CN103698463B

CN103698463B - 一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的lc-ms/ms方法

Info

Publication number: CN103698463B
Application number: CN201410018753.5A
Authority: CN
Inventors: 刘珊珊; 边照阳; 杨飞; 李中皓; 范子彦; 张洪非; 王颖; 张艳革; 唐纲岭; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: CN103698463A

Abstract

一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，特征在于：是通过以下方法进行分析测定：将样品经NaOH溶液浸润并水解后，用H₂SO₄酸化，加入二氯甲烷和内标物，然后涡旋提取，提取液用无水MgSO₄除水、C18净化，取上清液，以液相色谱-串联质谱法进行测定。本发明的方法改进了现有样品处理方法，并提供更干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。相比现有技术具有如下优良效果：将“以水浸润样品”更改“以NaOH水溶液浸润样品”，浸润的同时达到了水解的目的。加入H₂SO₄溶液调节pH值，可以将所有的苯氧羧酸盐和酯转化为游离酸的形式进行检测，提高了检测的准确。选取二氯甲烷作为萃取剂，比乙腈萃取更有针对性，提高了萃取效果。

Description

一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法

技术领域

本发明属于烟草中农药残留检测技术领域，具体涉及一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，是在烟草样品中加入NaOH溶液，通过碱液水解过程将酸、盐和酯等不同存在形式的苯氧羧酸类除草剂全部转化为盐的形式，然后通过用硫酸调节pH值使其全部转化为游离酸形式，再以二氯甲烷萃取、C18吸附剂净化，以液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行测定的方法。

背景技术

苯氧羧酸类除草剂是目前为止世界上第二大的选择性除草剂，也是世界上第一大除阔叶杂草的除草剂。苯氧羧酸类除草剂属于低毒除草剂，但具有内分泌扰乱作用，进入人体后会引起人类软组织恶性肿瘤，对动物体表现出胎盘毒性。这类物质在烟草生长过程中会被吸收并保留在烟叶中，从而对吸烟者的健康构成威胁。因此其在烟草中的残留受到了广泛关注。

鉴于苯氧羧酸类除草剂残留的危害性和重要性，CORESTA农用化学品咨询委员会(ACAC)在2008年制定的118种农用化学品指导性残留限量表中将麦草畏、2,4-D和2,4,5-T等苯氧羧酸类除草剂的限量分别定为0.20mg/kg，0.20mg/kg和0.05mg/kg。

目前，关于苯氧羧酸类除草剂残留量分析的报道主要是采用气相色谱法、气相色谱质谱联用法（GC/MS）和高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。基于传统气相色谱法或气相色谱质谱联用法的分析检测需要对苯氧羧酸类目标物进行衍生化，其前处理过程复杂费时，不利于高通量样品检测；采用液相色谱法分析则不需要衍生化，且LC-MS/MS的多反应监测模式亦可提供更低的检出限和更好的选择性。普通前处理方法多直接选用酸化试剂对目标化合物进行萃取，而苯氧羧酸类除草剂通常以游离酸、盐，或酯的形式存在，仅用酸化试剂萃取的检测最终会低估其实际浓度。而通过前处理将所有形式的残留物水解并最终转化为游离酸形式，能够提高目标物检出的准确性。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，旨在进一步优化现有前处理方法，将各种形式存在的苯氧羧酸类除草剂统一转化成游离酸从而提高检测的准确性。该方法能快速、准确的检测出烟草中苯氧羧酸类除草剂，定量结果准确、重复性好。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，是将样品经NaOH溶液浸润并水解后，用H₂SO₄酸化，加入二氯甲烷和内标物，然后涡旋提取，提取液用无水MgSO₄除水、C18净化，取上清液，以液相色谱-串联质谱法进行测定，具体步骤如下：

a、内标溶液的配制：配制氘代2,4,5-涕、氘代2,4-滴和氘代麦草畏浓度均为1.0μg/mL的甲醇溶液，即含有三种内标的甲醇溶液；

b、称取样品：称取1.0g烟草样品于50mL具塞离心管中，精确到0.1g；

c、加NaOH水溶液浸润并水解样品：加入100μL内标溶液,准确加入10mL0.5mol/L的NaOH溶液，静置30min并在涡旋混合震荡仪上以2000rpm涡旋2min；再加0.5mL9.2mol/L的浓H₂SO₄溶液中和至pH小于1.5；

d、振荡萃取：准确加入10mL二氯甲烷，在漩涡混合振荡仪上以2000rpm涡旋2min；

e、除水净化：取下层清液1mL于1.5mL离心管中，加入50mg无水硫酸镁和10mgC18吸附剂，于涡旋混合振荡仪上以2000r/min的速率涡旋振荡2min，以10000r/min离心5min；

f、稀释进样：吸取上清液200μL，用二氯甲烷稀释至1mL，经0.22μm有机相滤膜过滤后进行LC-MS/MS分析；

g、准备标准工作溶液：分别称取0.01g（精确至0.1mg）三种苯氧羧酸类除草剂标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，然后用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；

h、准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品按相同的前处理方式处理后，分别取200μL基质二氯甲烷溶液，分别加入200μL各浓度的标准工作溶液，用二氯甲烷稀释至1mL；

i、LC-MS/MS测定:吸取配制好的不同浓度的基质配标工作溶液，过0.22μm有机滤膜后，注入LC-MS/MS；

j、残留测定结果的计算:以内标法进行农药目标物的定量分析，即以目标物和其对应氘代内标的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对提取后的样品进行测定，测得检出目标物和对应内标的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中苯氧羧酸类除草剂的含量。

在本发明中，标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01g（精确至0.1mg）各种苯氧羧酸类除草剂标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成各除草剂浓度为1mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅰ，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成各农药浓度为10μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅱ，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成各农药浓度为1μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL和0.5mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10mL容量瓶中，准确加入100μL内标溶液，用二氯甲烷定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL。

在LC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：WatersAtlantisdC18柱（3μm，2.1mmx150mm）；柱温25℃；流动相为含0.1%乙酸的甲醇溶液；流速0.2mL/min，进样量5μL；总分析时间5min。

采用的质谱条件为：电离方式为电喷雾离子化负离子模式（ESI-）；电喷雾电压-4500V；雾化气压力10psi；离子源温度450℃；多反应检测模式（MRM），保留时间和质谱参数见表1，色谱分离图见图2。

表1三种农药及内标物质MRM参数

中文名称	保留时间(min)	定量离子	定型离子	去簇电压(V)	碰撞能量(V)
						2,4,5-涕	3.17	255.0/197.0	253.0/195.0	-30; -30	-15; -15
2,4-滴	2.77	221.1/162.8	219.1/160.8	-40; -40	-15; -15
						麦草畏	4.16	219.1/175.1	221.1/177.0	-55; -55	-7.5; -7.5
氘代2,4,5-涕	3.17	258.9/198.8	256.7/196.5	-40; -40	-17; -17
						氘代2,4-滴	2.78	223.7/165.8	221.8/164.2	-34; -34	-17; -17
氘代麦草畏	4.15	223.8/179.8	221.9/177.9	-26; -26	-7; -7

本发明的方法完善了现有样品处理方法，提高了样品检测的准确性，并提供更干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

⑴本发明方法样品前处理过程中在已有方法基础上，将“以水浸润样品”更改“以NaOH水溶液浸润样品”，浸润的同时达到了水解的目的，将各种存在形式统一转化为盐的形式，再加入H₂SO₄溶液调节pH值，可以将所有的盐形式存在的苯氧羧酸转化为游离酸的形式进行检测，提高了检测的准确。

⑵选取二氯甲烷作为萃取剂，比乙腈萃取更有针对性（因为乙腈是针对大部分农药来说有较好的整体萃取效果,而选用二氯甲烷是针对本专利申请涉及的3种苯氧羧酸类除草剂有更好的萃取效果），提高了萃取效果；二氯甲烷水溶性差，由于有机相和水相的液液分配作用，一些杂质留在水相，使萃取液中的共萃取基质大大减少，上机溶液更干净，减小了测定干扰，也减少了仪器的维护频率。

⑶本发明方法在净化步骤中选用C18为净化吸附剂，增加了非极性杂质的吸附作用，对极性目标化合物没有吸附作用，这样在降低基质效应的同时，亦排除了常用的极性吸附剂PSA对目标分析物吸附而造成的影响。

⑷本发明方法采用了高灵敏度和强抗干扰能力的LC-MS/MS进行检测，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的检测限：

将不同浓度的三种除草剂的基质配标工作溶液注入LC-MS/MS，以3倍信噪比（S/N=3）计算检测限（LOD），检测限在0.003mg/kg～0.005mg/kg之间。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

针对限量值为0.05μg/g的2,4,5-涕，实验选取0.02μg/g、0.05μg/g和0.10μg/g低、中、高三个浓度考察本方法的加标回收率，即在空白烟草样品中分别加入20μL、50μL和100μL三种苯氧羧酸类除草剂的标准溶液；针对限量值为0.20μg/g的2,4-滴和麦草畏，实验选取0.05μg/g、0.20μg/g和0.25μg/g低、中、高三个浓度考察本方法的加标回收率，即在空白烟草样品中分别加入50μL、200μL和250μL三种苯氧羧酸类除草剂的标准溶液；然后分别进行前处理和LC-MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，三种农药的平均回收率在84.1％～89.8％之间，相对标准偏差（RSD）在5.17％～7.03％之间，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。

图2为三种农药的MRM色谱图。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

2,4,5-T、2,4-D、麦草畏及其甲酯衍生物标准品均购自德国Dr.Eh实验室；氘代2,4,5-T、氘代2,4-D和氘代麦草畏标准品均购于加拿大CDN公司。

甲醇（农残级，韩国DUKSAN公司）；二氯甲烷（农残级，美国J.T.Baker公司）；冰醋酸（HPLC级，美国TEDIA公司）；C18（美国Agilent公司）；无水硫酸镁（天津市科密欧化学试剂有限公司），用前应在650℃灼烧4h，贮存于干燥器中备用；氢氧化钠（天津市化学试剂三厂）；浓硫酸（洛阳昊华化学试剂有限公司）。

液相色谱-串联质谱联用仪（API4000，美国AB公司）；台式高速冷冻离心机（3-30k，美国SIGMA公司）；涡旋振荡仪（TALBOYS，美国Troemner公司）；超声波清洗器（KQ-700DB，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（TEG612-L，德国Sartorius公司）。

2．样品处理：

称取1.00g样品于50mL具盖离心管中，加入含有1.0μg/mL氘代2,4,5-T、氘代2,4-D和氘代麦草畏的混合内标溶液100μL，然后加入10mL0.5mol/L的NaOH溶液，静置30min，至样品被水充分浸润，再于涡旋混合振荡仪上以2000r/min的速度振荡2min；加入0.5mL9.2mol/L的浓H₂SO₄，手持振荡使其混匀，使pH值小于1.5；然后加入10mL的CH₂Cl₂，于涡旋振荡仪上以2000r/min的速率涡旋振荡2min，静置。

移取下层清液1mL于1.5mL离心管中，加入50mg无水硫酸镁和10mgC18吸附剂，于涡旋振荡仪上以2000r/min的速率涡旋振荡2min；以10000r/min离心5min；吸取上清液200μL，用CH₂Cl₂稀释至1mL，经0.22μm有机相滤膜过滤后进行LC-MS/MS分析。

3.准备标准工作溶液：

分别称取0.01g（精确至0.1mg）各种苯氧羧酸类除草剂标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成各除草剂浓度为1mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅰ，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成各农药浓度为10μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅱ，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成各农药浓度为1μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL和0.5mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10mL容量瓶中，准确加入100μL内标溶液，用二氯甲烷定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL。

4.准备基质配标工作溶液：

对空白烟草样品按相同的前处理方式处理（参照步骤“2.样品处理”）后，分别取200μL基质CH₂Cl₂溶液，分别加入200μL各浓度的标准工作溶液，用CH₂Cl₂稀释至1mL；

5.测定方法：

将配制好的不同浓度的基质配标工作溶液注入LC-MS/MS，以内标法进行定量分析，即以目标化合物与相应内标的二级选择离子峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对各浓度级别的加标样品进行测定，测得检出农药与内标的二级选择离子峰面积比，代入标准曲线，求得样品中的3种农药的含量见表3。

表3样品A中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（mg/kg）
			1	2,4,5-涕	未检出
2	2,4-滴	未检出
			3	麦草畏	0.12

在LC-MS/MS测定时，采用的液相色谱条件：分析柱为WatersAtlantisdC18柱（3μm，2.1mmx150mm）；柱温25℃；流动相为含0.1%乙酸的甲醇溶液；流速0.2mL/min，进样量5μL；总分析时间5min。

质谱条件：电离方式为电喷雾离子化负离子模式（ESI-）；电喷雾电压-4500V；雾化气压力10psi；离子源温度450℃；多反应检测模式（MRM）。

三种苯氧羧酸类除草剂及对应氘代内标的保留时间和质谱参数见表1。

实例2：

如实施例1所述，选择另一烟草样品B，测得样品中3种农药目标物的含量见表4。

表4样品B中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（mg/kg）
			1	2,4,5-涕	0.16
2	2,4-滴	未检出
			3	麦草畏	未检出

实例3：

如实施例1所述，选择另一烟草样品C，测得样品中3种农药目标物的含量见表5。

表5样品C中农药目标物的检测结果

序号	中文通用名称	样品中农药目标物的含量（mg/kg）
			1	2,4,5-涕	未检出
2	2,4-滴	0.34
			3	麦草畏	未检出

Claims

1.一种分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，所述三种苯氧羧酸类除草剂为麦草畏、2,4-D和2,4,5-T，其特征在于：是通过以下方法进行分析测定：将样品经NaOH溶液浸润并水解后，用H₂SO₄酸化，加入二氯甲烷和内标物，然后涡旋提取，提取液用无水MgSO₄除水、C18净化，取上清液，以液相色谱-串联质谱法进行测定,具体步骤如下：

a、内标溶液的配制：配制氘代2,4,5-涕、氘代2,4-滴和氘代麦草畏浓度均为1.0μg/mL的甲醇溶液；

b、称取样品：称取1.0g烟草样品于50mL具塞离心管中；

g、准备标准工作溶液：分别称取0.01g三种苯氧羧酸类除草剂标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，然后用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种农药的标准工作溶液；

h、准备基质配标工作溶液：对空白烟草样品按相同的前处理方式即b、c、d、e处理后，分别取200μL基质二氯甲烷萃取上清液，分别加入200μL各浓度的标准工作溶液，用二氯甲烷稀释至1mL，得到不同浓度的基质配标工作溶液；

i、LC-MS/MS测定:吸取配制好的不同浓度的基质配标工作溶液，过0.22μm有机滤膜后，注入LC-MS/MS；采用的色谱条件为：色谱柱：WatersAtlantisdC18柱，规格3μm，2.1mmx150mm；柱温25℃；流动相为含0.1%乙酸的甲醇溶液；流速0.2mL/min，进样量5μL；总分析时间5min；采用的质谱条件为：电离方式为电喷雾离子化负离子模式（ESI-）；电喷雾电压-4500V；雾化气压力10psi；离子源温度450℃；多反应检测模式（MRM）；

2.根据权利要求1所述的分析烟草中三种苯氧羧酸类除草剂残留量的LC-MS/MS方法，其特征在于：标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.01g三种苯氧羧酸类除草剂标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成各除草剂浓度为1mg/mL的混合标准溶液Ⅰ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅰ，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成各农药浓度为10μg/mL的混合标准溶液Ⅱ；然后准确移取1mL混合标准溶液Ⅱ，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成各农药浓度为1μg/mL的混合标准溶液Ⅲ；准确移取0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL和0.5mL的混合标准溶液Ⅲ，置于10mL容量瓶中，准确加入100μL内标溶液，用二氯甲烷定容，即得系列标准工作溶液；配制的系列标准溶液浓度为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL。