CN104792771B - 鲁米诺‑过氧化氢‑溴酚红‑hrp‑bsa化学发光体系检测hrp的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鲁米诺‑过氧化氢‑溴酚红‑HRP‑BSA化学发光体系检测HRP的方法。目的是建立新型的化学发光体系，将其用于高灵敏度检测HRP。发光体系包括A液，B液和C液；A液为溴酚红与过氧化氢的混合液；B液为鲁米诺；C液BSA水溶液；待测样品HRP用C液稀释；置于测量杯中，加入A液，避光反应，加入B液，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。本发明具有如下优点：与经典鲁米诺‑过氧化氢‑HRP‑PIP化学发光体系进行对比研究，发现本发明在检测HRP方面具有更高的灵敏度和更好的线性。
Description
技术领域：
本发明涉及辣根过氧化物酶的检测方法，进一步涉及一种鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法。
背景技术：
化学发光(Chemiluminescence,CL)分析是根据化学反应产生光辐射确定物质含量的一种痕量分析法，由于其灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析快速及容易实现自动化，近年来已经成为分析化学中一个十分活跃的研究热点，并与众多学科相交叉，研究和应用领域越来越广泛。
鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)化学发光体系是一种常用的化学发光分析体系。由于HRP可与多种分子偶联，常用的包括有生物素修饰的HRP(Biotin-HRP)，链霉亲和素修饰的HRP(SA-HRP)，第二抗体修饰的HRP等，HRP还可以标记在各种固定相(如金纳米粒子、羧基修饰的聚苯乙烯微球和磁珠等)上，因此被广泛应用于免疫印迹，免疫组化法和化学发光酶免疫测定(CLEIA)中DNA、抗体和肿瘤标记物等的检测。由于鲁米诺-过氧化氢-HRP化学发光体系的化学发光强度并不高且容易衰减，因此该体系通常需要加入增强剂。对碘苯酚(4-Iodophenol，PIP)是鲁米诺-过氧化氢-HRP体系的经典增强剂。
发明内容:
本发明的目的是建立新型的鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系，将其用于高灵敏度检测HRP。
本专利所说的新型鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系中，鲁米诺是化学发光剂，过氧化氢是氧化剂，HRP是待测样品，BSA和溴酚红是联合增强剂。
本发明涉及了一种新型的增强剂为溴酚红，中文别名二溴苯酚磺酞，是一种酚类衍生物。
牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)又称第5组分，分子量约为67kDa，其含有607个依次排序的氨基酸残基，并在分子内部组成了3个圆柱形的疏水空腔。BSA是血清中含量最高的蛋白质，对维持血液的渗透平衡，外源性和内源性配体的转运、分布、代谢都起着重要的作用。它是药物和其他具有生理作用化合物的主要结合蛋白。由于BSA廉价易得，性质稳定，对药物具有很强的结合能力，因此其被广泛的用于生化研究、遗传工程和医药研究领域的研究。本文发现BSA与新型增强剂溴酚红对鲁米诺-过氧化氢-HRP化学发光光体系的发光信号具有显著的联合增强作用，基于此，本发明采用此新型的鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-BSA化学发光体系，高灵敏度检测HRP。
本专利所述新型发光体系包括A液，B液和C液；A液为溴酚红，0.1-10mM，0.2M HAc-KAc缓冲液，pH 5.25)与过氧化氢(0.1-5mM，水)临用前按体积比1：4混合的混合液；B液为鲁米诺(0.01-5mM，0.1M Tris缓冲液，pH 11.0)；C液为0.001％-1％的BSA水溶液。测量时，取待测样品HRP 10μL置于14×40mm测量杯中，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。
本发明相对于现有技术，具有如下优点：
溴酚红是一种新型的鲁米诺-过氧化氢-HRP化学发光体系的增强剂，发明人通过诸多的实验发现BSA对溴酚红增强的鲁米诺-过氧化氢-HRP化学发光体系具有明显的联合增强作用，能显著提高HRP的检测灵敏度。
与经典鲁米诺-过氧化氢-HRP-PIP化学发光体系进行对比研究，发现本发明在检测HRP方面具有更高的灵敏度和更好的线性。
附图说明
图1-16为实施例测试结果图，图中，横坐标代表HRP浓度，ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。
图1是实施例1测试结果图；当C液为0.001％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ngmL-1，线性范围为1-6ng mL-1，当HRP浓度为5ng mL-1时，回收率为88％±6％。
图2是实施例2测试结果图；当C液为0.01％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为1ngmL-1，线性范围为1.5-7ng mL-1，当HRP浓度为5ng mL-1时，回收率为103％±3％。
图3是实施例3测试结果图；当C液为0.1％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-5ng mL-1，当HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为105％±3％。
图4是实施例4测试结果图；当C液为0.5％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-5ng mL-1，当HRP浓度为4ng mL-1时，回收率为103％±3％。
图5是实施例5测试结果图；当C液为1％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1.5-9ng mL-1，当HRP浓度为2.5ng mL-1时，回收率为92％±7％。
图6是实施例6测试结果图；当B液为0.01mM鲁米诺时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-7ng mL-1，当HRP浓度为3ng mL-1时，回收率为106％±5％。
图7是实施例7测试结果图；当B液为0.1mM鲁米诺时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-7ng mL-1，当HRP浓度为1.5ng mL-1时，回收率为109％±3％。
图8是实施例8测试结果图；当B液为0.5mM鲁米诺时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-9ng mL-1，当HRP浓度为3ng mL-1时，回收率为105％±3％。
图9是实施例9测试结果图；当B液为5mM鲁米诺时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-7ng mL-1，当HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为93％±4％。
图10是实施例10测试结果图；当A液为0.1mM溴酚红和1mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-6ng mL-1，当HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为105％±5％。
图11是实施例11测试结果图；当A液为1mM溴酚红和1mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为0.5-7ng mL-1，当HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为109％±3％。
图12是实施例12测试结果图；当A液为10mM溴酚红和1mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-6ng mL-1，当HRP浓度为3ng mL-1时，回收率为101％±3％。
图13是实施例13测试结果图；当A液为4mM溴酚红和0.1mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为0.5-5ng mL-1，当HRP浓度为1.5ng mL-1时，回收率为105％±3％。
图14是实施例14测试结果图；当A液为4mM溴酚红和0.5mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为0.5-9ng mL-1，当HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为113％±6％。
图15是实施例15测试结果图；当A液为4mM溴酚红和2.5mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为1ng mL-1，线性范围为2-10ng mL-1，当HRP浓度为4ng mL-1时，回收率为93％±3％。
图16是实施例16测试结果图；当A液为4mM溴酚红和5mM过氧化氢按体积比1：4混合而成时，该新型化学发光体系检测HRP的标准曲线，其检测限为2ng mL-1，线性范围为3-9ngmL-1，当HRP浓度为5ng mL-1时，回收率为89％±3％。
图17是实施例17测试结果图；图中，横坐标代表SA-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。当C液为0.1％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测SA-HRP的标准曲线，其检测限为0.1ng mL-1，线性范围为0.25-6ng mL-1，当SA-HRP浓度为5ng mL-1时，回收率为78％±3％。
图18是实施例18测试结果图；图中，横坐标代表Biotin-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。当C液为0.1％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测Biotin-HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1-6ng mL-1，当Biotin-HRP浓度为1.5ng mL-1时，回收率为114％±3％。
图19是实施例19测试结果图；图中，横坐标代表SA-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。当C液为0.5％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测SA-HRP的标准曲线，其检测限为0.1ng mL-1，线性范围为0.5-4ng mL-1，当SA-HRP浓度为3ng mL-1时，回收率为101％±3％。
图20是实施例20测试结果图；图中，横坐标代表Biotin-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。当C液为0.5％BSA水溶液时，该新型化学发光体系检测Biotin-HRP的标准曲线，其检测限为0.5ng mL-1，线性范围为1.5-6ng mL-1，当Biotin-HRP浓度为2ng mL-1时，回收率为102％±3％。
图21-23是对比例1-3的测试结果图；
图21是对比例1的测试结果图；图中，横坐标代表HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。
图22是对比例2的测试结果图；图中，横坐标代表Biotin-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。
图23对比例3的测试结果图；图中，横坐标代表SA-HRP浓度，单位ng mL-1；纵坐标代表化学发光信号强度数值。
具体实施方式
实验步骤：
将溴酚红(0.1-10mM，pH 5.250.2M HAc-KAc缓冲液稀释)与过氧化氢(0.1-5mM，水稀释)按体积比1：4临用前混合，作为A液；鲁米诺(0.01-5mM，pH 11.00.1M Tris缓冲液稀释)作为B液；0.001％-1％BSA(水稀释)为C液；待测样品HRP用C液稀释。待测样品HRP 10μL置于14×40mm测量杯中，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。
以下实施例中未提及的条件均与上述步骤中的条件相同。
实施例1：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.001％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，6，7ng mL-1。实验结果如图1所示。
实施例2：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.01％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4，6，7，9ng mL-1。实验结果如图2所示。
实施例3：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图3所示。
实施例4：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.5％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取7个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，3，5ng mL-1。实验结果如图4所示。
实施例5：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取10个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，3，4，6，7，9ng mL-1。实验结果如图5所示。
实施例6：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；0.01mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4，7，9ng mL-1。实验结果如图6所示。
实施例7：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；0.1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，2，5，6，7，9，10ng mL-1。实验结果如图7所示。
实施例8：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；0.5mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4，9，10ng mL-1。实验结果如图8所示。
实施例9：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；5mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图9所示。
实施例10：将0.1mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图10所示。
实施例11：将1mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取10个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，5，6，7，9，10ng mL-1。实验结果如图11所示。
实施例12：：将10mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，4，6，7ng mL-1。实验结果如图12所示。
实施例13：将4mM溴酚红与0.1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，2，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图13所示。
实施例14：将4mM溴酚红与0.5mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，7，9，10ng mL-1。实验结果如图14所示。
实施例15：将4mM溴酚红与2.5mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，0.1，2，3，5，7，9，10，11ng mL-1。实验结果如图15所示。
实施例16：将4mM溴酚红与5mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品HRP用C液稀释。取10个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品HRP浓度分别为0，1，1.5，2，3，4，6，7，9，10ng mL-1。实验结果如图16所示。
实施例17：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品SA-HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品SA-HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品SA-HRP浓度分别为0，0.1，0.25，0.5，2，4，6，7ng mL-1。实验结果如图17所示。
实施例18：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.1％BSA为C液；待测样品Biotin-HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品Biotin-HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品Biotin-HRP浓度分别为0，0.5，1，2，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图18所示。
实施例19：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.5％BSA为C液；待测样品SA-HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品SA-HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品SA-HRP浓度分别为0，0.1，0.25，0.5，1，1.5，2，4ng mL-1。实验结果如图19所示。
实施例20：将4mM溴酚红与1mM过氧化氢按体积比1：4临用前混合，作为A液；1mM鲁米诺作为B液；0.5％BSA为C液；待测样品Biotin-HRP用C液稀释。取8个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入一定浓度待测样品Biotin-HRP 10μL，加入A液一份，避光反应30min，加入B液一份，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。待测样品Biotin-HRP浓度分别为0，0.5，1，1.5，3，4，5，6，7ng mL-1。实验结果如图20所示。
对比例1：取7个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入4mM PIP(0.1M Tris缓冲液，pH 8.3)，0.2份；一定浓度待测样品HRP水溶液，10μL；1mM过氧化氢水溶液，0.8份；1mM鲁米诺(0.1M Tris缓冲液，pH 11.0)一份，混匀后于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定，待测样品HRP的浓度分别为0，0.5，0.7，1，1.4，2，5ng mL-1。实验结果如图21所示。
对比例2：取9个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入4mM PIP(0.1M Tris缓冲液，pH 8.3)，0.2份；一定浓度待测样品Biotin-HRP水溶液，10μL；1mM过氧化氢水溶液，0.8份；1mM鲁米诺(0.1M Tris缓冲液，pH 11.0)一份，混匀后于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定，待测样品Biotin-HRP的浓度分别为0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6ngmL-1。实验结果如图22所示。
对比例3：取10个规格为14×40mm的测量杯，每个测量杯内加入4mM PIP(0.1MTris缓冲液，pH 8.3)，0.2份；一定浓度待测样品SA-HRP水溶液，10μL；1mM过氧化氢水溶液，0.8份；1mM鲁米诺(0.1M Tris缓冲液，pH 11.0)一份，混匀后于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定，待测样品SA-HRP的浓度分别为0，0.05，0.1，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4ng mL-1。实验结果如图23所示。
不应认为本发明局限于本文所述的具体实例，而应理解为本发明覆盖在所附权利要求书中完整地列出的本发明的所有方面。对本发明所属领域的技术人员而言，在阅览本发明后，本发明可适用的各种修改、等同方法、以及各种结构都是显而易见的。
Claims (10)
1.鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
发光体系包括A液，B液和C液；A液为溴酚红与过氧化氢的混合液；B液为鲁米诺；C液BSA水溶液；
待测样品HRP用C液稀释；置于测量杯中，加入A液，避光反应，加入B液，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。
2.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
A液为溴酚红与过氧化氢临用前按体积比1：4混合的混合液；溴酚红配置参数为：0.1-10mM，0.2M HAc-KAc缓冲液，pH 5.25；过氧化氢配置参数为：0.1-5mM，水。
3.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：B液为鲁米诺，配置参数为：0.01-5mM，0.1M Tris缓冲液，pH 11.0。
4.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：C液为0.001％-1％的BSA水溶液。
5.根据权利要求1-4任何一项所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于，检测过程如下：
待测样品HRP用C液稀释；置于测量杯中，加入A液，避光反应30分钟；加入B液，于微弱化学发光分析仪中进行化学发光信号强度测定。
6.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
溴酚红的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为1mM；鲁米诺的浓度为1mM；BSA的浓度为0.1％。
7.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
溴酚红的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为1mM；鲁米诺的浓度为1mM；BSA的浓度为0.5％。
8.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
溴酚红的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为1mM；鲁米诺的浓度为0.1mM；BSA的浓度为0.1％。
9.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
溴酚红的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为1mM；鲁米诺的浓度为0.5mM；BSA的浓度为0.1％。
10.根据权利要求1所述鲁米诺-过氧化氢-溴酚红-HRP-BSA化学发光体系检测HRP的方法，其特征在于：
溴酚红的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为2.5mM；鲁米诺的浓度为1mM；BSA的浓度为0.1％。
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