CN101221170A - 高效酶促化学发光底物系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效稳定的酶促化学发光底物系统。所述酶促化学发光底物系统由A液和B液两组组份构成，A液中含化学发光底物，B液中含有复合增强剂，在临用前将A液与B液等体积混合。其中A液中的化学发光底物为鲁米诺钠盐或其衍生物，B液中的复合增强剂为3－氯－4羟基乙酰苯胺和四水合过硼酸钠。该底物系统具有发光信号强，起效迅速，2分钟内可达发光平台，发光持续时间长等多种优点。另外还提供了含有该底物系统的化学发光免疫检测试剂盒。

Description

高效酶促化学发光底物系统

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及可用于化学发光免疫检测的一种高效酶促化学发光底物系统。

背景技术

本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术己从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)基本相似，但与放射免疫试剂(RIA)比较，化学发光避免了放射性核素的污染以及对操作人员的伤害，大大缩短了反应时间，同时兼具高灵敏度的优势。化学发光的灵敏度与可测范围远远高于酶免疫产品，同时兼具ELISA法简便的操作方法与较短的反应时间。

化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

常规的化学发光免疫检测试剂盒通常包括包被待测物抗体的聚苯乙烯板或板条、待测物系列标准品、检测试剂以及酶促化学发光底物系统。

目前市售的化学发光免疫检测试剂盒中的酶促化学发光底物系统的缺点在于：检测的灵敏度和特异性不够高、试剂稳定性不够、成本较高、检测不够简便快捷等等。

为解决上述问题，本发明提供了一种酶促化学发光底物系统以及含有该底物系统的增强型化学发光免疫检测试剂盒。

发明内容

本发明提供了一种酶促化学发光底物系统，所述酶促化学发光底物系统由A液和B液两组组份构成，A液中含化学发光底物，B液中含有复合增强剂，在临用前将A液与B液混合。

在本发明的另一方面，还提供了含有上述酶促化学发光底物系统的化学发光免疫检测试剂盒。

本发明酶促化学发光底物系统以及含有该底物系统的免疫检测试剂盒在用于免疫检测时具有如下优点：精确性和特异性强、灵敏度和稳定性高、污染小，成本低、检测简便快捷等，适合于医院检验部门对患者的血清进行人体免疫分析，为临床大夫提供诊断信息。

附图说明

图1示出了用某市售酶促化学发光底物系统进行HRP催化化学发光反应的动力学曲线。

图2示出了用本发明的酶促化学发光底物系统进行HRP催化化学发光反应的动力学曲线。

图3示出了本发明的酶促化学发光底物系统的标准曲线。

图4示出了使用本发明的一种示例性试剂盒进行雌二醇(E2)检测的标准曲线。

图5示出了使用本发明的一种示例性试剂盒进行三碘甲状腺原氨酸(T3)检测的标准曲线。

具体实施方式

由于酶促化学发光底物系统直接影响检测信号的大小，检测灵敏度及测量范围。因此，本发明提供了一种高效稳定的酶促化学发光底物系统，所述酶促化学发光底物系统由A液和B液两组组份构成，A液中含化学发光底物，B液中含有复合增强剂，在临用前将A液与B液等体积混合。

本发明的酶促化学发光底物系统为基于HRP-鲁米诺的发光系统，包括化学发光底物和复合增强剂。

在本发明的一个实施方案中，所使用的化学发光底物为鲁米诺钠盐，其分子式为：C₈H₆N₃O₂Na，结构式为：

在本发明的另一个实施方案中，所使用的化学发光底物为鲁米诺衍生物，鲁米诺衍生物的实例例如氨丁基乙基异鲁米诺和氨己基乙基异鲁米诺，它们结构式分别如下：

氨丁基乙基异鲁米诺                              氨己基乙基异鲁米诺。

在本发明的一个优选实施方案中，A液中的化学发光底物为鲁米诺钠盐，其浓度为0.005％-0.09％。

在本发明的另一个优选实施方案中，B液中的复合增强剂为3-氯-4羟基乙酰苯胺和四水合过硼酸钠，浓度分别为0.003％-0.09％和0.002％-0.05％。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述A液和B液中还含有稳定剂、防腐剂、金属螯合剂或离子强度调节剂等辅助物质。

在本发明的一个更优选的实施方案中，所述A液和B液的配方如下：

A液：

发光底物：鲁米诺钠盐，浓度为0.001％-0.8％；

稳定剂：甘氨酸，浓度为0.003％-0.7％；

金属螯合剂：DTPA，浓度为0.0001％-0.5％；

二水合柠檬酸三钠，浓度为0.001％-0.9％；

防腐剂：苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.8％；

叠氮钠，浓度为0.001％-0.07％；

缓冲系统：pH8.5的硼酸-硼酸钠缓冲液；

B液：

复合增强剂：3-氯-4羟基乙酰苯胺，浓度为0.001％-0.9％；

四水合过硼酸钠，浓度为0.001％-0.9％；

离子强度调节剂：NaCl，浓度为0.01-0.9％；

防腐剂：苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.8％；

叠氮钠，浓度为0.001％-0.07％；

缓冲系统：pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠盐缓冲液。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述A液和B液的配方如下：

A液：

化学发光底物：鲁米诺钠盐，浓度为0.005％-0.09％；

稳定剂：甘氨酸，浓度为0.003％-0.07％；

金属螯合剂：DTPA，浓度为0.0001％-0.07％；

二水合柠檬酸三钠，浓度为0.025％-0.9％；

防腐剂：苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.02％；

叠氮钠，浓度为0.002％-0.045％；

缓冲系统：pH值为8.5的硼酸-硼酸钠缓冲液；

B液：

复合增强剂：3-氯-4羟基乙酰苯胺，浓度为0.003％-0.09％；

四水合过硼酸钠，浓度为0.002％-0.05％；

离子强度调节剂：NaCl，浓度为0.02-0.9％；

防腐剂：苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.02％；

叠氮钠，浓度为0.002％-0.045％；

缓冲系统：pH值为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠盐缓冲液。

上述的底物系统在碱性条件下被HRP催化，发生偶合反应，产生光子，通过化学发光仪检测发光信号，根据光信号的强弱来进行HRP配合物定量检测。该底物系统具有如下优点：发光信号强，起效迅速，2分钟内可达发光平台，发光持续时间长，平台期约为150分钟，试剂在4℃可保存达15个月以上。

含有本发明的酶促化学发光底物系统的化学发光免疫检测试剂盒。

本发明还提供了含有上述酶促化学发光底物系统的化学发光免疫检测试剂盒。在所述试剂盒中包括上述的高效稳定的酶促化学发光底物系统、检测分析试剂以及酶标记复合物。

优选地，本发明的化学发光免疫检测试剂盒包括如下组成部分：盒体、用于包被待测物的微孔板和多个装有多种试剂的小瓶，在所述装有多种试剂的小瓶中提供了高效稳定的酶促化学发光底物系统、检测分析试剂、酶标记复合物以及待测物系列标准品。任选地，试剂盒中还包括该试剂盒的使用说明书。

本发明试剂盒中的用于包被待测物的微孔板可以是聚苯乙烯板或板条，也可以是本领域已知的任何其他合适的板或板条。

一般实验方案

本发明的实验方案基于抗原-抗体的免疫反应和酶促化学发光反应，从而对特异性的抗原或抗体进行检测。除本说明书所给出的检测方法以外，可以使用本领域技术人员认为合适的其他任何方法。

下面给出一种示例性的实验方案：

将抗体包被于白色不透明聚苯乙烯微孔板或可拆卸板条中，标记物为HRP标记的抗原或抗体，温育反应采用37℃恒温箱。使用时，取患者血清适量加入包被孔中，同时加入酶标记物及分析检测试剂，放小型震荡器上震荡1分钟，放恒温箱内温育，这时反应微孔中发生抗原抗体反应，形成免疫复合物，用洗板机洗板，多余的酶标记物及未反应物被除去，然后加入提前等量混合好的化学发光底物，震荡1分钟，放入化学发光仪，读取每孔的相对发光值，  然后与标准曲线对照，化学发光仪自动换算成相应的被测物的具体含量，然后通过打印机将结果打印。

应当理解的是，上述实验方案以及在本说明书实施例中所使用的实验方案及有关参数并不是限制性的。本领域技术人员能够根据具体情况以及待测物质选择合适的实验方案以及有关参数。

本发明试剂盒的应用

使用本发明的检测试剂盒，可以进行如下各类体外检测：

(1)肿瘤标志物系列：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、β2微球蛋白(β2-MG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(F-PSA)、癌抗125(CA125)、癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原19-9(CA19-9)、CA50；

(2)甲状腺功能系列：甲状腺素(T4)、游离甲状腺素(F-T4)、三腆甲腺原氨酸(T3)、游离三腆甲腺原氨酸(F-T3)、促甲状腺素(TSH)、抗-TG、抗-TPO；

(3)生殖内分泌激素系列：垂体泌乳素(PRL)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)、孕酣(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2)；

(4)传染病系列：甲肝(HAV)、乙肝五项(HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc)、丙肝(HCV)、丁肝(HDV)、庚肝(HGV)、HIV(1+2)、TORCH；

(5)心肌标志物系列：cTnI，cTnT，Mb，CK-MB，TNP；

(6)糖尿病系列：胰岛素、血清C肽；

(7)其他检测系列：皮质醇、总IgE。

应当理解的是，在上述应用中，本领域技术人员能够根据具体待测物质选择合适的抗原或抗体以及合适的实验方案。

实施例

提出以下实施例，以便为本领域技术人员更好地理解和实施本发明，这仅是出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。

对比实施例：现有技术的酶促化学发光底物系统的发光效力。

方法：商购某市售含有酶促化学发光底物系统的试剂盒。按其实验说明书，在微孔板中加入150μL该化学发光底物系统的底物液，再加入50μLHRP(50ng/L)，混匀，使用石家庄康普生科技有限公司KPS-II型化学发光免疫分析仪测量光子，每60秒测量一次，测量1小时。

结果：在图1中示出了该市售化学发光底物系统的HRP催化化学发光反应的动力学曲线。图1中横坐标为测试时间(分钟)，纵坐标为发光值(RLU值)。

实施例1：本发明的酶促化学发光底物系统的发光效力。

方法：在微孔板中加入如下配方的本发明的底物液：

A液(75μL)：

  鲁米诺钠盐，浓度为0.082％；

  甘氨酸，浓度为0.016％；

  DTPA，浓度为0.035％；

  二水合柠檬酸三钠，浓度为0.025％；

  苯甲酸钠，浓度为0.001％；

  叠氮钠，浓度为0.002％；

  pH8.5的硼酸-硼酸钠缓冲液；

B液(75μL)：

  3-氯-4羟基乙酰苯胺，浓度为0.0716％；

  四水合过硼酸钠，浓度为0.0052％；

  NaCl，浓度为0.033％；

  苯甲酸钠，浓度为0.001％；

  叠氮钠，浓度为0.002％；

  pH5.0的柠檬酸一柠檬酸钠盐缓冲液。

将上述A液和B液等体积混合即成为150μL本发明的底物液，再加入50μL HRP(50ng/L)，混匀，使用石家庄康普生科技有限公司KPS-II型化学发光免疫分析仪测量光子，每60秒测量一次，测量1小时。

结果：在图2中示出了本发明化学发光底物系统的HRP催化化学发光反应的动力学曲线。图2中横坐标为测试时间(分钟)，纵坐标为发光值(RLU值)。

由图1和图2的结果可以看出，在相同实验条件下，本发明化学发光底物系统的发光值与某市售化学发光底物系统相比，发光值高，发光反应达到峰值的时间缩短，且具有很好的发光持续性。这在临床诊断中具特别重要意义，可保证测量结果的准确性和可重复性。

实施例2：本发明的酶促化学发光底物系统的标准曲线及灵敏度

将HRP稀释成系列浓度：0.04、0.02、0.4、2、4、20fmol/mL，每孔加入如实施例1所述的150μL底物液，2min后测量发光值。以HRP浓度为横坐标，发光值RLU为纵坐标，取双对数作标准曲线，示于图3。

灵敏度：以分析缓冲液为“0”标准，平行测定10孔，以

计算，对应于标准曲线上HRP浓度即为分析灵敏度，为2.4amol/孔。

实施例3：雌二醇(E2)化学发光免疫检测试剂盒

雌二醇(Estradiol)为C18类固醇激素，分子量为272.4。它是雌性激素中活性最强的一种，主要产自卵巢和胎盘，少量产自肾上腺皮质和男性睾丸。

分泌进入血液的E2中98％与性激素结合球蛋白(SHBG)结合循环，少量的与其他血清蛋白如白蛋白结合，仅有很少部分以游离激素状态循环。雌激素的活性通过雌二醇-受体复合物在靶位上激发适当的反应。这些靶位包括卵泡、子宫、胸腺、阴道、下丘脑、垂体，对肝脏和皮肤也有较小的作用。

月经周期正常的未孕女性，E2的分泌遵循一种循环的两阶段模式，在排卵前达到最高浓度，排卵后E2水平快速下降，直至黄体细胞活跃产生第二次平缓的上升，并在黄体期形成平台。在孕期母亲血清E2水平明显升高，远高于上述的排卵前峰值水平，而且高水平的E2浓度持续整个孕期。

血清E2测定对评价各种月经异常是非常有用的指标：如女孩青春期提前或延迟、原发性或继发性闭经、卵巢早衰等。据报道，男性患有女性化综合征、乳房女性化以及睾丸癌的病人也会有E2升高。在不育症患者中，血清E2的监测对于监控诱导排卵及随后的治疗，例如用柠檬酸克罗米芬、LH释放激素(LHRH)或外源性的促性腺激素的治疗是非常有用的。在体外受精(IVF)中，对卵巢进行过激刺激时，通常每天对绒毛膜促性腺激素的使用和卵母细胞的收集进行最佳的调整，也需要检测血清E2浓度。

本试剂盒用于测定人血清或血浆中的总E2浓度。

实验原理：

本试剂盒应用竞争抑制法测定血清中E2的含量。将E2标准品或病人血清、兔抗E2抗体及E2-HRP结合物均加入抗兔IgG包被的微孔中一起温育，血清样品中的E2和E2-HRP与恒定量的兔抗E2抗体竞争结合，形成的复合物与固相上的抗兔IgG结合，最终结合在固相上的E2-HRP的量与血清中E2浓度成反比。加入化学发光底物，测定每孔发光值，发光强度与标本中E2的含量成反比。以系列标准品发光值为纵坐标(y轴)，以标准品浓度为横坐标(X轴)作图，即得到标准曲线。血清样品中雌二醇浓度可相应从该标准曲线上查得。

操作步骤：

实验前准备：

1.确保操作环境在室温(18-25℃)，取出试剂盒及待测样品。将所有试剂及样品恢复至室温(约需30分钟)。

2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。

3.液体标准品可以直接使用；固体标准品按要求充分溶解后使用。

4.将化学发光底物A、B液等比例混合至试验所需体积(每孔需200μl)。

实验过程：

1.取出一定量的包被孔编号，每孔分别加入25μl标准品或血清样品。

2.每孔分别加入待测E2分析物50μl。

3.每孔分别加入E2-HRP结合物100μl，充分混匀30秒。

4.37℃温育16分钟。

5.洗板：甩尽板孔内液体，用蒸馏水或去离子水注满各孔，甩去，重复5次，最后在吸水纸上拍干。亦可用洗板机机洗7次。

6.每孔加入混合后的底物200μl，室温(18-25℃)反应5分钟。

7.化学发光检测仪检测发光强度。

结果计算：

本试剂盒采用4P-Logistic-1.0拟和方式，以标准品发光强度值为横坐标(x轴)，以标准品浓度值为纵坐标(y轴)，建立标准曲线，进行计算。

在图4中示出了E2检测的标准曲线。

实施例4：三碘甲状腺原氨酸(T3)化学发光免疫检测试剂盒

3，5，3’三腆甲状腺原氨酸(T3)与T4相同，由甲状腺合成及分泌入血。血清中T3的量约是T4的1/60，但其生物活性比T4大5倍。故血清中三碘甲状腺原氨酸(T3)的浓度是评价甲状腺功能的重要参数，尤其用在确诊甲状腺功能亢进和检查甲状腺毒症时。T3的检测一般主要用于：

1.诊断甲状腺功能亢进：甲亢时血清中T3和T4浓度一般平行升高，但T3升高的幅度更明显。有些甲亢，T4升高不明显或未见升高，但T3明显升高，即为T3型甲亢。另外，甲亢时T3升高可能先于T4升高，因此，T3的检测对诊断及早期诊断甲亢很有意义。

2.评价治疗甲亢的疗效：甲亢在治疗过程中T4及T3先于临床症状的改善而下降，T4下降的速度快于T3，而且幅度较大，有时T4己降至正常范围，而T3仍高于正常。往往症状完全消失时，T3大多降至正常。因此要协同观察T3和T4作为治疗效果及临床变更药物的指标。

3.低T3综合症：许多疾病如肝硬化、肾病综合征、糖尿病酣症、恶性肿瘤、传染病、手术创伤后及心肌梗死等均可导致T3下降，下降的程度反应病情恶化的程度。

实验原理：

本试剂盒应用竞争型化学发光免疫测定技术检测血清中T3含量。将抗T3抗体包被在微孔板上，制成固相抗体，试剂盒中的酶结合物为辣根过氧化物酶标记的T3，往包被抗体的微孔中同时加入T3标准或待测血清以及酶标T3，二者共同与抗体竞争，反应后冲洗微孔板去掉未结合物，再加化学发光底物测定每孔发光值，其发光强度与T3含量成反比。

操作步骤：

实验前准备：

1.将所有试剂恢复至室温(约半小时)，整个操作环境应该控制在20到25度。

2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。

3.液体标准品可以直接使用；固体标准品要按要求充分溶解后使用。

4.将化学发光底物A、B液等比例混合至实验所需体积(每孔需200μl)。

实验过程：

1.将所需用量的微孔条放置在支架上：

2.在反应微孔中依次加入20μl标准品或待测标本；

3.每孔分别加入待测T3分析物80μl。

4.每孔加入80μl的T3-酶结合物，轻轻震荡微孔支架，充分混匀：

5.贴封膜后，37℃温育30分钟；

6.洗板，手动洗涤5次或洗板机机洗7次。

7.每孔加混合后的底物200μl，室温反应5分钟。

8.化学发光检测仪检测发光强度值。

结果计算：

本试剂盒采用4P-Logistic-1.0拟和方式，以标准品发光强度值为横坐标(x轴)，以标准品浓度值为纵坐标(y轴)，建立标准曲线，进行计算。

在图5中示出了T3检测的标准曲线。

在本说明书中，除非另有说明，在表示浓度时，固体溶质在溶液中的浓度为重量百分比浓度，液体溶质在溶液中的份数为体积百分比浓度。实验温度以℃为单位或者为环境温度，实验压力接近或等于大气压。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下可对本发明进行各种修改和变动。通过本发明公开内容的教导，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例应仅理解为用于示例，本发明实际的范围以所附的权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种酶促化学发光底物系统，其特征在于所述酶促化学发光底物系统由A液和B液两组组份构成，A液中含化学发光底物，B液中含有复合增强剂，在临用前将A液与B液等体积混合。

2.根据权利要求1所述的酶促化学发光底物系统，其特征在于所述化学发光底物选自鲁米诺钠盐、氨丁基乙基异鲁米诺或氨己基乙基异鲁米诺，它们的结构式分别为：

鲁米诺钠盐

氨丁基乙基异鲁米诺                                氨己基乙基异鲁米诺。

3.根据权利要求2所述的酶促化学发光底物系统，其特征在于所述A液中的化学发光底物为鲁米诺钠盐，其浓度为0.005％-0.09％。

4.根据权利要求2所述的酶促化学发光底物系统，其特征在于所述B液中的复合增强剂为3-氯-4羟基乙酰苯胺和四水合过硼酸钠，浓度分别为0.003％-0.09％和0.002％-0.05％。

5.根据权利要求4所述的酶促化学发光底物系统，其特征在于所述A液和B液的配方如下：

A液：

鲁米诺钠盐，浓度为0.005％-0.09％；

甘氨酸，浓度为0.003％-0.07％；

DTPA，浓度为0.0001％-0.07％；

二水合柠檬酸三钠，浓度为0.025％-0.9％；

苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.02％；

叠氮钠，浓度为0.002％-0.045％；

pH值为8.5的硼酸-硼酸钠缓冲液；

B液：

3-氯-4羟基乙酰苯胺，浓度为0.003％-0.09％；

四水合过硼酸钠，浓度为0.002％-0.05％；

NaCl，浓度为0.02-0.9％；

苯甲酸钠，浓度为0.001％-0.02％；

叠氮钠，浓度为0.002％-0.045％；

pH值为5.0的柠檬酸-柠檬酸钠盐缓冲液。

6.根据权利要求5所述的酶促化学发光底物系统，其特征在于所述A液和B液的配方如下：

A液：

鲁米诺钠盐，浓度为0.082％；

甘氨酸，浓度为0.016％；

DTPA，浓度为0.035％；

二水合柠檬酸三钠，浓度为0.025％；

苯甲酸钠，浓度为0.001％；

叠氮钠，浓度为0.002％；

pH8.5的硼酸-硼酸钠缓冲液；

B液：

3-氯-4羟基乙酰苯胺，浓度为0.0716％；

四水合过硼酸钠，浓度为0.0052％；

NaCl，浓度为0.033％；

苯甲酸钠，浓度为0.001％；

叠氮钠，浓度为0.002％；

pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠盐缓冲液。

7.一种化学免疫检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有根据权利要求1-6任一项所述的酶促化学发光底物系统。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括检测分析试剂和酶标复合物。

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