CN103592291A - 基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法 - Google Patents
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Abstract
基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法。以生物素化脱落酸抗体修饰纳米金为标记物，以磁珠为载体，结合酪胺信号放大技术和PIP-HRP-H2O2化学发光体系高灵敏度测定脱落酸的方法。属于化学发光领域。其原理是用抗体修饰磁珠捕获目标物脱落酸；用生物素化脱落酸抗体修饰纳米金，并以其为标记物；然后利用酪胺信号放大技术在磁珠表面聚集链霉亲和素-HRP；再利用PIP-HRP-H2O2化学发光体系实现对目标物的测定。由于通过酪胺信号放大在磁珠表面有大量的链霉亲和素-HRP形成，再利用高灵敏度化学发光检测体系，实现了脱落酸的高灵敏度测定。方法具有简单、成本低、灵敏度高的优势。
Description
技术领域
本发明属于化学发光技术领域，涉及以纳米金为标记物和酪胺信号放大技术建立的分析方法。具体涉及一种植物激素脱落酸测定的方法。
背景技术
脱落酸（abscisic acid，ABA）是植物体内一种重要的激素，由类胡萝卜素降解形成，有阻遏赤霉酸及细胞分裂素促进生长的作用；与叶子的衰老、果实的脱落等有关。虽然含量甚微，但对调节植物体的生长、成熟和衰老有着重要的作用。准确测定这种植物激素的含量，研究其变化规律，对于探索果实成熟及贮藏保鲜具有重要意义。植物激素测定的传统方法主要有色谱法及联用技术[Hou SJ,Zhu J,DingMY,Lv GH.Simultaneous determination of gibberellic acid,indole-3-acetic acid and abscisic acid in wheat extracts by solid-phase extraction andliquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.Talanta,2008,76:798]、免疫学方法[Ferreiraa WD,Kerbauyb GB,Krausb JE,Pescadorc R,Suzuki RM.Thidiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium.J Plant Phys,2006,163:1126]、光谱法、电化学方法[Carretero AS,Cruces-Blanco C,Pena MS,Ramirez SC,Gutierrez AF.Determination of phytohormones of environmental impact by capillary zone electrophoresis.J Agric Food Chem,2004,52:1419；Liu X,Ma L,Lin YW,Lu YT.Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.J Chromatogr A,2003,1021:209；Li J,Xiao LT,Zeng GM,Huang GH,Shen GL,Yu RQ.Immunosensor for rapid detection of gibberellin acid in the rice grain.J Agric Food Chem,2005,53:1348]等。目前测定脱落酸的方法主要有HPLC法[刘长江，刘旸旸，李书倩，张博，辛广.HPLC法测定软枣猕猴桃中内源激素脱落酸含量.食品研究与开发.2012,33:162；孙崇臻,王超,蔡子哲,陈沿廷,吴希阳.高效液相色谱测定蜂蜜中的脱落酸、黄酮和酚酸. 食品科学, 2013, 34: 281]、ELASE法[周振华,楚霞,沈国励,俞汝勤.间接竞争ELISA方法用于脱落酸的检测.化学传感器.2009,29:29]等。
但是，这些方法的各有其缺点，本发明利用纳米金为标记物和磁珠为载体，以酪胺信号放大技术，实现植物激素脱落酸的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
发明内容
本发明目的是提供一种测定脱落酸的方法，以纳米金为标记物、磁珠为载体，结合酪胺信号放大技术和PIP（对碘苯酚）-HRP-H2O2化学发光体系，实现脱落酸的测定。
技术方案
一种基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法。其特征在于用纳米金为标记物，羧基化磁珠为载体，再以酪胺信号放大技术和PIP-HRP-H2O2化学发光体系，实现脱落酸的测定。测定步骤如下：
（1）纳米金的制备。将用于制备纳米金的玻璃仪器及聚四氟乙烯搅拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸馏水冲洗后烘干备用。再向500mL三口烧瓶中加入250mL水，再加入2.5mL1%HAuCl4，在电炉上加热至沸腾后，快速加入4.4mL1%柠檬酸钠。溶液在2～3分钟内其颜色由淡黄色逐渐变为酒红色，然后继续保持沸10～15分钟，移走热源，在室温下继续搅拌至冷却，定容至200mL，置4℃冰箱冷藏备用。
（2）生物素化脱落酸抗体的制备。首先用1mol/LpH9.2的NaHCO3溶液将脱落酸抗体稀释为1mg/mL；用DMF将Bio-NHS配制成50mg/mL的溶液；然后按Bio-HNS与脱落酸抗体质量比1:7的比例将其混合，室温下搅拌混匀反应4h，即得生物素化脱落酸抗体。
（3）抗体修饰纳米金的制备。在2mL的小试管中加入150μL，10-7M的巯基丙酸，再加入1mL0.1M的EDC，活化30分钟。另取一个5mL的小试管，加入2mL纳米金，1mL咪唑缓冲液（0.1M，pH6.8），活化30分钟。将上述两溶液混合反应12小时，磁性分离，弃上清液， 再用磷酸缓冲溶液洗三次，定容至2mL。将10μg生物素化IgG、3μg生物素化脱落酸抗体加入上述溶液中，混合反应12小时，得抗体修饰纳米金。
（4）抗体修饰磁珠的制备。取30μL磁珠于1.5mL小试管中，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，加入200μL咪唑-HCl缓冲溶液（0.1M）和100μL0.2M的EDC溶液，在37℃下反应40分钟。然后用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，最后加入200μL磷酸缓冲溶液摇匀。再加入10μg抗体，37℃振荡孵育过夜。最后，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲溶液中。再加入200μL0.1g/mL的BSA，并置于37℃下反应40分钟，再用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲溶液中，得抗体修饰磁珠。4℃冰箱保存备用。
（5）生物素化酪胺的制备。分别取10.0mgBio-NHS和酪胺-HCl，用DMF溶解，分别配制成10mg/mL的溶液；在配置的酪胺-HCl溶液中加入三乙胺10μL，室温放置4小时后，取17.3μL，与60.2μL的Bio-NHS溶液混合，室温反应4小时，即得生物素化酪胺，4℃冰箱保存备。
（6）脱落酸的测定。取脱落酸标准溶液或样品溶液10μL加入50μL的抗体修饰磁珠溶液中，37℃下反应30分钟。然后加入抗体修饰纳米金20μL，37℃下反应30分钟，磁性分离，并用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于80μL磷酸缓冲溶液中。然后加入40μL的生物素化酪胺溶液，再加入10μL体积分数为0.5%的过氧化氢溶液，在37℃避光振荡孵育30分钟，用含0.05%（体积分数）吐温-20的磷酸缓冲液洗涤三次。然后再加入40μL的链霉亲和素-HRP，37℃振荡孵育30分钟，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于80μL磷酸缓冲溶液中。然后进行化学发光测定，根据标准溶液浓度和化学发光信号关系作图得标准曲线；根据所测定样品溶液的化学发光信号对样品中脱落酸含量进行定量。
（7）样品分析，将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（6）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（6）所得标准曲线可以获取植物激素脱落酸的含量。
本发明的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
本发明的磷酸缓冲溶液（0.2MpH7.4）配制方法：取浓度为35.61g/L的Na2HPO4·2H2O溶液81mL，浓度为27.6g/L的NaH2PO4·H2O溶液19mL混合即得。
咪唑-HCl缓冲液配制方法：取咪唑6.8g，氯化钠11.7g，加于500mL二次蒸馏水中，加0.1mol/L盐酸186mL，调pH至6.8，最后加二次蒸馏水至1升即得。
本发明的化学发光测定选用MPI-E型化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）。
本发明的振荡孵育选用THZ-82A气浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）。
本发明的离心机选用Anke-TGL-16C飞鸽牌高速离心机（上海市安亭科学仪器厂）。
本发明的pH测量选用PHS-3D型酸度计（上海雷磁仪器厂）。
本发明的磁性分离选用55002型磁性分离架（天津市倍思乐色谱技术开发中心）
本发明的显著效果
本发明研究了不同浓度脱落酸与发光强度之间的关系，得到了检测脱落酸的标准曲线，线性范围及线性方程。
当脱落酸的浓度在1.0ng/mL-3000.0ng/mL之间时，随着脱落酸浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测脱落酸的线性方程为ICL=2.13C+26.62（ICL是化学发光强度；C是脱落酸的浓度，ng/mL；n=12，n表示同一浓度测定次数，R2=0.9897）。检测限是0.3ng/mL（3σ）。该测定方法的精密度通过对浓度为7.0ng/mL的脱落酸进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.8%，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
附图说明
图1.酪胺信号放大技术测定脱落酸原理图
图2.脱落酸标准曲线。横坐标是脱落酸浓度，单位是ng/mL，纵坐标ICL是体系的化学发光强度。
具体实施方式
按照技术方案的步骤（1）至（6）得到脱落酸标准曲线见图2，其中N-羟基琥珀酰亚胺生物素（Bio-NHS）、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（链霉亲和素-HRP）购于上海生工生物工程技术服务有限公司；氯金酸（HAuCl4），柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）均购于天津市博迪化工有限公司；脱落酸、吐温-20、咪唑购自国药化学试剂公司；1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、生物素化IgG购自Sigma公司；脱落酸抗体购自盛世中方（北京）生物科技有限公司；巯基丙酸购自天津市博迪化工有限公司；牛血清蛋白（BSA）、二甲基甲酰胺（DMF）购自中国医药上海化学试剂公司；酪胺-HCl购自北京化工厂；磁珠（羧基化，粒径为1～2μm）购自天津市倍思乐色谱技术开发中心。
根据发明的方法对脱落酸含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为98.5–102.6%，测定结果见表1，本发明的方法在脱落酸检测中具有精密度高的特点。测定时用微纳米级微透析探针插入模式植物水稻茎部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样。
表1.样品分析测定结果a,b
| 编号 | 含量 | 标准样品加入量 | 测得量 | 回收率（%） |
| 1 | 56.7 | 50.00 | 107.3 | 102.6 |
| 2 | 135.9 | 100.00 | 234.4 | 98.5 |
| 3 | 567.1 | 500.00 | 1068.5 | 100.3 |
a7次测量结果
b单位：ng/mL。
Claims (5)
1.基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法，其特征在于以纳米金为标记物和磁珠为载体，以酪胺信号放大技术和PIP-HRP-H2O2化学发光体系实现植物激素脱落酸的测定，测定步骤如下：
（1）纳米金的制备：将用于制备纳米金的玻璃仪器及聚四氟乙烯搅拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸馏水冲洗后烘干备用；再向500mL三口烧瓶中加入250mL水，再加入2.5mL1%HAuCl4，在电炉上加热至沸腾后，快速加入4.4mL1%柠檬酸钠；溶液颜色由淡黄色逐渐变为酒红色，然后继续保持沸10～15分钟，移走热源，在室温下继续搅拌至冷却，定容至200mL，置4℃冰箱冷藏备用；
（2）生物素化脱落酸抗体的制备：首先用1mol/LpH9.2的NaHCO3溶液将脱落酸抗体稀释为1mg/mL；用DMF将Bio-NHS配制成50mg/mL的溶液；然后按Bio-HNS与脱落酸抗体质量比1:7的比例将其混合，室温下搅拌混匀反应4h，即得生物素化脱落酸抗体；
（3）抗体修饰纳米金的制备：在2mL的小试管中加入150μL，10-7M的巯基丙酸，再加入1mL、0.1M的EDC，活化30分钟；另取一个5mL的小试管，加入2mL纳米金，1mL咪唑缓冲液（0.1M，pH6.8），活化30分钟；将上述两溶液混合反应12小时，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，定容至2mL；然后将10μg生物素化IgG、3μg生物素化脱落酸抗体加入上述溶液中，混合反应12小时，得抗体修饰纳米金；
（4）抗体修饰磁珠的制备：取30μL磁珠于1.5mL小试管中，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，加入200μL咪唑-HCl缓冲溶液（0.1M）和100μL0.2M的EDC溶液，在37℃下反应40分钟；然后用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，最后加入200μL磷酸缓冲溶液摇匀；再加入10μg抗体，37℃孵育过夜；最后，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲溶液中；再加入200μL0.1g/mL的BSA，并置于37℃下反应40分钟，再用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲溶液中，得抗体修饰磁珠，4℃冰箱保存备用；
（5）生物素化酪胺的制备：分别取10.0mgBio-NHS和酪胺-HCl，用DMF溶解，分别配制成10mg/mL的溶液；在配置的酪胺-HCl溶液中加入三乙胺10μL，室温放置4小时后取17.3μL，与60.2μL的Bio-NHS溶液混合，室温反应4小时，即得生物素化酪胺，4℃冰箱保存备；
（6）脱落酸的测定：取不同量的脱落酸标准溶液或样品溶液加入抗体修饰磁珠溶液中，37℃下反应30分钟；然后加入抗体修饰纳米金，37℃下反应30分钟，磁性分离，并用磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于磷酸缓冲溶液中；然后加入生物素化酪胺溶液，再加入体积分数为0.5%的过氧化氢溶液，在37℃避光孵育30分钟，用含0.05%（体积分数）吐温-20的磷酸缓冲液洗涤三次；然后再加入链霉亲和素-HRP，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于磷酸缓冲溶液中；然后进行化学发光测定，根据标准溶液浓度和化学发光信号关系作图得标准曲线；根据所测定样品溶液的化学发光信号对样品中脱落酸含量进行定量；
（7）样品分析：将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（6）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（6）所得标准曲线可以获取植物激素脱落酸的含量。
2.根据权利要求1测定脱落酸的方法，其特征在于所述化学试剂为分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
3.根据权利要求1测定脱落酸的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液浓度为0.2M，pH7.4，配制方法：取浓度为35.61g/L的Na2HPO4·2H2O溶液81mL，浓度为27.6g/L的NaH2PO4·H2O溶液19mL混合即得。
4.根据权利要求1的测定脱落酸的方法，其特征在于所述咪唑-HCl缓冲液配制方法：取咪唑6.8g，氯化钠11.7g，加于500mL二次蒸馏水中，加0.1mol/L盐酸186mL，调pH至6.8，最后加二次蒸馏水至1升。
5.根据权利要求1的测定脱落酸的方法，其特征为以PIP-HRP-H2O2化学发光体系对化学发光进行测定。
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