IT201900000959A1 - Substrati chemiluminescenti ultra-sensibili per perossidasi - Google Patents

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Lorenzo BIAGINI
Thomas Paul Jansen
Rossana Perciaccante
Manuela Vargiolu
Marina Eleonora Vettraino
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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“SUBSTRATI CHEMILUMINESCENTI ULTRA-SENSIBILI PER PEROSSIDASI”
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell’invenzione
La presente invenzione riguarda un substrato chemiluminescente per il dosaggio delle perossidasi in un saggio per la determinazione di un analita in un campione, dove il substrato chemiluminescente consente la rivelazione quantitativa della perossidasi con una sensibilità molto elevata.
Tecnica di Sfondo
L’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dalla perossidasi di rafano (HRP) trova ampio impiego in test analitici di antigeni, anticorpi e acidi nucleici, e, in particolare, in test di blotting, ad es. Dot Blot, Western Blot (proteine), Southern e Northern Blot (acidi nucleici).
È noto che l’ossidazione chemiluminescente del luminolo catalizzata dall’HRP può essere resa più rapida ed efficiente aggiungendo un mediatore di elettroni, o enhancer (potenziatore), come mostrato, ad es., da Kricka LJ (1991), Clinical Chemistry, 37:1472-1481; o da Kricka LJ, Voyta JC e Bronstein I in “Chemiluminescent Methods for Detecting and Quantitating Enzyme Activity” (2000), Methods Enzymol; 305:370-390.
Il meccanismo della reazione di chemiluminescenza potenziata (ECL), in cui il luminolo e un enhancer sono ossidati simultaneamente, è stato descritto come segue [Lind J, Merenyi G, e Eriksen TE (1983), J Am Chem Soc, 105: 7655-7661]. Nella prima fase dell’ECL, l’enhancer (E), che è un substrato più attivo per l’HRP rispetto al luminolo, viene ossidato dal perossido di idrogeno in presenza di HRP secondo un meccanismo “ping-pong”:
dove E è un enhancer, E<● >è un prodotto radicalico dell’ossidazione per perdita di un elettrone dell’enhancer, HRP è l’enzima della perossidasi di rafano nel suo stato di riposo Fe(III), HRP-I e HRP-II sono gli intermedi ossidati della perossidasi che si trovano al di sopra dello stato di riposo rispettivamente di due equivalenti di ossidazione e di un equivalente di ossidazione. Successivamente, il prodotto radicalico dell’enhancer (E<●>) reagisce in maniera reversibile con una molecola di luminolo (LH-) [Easton PM, Simmonds AC, Rakishev A, Egorov AM, e Candeias LP (1996), J Am Chem Soc; 118:6619-6624]:
Termodinamicamente, la posizione dell’equilibrio redox (4) è determinata dalla differenza tra i potenziali di riduzione dell’enhancer e i radicali luminolo nelle condizioni dell’esperimento. Una volta formati, due radicali luminolo (L<●->) dismutano in un anione luminolo, (LH-) e una molecola di diazachinone (L):
L’intermedio diazachinone (L) reagisce con perossido di idrogeno con formazione di un perossido di luminolo (LO2<2-)>, che collassa nello stato eccitato di 3-amminoftalato ([AP<2->]*) con espulsione di azoto molecolare; [AP<2->]* poi ritorna allo stato fondamentale (AP<2->) con emissione di un fotone (h v) a 425 nm:
L’intensità della luce emessa è proporzionale al quadrato della velocità di generazione di radicali luminolo (L<●->). La relazione quadratica è una conseguenza del meccanismo di generazione della specie eccitata, che comporta la dismutazione di due radicali luminolo, Equazione 5. A sua volta, la velocità di generazione di radicali luminolo è data dalla velocità di turnover dell’enzima, gravata dalla frazione di radicali generati che portano a radicali luminolo (L<●->) dopo l’equilibrio redox (4). La velocità di turnover dell’enzima è regolata dal ratedetermining step (stadio lento), la riduzione di HRP-II a enzima ferrico (HRP), Equazione (3). In conclusione, il potenziamento della chemiluminescenza può essere descritto con buona approssimazione considerando (a) l’accelerazione del turnover dell’enzima per reazione dell’enhancer con HRP-II e (b) la reazione reversibile di trasferimento di elettroni tra il radicale dell’enhancer e il luminolo.
Un certo numero di composti è stato utilizzato con successo nel potenziamento della chemiluminescenza indotta da HRP tra cui luciferina, 6-idrossibenzotriazoli, piodofenoli, acido p-cumarico e altri enhancer fenolici (Thorpe GHG e Kricka LJ (1986), Methods Enzymol; 133:331); ammine aromatiche (Brevetto U.S. n. 4.279.950); acetanilidi (Domanda di Brevetto Europeo 603953); fenotiazine N-sostituite (Brevetto U.S. n. 5.171.688 e Brevetto U.S Brevetto U.S. n. 6.432.662); acidi boronici (Brevetto U.S. n. 5.629.168).
Una limitazione fondamentale in termini di emissione di luce chemiluminescente dei substrati a base di luminolo riguarda la sua resa quantica di luminescenza relativamente bassa, Eq.(6). Per questo motivo sono stati sviluppati diversi analoghi del luminolo, in particolare 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, noto anche come L-012 (Domanda di Brevetto Europeo n. 491477), con la seguente struttura chimica:
Così, in saggi chemiluminescenti per perossidasi di rafano potenziati da p-iodofenolo e boronato, questo composto ha mostrato un aumento dell’emissione di luce fino a 10 volte superiore rispetto al luminolo [Ji X, Kondo K, Aramaki Y, e Kricka LJ (1996) J Biolumin Chemilumin; 11:1-7].
Più recentemente, diversi composti appartenenti alla classe delle lofine sono stati testati come enhancer in substrati con 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione. In particolare, con 2-(4-idrossifenil)-4,5-di(2-piridil)imidazolo come enhancer, la sensibilità del sistema di chemiluminescenza è risultata 20 volte superiore a quella del sistema convenzionale con luminolo potenziato in cui si usa 4-iodofenolo [Ichibangase T, Ohba Y, Kishikawa N, Nakashima K, e Kuroda N (2014) Luminescence 29:118-121].
Tuttavia, recenti sviluppi nella tecnologia basata sul luminolo hanno portato a substrati chemiluminescenti per HRP almeno altrettanto sensibili rispetto a quelli basati su L-012 [Brevetto U.S. n. 7803573 (2010), Brevetto U.S. n. US 9040252 (2015)].
Pertanto, data la maggiore efficienza di chemiluminescenza del composto chemiluminescente L-012 rispetto al luminolo, esiste ancora un ampio potenziale per aumentare ulteriormente la sensibilità di rivelazione di un enzima perossidasi.
SCOPO E SINTESI DELL’INVENZIONE
Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire un substrato chemiluminescente ultra-sensibile per la determinazione quantitativa di un enzima perossidasi in saggi per la rivelazione di un analita in un campione.
Secondo l’invenzione, lo scopo di cui sopra si ottiene grazie ai kit specificati nelle conseguenti rivendicazioni, che sono intese come parte integrante della presente descrizione.
Secondo una forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un kit per eseguire un saggio per la determinazione di un analita in un campione, in cui il kit comprende 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin1,4(2H,3H)-dione, un ossidante a base di perossido, un enhancer e un co-enhancer, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il co-enhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina e un N-azolo.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente dell’8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un enzima perossidasi, un enhancer, un co-enhancer e un ossidante a base di perossido, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il co-enhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina o un N-azolo.
Secondo ancora un’ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un procedimento per eseguire un saggio chemiluminescente per la rivelazione un analita in un campione, in cui il procedimento impiega il kit qui descritto.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
L’invenzione sarà ora descritta, solo a titolo di esempio, con riferimento ai disegni allegati, in cui:
- La Figura 1 mostra le strutture di N-alchilfenotiazine anioniche come enhancer della presente invenzione.
- La Figura 2 mostra un grafico della dipendenza dal pH del segnale chemiluminescente per il sistema L-012/perossido/SPTZ.
- La Figura 3 mostra un grafico a barre del segnale chemiluminescente iniziale dei substrati L-012/perborato potenziati da SPTZ e CPTZ in presenza di co-enhancer imidazolo (IMDZ), 1-metilimidazolo (MIMDZ), 1,2,3-triazolo (TRIAZ), 4-morfolinopiridina (MORP), 4dimetilamminopiridina (DMAP) e 4-pirrolidinopiridina (PPY). - La Figura 4 mostra la dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di L-012 nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 5 mostra la dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di SPTZ nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 6 mostra la dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di MORP nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 7 mostra la dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di perborato nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 8 mostra la dipendenza dal pH del segnale chemiluminescente nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 9 mostra la dipendenza dal pH del segnale chemiluminescente nel substrato L-012/perborato/SPTZ/imidazolo.
- La Figura 10 mostra la dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di imidazolo nel substrato L-012/perborato/SPTZ/MORP.
- La Figura 11 mostra un confronto tra il segnale chemiluminescente iniziale nei substrati luminolo/perborato/SPTZ e L-012/perborato/SPTZ in assenza e in presenza dei co-enhancer MORP e imidazolo.
- La Figura 12 mostra un grafico del segnale chemiluminescente in funzione della quantità di perossidasi di rafano (HRP) per i substrati L012/B3 e Luminolo/A3.
- La Figura 13 mostra Western Blot di IKBα umano ottenuto con il substrato L012/B3 e un substrato a base di luminolo, Westar Supernova.
- La Figura 14 mostra una curva dose-risposta di un saggio ELISA per HDAC-1 umana per il substrato L012/B3 e un substrato a base di Luminolo, SuperSignal Femto ELISA.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Nella descrizione che segue, vengono forniti numerosi dettagli specifici per consentire una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o più dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere certi aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a “un’unica forma di realizzazione” o “una forma di realizzazione” significa che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione è incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni “in un’unica forma di realizzazione” o “in una forma di realizzazione” in vari punti della presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in modo appropriato in una o più forme di realizzazione.
I titoli qui forniti sono solo per comodità e non interpretano l’ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
La presente invenzione riguarda un kit per l’esecuzione di un saggio per la determinazione di un analita in un campione, in cui il kit comprende 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un ossidante a base di perossido, un enhancer e un co-enhancer, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il coenhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina e un N-azolo.
In una forma di realizzazione, la N-alchilfenotiazina anionica è scelta dal gruppo costituito da acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propan-1-solfonico (SPTZ), acido 4-(10H-fenotiazin-10-il)butan-1-solfonico (SBTZ), acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propanoico (CPTZ) e acido 4-(10H-fenotiazin-10-il)butanoico (CBTZ) e loro sali. Le strutture chimiche di queste N-alchilfenotiazine sono mostrate in Fig. 1.
I co-enhancer della presente invenzione appartengono a due diverse classi di composti, le 4-dialchilamminopiridine (come descritto in US 7.803.573) e gli N-azoli (come descritto in US 9.040.252). Tra le 4-dialchilamminopiridine, i composti preferiti sono la 4-morfolinopiridina (MORP), la 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e la 4-pirrolidinopiridina (PPY). Tra gli N-azoli, i composti preferiti sono l’imidazolo e l’1-metilimidazolo.
Un co-enhancer, o enhancer secondario, è definito come un composto, che di per sé non ha alcun effetto di potenziamento sulla reazione chemiluminescente del luminolo o dei suoi analoghi, mentre aumenta l’emissione di luce quando usato in congiunzione con un enhancer, vedi Marzocchi E, Grilli S, Della Ciana L, Prodi L, Mirasoli M e Roda A (2008) Anal Biochem, 377: 189-194; Vdovenko MM, Della Ciana L e Sakharov IY (2009) Anal Biochem, 392: 54-58. L’aumento dell’emissione di luce è stato attribuito a un corrispondente aumento del turnover dell’enzima perossidasi, vedi Sakharov IY e Vdovenko MM (2013) Anal Biochem, 434: 12-14.
L’ossidante a base di perossido secondo la presente invenzione può essere perossido di idrogeno, o qualsiasi complesso di perossido di idrogeno, che - dopo la dissoluzione in soluzione acquosa - rilascia perossido di idrogeno, come perborati, percarbonati o il complesso di urea/perossido di idrogeno in un rapporto molare uguale a 1:1. In una forma di realizzazione preferita, l’ossidante a base di perossido è scelto tra perossido di idrogeno, complesso di urea/perossido di idrogeno, un sale di perborato, un sale di percarbonato.
In un’ulteriore forma di realizzazione, il kit comprende inoltre un enzima perossidasi.
L’enzima perossidasi è una qualsiasi perossidasi adatta per l’uso in saggi di chemiluminescenza. Secondo una forma di realizzazione, l’enzima perossidasi è scelto tra perossidasi di rafano (per esempio Sigma tipo VIA o IX), o una perossidasi anionica, come la perossidasi di soia e la perossidasi di patata dolce.
L’enzima perossidasi può essere coniugato o non coniugato con un reagente di rivelazione per l’analita da rivelare. L’enzima perossidasi (o il suo coniugato) può essere aggiunto dall’utilizzatore finale.
In una forma di realizzazione, il kit comprende 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un ossidante a base di perossido, un enhancer e un co-enhancer, in cui 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione è presente in un primo flacone e l’ossidante a base di perossido è presente in un secondo flacone, e in cui l’enhancer e il co-enhancer sono presenti nel primo flacone o nel secondo flacone o in entrambi i flaconi. I reagenti del kit sono presenti nei flaconi sia allo stato liquido che allo stato solido. Se i reagenti del kit sono allo stato solido, possono essere presenti sotto forma di polvere o compresse e devono essere ricostituiti in una fase liquida mediante aggiunta di acqua o di una soluzione tampone al momento dell’uso.
L’8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione e l’ossidante a base di perossido sono meglio formulati in flaconi diversi, in modo da prolungare il loro tempo di conservazione. Gli enhancer e i co-enhancer, così come altri additivi, come chelanti e stabilizzanti, possono essere aggiunti ai flaconi di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione o di ossidante a base di perossido, o entrambi. I due flaconi contengono anche sostanze tampone che, dopo la miscelazione, generano un substrato chemiluminescente, o “Soluzione di Lavoro”, con un valore di pH adatto all’esecuzione del saggio.
L’enzima perossidasi o un suo coniugato - se presente nel kit - non viene conservato insieme al suo componente substrato (cioè l’ossidante a base di perossido), ma in un terzo flacone.
In una forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un enzima perossidasi o un suo coniugato, un enhancer, un coenhancer e un ossidante a base di perossido, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il coenhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina o un N-azolo.
In una forma di realizzazione, la N-alchilfenotiazina anionica è scelta dal gruppo costituito da acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propan-1-solfonico, acido 4-(10H-fenotiazin-10-il)butan-1-solfonico, acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propanoico e acido 4-(10H-fenotiazin-10il)butanoico e loro sali.
In una forma di realizzazione, il co-enhancer è scelto tra imidazolo, 1-metilimidazolo, 4-morfolinopiridina (MORP), 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 4-pirrolidinopiridina (PPY).
In una forma di realizzazione, l’enzima perossidasi viene scelto tra perossidasi di rafano, perossidasi di soia e perossidasi di patata dolce.
In una forma di realizzazione, l’ossidante a base di perossido è scelto tra perossido di idrogeno, complesso di urea e perossido di idrogeno in un rapporto molare 1:1, un sale di perborato, un sale di percarbonato.
Il procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H,3H)-dione viene eseguito preparando un substrato chemiluminescente miscelando insieme 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, l’enhancer, il co-enhancer e l’ossidante a base di perossido, e aggiungendo successivamente l’enzima perossidasi o un suo coniugato al substrato chemiluminescente.
Secondo una forma di realizzazione, la concentrazione del composto chemiluminescente, 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, nel substrato chemiluminescente è compresa tra 0,01 mM e 1 mM, preferibilmente tra 0,05 e 0,5 mM.
Secondo una forma di realizzazione, la concentrazione dell’enhancer N-alchilfenotiazina anionica nel substrato chemiluminescente è compresa tra 0,1 e 10 mM, preferibilmente tra 0,5 e 5 mM.
Secondo una forma di realizzazione, la concentrazione del co-enhancer nel substrato chemiluminescente è compresa tra 0,1 e 100 mM, preferibilmente tra 0,5 e 50 mM.
Secondo una forma di realizzazione, la concentrazione del perossido nel substrato chemiluminescente è compresa tra 0,1 e 10 mM, preferibilmente tra 0,5 e 8 mM.
Secondo una forma di realizzazione, il pH del substrato chemiluminescente è compreso tra 5,0 e 9,0, preferibilmente tra 6,0 e 8,5.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il substrato chemiluminescente, avente un pH compreso tra 5,0 e 9,0, preferibilmente tra 6,0 e 8,5, contiene:
i) 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione ad una concentrazione tra 0,01 mM e 1 mM, preferibilmente tra 0,05 e 0,5 mM;
ii) l’enhancer N-alchilfenotiazina anionica ad una concentrazione tra 0,1 e 10 mm, preferibilmente tra 0,5 e 0,5 mM;
iii) il co-enhancer ad una concentrazione tra 0,1 e 100 mM, preferibilmente tra 0,5 e 50 mM;
iv) l’ossidante a base di perossido ad una concentrazione tra 0,1 e 10 mM, preferibilmente tra 0,5 e 8 mM.
I substrati chemiluminescenti L-012 potenziati con SPTZ secondo la presente descrizione producono un segnale chemiluminescente circa tre volte più alto di un substrato luminolo/SPTZ ottimizzato, come mostrato nell’Esempio 1, Fig. 2.
Gli Esempi da 3 a 11 illustrano l’effetto dell’aggiunta di co-enhancer a substrati chemiluminescenti basati su L-012 potenziati con N-alchilfenotiazine anioniche in presenza di un co-enhancer scelto tra 4-dialchilamminopiridine e N-azoli.
Sorprendentemente, l’effetto dei co-enhancer nei substrati chemiluminescenti basati su L-012 è considerevolmente più alto che nei substrati chemiluminescenti basati su luminolo. Il segnale chemiluminescente di un substrato Luminolo/SPTZ ottimizzato aumenta di otto volte dopo l’aggiunta di imidazolo come coenhancer, mentre MORP produce un aumento di dieci volte del segnale. Al contrario, l’inclusione di questi co-enhancer nei substrati chemiluminescenti basati su L-012/SPTZ aumenta l’emissione del segnale di circa 40 volte (imidazolo) e 23 volte (MORP), come mostrato nell’Esempio 10, e nella Fig. 11. Di conseguenza, i substrati chemiluminescenti basati su L-012 secondo la presente descrizione raggiungono un livello di segnale di un ordine di grandezza (7-12x) più elevato rispetto al più potente e noto substrato basato su luminolo.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un procedimento per l’esecuzione di un saggio chemiluminescente per la rivelazione di un analita in un campione, in cui il procedimento impiega il kit qui descritto.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione riguarda un procedimento per l’esecuzione di un saggio chemiluminescente per la rivelazione di un analita in un campione, in cui il procedimento utilizza un procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione come qui descritta come mezzo di rivelazione dell’analita.
Il termine “saggio” indica la rivelazione, la semiquantificazione e la quantificazione di un analita. Tipicamente, l’implementazione di un saggio richiede di mettere in relazione l’emissione di luce con la quantità di perossidasi utilizzata. L’emissione di luce viene così rivelata o misurata in modo che la presenza o la quantità di analita sia correlata alla produzione di luce.
Secondo la presente descrizione, l’implementazione di un saggio richiede di mettere in relazione l’emissione di luce generata dalla reazione chemiluminescente di un composto chemiluminescente con un enzima perossidasi, un enhancer, un co-enhancer e un ossidante a base di perossido con la quantità di uno qualsiasi dei partner di reazione (cioè uno qualsiasi tra (8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, l’enzima perossidasi, l’ossidante a base di perossido, l’enhancer, e il coenhancer). Secondo una forma di realizzazione preferita, l’emissione di luce è correlata alla quantità dell’enzima perossidasi usato.
Nell’eseguire il saggio per la rivelazione dell’analita di interesse (in modo qualitativo o quantitativo), l’enzima perossidasi si presenta sotto forma di un coniugato con un reagente di rivelazione per l’analita da rivelare. Il reagente di rivelazione può essere scelto tra un anticorpo, un nucleotide, un oligonucleotide o una molecola di acido nucleico in base al tipo di analita da rivelare. Il reagente di rivelazione coniugato all’enzima perossidasi può essere un reagente di rivelazione in grado di legare specificamente l’analita o un reagente di rivelazione secondario in grado di legare il reagente di rivelazione che lega specificamente l’analita.
Le reazioni chemiluminescenti della presente invenzione sono applicabili alla rivelazione e alla quantificazione di analiti, usando, ad esempio, la formazione di un legame tra l’analita (ad es. una proteina o una molecola di acido nucleico) e un supporto solido (ad es. una membrana o una piastra di microtitolazione) e utilizzando l’enzima perossidasi come tracciante. La reazione luminescente viene iniziata aggiungendo il substrato chemiluminescente come qui descritto al supporto solido (precedentemente fatto reagire con il campione contenente l’analita) e aggiungendo successivamente la soluzione contenente l’enzima perossidasi al supporto solido. L’emissione di luce è prolungata e può essere misurata con pellicola, fotocamera o altra strumentazione.
I saggi chemiluminescenti basati sul substrato chemiluminescente secondo la presente descrizione includono saggi dot blot e Western blot per proteine e saggi Southern Blot e Northern Blot per acidi nucleici.
I saggi blot basati sul substrato chemiluminescente secondo la presente descrizione utilizzano l’elettroforesi su gel per separare l’analita di interesse (una proteina o una molecola di acido nucleico) dagli altri componenti (altre proteine o altre molecole di acido nucleico) presenti nel campione da testare. L’analita e gli altri componenti vengono quindi trasferiti su una membrana, dove vengono sondati (rivelati) utilizzando il substrato chemiluminescente come qui descritto e un reagente di rivelazione in grado di legarsi specificamente all’analita di interesse, in cui il reagente di rivelazione è coniugato all’enzima perossidasi.
Un confronto tra Western Blot ottenuti usando un substrato a base di L-012 (B3/Esempio 10) della presente invenzione e un substrato a base di luminolo disponibile in commercio (Westar Supernova di Cyanagen) è descritto nell’Esempio 12. Come mostrato in Fig. 13, il substrato basato su L-012 della presente invenzione consente la rivelazione di circa tre ulteriori bande rispetto al substrato basato su luminolo.
I saggi chemiluminescenti basati sul substrato chemiluminescente della presente invenzione includono anche i saggi immunoenzimatici (EIA), come ad esempio i saggi ELISA. I saggi immunoenzimatici sono particolarmente utili per rivelare analiti presenti nel campione in quantità estremamente piccole, come marcatori tumorali, ormoni tiroidei, proteine virali (ad es. proteine HIV, HCV, HPV), od ormoni steroidei (ad es. estradiolo, aldosterone). L’esecuzione di un saggio ELISA per la rivelazione di un analita comporta almeno un reagente di rivelazione con specificità per l’analita di interesse. L’analita all’interno del campione è immobilizzato su un supporto solido (di solito una piastra di microtitolazione di polistirene) sia non specificamente (tramite adsorbimento sulla superficie di supporto solida) sia specificamente (tramite cattura da parte di un altro reagente di rivelazione specifico per lo stesso analita sulla superficie di un supporto solido, in un “ELISA a sandwich”). Dopo che l’analita è stato immobilizzato sulla superficie di un supporto solido, viene aggiunto il reagente di rivelazione, che forma un complesso con l’analita. Il reagente di rivelazione può essere covalentemente legato a un enzima perossidasi come tracciante, oppure può essere esso stesso rivelato da un reagente di rivelazione secondario che è legato a un enzima perossidasi mediante (bio)coniugazione (come ad esempio tramite biotina o streptavidina). Tra ciascuna fase, la piastra viene in genere lavata con una soluzione detergente delicata per rimuovere eventuali proteine o anticorpi che non sono specificamente legati. Dopo la fase finale di lavaggio, la piastra viene sviluppata aggiungendo il substrato chemiluminescente qui descritto e - nel caso in cui il reagente di rivelazione non sia direttamente coniugato all’enzima perossidasi - la soluzione contenente l’enzima perossidasi coniugato al reagente di rivelazione secondario per produrre un segnale luminoso, che indica la quantità di analita nel campione.
L’Esempio 13 descrive un Saggio ELISA per HDAC-1 Umana, in cui la rivelazione viene effettuata con un substrato a base di L-012 (B3/Esempio 10) della presente invenzione e un substrato a base di luminolo disponibile in commercio (SuperSignal Femto ELISA, di Thermo Scientific). Come si può osservare in Fig. 14, il substrato L-012/B3 della presente invenzione ha prestazioni superiori rispetto al substrato basato sul luminolo di un fattore di circa cinque.
I seguenti esempi servono per illustrare aspetti specifici dell’invenzione. Tuttavia, non intendono limitare l’invenzione.
ESEMPI
Tutti i reagenti utilizzati nella presente domanda sono stati acquistati presso Sigma-Aldrich, TCI Europe e Panreac.
Gli enhancer SPTZ e CPTZ sono stati sintetizzati secondo la comune conoscenza generale dell’esperto del settore. SPTZ: Marzocchi E, Grilli S, Della Ciana L, Prodi L, Mirasoli M, e Roda A (2008) Anal biochem, 377:189-194; CPTZ: Han, F, Chi, L, Wu, W, Liang, X, Fu, M, e Zhao, J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry 196.1 (2008):10-23.
Le misurazioni chemiluminescenti sono state eseguite con uno spettrometro per micropiastre, multilabel (multirivelatore), Victor<3 >(Perkin-Elmer), in modalità luminescenza (nessun filtro di emissione). Sono state utilizzate micropiastre a 96 pozzetti neri (Optiplate-96F).
La soluzione per il test HRP è stata preparata diluendo 15 μl di soluzione madre di perossidasi di rafano (HRP) (20 mg/l) a 50 ml con tampone (concentrazione: 6 ng/ml). 28 μl di HRP sono stati aggiunti a ciascun pozzetto (228 μl di volume finale in pozzetto). Pertanto, la quantità finale di HRP in ciascun pozzetto è di 168 pg.
Esempio 1 - Dipendenza dal pH della reazione chemiluminescente di L-012/perossido/perossidasi a varie concentrazioni dell’enhancer 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato di sodio (SPTZ)
Una serie di substrati chemiluminescenti è stata preparata con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 0,1 mM
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,2-8,0.
Come substrato di riferimento, è stata preparata la seguente soluzione:
[Luminolo] = 5 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 1,5 mM
in Tampone Tris 150 mM, pH 9,0.
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto al pH, FIG. 2 (segnale del substrato di riferimento fissato a 1).
Esempio 2 - Screening di co-enhancer per la reazione chemiluminescente di L-012/perossido/perossidasi
Un substrato chemiluminescente è stato preparato con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 1 mM; [CPTZ] = 1 mM (enhancer)
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9
[co-enhancer] = 1 mM
I livelli iniziali di segnale per ciascun co-enhancer, imidazolo, 1-metilimidazolo, 1,2,3-triazolo, 4-morfolinopiridina (MORP), 4-dimetilamminopiridina (DMAP), 4-pirrolidinopiridina (PPY), sono riportati in un grafico a barre, come mostrato in FIG. 3.
Esempio 3 - Dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di L-012 nei substrati L-012/perborato/SPTZ/MORP.
È stata preparata una serie di substrati chemiluminescenti con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio]= 4 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
3 mM (co-enhancer)
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9.
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di L-012, come mostrato in FIG.
4.
Esempio 4 - Dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di SPTZ nei substrati L-012/perborato/SPTZ/MORP.
È stata preparata una serie di substrati chemiluminescenti con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 1-10 mM (enhancer)
[MORP] 3 mM (co-enhancer)
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9.
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di SPTZ, come mostrato in FIG.
5.
Esempio 5 - Dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di MORP nei substrati L-012/perborato/SPTZ/MORP.
È stata preparata una serie di substrati chemiluminescenti con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
[MORP] = 0-6 mM (co-enhancer)
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9.
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di MORP, come mostrato in FIG.
6.
Esempio 6 - Dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di perborato nei substrati L-012/perborato/SPTZ/MORP
È stata preparata una serie di substrati chemiluminescenti con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 0,5-8,0 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
[MORP] 3 mM (co-enhancer)
in tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9.
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di perborato, come mostrato in FIG. 7.
Esempio 7 - Dipendenza dal pH del segnale chemiluminescente nei substrati L-012/perborato/SPTZ/MORP.
È stata preparata una serie di substrati chemiluminescenti con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
[MORP] 3 mM (co-enhancer)
pH 5-9 (tampone Tris)
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di perborato, come mostrato in FIG. 8.
Esempio 8 - Dipendenza dal pH del segnale chemiluminescente nei substrati L-012/perborato/SPTZ/Imidazolo(IMDZ)
Una serie di substrati chemiluminescenti è stata preparata con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
[IMDZ] = 50 mM (co-enhancer)
Range di pH 6,3-8,1
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto al pH, come mostrato in FIG. 9.
Esempio 9 - Dipendenza del segnale chemiluminescente dalla concentrazione di imidazolo (IMDZ) nei substrati L-012/perborato/SPTZ/IMDZ
Una serie di substrati chemiluminescenti è stata preparata con la seguente composizione:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato di sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM (enhancer)
[IMDZ] = 0-100 mM (co-enhancer)
in tampone Tris 50 mM, pH 7,1
I livelli di segnale iniziali sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di Imidazolo (IMDZ), come mostrato in FIG. 10.
Esempio 10 - Confronto tra substrati chemiluminescenti basati su luminolo e L-012 per perossidasi
Sono stati preparati i seguenti substrati chemiluminescenti:
Substrati basati su luminolo
Luminolo/A1 (NO: senza co-enhancer; segnale fissato a 1) [Luminolo] = 5 mM
[perborato] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM
Tampone Tris 150 mM, pH 9,0
Luminolo/A2 (IMDZ: imidazolo come co-enhancer) [Luminolo] = 5 mM
[perborato] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM
[IMDZ] = 35 mM
Tampone Tris 150 mM, pH 9,0
Luminolo/A3 (MORP: 4-morfolinopiridina come co-enhancer) [Luminolo] = 5 mM
[perborato] = 4 mM
[SPTZ] = 3mM
[MORP] = 3 mM
Tampone Tris 150 mM, pH 9,0
Substrati basati su L-012
L012/B1 (NO: senza co-enhancer)
[L-012] = 0,15 mM
[perborato] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM
Tampone Tris/Fosfato 50/30 mM, pH, 7,1.
L012/B2 (IMDZ: Imidazolo come co-enhancer)
[L-012] = 0,15 mM
[perborato] = 7 mM
[SPTZ] = 2 mM
[IMDZ] = 100 mM
Tampone Tris 50 mM, pH 7,1
L012/B3 (MORP: 4-morfolinopiridina come co-enhancer)
[L-012] = 0,15 mM
[perborato] = 4 mM
[SPTZ] = 3 mM
[MORP] = 3 mM
Tampone Tris 50 mM/fosfato 30 mM, pH 7,9.
I livelli iniziali del segnale chemiluminescente sono stati registrati per ciascun substrato. Il segnale prodotto da luminolo/perborato/SPTZ senza co-enhancer è stato preso come segnale di riferimento (REF), con il suo valore fissato sull’unità.
Substrati basati su luminolo: NO (A1) = REF fissato a 1; IMDZ (A2) = 8; MORP (A3) = 10
Substrati basati su L-012: NO (B1) = 3; IMDZ (B2) = 115; MORP (B3) = 70
I risultati sono stati riportati in un grafico a barre, come mostrato nella Figura 11.
Esempio 11 - Segnale chemiluminescente rispetto alla concentrazione di HRP per il substrato chemiluminescente L-012/B3 e il substrato chemiluminescente Luminolo/A3
I substrati chemiluminescenti L-012/B3 e Luminolo/A3 sono stati preparati come descritto nell’Esempio 11. 200 μl di questi substrati sono stati distribuiti in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. La perossidasi di rafano (HRP) (20 μg/ml) è stata diluita per ottenere una soluzione di 1600 ng/ml, da cui sono state distribuite varie aliquote in ciascun pozzetto con il sistema di pompaggio automatico di un lettore multilabel Victor<3 >(Perkin-Elmer) in modo da ottenere una serie di diluizioni coprenti il range 30-300 ng/l. La colonna 1 nella piastra è stata utilizzata come bianco (solo substrato, senza aggiungere l’enzima). I segnali iniziali per i due substrati sono riportati in grafico rispetto alla concentrazione di HRP, come mostrato nella Figura 12. Le linee di regressione sono state calcolate per ciascun substrato. La pendenza di regressione del substrato L-012 B3 è circa sette volte maggiore rispetto al substrato Luminolo/A3, mentre il segnale di fondo misurato è simile per entrambi i substrati.
Esempio 12 - Saggio Western Blot di IKBα umano
IKBα umano purificato (inibitore del fattore nucleare del potenziatore del gene polipeptidico della catena leggera kappa in cellule B, alfa; Abcam) è stato diluito a 1,5 ng/ml in tampone di campionamento riducente per elettroforesi e sono state preparate diluizioni 1:5. 5 μl di ciascuna diluizione sono stati separati tramite SDS-PAGE e le proteine sono state trasferite con il sistema di trasferimento Trans-Blot® Turbo<TM >BIO-RAD. Le membrane sono state bloccate con l’Agente Bloccante 2% Amersham<TM >ECL<TM >(GE Healthcare) in Tampone 1X PBS TWEEN®20, quindi incubate con anti-IKBα di coniglio (Abcam) a 1:1000, facendo seguire l’incubazione con anti-IgG di coniglio coniugato con HRP (Abcam) a 1:500000. Il substrato chemiluminescente L012/B3 (Esempio 11) e il Westar Supernova (Cyanagen), un substrato a base di luminolo, sono stati utilizzati per la rivelazione con ImageQuant<TM >LAS 4000 (GE Healthcare) in base alle istruzioni del produttore.
I risultati sono mostrati in FIG. 13.
Esempio 13 - Saggio ELISA di HDAC-1 umana
Anti-HDAC-1 umana di coniglio (Abcam) è stato diluito in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6 e sono state preparate diluizioni 1:2 partendo da 20 ng/ml a 19,9 pg/ml. Una micropiastra nera a 96 pozzetti con polistirene a fondo piatto trasparente (Corning) è stata rivestita con 50 µl/pozzetto a 4°C per una notte. La soluzione di rivestimento è stata rimossa e la piastra è stata lavata 6 volte con 200 µl/pozzetto di PBS-Tween allo 0,01%. 100 µl dell’agente bloccante ECL al 3% (GE Healthcare) in PBS-Tween allo 0,01% sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e la piastra è stata incubata per 1 ora a temperatura ambiente. Il tampone bloccante è stato rimosso con un breve lavaggio in PBS-Tween allo 0,01% e 100 µl di anticorpo di capra anti coniglio-HRP (Abcam), diluito alla concentrazione di 0,4 µg/ml, sono stati aggiunti ad ogni pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. La soluzione di anticorpo di capra anti coniglio-HRP è stata rimossa e la piastra è stata lavata 6 volte con 200 µl/pozzetto di PBS-Tween allo 0,01%. Ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 200 µl di substrati chemiluminescenti (L012/B3, Esempio 11; SuperSignal ELISA Femto, un substrato a base di luminolo di Thermo Scientific) e la piastra è stata analizzata con l’analizzatore Perkin Elmer Victor<3 >a 60 e 120 secondi. Un grafico del Segnale/Rumore (S/N) rispetto alla HDAC-1 Umana (pg) è mostrato in Fig. 14.
Naturalmente, mentre il principio dell’invenzione rimane lo stesso, i dettagli di costruzione e le forme di realizzazione possono variare notevolmente rispetto a quanto descritto e illustrato a titolo di esempio, senza discostarsi dall’ambito della presente invenzione.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Kit per l’esecuzione di un saggio per la determinazione di un analita in un campione, in cui il kit comprende 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un ossidante a base di perossido, un enhancer e un co-enhancer, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il co-enhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina o un N-azolo.
  2. 2. Kit secondo la rivendicazione 1, in cui il kit comprende inoltre un enzima perossidasi o un suo coniugato.
  3. 3. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 2, in cui la N-alchilfenotiazina anionica è scelta dal gruppo costituito da acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propan-1-solfonico, acido 4-(10H-fenotiazin-10-il)butan-1-solfonico, acido 3-(10H-fenotiazin-10-il)propanoico e acido 4-(10H-fenotiazin-10-il)butanoico, e loro sali.
  4. 4. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il co-enhancer è scelto tra imidazolo, 1-metilimidazolo, 4-morfolinopiridina (MORP), 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 4-pirrolidinopiridina (PPY).
  5. 5. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui l’enzima perossidasi è scelto tra perossidasi di rafano, perossidasi di soia e perossidasi di patata dolce.
  6. 6. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui l’ossidante a base di perossido è scelto tra perossido di idrogeno, complesso di urea/perossido di idrogeno, un sale di perborato, un sale di percarbonato.
  7. 7. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione è presente in un primo flacone e l’ossidante a base di perossido è presente in un secondo flacone, e in cui l’enhancer e il co-enhancer sono presenti o nel primo flacone o nel secondo flacone o in entrambi i flaconi.
  8. 8. Procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione, un enzima perossidasi o un suo coniugato, un enhancer, un coenhancer e un ossidante a base di perossido, in cui l’enhancer è una N-alchilfenotiazina anionica e il coenhancer è scelto tra una 4-dialchilamminopiridina o un N-azolo.
  9. 9. Procedimento per eseguire un dosaggio chemiluminescente per la rivelazione di un analita in un campione, in cui il procedimento impiega un kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7.
  10. 10. Procedimento per l’esecuzione di un saggio chemiluminescente per la rivelazione di un analita in un campione, in cui il procedimento impiega un procedimento per aumentare l’emissione di luce prodotta dalla reazione chemiluminescente di 8-ammino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazin-1,4(2H,3H)-dione secondo la rivendicazione 8 come mezzo di rivelazione dell’analita.
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