CN109116038A - 未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于体外检测技术领域。该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒悬浮液、化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体和偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体。本发明还提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明的试剂盒采用链霉亲和素磁颗粒与偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。

Description

未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
未结合雌三醇是一种18碳类固醇类激素，分子量为288.4Da，在妊娠血中主要的循环雌激素，它指示胎盘的老化及成熟程度，是胎儿供氧的保障。在正常女性体内为雌酮和雌二醇的代谢产物。在体液中只有8％为游离型(FE3/UE3)，82％为结合型，结合型中大部分与性激素结合球蛋白结合，少量与白蛋白结合。在妊娠期间UE3是经胎儿肾上腺和肝脏产生，最后由胎盘合成的一种甾体类激素，胎儿的肾上腺把孕烯醇酮转化为脱氢表雄酮(DHEA)，DHEA在胎儿的肝脏中转化为16-OH-DHEA-硫酸盐，这种硫酸盐的单克隆抗体在胎盘转化为雌三醇，并通过胎盘进入母体血液，其在母体血清中的水平随着孕周的增长而增加。雌三醇在进入肝脏结合之前在母体血循环中的半衰期大约为20min。孕妇血清中游离态雌三醇含量为临床上指示胎盘功能的重要参数，也常用于非孕妇肿瘤病学筛查、乳腺癌及宫颈癌的风险评估等；新生儿患有唐氏综合症的孕妇通常UE3含量低于正常水平。
目前测定未结合雌三醇的方法有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、时间分辨荧光(TRFIA)等。但它们在应用中都存在一些固有的缺陷：RIA的放射性核素污染、标记物的货价期短、操作复杂、测试结果不稳定；EIA酶的活性容易失活，导致EIA的灵敏度不高，难以精确定量；TRFIA法虽然灵敏度较RIA高，但存在稀有重金属污染的风险。化学发光免疫分析法具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测。
UE3化学发光免疫测试剂盒相比传统的检测方法，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，UE3化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，本发明的检测试剂盒检测精度高，时间短。
本发明首先提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁颗粒悬浮液
化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体
偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体
优选的是，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒的质量比为0.01％～1％。
优选的是，所述的链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径为0.05～3μm。
优选的是，所述的化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:(3～20)。
优选的是，所述的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
优选的是，所述的偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(5～20)。
优选的是，所述的偶联标记物为生物素或抗原。
优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。
优选的是，所述的试剂盒还包括未结合雌三醇校准品，所述的试剂盒未结合雌三醇校准品的浓度分别为0.00ng/mL、0.43ng/mL、0.86ng/mL、1.72ng/mL、2.58ng/mL、4.30ng/mL和8.60ng/mL的未结合雌三醇溶液。
本发明还提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
步骤二：化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
将未结合雌三醇单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；
步骤三：偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
取未结合雌三醇单克隆抗体，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～3h，再转入室温继续反应10～30min，最后加入赖氨酸反应10～30min，经纯化，加入等体积甘油和NaN3或ProClin300，得到偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体。
本发明的有益效果
本发明提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体和偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体；该试剂盒选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本；同时采用链霉亲和素磁颗粒与偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。本发明的化学发光免疫分析试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对未结合雌三醇的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，减少人为操作误差，并且实现无人值守，缩短了临床检测所需的时间，同时检测精度较高，试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。
附图说明
图1为本发明未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的制备流程设计图；
图2为本发明未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同与描述的其他方式来实施。
本发明首先提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁颗粒悬浮液
化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体
偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体
按照本发明，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒的质量比优选为0.01％～1％，更优选为0.072％。
按照本发明，所述的链霉亲和素磁颗粒悬浮液中链霉亲和素磁颗粒的粒径优选为0.05～3μm，更优选为3μm。当链霉亲和素磁颗粒的粒径低于0.05μm时，抗原或者抗体与磁珠结合率低，可能导致整体光量子数偏低；当链霉亲和素磁颗粒的粒径高于3μm时，非特异性结合效果明显，可能导致试剂盒灵敏度差等。
按照本发明，所述的化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与化学发光标记物标记的摩尔比优选为1:(3～20)，更优选为1：3；所述的化学发光标记物优选为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，更优选为吖啶酯。
按照本发明，所述的偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与偶联标记物标记的摩尔比优选为1:(5～20)，更优选为1：5；所述的所述偶联标记物优选为生物素或抗原。
按照本发明，所述的试剂盒还包括化学发光底物液和未结合雌三醇校准品，所述化学发光底物液包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。
所述的试剂盒未结合雌三醇校准品的浓度优选分别为0.00ng/mL、0.43ng/mL、0.86ng/mL、1.72ng/mL、2.58ng/mL、4.30ng/mL和8.60ng/mL的未结合雌三醇溶液。
本发明还提供一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，具体流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50～100mg/ml；链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液的体积比优选为(0.5～1)：(5～10)；所述的混匀时间优选为10-15分钟，所述的缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5；所述的固相试剂的浓度优选为0.01％～1％；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购，选自安捷伦科技有限公司公司，货号PL6727-1001。
步骤二：化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
将未结合雌三醇单克隆抗体放入离心管中离心，优选在室温下离心10s～30s，保证抗体位于离心管底部位置，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，所述的离心温度优选为室温，离心时间优选为0.5min～3min；将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀，所述的混匀时间优选为2-4h，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，所述的封闭时间优选为1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化、用PB缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；
所述的未结合雌三醇单克隆抗体的质量(μg)：化学发光标记物溶液的体积(μl)优选为500：(0.75～5)；所述的化学发光标记物溶液的浓度优选为2mg/mL；所述的封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为20％；所述的缓冲液为50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5；
步骤三：偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
取未结合雌三醇类似物，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，2～8℃反应1～3h，再转入室温继续反应10～30min，最后加入赖氨酸反应10～30min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3或0.1％ProClin300，得到偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体；
所述的未结合雌三醇类似物、已活化的长链磺化生物素和赖氨酸的摩尔比优选为1：(5-20)：100；所述的已活化的长链磺化生物素的来源为商购，选自ACROBiosystems公司。
本发明的链霉亲和素磁颗粒可以直接使用，化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体及偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体分别溶于含有盐、表面活性剂、防腐剂及蛋白的缓冲液中，将三相试剂灌封于不同的试剂瓶中组成试剂盒，所述的盐、表面活性剂、防腐剂及蛋白的缓冲液没有特殊限制，采用本领域常用的即可。
本发明的未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒用于检测未结合雌三醇时，利用全自动化学发光免疫分析仪(CM180)对未结合雌三醇校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算未结合雌三醇的浓度；最后对未结合雌三醇全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、抗干扰/特异性)的评价。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5mL(其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入10mL的TBST溶液充分混匀10分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％的固相试剂，2～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体标记工艺：将500μg未结合雌三醇抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心30s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入0.75μL的2mg/mL吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4小时；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为2h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PB缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存；使用时将纯化后的未结合雌三醇抗体浓溶液用50mMMES、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL，2～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体制备工艺：
取500μg未结合雌三醇单克隆抗体，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，5℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应1h，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3或0.1％ProClin300。
实施例2
(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5mL(其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入10mL的TBST溶液充分混匀13分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗5次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体标记工艺：将250μg未结合雌三醇抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心40s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入0.375μL的2mg/mL吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心1min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀5小时；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为3h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PB缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存；使用时将纯化后的未结合雌三醇抗体浓溶液用50mMMES、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/mL，2～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体制备工艺：
取250μg未结合雌三醇单克隆抗体，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，6℃反应3h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应50min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％NaN3。
实施例3
(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备：
取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5mL(其中链霉亲和素磁珠来自安捷伦科技有限公司，货号PL6727-1001)。加入10mL的TBST溶液充分混匀15分钟，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗4次后在50mM MES、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.1％的固相试剂，2～8℃保存。
(2)化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体标记工艺：将1mg未结合雌三醇抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心50s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入1.5μL的2mg/mL吖啶酯DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀3小时；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为2.5h；将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PB缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗体溶液放置于2～8℃保存；使用时将纯化后的未结合雌三醇抗体浓溶液用50mMMES、0.05％吐温、0.05％Proclin300，pH6.5的缓冲液稀释至终浓度为1μg/mL，2～8℃保存。
(3)偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体制备工艺：
取1mg未结合雌三醇单克隆抗体，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)，4℃反应2.5h，再转入室温继续反应1h，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应40min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％ProClin300。
实施例4：未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒检测方法：
以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测工具，方法学模式为竞争法，即仪器依次加入35μL的样本，50μL吖啶酯标记的未结合雌三醇单克隆抗体，50μL生物素标记的未结合雌三醇类似物及40μL链霉亲和素磁颗粒。反应20分钟后，进行磁分离。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光底物液A液(HNO3溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应，最后记录光量子数。
实施例5：未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒性能评价
1、线性的检测：将校准品浓度为0.00ng/mL、0.43ng/mL、0.86ng/mL、1.72ng/mL、2.58ng/mL、4.30ng/mL和8.60ng/mL作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9988，线性范围为0.5-6.9ng/mL。如表1所示，图2为未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的标准曲线图。横坐标为校准品浓度，纵坐标为试剂反应的光量子数，其拟合度达0.9988。
表1
浓度 光量子数
0 339664
0.43 339664
0.86 180537
1.72 113142
2.58 95549
4.3 62193
8.6 28389
2、分析灵敏度测试
分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值减去两倍的标准差，带入标准曲线所得即为灵敏度；计算未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为0.02ng/mL。如表2所示：
表2
3、抗干扰特异性实验：
含高达20mg/dL(342μmol/L)胆红素、500mg/dL(5g/L)血红蛋白、相当于1800mg/dL(20.32mmol/L)甘油三酯(三酸甘油脂)、10g/dL(100g/L)总蛋白的样本，结果表明：干扰物质不会显著影响未结合雌三醇的测定(±10％)。

Claims (10)

1.一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁颗粒悬浮液
化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体
偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒的质量比为0.01％～1％。
3.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径为0.05～3μm。
4.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:(3～20)。
5.根据权利要求1或4所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。
6.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体中，未结合雌三醇单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:(5～20)。
7.根据权利要求1或6所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的所述偶联标记物为生物素或抗原。
8.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液，所述A液为硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。
9.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括未结合雌三醇校准品，所述的试剂盒未结合雌三醇校准品的浓度分别为0.00ng/mL、0.43ng/mL、0.86ng/mL、1.72ng/mL、2.58 ng/mL、4.30ng/mL和8.60ng/mL的未结合雌三醇溶液。
10.根据权利要求1所述的一种未结合雌三醇化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；
步骤二：化学发光标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
将未结合雌三醇单克隆抗体放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；
步骤三：偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体的制备
取未结合雌三醇单克隆抗体，pH6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～3h，再转入室温继续反应10～30min，最后加入赖氨酸反应10～30min，经纯化，加入等体积甘油和NaN3或ProClin300，得到偶联标记物标记的未结合雌三醇单克隆抗体。
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