 mmol e 50 mmol/litro.
In tutti i casi la dipendenza del pH dell’iniziale emissione di luce segue una curva ben determinata. I risultati migliori in termini di emissione di luce iniziale sono ottenuti nell’intervallo di pH tra 8,3 e 8,6 per l’imidazolo e 1-metilimidazolo, FIG. 1 e 2, mentre per 1,2,4-triazolo l’optimum slitta a intervalli di pH più alti, FIG. 3.
D’altro canto, la stabilità del segnale, calcolata come diminuzione percentuale del segnale iniziale dopo 15 minuti, segue in tutti i casi una curva sigmoidale. Il punto di flesso della curva si colloca approssimativamente sugli stessi valori di pH del segnale iniziale.
La dipendenza dell’emissione iniziale di luce dalla concentrazione dell’enhancer secondario à ̈ riportato nel grafico di FIG. 4. In contrasto con l’incremento molto netto di emissione di luce osservata anche con concentrazioni molto basse di 4-morfolinopiridina (MORP), una tipica 4-amminopiridina, quando sono usati come enhancer secondari gli N-azoli, l’incremento di intensità di segnale osservato à ̈ molto graduale. Inoltre, mentre il MORP raggiunge il massimo effetto alla concentrazione di 6mM e poi mostra una caduta netta dell’effetto con un ulteriore aumento della concentrazione, gli N-azoli o mostrano un decadimento dell’effetto molto lenta ad altissime concentrazioni, come l’imidazolo, o tendono a raggiungere un plateau(imidazolo, triazolo).
Da questi dati risulta evidente che l’uso di enhancer secondari tipo N-azoli permette un miglior grado di controllo della reazione chemiluminescente in confronto alla classe, precedentemente nota, delle 4-amminopiridine. E’ possibile, attraverso l’uso di N-azoli, regolare finemente sia il segnale iniziale che la sua durata. Questa caratteristica ha un estremo valore in quanto permette di preparare substrati-HRP chemiluminescenti appropriati per uno specifico uso. Per esempio, può essere utile ottenere un incremento più moderato del segnale associato ad una maggiore durata per massimizzare la quantità di luce totale prodotta in una data finestra di esposizione. E’ quindi possibile ottimizzare un substrato chemiluminescente secondo il metodo di rivelazione, per esempio film rispetto a dispositivi elettronici quali i dispositivi chargedcoupled (CCD), con caratteristiche opposte.
Per quanto riguarda il meccanismo di reazione responsabile dell’effetto degli enhancer secondari, dovrebbe essere simile a quello suggerito per le 4-amminopiridine: attacco nucleofilo sul diazachinone, L, con produzione di un intermedio più reattivo verso il perossido di idrogeno. La differenza tra gli effetti osservati degli N-azoli e delle 4-amminopiridine può essere attribuita alla loro diversa nucleofilicità.
Per quanto riguarda gli altri componenti dei substrati enzimatici, si applicano le seguenti specifiche.
Il luminolo utilizzato dovrebbe avere una purezza adeguata ai saggi chemiluminescenti. Il luminolo può essere utilizzato in forma di sale sodico. La concentrazione utilizzata nel substrato chemiluminescente à ̈ generalmente tra 0,1 mmol/litro e 50 mmol/litro, preferibilmente tra 0,5 e 10 mmol/litro.
L’ossidante può essere qualsiasi sostanza capace di ossidare il luminolo con produzione di luce. E’ preferibile una sorgente di perossidi come perossido di idrogeno o sodio perborato. La concentrazione di ossidante utilizzata nel substrato chemiluminescente à ̈ tra 0,1 e 100 mmol/litro, preferibilmente tra 0,5 e 10 mmol/litro.
L’enhancer primario (mediatore elettronico) può essere qualsiasi substrato elettroattivo capace di agire come mediatore elettronico tra l’ossidante ed il luminolo. In particolare, enhancer appartenenti alle seguenti classi di composti: benzotiazoli, fenoli, ammine aromatiche,N-alchil fenotiazine, indofenoli, acidi arilboronici. Gli enhancer preferiti sono: p-iodofenoli, acido p-iodofenilboronico, sali di acido 3-(fenotiazino-10-il)propan-1-sulfonico o acido 4-(fenotiazino-10-il)butan-1-sulfonico. Gli enhancer primari devono essere di adeguata purezza per l’utilizzo in saggi chemiluminescenti; in particolare non devono contenere impurezze che possano inibire la reazione chemiluminescente. La concentrazione dell’enhancer primario utilizzata nel saggio chemiluminescente in accordo con questa invenzione à ̈ tra 0,001 e 20 mmol/litro, preferibilmente tra 0,1 e 10 mmol/litro.
L’enzima perossidasi à ̈ qualsiasi perossidasi disponibile per utilizzo in saggi di luminescenza. In particolare, può essere la perossidasi del rafano (HRP), ad esempio il tipo SIGMA VIA o IX. Può anche essere una perossidasi anionica, ad esempio la perossidasi della soia o della patata dolce. La perossidasi può essere libera o coniugata ad un legante, un biopolimero o una fase solida.
Le reazioni chemiluminescenti di questa invenzione sono applicabili alla rivelazione e quantificazione di analiti, utilizzando per esempio la formazione di un legame tra una proteina o un acido nucleico con una membrana e la perossidasi come tracciante. La reazione chemiluminescente à ̈ iniziata aggiungendo il substrato chemiluminescente alla membrana. L’emissione di luce à ̈ prolungata e può essere misurata tramite film, fotocamera o altra strumentazione.
Il substrato chemiluminescente, composto da luminolo, una sorgente di perossido, un enhancer primario ed un N-azolo come enhancer secondario può essere convenientemente formulato in forma di kit, come noto nell’arte. In particolare, il luminolo e la perossidasi sono formulate come soluzioni separate, A e B, in modo da prolungare la loro shelf life. Gli enhncer primari e secondari, così come gli altri additivi quali chelanti o stabilizzanti, possono essere aggiunti indistintamente alla soluzione di luminolo o perossido o ad entrambe. Le due soluzioni del kit contengono anche sostanze tamponanti e sono formulate in modo tale che, dopo miscelamento, il substrato chemiluminescente, o la “working solution†, raggiunga il valore di pH ottimale.
Il saggio chemiluminescente basato sul substrato di questa invenzione include saggi Dot Blot e Western Blot per le proteine e saggi Southern e Northern Blot per gli acidi nucleici. Un’altra importante applicazione del substrato chemiluminescente di questa invenzione à ̈ nei saggi immunoenzimatici ELISA, specialmente per gli analiti presenti in quantità estremamente ridotta, quali i marcatori tumorali, gli ormoni tiroidei , le proteine virali (HIV, HCV) e gli ormoni steroidei (estradiolo, aldosterone).
Esempi
I seguenti esempi intendono illustrare specifici aspetti dell’invenzione, ma non a titolo limitativo.
Naturalmente, mentre il principio dell'invenzione rimane lo stesso, i dettagli di costruzione e le implementazioni possono variare notevolmente rispetto a quanto à ̈ stato descritto e illustrato a titolo di esempio, senza uscire dal campo di applicazione della presente invenzione.
Tutti i reagenti utilizzati per questa applicazione sono stati acquistati da Sigma-Aldrich.
Tutte le misurazioni riportate in Esempi sono state effettuate con uno spettrofluorimetro Varian Eclipse con le seguenti impostazioni: bio/mode chemiluminescenza; lunghezza d’onda d’emissione: 425 nm; fessura di emissione: 20 nm; voltaggio del fotomoltiplicatore: medio.
Esempio 1
Dipendenza dal pH dell’imidazolo sulla reazione luminolo-perossido di sodio-3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato-perossidasi
Un substrato chemiluminescente à ̈ stato preparato con la seguente composizione:
[sale di sodio luminolo] = 5 mM
[sodio perborato]= 4 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-yl)propano-1-sulfonato] = 3 mM
[imidazolo] = 10 mM
In 0,15 mM tampone di Tris, pH 9,0
Sono state preparate una serie di cuvette in polimetilmetacrilato usa e getta, ciascuna contenente 2 ml di soluzione di substrato. Per ogni cuvetta sono state aggiunte piccole quantità di 5 M HCl o 5 M NaOH, al fine di regolare il pH nell’intervallo 8,00 – 10,00 senza produrre alcun cambiamento significativo del volume totale. Per ogni provetta sono state aggiunte 10 µl di 2 Î1⁄4g/mL soluzione perossidasi (HRP-tipo VIA) e contemporaneamente viene fatto partire il conto alla rovescia di 30 secondi. La cuvetta à ̈ chiusa con un pezzo quadrato di parafilm e agitato per 3 secondi. La cuvetta viene poi inserita nel fluorimetro. Terminato il conto alla rovescia di 30 secondi à ̈ stata avviata la misurazione del segnale luminescente e registrato per un tempo di 900 secondi. In tutti i casi il segnale raggiunge un livello di plateau entro 30 secondi dopo l’aggiunta della perossidasi, e poi comincia a diminuire lentamente. L’intensità del segnale iniziale così come la percentuale del segnale di decadimento in funzione del pH sono stati riportati in un grafico per i primi 900 secondi in FIG.1.
Esempio 2
Dipendenza dal pH dell’1-metilimidazolo sulla reazione luminolo-perossido di sodio-3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato-perossidasi
Un substrato chemiluminescente à ̈ stato preparato con la seguente composizione:
[sale di sodio luminolo] = 5 mM
[sodio perborato]= 4 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 3 mM
[1 metilimidazolo] = 10 mM
In 0,15 mM tampone di Tris, pH 9,0
E’ stata usata la stessa procedura sperimentale descritta nell’esempio 1. L’intensità del segnale iniziale così come la percentuale del segnale di decadimento in funzione del pH sono stati riportati i un grafico per i primi 900 secondi in FIG.2.
Esempio 3
Dipendenza dal pH dell’1,2,4 triazolo sulla reazione luminolo-perossido di sodio-3-(fenotiazina-10-yl) propano-1-sulfonato-perossidasi
Un substrato chemiluminescente à ̈ stato preparato con la seguente composizione:
[sale di sodio luminolo] = 5 mM
[sodio perborato]= 4 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 3 mM
[1,2,4 triazolo] = 10 mM
In 0,15 mM tampone di Tris, pH 9,00
E’ stata usata la stessa procedura sperimentale descritta nell’esempio 1. L’intensità del segnale iniziale così come la percentuale del segnale di decadimento in funzione del pH sono stati riportati in un grafico per i primi 900 secondi in FIG.3.
Esempio 4
Dipendenza della reazione sodio 3-(fenotiazina-10il)propan-1-sulfonato luminolo-perossido-perossidasi sulla concentrazione di enhancer secondari.
Una serie di substrati chemiluminescenti in 0,15 M tampone di Tris, pH 9,00 ± 0,05, sono stati preparati alle seguenti composizioni:
[sale di sodio luminolo] = 5 mM
[sodio perborato]= 4 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 3 mM
Enhancer secondari = MORP, imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo, 1,2,4-triazolo alle seguenti concentrazioni:
[MORP] = 0,025 mM, 0,05 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1,5 mM, 3 mM , 5 mM, 6,5 mM, 8 mM, 10 mM.
[imidazole] = 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 35 mM, 45 mM, 75 mM
[1-methylimidazole] = 1,5 mM, 3 mM, 5 mM, 15 mM, 25 mM, 35 mM, 45 mM, 75mM.
[1,2,3-triazole] = 3 mM, 25 mM, 55 mM, 85 mM.
[1,2,4-triazole] = 1,5mM, 3 mM, 5 mM, 25 mM, 45 mM, 55 mM, 75 mM, 85 mM
Sono state preparate una serie di cuvette in polimetilmetacrilato usa e getta, ciascuna contenente 2 ml di soluzione di substrato. Per ogni cuvetta sono state aggiunte piccole quantità di 5 M HCl o 5 M NaOH, al fine di regolare il pH nell’intervallo 8,00 – 10,00 senza produrre alcun cambiamento significativo del volume totale. Per ogni provetta sono state aggiunte 10 µl di 2 Î1⁄4g/mL soluzione per ossidasi (HRP-tipo VIA) e contemporaneamente viene fatto partire il conto alla rovescia di 30 secondi. La cuvetta à ̈ chiusa con un pezzo quadrato di parafilm e agitato per 3 secondi. La cuvetta viene poi inserita nel fluorimetro. Terminato il conto alla rovescia di 30 secondi à ̈ stata avviata la misurazione del segnale luminescente e registrato per un tempo di 900 secondi. In tutti i casi il segnale raggiunge un livello di plateau entro 30 secondi dopo l’aggiunta della per ossidasi, e poi comincia a diminuire lentamente. Le intensità iniziali dei segnali fino al livello di plateau in funzione della concentrazione dell’enhancer secondario sono stati riportati in un grafico FIG.4. Come si può notare, l’effetto del MORP sull’intensità del segnale à ̈ molto forte anche a concentrazioni molto basse. L’intensità del segnale raggiunge un massimo netto a circa 1,5 mM di MORP e poi cade di colpo. Al contrario gli N-azoli esercitano un effetto molto più graduale sull’intensità del segnale, raggiungendo il plateau a livelli di concentrazioni molto più alte. Pertanto questi offrono un notevole grado di regolazione del flusso luminoso chemiluminescente, che non può essere ottenuto con gli enhancer secondari di alchilamminopiridine come il MORP.
Esempio 5
Substrati per la misurazione della perossidasi per mezzo della Chemiluminescenza
Per garantire la stabilità a lungo termine, i componenti del substrato chemiluminescente possono essere forniti come soluzioni separate che, quando necessario, possono essere mescolati per produrre una soluzione di lavoro. Per esempio, una soluzione di lavoro per la misurazione della perossidasi può essere ottenuta miscelando parti uguali delle seguenti soluzioni:
Substrato (1)
Solution A:
[sale sodio luminolo] = 2 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 0,3 mM [imidazolo] = 0,25 mM
In 0,10 mM tampone di Tris, pH 9,6
Soluzione B:
[sodio perborato] = 8 mM
In 50 mM tampone di acetato, pH 5,0
Il pH della soluzione di lavoro, dopo la miscelazione di Soluzione A e B Ã ̈ 9,00.
Substrato (2)
Soluzione A:
[sale sodio luminolo] = 10 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 1,5 mM [imidazolo] = 1,0 mM
In 0,25 mM tampone di Tris, pH 9,6
Soluzione B:
[sodio perborato] = 8 mM
In 50 mM tampone di acetato, pH 5,0
Il pH della soluzione di lavoro, dopo la miscelazione di Soluzione A e B Ã ̈ 9,00.
Substrato (3)
Soluzione A:
[sale sodio luminolo] = 10 mM
[sodio 3-(fenotiazina-10-il)propan-1-sulfonato] = 6 mM
[imidazolo] = 40 mM
In 0,30 mM tampone di Tris, pH 9,6
Soluzione B:
[sodio perborato] = 8 mM
In 50 mM tampone di acetato, pH 5,0
Il pH della soluzione di lavoro, dopo la miscelazione di Soluzione A e B Ã ̈ 8,6.
Esempio 6
Saggio Western Blot su Akt Totale.
Per i metodi dei saggi blotting usati, decsritti da H. Towbin ed altri Proc. Acad. Sci. 76, 4350-4353 (1979), diluizioni seriali di lisati di cellule C2C12 sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide sodio dodecilsulfato (SDS) 12%. Il gel à ̈ stato trasferito su una membrana di nitrocellulosa per Wester Blot. I siti di legame non specifici sono stati bloccati con una soluzione di latte in polvere al 5% per un’ ora e poi lavati più volte con un tampone di lavaggio (20 mM Tris, 137 mM NaCl). I blots sono stati poi incubati con l’anticorpo primario (rabbit anti-total AKT, diluizione 1:20000) per un’ora, poi lavati come descritto sopra per rimuovere l’anticorpo non legato all’antigene. La membrana con il blot à ̈ stata incubata per un’ora con l’anticorpo secondario marcato con HRP (goat anti-rabbit, diluizione 1:100000). E’ stata preparata una soluzione di lavoro, secondo l’esempio 5, Substrato (2). La soluzione di lavoro à ̈ stata poi aggiunta alla membrana ed incubata per cinque minuti. Il segnale chemiluminescente à ̈ stato acquisito usando un film autoradiografico con un’esposizione di un minuto. I risultati ottenuti sono comparabili a quelli ottenuti utilizzando un substrato chemiluminescente commerciale (SuperSignal Dura, ThermoScientific).
Esempio 7
Saggio ELISA della Tiroglobulina umana
Questo saggio immunometrico à ̈ basato sulla reazione immunochimica tra anticorpo di cattura, antigene (tiroglobulina umana, Tg) e anticorpo marcato con la perossidasi della soia (SbP). Sono sati preparati dei pozzetti con l’anticorpo di cattura incubando delle piastre per microtitolazione rivestite di strptavidina con una soluzione di anticorpo di cattura biotilinato. I pozzetti sono poi stati incubati con i calibratori di tiroglobulina (Tg) di un kit commerciale. Dopo un periodo di incubazione di un’ora a 37° C, la piastra à ̈ stata lavata con PBS-0,05% Tween®-20. A ciascun pozzetto poi sono stati aggiunti 200 Î1⁄4L di una soluzione di anticorpo anti-Tg coniugato con la perossidasi. I pozzetti sono stati poi incubati a temperatura ambiente per un’ora e successivamente lavati per rimuovere l’eccesso di coniugato. Una soluzione di lavoro chemiluminescente, preparata come descritto nell’esempio 5, Substrato 3, à ̈ stata aggiunta ai pozzetti e si à ̈ lasciato in incubazione per dieci minuti. E’ stato ottenuto un limite di rilevabilità per la Tg di 0,2 ng/mL, valore identico a quello ottenuto con un kit commerciale basato su un sistema di rivelazione fosfatasi alcalina/diossetano.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per aumentare l’emissione luminosa prodotta dalla reazione chemiluminescente del luminolo, un enzima perossidasi , un ossidante ed un enhancer primario caratterizzato dal fatto che la reazione chemiluminescente avviene in presenza di un enhancer secondario.
  2. 2. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enhancer secondario à ̈ selezionato dalla classe chimica degli N-azoli, classe di composti ciclici eteroaromatici azotati a 5 membri contenenti almeno un altro atomo di azoto.
  3. 3. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enhancer secondario à ̈ selezionato tra imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo e 1,2,4-triazolo.
  4. 4. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enzima perossidasi à ̈ selezionato tra la perossidasi del rafano (HRP), la perossidasi della soia e la perossidasi della patata dolce.
  5. 5. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la suddetta perossidasi à ̈ libera o coniugata ad un legante.
  6. 6. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il suddetto ossidante à ̈ selezionato tra il sodio perborato ed il perossido di idrogeno.
  7. 7. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l’enhancer primario à ̈ il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan -1-sulfonato.
  8. 8. Un metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la reazione chemiluminescente à ̈ condotta a pH tra 8,0 e 10,0.
  9. 9. Un metodo per eseguire un saggio blot di un analita in un campione, caratterizzato dal fatto che il metodo comprende una reazione chemiluminescente secondo le rivendicazioni 1-8 come mezzo di rivelazione e quantificazione del suddetto analita.
  10. 10. Un metodo per eseguire un saggio ELISA di un analita in un campione, caratterizzato dal fatto che il metodo comprende una reazione chemiluminescente secondo le rivendicazioni 1-8 come mezzo di rilevazione e quantificazione del suddetto analita.
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