CN103293145A

CN103293145A - 一种化学发光试剂

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Publication number: CN103293145A
Application number: CN2013101817890A
Authority: CN
Inventors: 刘涧泉; 葛胜祥; 林静; 黄炳河; 宋浏伟; 夏宁邵
Original assignee: HELIOSENSE BIOTECHNOLOGIES Inc; Xiamen University
Current assignee: HELIOSENSE BIOTECHNOLOGIES Inc; Xiamen University
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: CN103293145B

Abstract

一种化学发光试剂，涉及主要用于生物技术、生命科学、医疗诊断、食品安全、环保检测中的一种化学发光试剂。所述化学发光试剂按质量百分比的原料组成：至少一种发光试剂，浓度为0.001%～0.1%；至少一种氧化剂，浓度为0.001%～0.2%；至少一种发光增强剂，浓度为0.01%～0.5%；至少一种本底控制剂，浓度为0.000001%～0.05%；pH值为8～11的缓冲液。其核心是使用本底控制剂（特别是抗氧化剂）来调节化学发光，对增强型化学发光酶免分析检测的背景控制、信噪比的提高等非常有效，其依据是如何控制辣根过氧化物酶-鲁米诺发光体系中鲁米诺自由基及相关自由基的浓度。

Description

一种化学发光试剂

技术领域

本发明涉及一种化学发光试剂，尤其是涉及主要用于生物技术、生命科学、医疗诊断、食品安全、环保检测中的一种化学发光试剂。

背景技术

化学发光是指在化学反应过程中产生可见光的一种现象，通常是指一些化合物在没有紫外光或可见光照射的情况下，通过吸收化学能，从基态激发至激发态，在退激时释放能量产生光子，实现化学能到光能装换，从而导致发光的现象。通过测量化学发光反应的光强度，可分析痕量化合物的含量。近年来发展起来的化学发光免疫检测技术(chemiluminescentimmunoassay，CLIA)是化学发光技术与免疫学方法相结合的产物，不但具有发光检测的高度灵敏性，而且还具有免疫分析的高度特异性。同时，化学发光免疫检测技术不仅检测快速、可实现高通量检测，而且避免传统的放射性标记试剂的使用，从而避免放射性危害，减少对环境的冲击。化学发光免疫检测技术的检测灵敏度是目前光学检测中最好的技术之一，最低检测限（LOD）可达10^-21mol／L。

目前最广泛的化学发光检测技术可分为板式化学发光和管式化学发光。板式化学发光使用抗体包被的96孔或更多孔的多孔板，通过抗体-抗原的特异性作用把检测目标（抗原）从样品中提取出来，加入化学发光标记的抗体后形成“三明治（sandwich）”夹心层。根据化学发光标记种类的不同，板式化学发光既可是酶促化学发光，也可是非酶促化学发光。酶促化学发光技术使用酶标记，常用的酶有辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、黄嘌呤氧化酶等。其最大特点是通过酶的催化作用放大发光信号，从而提高检测灵敏度；同时，发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光底物试剂充分过量，发光信号强而稳定，发光时间较长，可采用速率法测量。因此，酶促化学发光检测方式简单、成本较低、灵敏度高。非酶促化学发光技术也被称之为直接化学发光，使用吖啶脂或异鲁米诺（如aminobutylethylisoluminol，ABEI），特点是不使用生物酶、可简化化学发光检测过程、降低试剂成本，但在其发光过程中作为标记物的发光剂会被消耗，导致发光信号持续时间较短。另外，由于发光剂被很快消耗，只能进行一次性测量，因此重复性较差。

板式化学发光在生命科学、生物医药、食品安全、环保检测等领域有着广泛的应用。管式化学发光则是最近发展起来的一种新型化学发光检测技术，使用磁性或非磁性微粒作包被载体。比起板式化学发光来说，管式化学发光有着不少优势，特别是使用磁性微粒的管式发光技术，在大型、全自动的诊断仪上有着广泛的应用。当然，管式化学发光也有其弱点，包括如何降低散射作用对检测灵敏度的影响、如何控制磁性微粒体积分布均匀、如何保证磁性微粒-抗体共轭体的质量、如何避免磁性微粒的聚合问题等。

鲁米诺-HRP系统是化学发光检测最常见的技术。下述方案1描述的是鲁米诺的发光反应机制（J.Pharma.& Biomed.Anal.1994,12,433-462）：鲁米诺发光机制中的一个关键中间体是杂环被氧化的α-羟基过氧化物（α-hydroxyperoxide），此中间体的分解导致处于激发态中间体的产生，激发态中间体回归到基态时产生发光。产生α-羟基过氧化物的第一步反应与系统介质紧密相关，如总体浓度、氧化剂的性质、添加物、缓冲液及pH。在质子溶液（水、水溶液、含水醇溶液等）中，各种氧化物（分子氧、过氧化物、超氧阴离子）都可氧化鲁米诺，但都需要酶或矿物催化剂。与此相反，发光过程（第二步及第三步）所涉及的α-羟基过氧化物的分解过程非常独特，只依赖于系统的pH值。

方案2所描述的则是辣根过氧化酶的催化机制：HRP与过氧化氢反应形成一种氧化的HRP（HRPI），HRPI和鲁米诺阴离子反应形成半还原的酶（HRPII）及鲁米诺自由基。HRPII同另一分子的鲁米诺反应，变回原始的HRP（J.Pharma.& Biomed.Anal.1994,12,433-462）。此过程产生鲁米诺自由基，而鲁米诺自由基的产生效率与其发光效率直接相关。

方案1.简化的鲁米诺反应机制：在碱性条件下，鲁米诺被氧化成关键中间体α-羟基过氧化物（α-hydroxyperoxide）（第一步）；失去氮气（N2）后此中间体分解成激发态的邻苯二甲酸（第二步），当激发态的邻苯二甲酸回到基态伴随着光的产生（第三步）。

方案2.辣根过氧化酶催化反应机制：辣根过氧化酶与过氧化氢反应形成一种氧化的HRP（HRPI），HRPI和鲁米诺阴离子反应形成半还原的酶（HRPII）及鲁米诺自由基。HRPII同另一分子的鲁米诺反应，变回原始的HRP。

最近人们发现一些苯酚、苯胺类化合物可极大地提高鲁米诺的发光效率，这是因为它们可以产生苯氧或苯胺自由基，而这些自由基在和HRP作用时作为电子转移介质（electron-transfer mediator）可催化鲁米诺自由基的生产，提高其产率，从而大大提高发光效率（Talanta2000,51，415–439）。

值得注意的是，此机制中包含两种关键的自由基，一是鲁米诺自由基，另一个是催化性的苯氧或苯胺自由基。这些自由基的性质、浓度、相互作用等将直接影响到系统化学发光性质，包括发光强度、发光稳定性、背景等，从而对以HRP-鲁米诺为基础的酶免检测系统的线性、灵敏度、本底、储藏稳定性等产生影响。这些因素正是本发明所考量的理论基础。同样的推理也适用于其它含催化性自由基的酶催化过程，如碱性磷酸酶系统。

一个好的化学发光检测方法必须满足诸多要求：1）发光量强；2）线性范围广；3）灵敏度高；4）热稳定性或储藏稳定性好；5）本底低。化学发光本底高是一个普遍的问题。很多化学发光产品可产生很强的发光效果，但同时也造成很高的本底，导致检测灵敏度的降低。如何保持强的发光量、同时降低本底是一个非常具挑战性的难题。一些文献（Anal.Biochem.1995,231，170-174及EP0650044A2）中曾报道使用脱脂奶粉、酪蛋白（casein）、单糖、离子洗涤剂等，但脱脂奶粉及酪蛋白的储藏稳定性、批间差是一个极大的问题，在没有防腐剂的情况下，脱脂奶粉及酪蛋白很容易变质；不同批次的脱脂奶粉及酪蛋白可含有不同量的蛋白，因此，批间差的质量不易控制。另外，传统的化学发光技术普遍使用螯合剂（如EDTA等）来降低本底，但只能满足部分要求，过高的EDTA将严重影响HRP的活性，从而影响检测灵敏度、线性等。

发明内容

本发明的目的在于针对增强型化学发光酶免分析检测技术中面对的主要问题，提供一种化学发光试剂。

所述化学发光试剂按质量百分比的原料组成如下：

至少一种发光试剂，浓度为0.001%～0.1%；

至少一种氧化剂，浓度为0.001%～0.2%；

至少一种发光增强剂（enhancer），浓度为0.01%～0.5%；

至少一种本底控制剂（Background-reducer），浓度为0.000001%～0.05%；

pH值为8～11的缓冲液。

所述发光试剂可选自鲁米诺（luminol）、异鲁米诺（isoluminol）、鲁米诺相关的酰肼或环酰肼（cyclic hydrazides）、吖啶酯（acridinium ester）及其衍生物、邻苯三酚（pyrogallol）、间苯三酚（phioroglucinol）、间苯二酚（rescorcinol）等中的一种；发光试剂也可选自能量转移类的鲁米诺衍生物（energy-transfer luminol derivative），所述能量转移类的鲁米诺衍生物可选自鲁米诺链接到吖啶酮（luminol-acridone）；或鲁米诺链接到荧光素（luminol-fluorescein）；或鲁米诺链接到罗丹明（luminol-rhodamine）；其中，吖啶酮、荧光素、罗丹明是能量受体（参见文献J.Pharma & Biomed.Anal.12,433-462,1994、Biotech Annual Rev.9,199,2003及Methods in Enzymology，Vol.LVII409,1978）。其它能量受体可同样被采用。

所述氧化剂可选自双氧水、尿素过氧化氢、过硼酸钠（sodium perborate）或其它可现场产生过氧化物的化合物（in-situ peroxide forming compound）等中的至少一种，所述可现场产生过氧化物的化合物是指一些化合物本身并不是过氧化物，但在特定条件下可分解产生过氧化物。

所述发光增强剂可选自苯酚类化合物、苯胺类化合物、吩噻嗪类化合物、吡啶类化合物、硼化合物、非离子类洗涤剂等中的至少一种；所述苯酚类化合物可选自对-甲氧基苯酚（p-methoxyphenol）,邻-甲氧基苯酚（O-methoxyphenol）,对,对'-联苯酚(p,p’-biphenol),对-苯基苯酚（p-phenylphenol），对-碘基苯酚（p-iodophenol），对-溴苯酚（p-bromophenol），对-羟基肉桂酸（p-hydroxycinnamic acid），6-羟基苯并噻唑（6-hydroxybenzothiazole）等中的一种；所述苯胺类化合物可选自对-甲氧基苯胺（p-anisidine）,对-羟基-N,N’-二甲基苯胺（p-hydroxy-N,N’-dimethylaniline）,邻-苯二胺（O-phenylenediamine）等中的一种；所述吩噻嗪类化合物可选自3-（10-吩噻嗪基）丙烷-1-磺酸钠及其衍生物，10-(3-二甲基氨丙基)吩噻嗪及其衍生物等中的一种；所述吡啶类化合物可选自4-二甲基氨基吡啶（N,N’-dimethylaminopyridine，DMAP）,4-二乙基氨基吡啶（4-diethylaminopyridine，DEAP），4-甲基氨基吡啶（N-methylaminopyridine，MAP），吗啉（p-morpholinopyridine，MORP）,4-吡咯烷吡啶（4-pirrolidinopyridine，PPY),4-哌啶子基吡啶（4-piperidinopyridine）,4-（4-甲基哌啶子基）吡啶（4-(4-methylpiperidin-1-yl)pyridine）等中的一种；所述硼化合物可选自对-碘苯基硼酸（4-iodophenylboric acid，PIBA),对-氯苯基硼酸（4-chlorophenylboric acid，PCBA),间-氯苯基硼酸（3-chlorophenylboric acid，MCBA)，3,4-二氯苯基硼酸（3,4-dichlorophenylboric acid，PCBA)，对-溴苯基硼酸（4-bromophenylboric acid，PBBA)等中的一种；所述非离子类洗涤剂可选自曲拉通X-100（Triton X-100），吐温20（Tween20）、吐温80（Tween80）,聚氧乙烯月桂醇醚（BRIJ35，polyethylene glycol lauryl ether）,聚氧乙烯(16EO)羊毛醇醚（Solulan16）等中的一种。

所述本底控制剂由可选自螯合剂、抗氧化剂（antioxidants）、特殊蛋白质、特殊糖醇或它们的组合等；组合型本底控制剂可达到更好效果。所述特殊蛋白质可选自牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脱脂牛奶（skim milk）、酪蛋白（Casein）、卵白蛋白（eggalbumin）等中的一种；所述特殊糖醇可选自半乳糖，D-甘露醇、山梨醇等中的一种。

所述螯合剂可选自乙二胺四乙酸（EDTA，ethylenediaminetetraacetic acid）、环己烷乙二胺四乙酸（CDTA，cyclohexylethylenediaminetetraacetic acid）、乙二醇四乙酸（EGTA，ethyleneglycotetraacetic acid）、二乙基三胺五乙酸（DTPA，diethylenetriamine-pentaacetic acid）、三乙基四胺六乙酸（TTHA，triethyleneteraamine hexaacetic acid）、丙基三胺五乙酸（PTPA propylenetriaminepentaacetic acid）等中的至少一种。

所述抗氧化剂（antioxidants）包括各类可以与自由基（radical）作用或反应的小分子化合物、高分子化合物、生物大分子、生物酶等中的至少一种（Denisov，E.T.& Afanas’ev,I.B.Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology，2005年CRCPress Taylor & Francis Group出版）。所述小分子化合物可选自还原剂、维生素、含巯基化合物、酚类或多酚类化合物、有机磷类化合物等中的至少一种。所述高分子化合物可选自多聚酚类化合物、多聚苯胺类化合物、多聚硫化物等中的至少一种。所述生物酶可选自抗氧化性酶，所述抗氧化性酶可选自超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）、过氧化氢酶（catalase）、过氧化物酶（peroxiredoxins）、硫氧还蛋白及谷胱甘肽系统（thioredoxin &glutathione systems）等中的至少一种。所述还原剂可选自氯化亚铁（FeCl₂）、氯化锡（SnCl₂）、焦亚硫酸钠（Na₂S₂O₅）、亚硒酸钠（Na₂SeO₃）等中的至少一种。所述维生素可选自维生素C、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6等中的至少一种。所述含巯基化合物可选自乙酰半胱胺酸（N-acetylcysteine）、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）、硫辛酸（Lipoicacid）、二氢硫辛酸（Dihydrolipoic acid）、2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol）等中的至少一种。所述酚类或多酚类化合物可选自斛皮素（quecertin）、阿巍酸（ferulic acid）、核黄素（riboflavin）、白藜芦醇(resveratrol)、没食子酸（gallic acid）、2-叔丁基-4-羟基茴香醚（2-tert-butyl-4-hydroxyanisole）、2,6-对二叔丁基对甲酚（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol）或其它天然多酚类化合物；所述有机磷类化合物可选自三羧乙基膦（TCEP，tris（2-carboxylethyl）phosphine）、三羧丁基膦（TCBP，tris（4-carboxylbutyl）phosphine）、3,3’,3’’-phosphinidynetris(benzenesulfonic acid)、三（间-苯磺基）膦（tris(O-phenylsulfonyl)phosphine）及其衍生物等中的至少一种。

所述抗氧化剂（antioxidants）可进一步选自具抗氧化性的各类生物提取液、植物提取液，如葡萄提取液、中药提取液等中的至少一种。所述抗氧化剂（antioxidants）再进一步可选自各类生物代谢产物，如谷胱甘肽、尿酸、褪黑素、抗坏血酸（ascorbic acid）等中的至少一种。

所述缓冲液可选自三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、磷酸盐、碳酸盐等中的至少一种。

所述化学发光试剂的制备方法如下：

所述化学发光试剂由A液及B液组成，A液含发光剂、增强剂、抗氧化剂，B液含有氧化剂及螯合剂。A液、B液分别储藏，只在使用前将A液、B液等体积混合。其制备方法如下：

1）配制A液：

据以下各成份的浓度在纯水中配制A液：

鲁米诺单钠盐，浓度为0.002%～0.2%；

吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐,浓度为0.02%～1.0%；

抗氧化剂,浓度为0.000002%～0.06%；

在纯水中配制。

2）配制B液

据以下各成份的浓度在四硼酸钠-硼酸缓冲溶液中配制B液：

过硼酸钠，浓度为0.002%～0.4%；

乙二胺四乙酸二钠0.006%～0.04%；

在pH为8.5的四硼酸钠-硼酸缓冲溶液中配制。

上述制备方法中所用原料均从供应商购买并直接使用（见具体实施方式）。

所述化学发光试剂的具体应用：

本发明的化学发光试剂是HRP酶底物，而HRP被广泛应用于生物酶标记，如抗体的HRP标记、DNA或RNA的HRP标记。因此，只要用到HRP酶的地方都可使用本发明的产品。具体来讲，本发明可广泛应用于医疗诊断、生物技术、生命科学、食品安全、环保检测等领域，包括免疫分析以及DNA、RNA或蛋白质的分析检测，特别是酶促化学发光免疫检测，如癌症生物标记物（PSA、AFP、CEA等）的检测、甲状腺功能检测（T4、T3、TSH等）、激素检测（HCG、FSH、E2、LH、PRL等）、急性心肌梗死型心脏病检测（CK-MB、cTnI、cTnT、Mb等）、病毒检测（乙型肝炎e抗原HBeAg、乙型肝炎核心抗原HBcAg等）、素肉精检测等。

本发明的技术方案中，包括酶底物、发光增强剂、本底控制剂、缓冲液等。其中的关键技术（也是本发明的关键）是依据HRP-鲁米诺化学发光原理而设计的使用发光增强剂来增加化学发光强度、以及使用抗氧化剂及螯合剂来降低本底的技术。

本发明使用特殊的发光增强剂来增加化学发光强度，并将其用于增强型化学发光酶免分析检测。相对于新一代的增强剂（如Pierce的吩噻嗪类增强剂等）来讲，许多经典的化学发光增强剂（如对-碘苯酚、对-苯基苯酚等）的增强效果其实很弱。另一方面，太强的增强剂也会遇到一些问题，比如吩噻嗪类增强剂对纯度的要求极高，微量的杂质对发光效率、线性、背景等都会造成很大影响。同时，过强的发光效率会造成较快的衰减，导致较差的发光稳定性。

本发明的核心技术是使用本底控制剂（特别是抗氧化剂）来调节化学发光，对增强型化学发光酶免分析检测的背景或本底控制、信噪比的提高等很有效。其依据是如何控制HRP-鲁米诺发光体系中鲁米诺自由基及相关自由基的浓度。很多抗氧化剂可降低、减少或抑制有害自由基（如超氧阴离子自由基、羟基自由基、次氯酸自由基）的生成，在生物医药（如抗癌、抗衰老）、美容化妆品、食品饮料等领域有着广泛的应用。这些抗氧化剂包括各类维生素、含巯基化合物、酚类或多酚类化合物、苯胺类化合物、抗氧化性酶（超氧化物歧化酶Superoxidedismutase,过氧化氢酶catalase，过氧化物酶peroxiredoxins、硫氧还蛋白及谷胱甘肽系统thioredoxin & glutathione systems等）、各类植物提取液、代谢产物（谷胱甘肽、尿酸、褪黑素、抗坏血酸等）。当被加入到化学发光反应系统后，抗氧化剂对整个发光系统产生很大影响，包括发光强度、线性、本底、信噪比、稳定性等。当然，这些影响与抗氧化剂的浓度密切相关。

附图说明

图1为抗氧化剂对HRP化学发光本底的影响。由图1可知，抗氧化剂可有效地降低HRP底物发光的本底，不同的抗氧化剂对HRP底物的发光本底有不同的影响，而且其影响与抗氧化剂的浓度直接相关，一些非常有效的抗氧化剂，在高nM至低μM范围内就对本底有强烈影响，而其它的抗氧化剂则可能要求几百个μM的浓度才合适。图1中的乙酰半胱胺酸、白藜芦醇、核黄素、维生素B1只是本发明使用的部分抗氧化剂。

图2为抗氧化剂对HRP化学发光信噪比的影响。在图2中，I：乙酰半胱胺酸;II：白藜芦醇;III：核黄素;IV：维生素B1;V：无抗氧化剂；由图2可知，抗氧化剂可有效地提高HRP检测的信噪比，其提高程度与氧化剂及其浓度有关，如本实验中的白藜芦醇可将无抗氧化剂的化学发光信噪比提高9倍以上。

图3为抗氧化剂对HRP化学发光线性的影响。在图3中，各标记为：◆乙酰半胱胺酸，■白藜芦醇，▲核黄素，-维生素B1，●无抗氧化剂；由图3可知，抗氧化剂对HRP化学发光线性的影响与其种类及其浓度直接相关；在同样浓度下，不同的抗氧化剂对线性影响不同；对同一抗氧化剂来说，太高的浓度可抑制HRP酶反应，导致不良的化学发光线性。白藜芦醇、乙酰半胱胺酸对曲线斜率也有影响。

图4为本发明HRP底物的热稳定性。在图4中，各标记为：◆室温-5天;■37°C-1天;▲37°C-5天；由图4可知，维生素B1对线性的影响；HRP底物溶液A（含抗氧化剂维生素B1及增强剂）和溶液B（含过氧化物）分别放置，一组放置于室温，一组放置于37°C，1天、5天后，其取出2mL做对比试验。在此条件下，本发明的HRP底物在37°C下培养5天之后，其线性变化很小。

图5为本发明HRP底物的热稳定性。由图5可知，维生素B1对本底的影响。实验条件与图4一样。在此条件下，本发明的HRP底物在37℃下培养5天之后，其本底变化很小。

图6为本发明HRP底物的热稳定性。在图6中，A∶室温-5天;B∶37℃-1天;C：37℃-5天；由图6可知，维生素B1对信噪比的影响，实验条件与图4一样，在此条件下，本发明的HRP底物在37℃下培养5天之后，其信噪比变化很小。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

⑴所需仪器：

Orion II Microplate Luminometer（Berthold，Germany）、全自动酶标洗板仪（PW-812，汇松）、紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)，全自动新型电热培养箱（ZDP-A2080A，上海智城分析仪器制造有限公司）。

⑵所需药品：

除非特殊注明，下列药品是从Sigma-Aldrich、Alfa、TCI、百灵威、西亚、国药、北京万泰等商业机构购买并直接使用。

鲁米诺钠盐、双氧水、硼酸、硼酸钠、Tris盐酸盐、Tris碱、硼酸盐、HEPES、磷酸盐、碳酸盐、EDTA、吩噻嗪、盐酸、氢氧化钠、3-（-10-吩噻嗪基）丙烷-1-磺酸钠、对-碘苯酚、对-苯基苯酚、对-碘苯硼酸、对-溴苯硼酸、对-氯苯硼酸、脱脂牛奶、酪蛋白、Proclin、斛皮素（quecertin）、阿巍酸（ferulic acid）、核黄素（riboflavin）、维生素B1（thiamine）、褪黑素（melatonin）、精氨酸（Arginine）、白藜芦醇、吐温20（Tween20）、蔗糖（Sucrose）、酪蛋白钠盐，小牛血清（FBS）及牛血清白蛋白（BSA）（上海符达生物有限公司）、乙型肝炎抗原（HBeAg、HBcAg）、抗乙型肝炎核心抗原（anti-HBc）单克隆抗体20B11、抗乙型肝炎核心抗原（anti-HBc）单克隆抗体CZ、抗乙型肝炎e抗原（anti-HBe）单克隆抗体W1、抗乙型肝炎e抗原（anti-HBe）单克隆抗体W2、辣根过氧化酶（HRP）、单克隆抗体-HRP（MAb-HRP）共轭化合物、。

⑶操作方案：

A)HRP化学发光底物配制

本发明的HRP化学发光底物使用不同的A液，但使用同一B液。根据不同的抗氧化剂，可配制不同的A液。A液是在纯水中配制的。以下以乙酰半胱胺酸、维生素B1为例说明其具体配方。

i）实施案例1，含抗氧化剂乙酰半胱胺酸配方：

a）配制A液

鲁米诺单钠盐，浓度为0.01%;

吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐，浓度为0.05%;

乙酰半胱胺酸，浓度为0.00003%；

在纯水中配制。

b）配制B液

过硼酸钠，浓度为0.03%;

乙二胺四乙酸二钠，浓度为0.008%;

在pH值为8.5的四硼酸钠-硼酸缓冲溶液中配制。

ii）实施案例2，含抗氧化剂维生素B1配方：

a）配制A液

鲁米诺单钠盐，浓度为0.01%;

吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐，浓度为0.05%;

维生素B1，浓度为0.001%。

在纯水中配制。

c）配制B液

过硼酸钠，浓度为0.03%;

乙二胺四乙酸二钠，浓度为0.008%;

在pH值为8.5的四硼酸钠-硼酸缓冲溶液中配制。

B)HRP化学发光底物在增强型化学发光酶免检测中应用

下面以96孔板乙型肝炎抗原（HBeAg或HBcAg）的增强型化学发光酶免检测为例来叙述操作方案：

一、乙型肝炎e抗原HBeAg（hepatitis B e antigens）检测

1、用抗-HBe单克隆抗体W1（包被缓冲液PB，pH7.4稀释1∶1000至1μg/mL）来包被96孔化学发光板（厦门怡嘉美有限公司），每孔100μL包被液。在37℃培养箱孵育2h。

2、用洗涤液（PBS+0.1%吐温，pH7.4）洗板1次，加200μL封闭液（10%蔗糖,1%酪蛋白钠盐,and2%BSA in PBS,pH7.4），在37℃培养箱培养2h。甩干封闭液，抽干备用。

3、将大肠杆菌表达纯化后重组的HBeAg全长蛋白用20%NBS稀释至10ng/mL,再倍比稀释至10pg/mL，制备为样品。

4、将样品分别100μL加入孔中，37℃培养箱孵育1h。

5、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板5次。

6、用酶的稀释液（FBS，上海符达生物有限公司）将HRP标记好的抗-HBe单克隆抗体W2稀释至1∶2000，配制为酶标试剂。

7、每孔加入稀释好的酶标试剂100μL，37℃孵育30min。

8、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板5次。

9、将含有抗氧化剂（如斛皮素、阿巍酸、核黄素、维生素B1、褪黑素、精氨酸或白藜芦醇）的HRP底物A液与B液混匀，每孔加入100μL。

10、用化学发光检测仪Orion II Microplate Luminometer(Berthhold,Germany)读板。数据用Excel处理。

二、乙型肝炎核心抗原HBcAg（Hepatitis B Core Antigen）检测

1、用抗-HBc单克隆抗体20B11（2.4mg/mL）（包被缓冲液PB，pH7.4稀释1∶1000至2.4μg/mL）来包被96孔化学发光板（厦门怡嘉美有限公司），每孔100μL包被液。在37℃培养箱孵育2h。

2、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板1次，加200μL封闭液（10%蔗糖,1%酪蛋白钠盐,and2%BSA in PBS,pH7.4），37℃孵育2h。

3、甩干封闭液，抽干备用。

4、将大肠杆菌表达纯化后重组的HBcAg全长蛋白（抗原C1830）用20%NBS（婴牛血清+PBS）稀释至100ng/mL,再倍比稀释至100pg/mL，制备为样品。

5、将样品分别100μL加入孔中，37℃孵育1h。

6、用洗涤液（PBS+0.1%Tween20，pH7.4）洗板5次。

7、将用酶的稀释液将HRP标记好的抗-HBc单克隆抗体CZ（Anti-HBc C1-HRP）用NRAED溶液（北京万泰）稀释至1∶2000，配制为酶标试剂.

8、每孔加入稀释好的酶标试剂100μL，37℃孵育30min。

9、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板5次。

10、将含有抗氧化剂（如斛皮素、阿巍酸、核黄素、维生素B1、褪黑素、精氨酸或白藜芦醇）的HRP底物A液与B液混匀，每孔加入100μL。

11、用化学发光检测仪Orion II Microplate Luminometer(Berthhold,Germany)读板。数据用Excel处理（表1）。

三、HRP底物储藏稳定性测试

1、含抗氧化剂白藜芦醇的HRP底物A液和B液配制好后，放置于4℃、室温或37℃培育。在不同时间从37℃培育的样品中取出2mL，以备在最后一天与其它样品一起测试。

2、用抗-HBc单克隆抗体20B11（2.4mg/mL）（包被缓冲液PB，pH7.4稀释1∶1000至2.4μg/mL）来包被96孔化学发光板（厦门怡嘉美有限公司），每孔100μL包被液。在37℃培养箱孵育2h。

3、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板1次，加200μL封闭液（10%蔗糖,1%酪蛋白钠盐,and2%BSA in PBS,pH7.4），37℃孵育2h。

4、甩干封闭液，抽干备用。

5、将大肠杆菌表达纯化后重组的HBcAg全长蛋白（抗原C1830）用20%NBS（婴牛血清+PBS）稀释至100ng/mL,再倍比稀释至100pg/mL，制备为样品。

6、将样品分别100μL加入孔中，37℃孵育1h。

7、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板5次。

8、用酶的稀释液将HRP标记好的抗-HBc单克隆抗体CZ（Anti-HBc C1-HRP）用NRAED溶液（北京万泰）稀释至1∶2500，配制为酶标试剂.

9、每孔加入稀释好的酶标试剂100μL，37℃孵育30min。

10、用洗涤液（PBS+0.1%吐温20，pH7.4）洗板5次。

11、将含有维生素B1（表2）的HRP底物A液与B液混匀，每孔加入100μL。

12、用化学发光检测仪Orion II Microplate Luminometer(Berthhold,Germany)读板。数据用Excel处理（表2）。

⑷实验数据：

表1.含不同抗氧化剂的HRP底物在乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的化学发光酶免检测中的应用。此数据被用制作图1～3。

表1.乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的化学发光酶免检测

表2.含抗氧化剂（维生素B1）的HRP底物稳定性测试数据。乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的化学发光酶免检测：HRP底物A液、B液配制好后，放置于4℃、室温或37℃培育十天后进行测试。此数据被用制作图4、图5及图6。

表2.含抗氧化剂（维生素B1）的HRP底物稳定性测试数据

1、抗氧化剂对HRP-鲁米诺化学发光强度的影响

抗氧化剂会对HRP鲁米诺化学发光系统的发光强度产生重大影响。当抗氧化剂的浓度过低时，其对发光系统影响很小；当抗氧化剂的浓度过高时，整个发光系统将会被完全抑制。因此，抗氧化剂的浓度必须经过试验调整以达到既能调控整个系统发光性质，又能保持合适的发光强度。一般来说，抗氧化剂的浓度范围在0.0000001%～0.02%之内，最佳范围为0.000001%～0.002%。同时，不同的抗氧化剂对发光的影响差别很大，如斛皮素（quecertin）是一个非常强的抗氧化剂，只需纳摩尔级（nM）浓度就可影响发光效率；而有的抗氧化剂（如精氨酸）则需要低毫摩尔的浓度才有影响。

2、抗氧化剂对HRP-鲁米诺化学发光本底的影响

对于增强型化学发光酶免分析来说，发光本底值对于检测范围、灵敏度、信噪比等都有重要影响。因此，本底的控制对于一个新发光体系的开发很重要。本发明通过使用合适的抗氧化剂来调节本底。如图1所示，不同的抗氧化剂对本底的影响不同。在能保持合适线性范围的浓度情况下，一些抗氧化剂能明显地降低本底，如斛皮素（quecertin）、阿巍酸（ferulicacid）、核黄素（riboflavin）及维生素B1（thiamine），而其它抗氧化剂则对本底影响较小，如褪黑素（melatonin）、精氨酸（Arginine）等。

3、抗氧化剂对HRP--鲁米诺化学发光信噪比的影响

信噪比是增强型化学发光酶免分析技术中一个关键的指标，对提高酶免检测灵敏度很重要。对于使用增强型化学发光酶免分析技术来说，本底是一个特别突出的大问题，这是因为增强剂在增强发光量的同时也提高了本底。因此，系统的信噪比会受到很大的影响。传统的解决办法是利用螯合剂，如EDTA、CDTA、EGTA等。这些螯合剂通过对体系中的二价金属离子的调节来控制HRP酶的活性进而降低本底，但此类技术只能将本底降低到一定程度。由此看来，增强型化学发光酶免分析技术急需新的技术来控制本底。一种办法是使用脱脂牛奶或酪蛋白(casein)，但我们的实验结果表明脱脂牛奶或酪蛋白的稳定性很差，即使是在抗菌素的存在下，脱脂牛奶或酪蛋白也很容易变坏，造成本底提高、信噪比降低、线性变差等现象。

本发明在螯合剂的基础上通过使用抗氧化剂来进一步降低本底，可大大提高系统的检测信噪比。如图2所示，不同的抗氧化剂对于信噪比提高的影响不一样，在2.56NCU抗原的情况下，其信噪比可达超过901倍（白藜芦醇），是不加抗氧化剂信噪比的9倍。

4、抗氧化剂对HRP--鲁米诺化学发光线性的影响

线性是增强型化学发光酶免分析技术中另一个关键的指标，对提高酶免检测范围很重要。不同的抗氧化剂对线性有不同的影响，这种影响与抗氧化剂的浓度直接相关。太高的浓度会导致在抗原浓度低的时候酶的活性差、线性也受到极大影响。即使在线性范围好的情形下，不同的抗氧化剂的线性的斜率的影响也不同。一个好的抗氧化剂是那些既能保持发光强度、保持线性范围，又能提高斜率的抗氧化剂。值得一提的是，一些抗氧化剂在检测目标的高浓度范围对发光强度影响不大，但在检测目标的低浓度范围影响较大，不仅可降低本底，还可调节检测曲线的斜率，如白藜芦醇、乙酰半胱胺酸、维生素B1等。这一类抗氧化剂具有本底低、线性好、曲线斜率高、发光强度适宜等特点，可以说是理想的抗氧化剂。

5、HRP底物的储藏稳定性

HRP底物的储藏稳定性对于终端用户来讲很重要，维持12～18个月的稳定性是其中一项重要要求。为了加快测试速度，人们通常使用37℃培养来模拟室温储藏。图4～图6显示本发明的产品在37℃下培养5天其线性、本底、信噪比等变化不大，相对稳定。另一组实验数据显示即使是在37℃下培养10天（相当于室温18个月）其线性、本底、信噪比等变化也不大。

增强型化学发光酶免分析技术对其酶底物有很高的要求，包括宽线性范围(>3log)、高信噪比、高灵敏度、低本底、可稳定储藏等，是酶免分析技术中的一个挑战性难题。本发明通过组合使用化学发光增强剂、本底抑制剂（特别是抗氧化剂）、缓冲液来解决上述困难，效果良好，为化学发光酶免检测提供一套有效的解决方案。除酶免检测外，本发明的酶底物可广泛应用于HRP相关的生物医药、生命科学、食品安全检测、环保检测以及反恐防恐监测等领域。

Claims

1.一种化学发光试剂，其特征在于按质量百分比的原料组成如下：

至少一种发光试剂，浓度为0.001%～0.1%；

至少一种氧化剂，浓度为0.001%～0.2%；

至少一种发光增强剂，浓度为0.01%～0.5%；

至少一种本底控制剂，浓度为0.000001%～0.05%；

pH值为8～11的缓冲液。

2.如权利要求1所述一种化学发光试剂，其特征在于所述发光试剂选自鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺相关的酰肼或环酰肼、吖啶酯及其衍生物、邻苯三酚、间苯三酚、间苯二酚中的一种；或选自能量转移类的鲁米诺衍生物，所述能量转移类的鲁米诺衍生物选自鲁米诺链接到吖啶酮、或鲁米诺链接到荧光素、或鲁米诺链接到罗丹明。

3.如权利要求1所述一种化学发光试剂，其特征在于所述氧化剂选自双氧水、尿素过氧化氢、过硼酸钠或其它可现场产生过氧化物的化合物中的至少一种，所述可现场产生过氧化物的化合物是指一些化合物本身并不是过氧化物，但在特定条件下可现场产生过氧化物。

4.如权利要求1所述一种化学发光试剂，其特征在于所述发光增强剂选自苯酚类化合物、苯胺类化合物、吩噻嗪类化合物、吡啶类化合物、硼酸化合物、非离子类洗涤剂中的至少一种；所述苯酚类化合物可选自对-甲氧基苯酚,邻-甲氧基苯酚,对,对'-联苯酚,对-苯基苯酚，对-碘基苯酚，对-溴苯酚，对-羟基肉桂酸，6-羟基苯并噻唑中的一种；所述苯胺类化合物可选自对-甲氧基苯胺,对-羟基-N,N’-二甲基苯胺,邻-苯二胺中的一种；所述吩噻嗪类化合物可选自3-（10-吩噻嗪基）丙烷-1-磺酸钠，10-(3-二甲基氨丙基)吩噻嗪及其衍生物中的一种；所述吡啶类化合物可选自4-二甲基氨基吡啶,4-二乙基氨基吡啶，4-甲基氨基吡啶，吗啉,4-吡咯烷吡啶,4-哌啶子基吡啶,4-（4-甲基哌啶子基）吡啶中的一种；所述硼酸化合物可选自对-碘苯基硼酸,对-氯苯基硼酸,间-氯苯基硼酸，3,4-二氯苯基硼酸，对-溴苯基硼酸中的一种；所述非离子类洗涤剂可选自曲拉通X-100，吐温20、吐温80,聚氧乙烯月桂醇醚,聚氧乙烯(16EO)羊毛醇醚中的一种。

5.如权利要求1所述一种化学发光试剂，其特征在于所述本底控制剂选自螯合剂、抗氧化剂、特殊蛋白质、特殊糖醇中的至少一种；所述特殊蛋白质可选自牛血清白蛋白、脱脂牛奶、酪蛋白卵白蛋白中的一种；所述特殊糖醇可选自半乳糖，D-甘露醇、山梨醇中的一种。

6.如权利要求5所述一种化学发光试剂，其特征在于所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、环己烷乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、二乙基三胺五乙酸、三乙基四胺六乙酸、丙基三胺五乙酸中的至少一种。

7.如权利要求5所述一种化学发光试剂，其特征在于所述抗氧化剂包括各类可以与自由基作用或反应的小分子化合物、高分子化合物、生物大分子、生物酶中的至少一种。

8.如权利要求7所述一种化学发光试剂，其特征在于所述小分子化合物选自还原剂、维生素、含巯基化合物、酚类或多酚类化合物、有机磷类化合物中的至少一种；所述高分子化合物可选自多聚酚类化合物、多聚苯胺类化合物、多聚硫化物中的至少一种；所述生物酶可选自抗氧化性酶，所述抗氧化性酶可选自超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白及谷胱甘肽系统中的至少一种；所述还原剂可选自氯化亚铁、氯化锡、焦亚硫酸钠、亚硒酸钠中的至少一种；所述维生素可选自维生素C、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6中的至少一种；所述含巯基化合物可选自乙酰半胱胺酸、二硫苏糖醇、硫辛酸、二氢硫辛酸、2-巯基乙醇中的至少一种；所述酚类或多酚类化合物可选自斛皮素、阿巍酸、核黄素、白藜芦醇、没食子酸、2-叔丁基-4-羟基茴香醚、2,6-对二叔丁基对甲酚或其它天然多酚类化合物；所述有机磷类化合物可选自三羧乙基膦、三羧丁基膦、三（间-苯磺基）膦及其衍生物中的至少一种。

9.如权利要求5所述一种化学发光试剂，其特征在于所述抗氧化剂选自具抗氧化性的各类生物提取液、植物提取液中的一种，所述植物提取液可选自葡萄提取液、中药提取液中的至少一种；所述抗氧化剂可选自各类生物代谢产物，所述生物代谢产物可选自谷胱甘肽、尿酸、褪黑素、抗坏血酸中的至少一种。

10.如权利要求1所述一种化学发光试剂，其特征在于所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸盐、碳酸盐中的至少一种。