CN106353505A - 基于催化信号放大的ApoE试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于催化信号放大的ApoE试剂盒,所述试剂盒包含R1试剂、R2试剂及校准品;所述R1试剂为含有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的磷酸盐缓冲体系,所述R2试剂为含有‑ApoE抗体和生物素标记的生物胺的磷酸缓冲体系,所述校准品包括4支不同ApoE浓度的牛血清基质校准品。本发明采用低分子含氮生物胺催化信号放大技术,利用敏感度极强的生物胺与过氧化物酶反应,增加试剂的反应浊度,使试剂的灵敏度提高,减少抗体用量,大大降低试剂成本,本发明解决了目前市场上ApoE试剂检测灵敏度不高,价格昂贵等问题,明显提高了测定结果的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属医学免疫体外诊断领域,具体涉及一种基于催化信号放大的ApoE试剂盒。
背景技术
载脂蛋白E(ApoE)是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。其分子量为34kD。ApoE可以在各种组织中合成,但肝脏为主,首先合成的是含有317个氨基酸的前肽,这个前肽在内质网中经过蛋白水解作用除去18个氨基酸的信号肽,再经过糖基化作用和细胞外液的脱唾液酸形成成熟的ApoE;ApoE分泌入血液后转移到脂蛋白中。ApoE是脂蛋白所必须的结构蛋白,可通过与各组织细胞的受体结合,参与脂蛋白代谢,调节胆固醇水平,激活卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT),并具有某种免疫调节作用。测定ApoE对诊断和治疗高脂血症动脉粥样硬化等疾病提供了重要理论依据。
ApoE的检测原理为:试剂中的ApoE抗体与检测标本血清中的ApoE相遇,形成不溶性的抗原-抗体复合物,使反应液产生浑浊。通过测定340nm波长吸光度,并与校准曲线比较,求出标本中ApoE的含量。
已知测定ApoE的方法有层析法、电泳法、免疫分析法、其中层析法和电泳法操作繁琐,不能进行批量样本分析和直接上全自动生化分析仪等缺点,而免疫分析法中的免疫扩散法、放射免疫分析法、荧光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、化学发光免疫分析法也存在诸多不足之处;如需特殊的设备,样品需处理,不能上全自动生化分析仪进行批量监测分析等。临床常用的免疫比浊法因其样本用量少,可直接在全自动生化分析仪上批量样本分析、操作简单受其欢迎。
目前国内检测ApoE普遍采用免疫比浊法,该方法虽然操作简便,但灵敏度不高,不能满足临床对ApoE定量的要求。原因是国内ApoE检测试剂所用抗体存在纯度不高、批间差大等问题,而且主要抗原来源主要依靠进口,价格昂贵。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的是提供一种基于催化信号放大的ApoE试剂盒。该试剂盒用于检测血清中的ApoE的含量,以达到操作简便、灵敏度高、特异性好,快速、测定结果准确可靠的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种基于催化信号放大的ApoE试剂盒,包含R1试剂、R2试剂及校准品;所述R1试剂为含有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的磷酸盐缓冲体系,所述R2试剂为含有-ApoE抗体和生物胺的磷酸缓冲体系,所述校准品包括4支不同ApoE浓度的牛血清基质校准品。
优选地,所述R1试剂包括以下浓度的各组分:PH 7.0~7.6、50~200mmol/L磷酸盐缓冲液,50~200mmol/L聚合物,10~20mmol/L乙二胺四乙酸二钠,以及体积分数为0.1%~2%(V/V)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。链霉亲和素能与R2中的生物素发生不可逆反应而紧密结合在一起,产生生物素沉积。
优选地,所述聚合物为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一种或几种。
优选地,所述R2试剂包括以下浓度的各组分:PH 7.0~7.6、50~200mmol/L磷酸盐缓冲液,10~20mmol/L乙二胺四乙酸二钠,体积分数为0.1‰~2‰(V/V)的吐温-20,体积分数为10%~50%(V/V)ApoE抗体,10~200mmol/L生物素标记的含氮低分子生物胺。所述含氮低分子生物胺的浓度低于10mmol/L,会导致试剂灵敏度下降;浓度高于200mmol/L,会导致试剂的检测精密度下降。
优选地,所述含氮低分子生物胺包括酪胺、盐酸-3-羟基酪胺、苯乙胺中的一种或几种。
优选地,所述4支牛血清基质校准品的ApoE浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl。由于抗原抗体结合的过程中,吸光度与浓度之间不成线性关系,一般是三次方程曲线关系,采用多点定标方式,经三次曲线方程拟合出一条能反应真实情况的浓度与吸光度的关系曲线方程,使得检测结果更准确。
优选地,所述牛血清基质校准品中还包括以下浓度的各组分:防腐剂0.2~2.2%、吐温-20 1~10%、保护剂1~3%。
优选地,所述防腐剂包括Proclin 300。
优选地,所述保护剂包括甘油、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。
优选地,所述牛血清基质校准品的制备方法包括以下步骤:
在经过处理的牛血清,加入保护剂1~3%吐温-20 1~10%、防腐剂0.2~2.2%得到校准品稀释液;
将ApoE溶于校准品稀释液中,即制备得不同ApoE浓度的牛血清基质校准品。
本发明基于催化信号放大技术,采用免疫比浊法检测血清中的ApoE含量。采用低分子含氮生物胺催化信号放大,由于其敏感度极强,使得本发明的方法灵敏度能够检测到0.05mg/dl提高,而且可以减少抗体的使用量,降低了试剂的成本。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
(1)本发明试剂盒校准品采用牛血清基质,该牛血清基质由无HBV、HIV、HAV、HCV、TP传染源,对操作者危害极小;
(2)在试剂R1、R2中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素、生物素标记的含氮低分子生物胺,利用生物胺的过氧化物酶反应,生物胺在HRP催化下形成共价结合位点,产生大量酶促产物,这些产物可以与周围的蛋白残基结合,使得抗原-抗体结合部位有大量的生物素沉积,引起明显的浊度变化,使试剂灵敏度大大提高,在样品浓度低至0.05mg/dl时仍可检测出结果,而市售试剂的最低检测限为0.2mg/dl;
(3)本发明试剂盒与市售试剂(强盛生物试剂)相比灵敏度明显提高,如本发明试剂盒测定生理盐水时吸光度变化为1.4(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为1064.8(1/10000A),而强盛生物试剂测定生理盐水时吸光度变化为17.6(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为617.4(1/10000A)。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为4种不同含量的ApoE参考标准的标准曲线;
图2为分别采用本发明试剂和英国朗道公司的ApoE试剂对50份人血清测定结果的相关性分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种基于信号放大的ApoE检测试剂盒,组成如下:
1.试剂R1为:
2.试剂R2为:
3.校准品
4支ApoE浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基质校准品;每支牛血清基质校准品中还包括甘油1%,Proclin300 0.5%,吐温-20 1%。
所述牛血清基质校准品制备:
将经过处理的牛血清,加入甘油1%,Proclin300 0.5%,吐温-20 1%得到校准品稀释液。用ApoE溶于制备的类似人血清基质的溶液,制备不同浓度的校准品(1.25mg/dl,2.5mg/dl,5mg/dl,10mg/dl)。
本实施例描述的ApoE检测试剂盒,适用于各种类型的全自动生化仪,以日立7170全自动生化仪为例,其操作如表1。分析方法:两点终点法,即试剂R1、R2的用量分别为300ul和100ul,样本量3ul;300ul试剂R1加入3ul样本于37℃5min后,读取吸光度,然后加入100ulR2,反应5min后读取另一点;检测主波长为340nm。
采用本试剂及上述测定方法,采用日立7170生化分析仪测得的4种不同含量的ApoE校准品(自制)的曲线(如图1所示),每个点代表一个含量的参考校准品,其中X轴表示ApoE含量(mg/dl);Y轴表示吸光度。
表1
实施例2
本实施例提供一种基于信号放大的ApoE检测试剂盒,组成如下:
1.试剂R1为:
2.试剂R2为:
3.校准品
4支ApoE浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基质校准品;每支牛血清基质校准品中还包括甘油2.5%,Proclin300 1.5%,吐温-20 8%。
所述牛血清基质校准品制备:
将经过处理的牛血清,加入甘油2.5%,Proclin300 1.5%,吐温-20 8%得到校准品稀释液。用ApoE溶于制备的类似人血清基质的溶液,制备不同浓度的校准品(1.25mg/dl,2.5mg/dl,5mg/dl,10mg/dl)。
试剂盒具体操作方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种基于信号放大的ApoE检测试剂盒,组成如下:
1.试剂R1为:
2.试剂R2为:
3.校准品
4支ApoE浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl的牛血清基质校准品;每支牛血清基质校准品中还包括甘油3%,Proclin300 2.2%,吐温-20 10%。
所述牛血清基质校准品制备:
将经过处理的牛血清,加入甘油3%,Proclin300 2.2%,吐温-20 10%得到校准品稀释液。用ApoE溶于制备的类似人血清基质的溶液,制备不同浓度的校准品(1.25mg/dl,2.5mg/dl,5mg/dl,10mg/dl)。
所述试剂盒具体操作方法同实施例1。
实施例4、检测试剂的相关性试验
使用实施例1制备的试剂盒和对照试剂英国朗道公司的ApoE试剂,采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定,对测定值进行相关性分析。按照与上述“表1”中的参数进行测定测定结果见图2,X,Y轴均为测定值(ApoE的含量mg/dl)。
由图2的结果看出,两种试剂的相关系为R2=0.9977,回归方程为y=1.0189x+0.0204。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好,具有很好的特异性和准确性。此外,以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。本发明实施例2和3制备的试剂盒的特异性和准确性与实施例1的相当。
试验例5、最低检测限试验
本实施例的目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
实验原料:采用实验例2制备的试剂盒、对照试剂(强盛生物)、校准品、空白溶液(生理食盐水)、正常人血清样本,低值样本。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本,然后50%稀释成5个点,和零点一起每一个样本测试5次,计算平均值,求得SD数值。
结果解析:根据检测数据,计算SD数值和CV数值,分别计算1SD,2SD,从最小的开始,其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。表2显示,本发明试剂盒试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时,稀释平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD,表明本发明试剂盒试剂最低检测限至少可以达到0.05mg/dl。表3显示,强盛生物试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清,并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小,1/8和1/16稀释血清平均值-2SD的数值均小于零点平均值+2SD,表明强盛生物试剂最低检测限为0.2mg/dl左右。本发明实施例1和3制备的试剂盒最低检测限与实施例2的相当,至少可以达到0.05mg/dl。
表2
表3
试验例6、灵敏度实验
本实施例的目的是试剂盒试剂在测试生理盐水以及一定浓度的管理血清时的吸光度变化值。
实验原料:采用实验例3制备的试剂盒、对照试剂(强盛生物)、校准品、空白溶液、0.9%的生理食盐水,浓度的管理血清时的吸光度变化值。
机器:日立7170自动生化分析仪。
操作步骤:使用生理食盐水、低值样本,每个样本测试5次,计算吸光度。
表4、5显示,本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为1.4(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为1064.8(1/10000A),而强盛生物试剂测定生理盐水时吸光度变化为17.6(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为617.4(1/10000A),表明本发明试剂盒试剂灵敏度要显著高于强盛生物试剂。表4、5分别表示发明试剂盒试剂和强盛生物试剂灵敏度,表明本发明试剂盒试剂灵敏度明显好于强盛生物试剂。本发明实施例1和2制备的试剂盒灵敏度与实施例3的相当。
表4
表5
综上所述,本发明试剂盒校准品采用牛血清基质,该牛血清基质由无HBV、HIV、HAV、HCV、TP传染源,对操作者危害极小;在试剂R1、R2中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素、生物素标记的含氮低分子生物胺,利用生物胺的过氧化物酶反应,生物胺在HRP催化下形成共价结合位点,产生大量酶促产物,这些产物可以与周围的蛋白残基结合,使得抗原-抗体结合部位有大量的生物素沉积,引起明显的浊度变化,使试剂灵敏度大大提高,在样品浓度低至0.05mg/dl时仍可检测出结果,而市售试剂的最低检测限为0.2mg/dl;本发明试剂盒与市售试剂(强盛生物试剂)相比灵敏度明显提高,如本发明试剂盒测定生理盐水时吸光度变化为1.4(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为1064.8(1/10000A),而强盛生物试剂测定生理盐水时吸光度变化为17.6(1/10000A),理论浓度为5mg/dl血清样本时吸光度变化为617.4(1/10000A)。
本发明具体应用途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出,以上实施例仅用于说明本发明,而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,包含R1试剂、R2试剂及校准品;所述R1试剂为含有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的磷酸盐缓冲体系,所述R2试剂为含有-ApoE抗体和生物素标记的生物胺的磷酸缓冲体系,所述校准品包括4支不同ApoE浓度的牛血清基质校准品。
2.根据权利要求1所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述R1试剂包括以下浓度的各组分:PH 7.0~7.6、50~200mmol/L磷酸盐缓冲液,50~200mmol/L聚合物,10~20mmol/L乙二胺四乙酸二钠,以及体积分数为0.1%~2%的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
3.根据权利要求2所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述聚合物为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述R2试剂包括以下浓度的各组分:PH 7.0~7.6、50~200mmol/L磷酸盐缓冲液,10~20mmol/L乙二胺四乙酸二钠,体积分数为0.1‰~2‰的吐温-20,体积分数为10%~50%的ApoE抗体,10~200mmol/L生物素标记的含氮低分子生物胺。
5.根据权利要求4所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述含氮低分子生物胺包括酪胺、盐酸-3-羟基酪胺、苯乙胺中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述4支牛血清基质校准品的ApoE浓度分别为1.25mg/dl、2.5mg/dl、5mg/dl和10mg/dl。
7.根据权利要求6所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述牛血清基质校准品还包括以下体积百分含量的各组分:防腐剂0.2~2.2%、吐温-20 1~10%、保护剂1~3%。
8.根据权利要求7所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述防腐剂包括Proclin 300。
9.根据权利要求7所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述保护剂包括甘油、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。
10.根据权利要求7所述的基于催化信号放大的ApoE试剂盒,其特征在于,所述不同ApoE浓度的牛血清基质校准品的制备方法包括以下步骤:
在经过处理的牛血清,加入保护剂、吐温-20和防腐剂得到校准品稀释液;将ApoE溶于校准品稀释液中,即制备得不同ApoE浓度的牛血清基质校准品。
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