CN110068568A - 一种化学发光检测试剂盒及其化学发光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生化实验试剂领域，具体涉及一种化学发光检测试剂盒及其化学发光检测方法。该化学发光检测试剂盒由A溶液和B溶液组成；该A溶液为含有2.5mM鲁米诺和0.396mM对香豆酸的缓冲液，该B溶液为含有0.02％双氧水的缓冲液。本发明提供的发光检测试剂盒可以较好检测各个浓度蛋白，该检测灵敏度和强度是市场上普通商用试剂盒的近20倍，从而起到减少抗体用量，节省实验成本的效果。

Description

一种化学发光检测试剂盒及其化学发光检测方法

技术领域

本发明属于生化实验试剂领域，具体涉及一种化学发光检测试剂盒及其化学发光检测方法。

背景技术

蛋白质印迹法(免疫印迹试验，即Western Blot)是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin在1979年提出的，是目前分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

增强型底物化学发光(ECL，Enhanced chemiluminescence)是近年来在生物技术领域发展非常迅速的一种Western Blot显色方法，是一种超高灵敏度的微量测定技术。它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。其原理是，反应底物为过氧化物和鲁米诺，如遇到抗体标记的HRP(辣根过氧化物酶)，即发光，可直接使用荧光CCD扫描或使用胶片曝光后，洗出条带。但是市面现有的化学发光检测试剂盒不仅价格昂贵而且灵敏度差，不适于实验室普遍使用。因此需要一种强度和性价比均高的化学发光检测试剂盒。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，为了解决上述现有问题，本发明的目的是提供一种化学发光检测试剂盒及其化学发光检测方法。

本发明的目的是通过如下方案实现的：

在第一方面，本发明提供一种增强型化学发光检测试剂盒，包括A溶液和B溶液，其中：所述A溶液为含有2.5mM鲁米诺和0.396mM对香豆酸的缓冲液，所述B溶液为含有0.02％双氧水的缓冲液。

可选地，所述A溶液由2.5mM鲁米诺，0.396mM对香豆酸以及pH值为8.8的0.01MTris组成。

可选地，所述B溶液由0.02％双氧水以及pH值为8.8的0.01M Tris组成。

可选地，所述0.01M Tris使用HCl调节pH值。

可选地，所述A溶液的溶剂为DMSO。

在第二方面，本发明实施例提供一种应用上述化学发光检测试剂盒的化学发光检测方法，包括：将A溶液和B溶液混合，获得发光反应工作液；将所述发光反应工作液加入到样品中，接触孵育；曝光。

可选地，所述样品为经过转膜和HPR抗体孵育的PVDF膜。

可选地，按体积比计，所述A溶液和B溶的混合比例为1:1。

可选地，所述接触孵育的时间为0秒。

可选地，所述曝光具体包括：

将所述与发光反应工作液接触孵育后的样品放入暗盒内；

曝光预定时间后，获取样品的显影结果图。

本发明提供的发光检测试剂盒可以较好检测各个浓度蛋白，该检测灵敏度和强度是市场上普通商用试剂盒的近20倍，从而起到减少抗体用量，节省实验成本的效果。

附图说明

图1为本发明试剂盒的原理示意图；

图2为采用本发明的试剂盒和采用现有商用品牌化学发光试剂盒检测效果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明实施例首先提供一种化学发光检测试剂盒。该试剂盒用于对转膜以后的样品进行增强型化学发光，获得相应的发光条带。该化学发光检测试剂盒包括配合使用的A溶液和B溶液。

其中，所述A溶液为含有2.5mM鲁米诺和0.396mM对香豆酸的缓冲液，所述B溶液为含有0.02％双氧水的缓冲液。

图1为所述化学发光检测试剂盒的原理示意图。首先，将转模后获得的具有待检测蛋白质的PDVF膜进行一抗和二抗的孵育，令相应的抗体与待检测蛋白质特异性结合。其中，在二抗上连接有HPR。然后，将PDVF膜与A溶液和B溶液混合形成的发光反应工作液接触孵育后，进行曝光，二抗上的HPR将触发工作液发生氧化反应，发出相应的亮光。

在一些实施例中，所述A溶液由2.5mM鲁米诺，0.396mM对香豆酸以及pH值为8.8的0.01M Tris组成；所述B溶液由0.02％双氧水以及pH值为8.8的0.01M Tris组成。

以下详细介绍A溶液和B溶液的配置方法。

首先，配置需要的母液，该母液包括：250mM鲁米诺母液和90mM对香豆酸母液。

250mM鲁米诺母液是由0.443g鲁米诺于溶解10ml DMSO(二甲基亚砜)中，避光搅拌均匀至完全溶解后(溶液显透明黄色)，分装避光保存于4℃冰箱中。90mM对香豆酸母液是由0.1475g对香豆酸溶解于体积比1:1的10ml DMSO(二甲基亚砜)和水中(即5ml DMSO和5ml水)，避光搅拌均匀至完全溶解，然后分装避光保存于4℃冰箱。

然后，由500μl上述250mM鲁米诺母液、220μl上述90mM对香豆酸母液、3.3ml 0.01MTris(pH8.8)缓冲液加水配制至50ml总体积，混合后即可配置获得所述A溶液。

B溶液可以由31μl 30％双氧水、3.3ml 0.01M Tris(pH8.8)缓冲液加水配制至50ml总体积后，混合获得。

在本实施例中，混匀后配置获得的A溶液和B溶液均避光保存于4℃冰箱中，保存时长为1年。

在本实施例中，该检测试剂盒针对的样品是经过转膜和HPR抗体孵育的PVDF膜。该样品的具体准备过程如下：

首先，将蛋白样品加蛋白上样缓冲液(SDS-Loading buffer)并经95℃加热10min后，上样至合适浓度的蛋白胶的上样孔中进行电泳，直至标记物溴芬蓝前沿跑至蛋白胶底部为止。

然后，将分离后的蛋白胶小心转膜至0.45μm PVDF膜。完成后用TBS从下向上浸湿，移至含有封闭液的平皿中，4℃摇床5％脱脂奶粉封闭摇动过夜。

封闭后的PVDF膜使用TBST洗涤3次，每次5～10min。洗涤后，将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中)；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上。

然后，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡。在室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。同上方法准备HPR标记二抗稀释液并与膜孵育1～2h后，用TBST在室温下摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

本发明实施例还提供了一种应用如上所述的化学发光检测试剂盒的化学发光检测方法。在实际销售过程中，可以将该检测方法印制在说明书中，随试剂盒进行销售，用以指导用户使用。该检测方法可以包括如下步骤：

首先，将A溶液和B溶液混合，获得发光反应工作液。然后，将所述发光反应工作液加入到样品中，接触孵育。最后曝光获得相应的发光条带。

具体的，在本发明实施例中，该检测方法可以包括如下步骤：

首先，将试剂盒中A溶液和B溶液各取等体积混合，获得工作液。然后，将处理好的PVDF膜与工作液接触孵育后，放入CDD拍摄暗匣中，调试曝光时间进行发光反应，获得发光图像。

在本实施例中，该接触孵育的时间很短，约等于不需要接触孵育即可完成发光反应，能够有效的降低长时间显影造成的发光剂淬灭，本底升高等问题。

采用本发明的上述试剂和操作步骤可以高灵敏性检测HPR标记抗体目标蛋白，大大简化了WesternBlot蛋白检测步骤和时间，作为Western Blot的理想试剂盒，可以为生物学功能研究加强巩固基础。

为了使本发明的上述方法步骤实施中的细节和过程能进一步易于本领域是人员的理解和改进，同时为使本发明试剂盒对于Western Blot蛋白检测效果有更深入的理解，以下通过详细的对蛋白Grb2 SH2的细胞表达的检测实施例进行具体说明。

1)收集和裂解蛋白：倒掉细胞培养液后，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干细胞培养液。每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去细胞培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。按1ml裂解液加10μ1 PMSF(100mM)，摇匀置于冰上裂解30min。

为使细胞充分裂解要经常来回摇动。裂解完后，可以用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中放置冰上。于4℃下12000rpm离心5min。将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。

2)蛋白含量的测定：使用紫外分光光度计，在280nm波长下测点吸收值。

3)SDS-PAGE电泳：

分别使用4μg、10μg、20μg、30μg、40μg目标蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，5％的浓缩胶，10％的分离胶，浓缩胶电泳电压90V，分离胶电压120V。

4)转膜显色：

按滤纸-胶-PVDF膜-滤纸从下至上的顺序叠放，置于装有转膜缓冲液的槽中，冰上，100V恒压转移lh～2h。

5)封闭和抗体孵育：

将转膜结束的PVDF膜用TBST洗3次，每次5min。然后用5％脱脂奶粉封闭液封闭90min，将封闭好的PVDF膜放入用TBST稀释好的一抗Grb2 SH2-antibody(1:2000)中，室温摇床上孵育1h，用TBST洗膜3次，每次5min，然后将膜放入用TBST稀释好的HPR标记二抗(1:5000)中，室温孵育90min，用TBST洗膜3次，每次5min。

6)发光：

应用本发明实施例提供的试剂盒，采用ECL化学曝光法,即放置膜与混合液接触孵育并放入CDD拍摄暗匣中，调试曝光时间进行发光反应。最后，将洗脱后的PVDF膜用CDD图像扫描仪扫描，即得Western Blot图谱。

为进一步的验证本发明实施例提供的试剂盒的效果，以下提供使用不同的试剂盒，对上述实施例中的PVDF膜进行发光后的发光条带结果进行比较。

其中，图2中的A发光条带为使用现有某商用品牌化学发光试剂盒的显影结果图。图2中的B发光条带为使用现有另一种商用品牌化学发光试剂盒的显影结果图。图2中的C发光条带为使用本发明实施例提供的化学发光检测试剂盒的显影结果图。

在本实施例中，比较了4μg、10μg、20μg、30μg以及40μg这几种不同浓度的目标蛋白的Western Blot信号。如图2中A—C发光条带所示，对于不同浓度的目标蛋白，本发明实施例提供的化学发光检测试剂盒可以较好检测各个浓度蛋白，该检测灵敏度和强度是市场上普通商用试剂盒的近20倍，从而起到减少抗体用量，节省实验成本的效果。进一步的，由于样品与工作液直接只需要接触孵育即可，减省了孵育时间，可以有效的避免过度曝光导致的背景污染，因此在使用上更为方便快捷。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种化学发光检测试剂盒，其特征在于，由A溶液和B溶液组成；

所述A溶液为含有2.5mM鲁米诺和0.396mM对香豆酸的缓冲液，所述B溶液为含有0.02％双氧水的缓冲液。

2.根据权利要求1所述的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述A溶液由2.5mM鲁米诺，0.396mM对香豆酸以及pH值为8.8的0.01M Tris组成。

3.根据权利要求1所述的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述B溶液由0.02％双氧水以及pH值为8.8的0.01M Tris组成。

4.根据权利要求2或3所述的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述0.01M Tris使用HCl调节pH值。

5.根据权利要求1所述的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述A溶液的溶剂为DMSO。

6.一种应用如权利要求1所述的化学发光检测试剂盒的化学发光检测方法，其特征在于，包括：

将A溶液和B溶液混合，获得发光反应工作液；

将所述发光反应工作液加入到样品中，接触孵育；

曝光。

7.根据权利要求6所述的化学发光检测方法，其特征在于，所述样品为经过转膜和HPR抗体孵育的PVDF膜。

8.根据权利要求6所述的化学发光检测方法，其特征在于，按体积比计，所述A溶液和B溶的混合比例为1:1。

9.根据权利要求6所述的化学发光检测方法，其特征在于，所述接触孵育的时间为0秒。

10.根据权利要求6所述的化学发光检测方法，其特征在于，所述曝光具体包括：

将所述与发光反应工作液接触孵育后的样品放入暗盒内；

曝光预定时间后，获取样品的显影结果图。