CN102156121B - 一种用于以hrp为酶促反应的化学发光底物液 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种化学发光底物液，主要由发光剂鲁米诺及增强剂对碘苯酚和氧化剂过氧化脲组成，用于以HRP为酶促反应的检测体系。该化学发光底物液具有反应时间短、检测平台期长、稳定性好等特点，可以增加试剂盒灵敏度、拓宽线性范围和延长试剂盒的有效期。

Description

一种用于以HRP为酶促反应的化学发光底物液

技术领域

本发明涉及酶联免疫分析领域，可应用于HRP为酶促反应的检测体系，如免疫检测体系、荧光检测体系等。

背景技术

化学发光免疫分析技术在免疫检测中已经得到了广泛的推广，近几十个品种在普遍应用，其范围从普通的临床检验品种到各种肿瘤标志物筛查、细胞因子、药物等等，不仅在临床检验，而且在药物学、环境学、食品安全以及预防医学都表现出了广阔的应用前景。同时，化学发光免疫分析技术的简便、快捷、灵敏等优点使在基层对疾病的普查、诊断和疗效考核都具有重要的价值。

在化学发光免疫分析中，通过免疫反应结合在微孔板内的酶结合物的量直接反应了免疫结合的效率，该效率在标记抗体(抗原)和包被抗体(抗原)均过量的条件下，完全取决于待测的抗原(抗体)的浓度。由此而引起的发光信号强度(RLU)也就直接揭示了待测抗原(抗体)浓度的变化。

现有发光底物有效期短、本底高、不稳定。发光底物的配方决定底物的这些特性，我们主要对发光底物配方进行了研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种反应时间短、检测平台期长、稳定性好的底物系统，即一种化学发光底物液。

本发明的化学发光底物液主要由发光底物液A和发光底物液B组成；所述发光底物液A包括发光剂鲁米诺和增强剂对碘苯酚；所述发光底物液B包括氧化剂过氧化脲。

具体地，所述发光底物液A含有如下组分：

鲁米诺           0.08-0.12mg/ml

对碘苯酚         2.8-3.2mg/ml

甘氨酸           0.02-0.04％

牛血清白蛋白     0.008-0.012％。

优选地，所述发光底物液A含有如下组分：

鲁米诺           0.1mg/ml

对碘苯酚         3mg/ml

甘氨酸           0.03％

牛血清白蛋白     0.01％。

所述发光底物液A还含有缓冲系统，所述缓冲系统选自0.05M磷酸盐缓冲液、0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2M硼酸盐缓冲液中的一种，pH8.3-8.9；优选地，所述缓冲系统为0.2M硼酸盐缓冲液，pH8.6。

具体地，所述发光底物液B含有如下组分：

过氧化脲         0.08-0.12mg/ml

苯甲酸钠         0.01-0.03％。

优选地，所述发光底物液B含有如下组分：

过氧化脲         0.1mg/ml

苯甲酸钠         0.02％。

所述发光底物液B还含有缓冲系统，所述缓冲系统选自0.05M磷酸盐缓冲液、0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2M硼酸盐缓冲液中的一种，pH8.3-8.9；优选地，所述缓冲系统为0.2M硼酸盐缓冲液，pH8.6。

本发明的化学发光底物液可以用于以HRP为酶促反应的检测系统。使用时，发光底物液A与发光底物液B的体积比为2-3∶3-2；优选地，发光底物液A与发光底物液B的体积比为1∶1。在一个优选的实施方案中，本发明是针对辣根过氧化物酶(HRP)的鲁米诺化学发光体系(反应原理见下式)。

检测系统是由发光底物液A和发光底物液B组成。发光底物液A含有发光剂鲁米诺和增强剂对碘苯酚，底物液B中含有氧化剂过氧化脲。底物的稳定性、灵敏度以及检测方式决定了是否有利于临床免疫分析。以此目的为研究方向，发明人对化学发光底物液的缓冲体系，主要原料的浓度，以及配方进行了研究和优化，较目前商品化的底物有明显的改进。主要体现在反应时间短、检测平台期长、稳定性好等性能上。

缓冲体系的选择及优化：分别对磷酸盐、Tris-HCl、硼酸盐等缓冲系统进行了稳定性、灵敏度等性能测试，根据测试结果优选pH8.6的硼酸盐缓冲液。其配制方法为：配制0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然后按11∶9的体积比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即得pH8.6硼酸盐缓冲液。

不同增强剂、稳定剂的选择及优化：对碘苯酚、过硼酸钠、甘氨酸、牛血清白蛋白等多种增强剂和稳定剂等物质对检测结果的影响，并对其使用浓度进行了优化；然后进行稳定性、灵敏度等性能测试，最终确定包括增强剂、稳定剂(甘氨酸、牛血清白蛋白)等物质在内的发光底物液A和发光底物液B优选的和最优选的组分及其浓度配比。

主要原料的浓度优化：对鲁米诺和过氧化脲分别进行实验设计，然后按设计中的浓度配制工作液，再进行性能测试，最终确定了发光底物液A中鲁米诺的浓度为0.08-0.12mg/ml，最优浓度为0.1mg/ml；发光底物液B中过氧化脲的浓度为0.08-0.12mg/ml，最优浓度为0.1mg/ml。

性能测试：分别进行了酶促发光反应动力学研究、反应温度研究、灵敏度、稳定性等研究。

本发明研究得到的化学发光底物液，其有效期达到12个月以上，灵敏度达到10^-18mol，有效延长反应平台期(一般会延长5到20分钟，不同的酶浓度，其反应速度不一致)。本发明的化学发光底物液主要应用于以HRP为酶促反应的检测体系，如免疫检测体系、荧光检测体系等。在免疫诊断体系中，该发光底物可以增加试剂盒灵敏度、试剂盒的有效期和检查的线性范围(光度法常见的有效吸光度范围在0～2.0之间；化学发光法检测的发光信号强度(RLU)受检测仪器的限制；本发明所用仪器的可检测范围在0～2290万之间)，并方便用户使用、快捷的操作。

附图说明

图1为酶促发光反应动力学曲线，即RLU随反应时间变化的曲线图；

图2为灵敏度梯度曲线，即RLU(S/N)随HRP浓度变化的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

缓冲液的配制：分别配制0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然后按11∶9的体积比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即为0.2M pH8.6的硼酸盐缓冲液。室温静置待用。

发光底物液A的配制：分别称取对碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白0.01g，其中对碘苯酚先用1ml无水乙醇溶解，然后将上述物质加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中；称取鲁米诺0.01g，先用5ml纯水溶解，然后加入到上述缓冲液中，混匀，得发光底物液A，4℃保存。

发光底物液B的配制：称取苯甲酸钠0.02g，加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中，然后直接加入过氧化脲0.01g，溶解，混匀，得发光底物液B，4℃保存。

实施例2

缓冲液的配制：分别配制0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然后按11∶9的体积比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即为0.2M pH8.6的硼酸盐缓冲液。室温静置待用。

发光底物液A的配制：分别称取对碘苯酚0.28g、甘氨酸0.02g、牛血清白蛋白0.008g，其中对碘苯酚先用1ml无水乙醇溶解，然后将上述物质加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中；称取鲁米诺0.008g，先用5ml纯水溶解，然后加入到上述缓冲液中，混匀，得发光底物液A，4℃保存。

发光底物液B的配制：称取苯甲酸钠0.01g，加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中，然后直接加入过氧化脲0.008g，溶解，混匀，得发光底物液B，4℃保存。

实施例3

缓冲液的配制：分别配制0.05M硼砂溶液和0.2M硼酸溶液，然后按11∶9的体积比量取硼砂溶液和硼酸溶液，混合后即为0.2M pH8.6的硼酸盐缓冲液。室温静置待用。

发光底物液A的配制：分别称取对碘苯酚0.32g、甘氨酸0.04g、牛血清白蛋白0.012g，其中对碘苯酚先用1ml无水乙醇溶解，然后将上述物质加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中；称取鲁米诺0.012g，先用5ml纯水溶解，然后加入到上述缓冲液中，混匀，得发光底物液A，4℃保存。

发光底物液B的配制：称取苯甲酸钠0.03g，加入到100ml 0.2M的硼酸盐缓冲液中，然后直接加入过氧化脲0.012g，溶解，混匀，得发光底物液B，4℃保存。

实施例4

缓冲液的配制：0.05M磷酸盐缓冲液，pH8.9。

发光底物液A的配制：分别称取对碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白0.01g，其中对碘苯酚先用1ml无水乙醇溶解，然后将上述物质加入到100ml 0.05M磷酸盐缓冲液中；称取鲁米诺0.01g，先用5ml纯水溶解，然后加入到上述缓冲液中，混匀，得发光底物液A，4℃保存。

发光底物液B的配制：称取苯甲酸钠0.02g，加入到100ml 0.05M磷酸盐缓冲液中，然后直接加入过氧化脲0.01g，溶解，混匀，得发光底物液B，4℃保存。

实施例5

缓冲液的配制：0.05M Tris-HCl缓冲液，pH8.3。

发光底物液A的配制：分别称取对碘苯酚0.3g、甘氨酸0.03g、牛血清白蛋白0.01g，其中对碘苯酚先用1ml无水乙醇溶解，然后将上述物质加入到100ml 0.05M Tris-HCl缓冲液中；称取鲁米诺0.01g，先用5ml纯水溶解，然后加入到上述缓冲液中，混匀，得发光底物液A，4℃保存。

发光底物液B的配制：称取苯甲酸钠0.02g，加入到100ml 0.05MTris-HCl缓冲液中，然后直接加入过氧化脲0.01g，溶解，混匀，得发光底物液B，4℃保存。

实验例1酶促发光反应动力学研究

1.反应动力学曲线：

微孔板中加入10μl HRP(10ng/ml)，每孔中加入实施例1制备的发光底物液A 50μl和发光底物液B 50μl，检测RLU 30分钟，绘制反应动力学曲线。实验结果见图1。

2.反应温度研究：

微孔板中分别加入10μl PBS和10μl HRP(10ng/ml)，于每孔中加入实施例1制备的发光底物液A 50μl和发光底物液B 50μl，分别在室温(20℃～28℃)，37℃、45℃下避光反应5分钟，观察HRP和PBS的RLU值，来比较不同温度的影响，以S/N进行评价与分析。实验结果见表1。

表1不同温度对发光反应的影响

由表1可知，37℃时，S/N值最大；45℃时，S/N值最小。

3.灵敏度研究：

将HRP用PBS倍比稀释(浓度从100ng/ml到0.01ng/ml)，微孔板中分别加入10μl PBS和10μl HRP(不同稀释浓度)，于每孔中加入实施例1制备的发光底物液A 50μl和发光底物液B 50μl，5分钟后测定RLU。观察RLU随HRP浓度的变化，以S/N进行评价与分析。实验结果见表2和图2。

表2不同浓度HRP的S/N值

4.热稳定性研究：

将实施例1制备的发光底物液A和B分装成4份，放入37℃保存，于3天、5天、7天和14天取出，与4℃保存的底物液进行测试，观察HRP和PBS的RUL值，用S/N评价与分析。实验结果见表3。

表3加速稳定性测试数据

5.线性实验：

在弓形虫IgG抗体检测中，将阳性样本按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释，检测其发光信号强度(RLU)，实验结果见表4。

表4线性实验结果

采用实施例2-5制备的发光底物液A和B同法进行上述实验，结果相似，但从发光底物液的综合性能角度来看，以实施例1的效果为最优。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种化学发光底物液，其特征在于，主要由发光底物液A和发光底物液B组成；

其中所述发光底物液A含有如下组分：

鲁米诺        0.08-0.12mg/ml

对碘苯酚      2.8-3.2mg/ml

甘氨酸        0.02-0.04%

牛血清白蛋白  0.008-0.012%；

所述发光底物液A还含有缓冲系统，所述发光底物液A的缓冲系统选自0.05M磷酸盐缓冲液、0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2M硼酸盐缓冲液中的一种，pH8.3-8.9；

所述发光底物液B含有如下组分：

过氧化脲    0.08-0.12mg/ml

苯甲酸钠    0.01-0.03%；

所述发光底物液B还含有缓冲系统，所述发光底物液B的缓冲系统选自0.05M磷酸盐缓冲液、0.05M Tris-HCl缓冲液和0.2M硼酸盐缓冲液中的一种，pH8.3-8.9。

2.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，所述发光底物液A含有如下组分：

鲁米诺        0.1mg/ml

对碘苯酚      3mg/ml

甘氨酸        0.03%

牛血清白蛋白  0.01%。

3.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，所述发光底物液A的缓冲系统为0.2M硼酸盐缓冲液，pH8.6。

4.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，所述发光底物液B含有如下组分：

过氧化脲    0.1mg/ml

苯甲酸钠    0.02%。

5.根据权利要求1所述的化学发光底物液，其特征在于，所述发光底物液B的缓冲系统为0.2M硼酸盐缓冲液，pH8.6。

6.权利要求1-5任一项所述的化学发光底物液在以HRP为酶促反应的检测系统中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用时，发光底物液A与发光底物液B的体积比为2-3：3-2。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，使用时，发光底物液A与发光底物液B的体积比为1：1。

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