CN105606597A - 一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒 - Google Patents

一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒，化学发光底物液为：0.8～1.5g/L鲁米诺或其衍生物，0.05～0.6g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.01～0.05mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，3～6g/L聚乙烯醇，6～20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3～4.5g/L聚乙二醇600，100～300万单位/L硫酸庆大霉素，0.1～1.0g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。本发明的化学发光底物液为单一溶液，既能够实现HRP酶催化化学发光的反应，又能够有效提高发光强度和减少发光背景，实现高灵敏度检测。

Description

一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种化学发光底物液及利用其的降钙素原检测试剂盒。
背景技术
化学发光免疫分析是一种应用广泛的免疫分析方法，常见的化学发光底物液由A液氧化剂和B液发光剂组成，使用时A液和B液混合，混合步骤繁琐，混合不容易均匀而且使用也不太方便，目前市面上的化学发光液，多采用这种方式来配制，往往步骤繁琐，而且由于增强剂效果有限，灵敏度也较低。CN200410005756.1公开了采用对碘苯酚作为增强剂的底物液，但仅以对碘苯酚为增强剂时，其背景发光值高，灵敏度低，发光强度较低。CN200510071823.4公开了采用对碘苯酚和四苯硼钠作为增强剂的底物液，该配方同仅采用对碘苯酚作为增强剂的配方相比，增强发光的效果有限，灵敏度仍然较低。CN200810105504.4公开了采用4-羟基联苯和4-碘代苯基硼酸作为增强剂的底物液，该配方同采用对碘苯酚和四苯硼钠作为增强剂的配方相比，增强发光的效果有限，灵敏度仍然较低。
降钙素原(PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质。正常代谢时，甲状腺C细胞分泌并产生有激素活性的降钙素。PCT在健康个体中的浓度非常低(<0.1ng/ml)，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高，局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。
辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用在于分解过氧化氢产生氧负离子，氧负离子氧化鲁米诺化学发光。其作用机理在于，首先辣根过氧化物酶和过氧化氢反应生成水和氧化态辣根过氧化物酶I，氧化态辣根过氧化物酶I和鲁米诺反应生成氧化态辣根过氧化物酶II和氧化态鲁米诺中间体，氧化态辣根过氧化物酶II进一步和鲁米诺反应生成氧化态鲁米诺中间体和辣根过氧化物酶，氧化态鲁米诺中间体水解释放出光子。如果增强剂可以更高效快速的和HRPI和HRPII反应生成增强剂自由基，增强剂自由基就可以更快的和鲁米诺反应生成鲁米诺自由基，就可以显著的增强其化学发光。研究新型的增强剂是提高化学发光检测灵敏度的关键，也是化学发光中最前沿的研究方向。
目前市面上的降钙素原检测试剂盒，采用胶体金检测、胶乳比浊法和ELISA方法的，这几种方法灵敏度较低，不能满足微量检测的需要；采用化学发光方法的，但目前的化学发光方法多采用双试剂和灵敏度较低的发光底物液，背景值高，灵敏度也不高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种单一的化学发光底物液及利用此化学发光底物液的灵敏度高的降钙素原检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种化学发光底物液，由以下组分组成：0.8～1.5g/L鲁米诺或其衍生物，0.05～0.6g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.01～0.05mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，3～6g/L聚乙烯醇，6～20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3～4.5g/L聚乙二醇600，100～300万单位/L硫酸庆大霉素，0.1～1.0g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
进一步地，由以下组分组成：1.2g/L鲁米诺或其衍生物，0.3g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.04mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，5g/L聚乙烯醇，12g/L聚乙烯吡咯烷酮，4.2g/L聚乙二醇600，250万单位/L硫酸庆大霉素，1g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
一种降钙素原的化学发光检测试剂盒，包括：亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品，上述的化学发光底物液。
进一步地，所述生物素化抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为：琥珀酰生物素和抗降钙素原单克隆抗体上的氨基反应。
进一步地，所述辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为：利用NaIO4溶液氧化HRP，得到醛化HRP，调解醛化HRP的pH至9.0～9.5，加入抗降钙素原抗体，搅拌2小时；最后利用NaBH4溶液还原得到。
本发明提供的一种化学发光底物液，是一种含有增强剂的单一试剂，既能够实现HRP酶催化化学发光的反应，又能够有效提高发光强度和减少发光背景，实现高灵敏度检测。将此化学发光底物液用于降钙素原检测试剂盒，采用单克隆抗体结合方式和HRP酶催化的化学发光反应来获得检测结果，灵敏度大大提高，性能优于市面上的检测试剂盒。
具体实施方式
本发明实施例提供一种化学发光底物液，按照下列组分制成：0.8～1.5g/L鲁米诺或其衍生物，0.05～0.6g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.01～0.05mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，3～6g/L聚乙烯醇，6～20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3～4.5g/L聚乙二醇600，100～300万单位/L硫酸庆大霉素，0.1～1.0g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
本发明实施例还提供一种降钙素原的化学发光检测试剂盒，包括：亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品和上述的化学发光底物液。
其中，鲁米诺或其衍生物是发光剂，使用HRP酶做为催化剂，是一种使用范围最广的发光剂，特点是HRP标记方法简单，发光时间长，发光稳定，背景值低；2-氨基-4-硝基苯酚和9,9-二己基-2,7-二溴代芴是发光增强剂，特点是对于HRP催化鲁米诺发光的过程有很强的发光增强作用，效果明显好于市面上的发光增强剂；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇是稳定剂，主要是稳定鲁米诺或其衍生物和氧化剂，防止在放置时产生反应，降低反应背景；硫酸庆大霉素是防腐剂，在反应液中起稳定防腐作用；过氧化脲是氧化剂，在化学发光反应中起到氧化鲁米诺或其衍生物，生成发光中间体的作用。
实施例1一种化学发光底物液
实施例1提供一种化学发光底物液的制备方法，按照下列组分重量称取：
以pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解，定容到1L即可。
本发明化学发光底物液和进口化学发光底物液(Thermo公司最高灵敏度的SuperSignalWestFemto底物液)以及几种常见的化学发光底物液对比：以50ul1ng/mL辣根过氧化物酶为样品，以去离子水作为空白对照，分别加入100uL本发明的化学发光液和Thermo公司化学发光底物液以及含有几种常见增强剂的化学发光底物液，在化学发光检测仪上测量化学发光信号。由表1结果可知，本发明的本底更低，灵敏度更高。对碘苯酚浓度0.36mM，对羟基肉桂酸0.18μM，6羟基苯并噻唑5mM，4苯硼钠浓度为40mM，其余成分和本发明除2-氨基-4-硝基苯酚和9,9-二己基-2,7-二溴代芴以外的相同。
表1本发明化学发光底物液和进口化学发光底物液对比
实施例2一种降钙素原检测试剂盒
实施例2提供一种降钙素原检测试剂盒，包括：亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品，实施例1的化学发光底物液。
(一)制备方法
1、降钙素原标准品
PCT纯品为PCT重组抗原，由武汉华美生物工程有限公司制，纯度为99％，浓度为1mg/ml，以Tris缓冲液保存。分别将PCT重组抗原进行梯度稀释，浓度分别为0、0.08、0.4、2、10、60和100ng/ml。
2、辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体
1)用1ml蒸馏水溶解5mgHRP，制备HRP水溶液。
2)新鲜配制0.2MNaIO4溶液，取0.2ml加入到上述水溶液中，室温下避光搅拌20分钟。
3)1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液对上述反应液进行超滤浓缩，制备成醛基化的HRP溶液。
4)加20μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg抗降钙素原抗体在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
5)加0.2ml新配的2mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
6)用0.15MPH7.4PBS对上述反应液进行超滤，得到酶标抗体。
3、生物素化抗降钙素原单克隆抗体
1)将待生物素化的降钙素原单克隆抗体用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)稀释到1mg/ml，取单抗体积为1～2.5ml待生物素化。
2)用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)对单克隆抗体进行超滤。
3)用1mlDMSO溶解琥珀酰生物素1mg。
4)向1ml降钙素原单克隆抗体溶液(即含单抗1mg)加入120μl琥珀酰生物素溶液(即含NHSB120μg)。
5)在室温下持续搅拌，保温2～4小时。
6)加入9.6μL1mol/LNH4Cl(每25μg琥珀酰生物素加1μl)，在室温下搅拌10分钟。
7)在4℃，对PBS充分透析，以除去过量的生物素。
8)样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50％甘油，置-20℃保存。
4、亲和素偶联的纳米磁粒子：产品购自法国Ademtech公司。
(二)检测方法
1)将亲和素偶联的纳米磁粒子加入到微孔板，同时加入生物素化抗降钙素原单克隆抗体(10ug/ml)到纳米磁珠上，37℃反应30min后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；2)按合适的稀释度1∶2～1∶10稀释正常人或患者的血浆，加入到包被有降钙素原的微孔板板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；3)加入HRP标记的抗人降钙素原的单克隆抗体，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；4)最后加入化学发光底物液，通过分析发光值的大小，判断人血清中降钙素原浓度。
(三)试剂盒性能
1)灵敏度：平行测定20孔零值校准品血清，以S0+2SD作为试剂盒的最低检测浓度。检测结果表明，该试剂盒的灵敏度为0.01ng/mL。
2)精密度：平行测定两个不同浓度的质控血清各10孔，计算其测定值的变异系数(CV)。分别用PCT含量为低值、高值的质控血清进行精密性测定，结果批内变异率分别为7.5％和6.5％(n＝10)，平均7.0％；3批间高低值质控血清的变异率分别为9.5％和8.5％(n＝10)，平均9.0％。
3)准确性：用参考物质作为样本进行检测，计算其回收率。用3批试剂盒检测浓度为5ng/mL的参考物质，按照公式：回收率＝测定值/已知值×100％，计算回收率分别为98.5％、96.1％、103.4％。
4)特异性：检测分别含有一定浓度白蛋白、球蛋白、脂蛋白、血红蛋白、层粘连蛋白、C反应蛋白的血清标本，进行交叉反应。检测10mg/mL白蛋白、5mg/mL球蛋白、1mg/mL脂蛋白、0.1mg/mL血红蛋白、0.2μg/mL层粘连蛋白、10μg/mLC反应蛋白对PCT测定的影响，检测结果均＜0.05ng/mL，说明血清中其他蛋白对PCT检测不发生交叉反应。
(四)标准曲线的线性范围
由于采用两步夹心法测定，而磁粒子表面的抗体容量有限，导致结合抗原的量相对有限，这样对于特高浓度的样本，测定值反而可能降低，即出现所谓钩状效应(HOOK效应)。实验表明，本方法的检测范围为0.01-15ng/mL，对于更高浓度的样本在本检测方法中未出现明显HOOK效应。但要测定出准确的浓度，应将超过校准品浓度范围的高浓度样本作适当稀释后重测为宜。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种化学发光底物液，其特征在于，由以下组分组成：0.8～1.5g/L鲁米诺或其衍生物，0.05～0.6g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.01～0.05mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，3～6g/L聚乙烯醇，6～20g/L聚乙烯吡咯烷酮，3～4.5g/L聚乙二醇600，100～300万单位/L硫酸庆大霉素，0.1～1.0g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
2.如权利要求1所所述的化学发光底物液，其特征在于，由以下组分组成：1.2g/L鲁米诺或其衍生物，0.3g/L2-氨基-4-硝基苯酚，0.04mg/L9,9-二己基-2,7-二溴代芴，5g/L聚乙烯醇，12g/L聚乙烯吡咯烷酮，4.2g/L聚乙二醇600，250万单位/L硫酸庆大霉素，1g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
3.一种降钙素原的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：亲和素偶联的纳米磁粒子，生物素化抗降钙素原单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体，降钙素原标准品，权利要求1所述的化学发光底物液。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为：琥珀酰生物素和抗降钙素原单克隆抗体上的氨基反应。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记抗降钙素原单克隆抗体的制备方法为：利用NaIO4溶液氧化HRP，得到醛化HRP，调解醛化HRP的pH至9.0～9.5，加入抗降钙素原抗体，搅拌2小时；最后利用NaBH4溶液还原得到。
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