CN109406774A - 一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器 - Google Patents

一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型信号放大‑毛细管化学发光免疫传感器，它是由下述方法制备的：1）依次用HCl、NaOH清洗毛细管，用水清洗、N2吹干，通入氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液，用甲苯清洗、N2吹干，通入2~3%戊二醛水溶液；2）向步骤1）预处理的毛细管中，通入甲胎蛋白抗体Ab1，两端封口，置于4℃下过夜，用PBS溶液洗去未结合的Ab1；3）通入10mg/mL氧化型谷胱甘肽溶液至毛细管中，两端封口，室温放置1.5~2.5h，将毛细管截为多根；还提供了所述的一种新型信号放大‑毛细管化学发光免疫传感器在检测降钙素原方面的应用；本发明低成本、低消耗，快速、仪器简便；灵敏度高，最低可检测出2.5 pg/mL；抗干扰性强。

Description

一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种信号放大的高灵敏毛细管化学发光免疫传感器。
背景技术
降钙素原（PCT）降钙素的前体，通常由甲状腺C细胞分泌的，主要用于鉴别重症细菌性感染和病毒感染、自身免疫性疾病所致的炎症性反应。PCT属于无激素活性的前肽，是由 116 个氨基酸糖蛋白组成，在正常人体血清中，浓度很低，一般为10-50pg/mL，但是在细菌性感染，严重脓毒症休克等全身炎症反应综合征，烧伤创伤、呼吸系统疾病后，血浆中PCT 的浓度和含量会明显升高，这种病理情况下浓度可达到 10ng/mL，并且随着病情加剧，感染进展而持续上升，所以 PCT 可以作为全身炎症反应、脓毒症等疾病检测的有效生物指标。随着研究成果不断的成熟和应用，降钙素原已成为新的临床标志物，监控 PCT 浓度不仅可以为传染性和非传染性的疾病的鉴别诊断提供有用可靠的信息，避免滥用广谱抗生素，减少耐药性的发生；而且在病人的感染和系统性炎症反应方面，可以提高抢救成功率，评估疾病预后，改善治疗疗效。因此，检测血清中 PCT 对于病人菌血症预测评估、疾病诊断和疗效判断具有重要的意义。
毛细管免疫分析方法，在选择性和灵敏性分析作为一种有前景的方法，以低成本、低消耗，快速、仪器简便，简单信号量化、重复性高等优点，已经在环境保护、食品安全和临床诊断等不同的领域成为重要的分析工具。对于毛细管免疫传感器的构建，它是基于抗原抗体特异性相互作用的传感器，至关重要的一步是有效将目标分子固定在毛细管内表面。此外，毛细管壁具有优异的光波导性，因此毛细管型免疫传感器特别适用于敏感光学检测，如化学发光（CL）或激光诱导荧光。基于毛细管的免疫传感器具有易于集成和自动化的优点，可满足当今小型化生物分析的要求。尽管具有以上优势，阻碍毛细管的免疫传感器进一步应用于临床诊断的关键问题是它们的检测灵敏度有限，这可归因于毛细管固有的一维圆柱形几何形状。
发明内容
本发明目的是为解决现有毛细管免疫传感器检测灵敏度有限的问题，而提供一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器及其应用。
一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，它是由下述方法制备的：
1）毛细管预处理：依次用0.1M HCl、0.1M NaOH清洗毛细管，清洗时间分别为15~25min和55~65min，用水清洗、N2吹干，通入体积分数为0.5~1.5%氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液，用甲苯清洗、N2吹干，通入2~3% 戊二醛水溶液；
2）抗体Ab1的固定：向步骤1）预处理的毛细管中，通入38~45 µg/mL甲胎蛋白抗体Ab1，两端封口，置于4℃下过夜，用摩尔质量0.1M 、pH为7.4 的PBS溶液洗去未结合的甲胎蛋白抗体Ab1；
3）消除非特异性吸附：通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽溶液至毛细管中，两端封口，室温放置1.5~2.5h；将毛细管截为多根，每根毛细管长度为5~7cm；
步骤1）所述的毛细管预处理，通入体积分数为1%氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液；通入2.5% 戊二醛水溶液；
步骤2）所述的抗体Ab1的固定，通入40µg/mL甲胎蛋白抗体Ab1；
步骤3）所述的每根毛细管长度为6cm，并设有2厘米长的窗口。
所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器在检测降钙素原方面的应用；
所述的应用，具体步骤为：
1）将待测样品溶液通入所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器中，在36~37.5℃下免疫反应55~65min，PBST溶液冲洗；
2）将生物素标记的降钙素原抗体通入传感器中，在36~37.5℃下免疫反应55~65min，PBST溶液洗去未结合的B-Ab2；
3）将链霉亲和素和生物素标记辣根过氧化酶形成的复合物溶液通入传感器中，36~37.5℃下孵育30min， PBST溶液洗去未结合的复合物溶液；
4）将传感器插入毛细管支架中，并将传感器的一端浸入含有化学发光底物的溶液中，进行化学发光信号的数据采集；
5）测得的化学发光强度代入降钙素原抗原标准曲线，求出实际样品中降钙素原抗原浓度；
所述的免疫反应，是在37℃下免疫反应60min；
所述的PBST溶液，是含有体积分数为0.05% Tween-20的PBS溶液；
步骤4）所述的含有化学发光底物的溶液，是取鲁米诺和双氧水各10μL，即时混合得到的溶液。
发明详述：鉴于细菌炎性疾病的生物标志物在炎症检测中的重要地位、毛细管壁具有优异的光波导性以及链霉亲和素-生物素系统信号放大技术的优势，结合毛细管和链霉亲和素-生物素系统信号放大两种技术实现对降钙素原抗原的定量检测；预处理过的毛细管内表面富含醛基，可以和甲胎蛋白单克隆抗体(Ab1) 的氨基反应，依次加入抗原、生物素标记抗体（B-Ab2）二抗，通过抗原抗体之间的作用，形成一种夹心结构，然后再向其中加入链霉亲和素、生物素标记酶，通过引入基于生物素-链霉亲和素的信号放大系统以增加免疫传感器的灵敏度，从而定量检测细菌炎性疾病的生物标志物PCT。
本发明提供了一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，它是由下述方法制备的：1）毛细管预处理：依次用0.1M HCl、0.1M NaOH清洗毛细管，用水清洗、N2吹干，通入体积分数为0.5~1.5%氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液，用甲苯清洗、N2吹干，通入2~3%戊二醛水溶液；2）抗体Ab1的固定：向步骤1）预处理的毛细管中，通入甲胎蛋白抗体Ab1，两端封口，置于4℃下过夜，用PBS溶液洗去未结合的甲胎蛋白抗体Ab1；3）消除非特异性吸附：通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽溶液至毛细管中，两端封口，室温放置1.5~2.5h，将毛细管截为多根；还提供了所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器在检测降钙素原方面的应用；本发明优势在于：1）采用毛细管作为免疫反应载体，以低成本、低消耗，快速、仪器简便，简单信号量化、重复性高等优点，并且毛细管壁具有优异的光波导性、易于集成和自动化的优点，可满足当今小型化生物分析的要求，已经在环境保护、食品安全和临床诊断等不同的领域成为重要的分析工具；2）首次把生物素-链霉抗生物素蛋白信号放大策略应用于毛细管免疫传感器中，显著提高了其检测灵敏度，使得毛细管免疫传感器满足了痕量靶标的临床诊断需求；3）化学发光检测操作简单，只需将毛细管免疫传感器浸入含有化学发光底物的溶液中，溶液通过虹吸作用自动进入毛细管，实现化学发光和化学发光信号的同时数据采集；化学发光强度和降钙素原浓度之间正相关关系，可同时实现定性和定量检测，且灵敏度高，最低可检测出 2.5 pg/mL；4）抗干扰性强。
附图说明
图1 检测降钙素原抗原的原理图；
图2毛细管化学发光免疫传感器的表征图；
图3 实验条件的优化图；
图4 本发明制备的基于光子晶体光纤的甲胎蛋白(AFP)样品定量检测拟合曲线；
图5 不同干扰试剂对测定的影响；
图6 不同方法检测临床血清样品的结果对比。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器
1、毛细管的预处理
依次用0.1M HCl、0.1M NaOH清洗毛细管，时间分别为20min和60min，对内表面硅羟基进行活化；然后用水清洗、N2吹干；通入1% v/v氨丙基二乙氧基甲基硅烷（3-ADMS）的甲苯溶液，通过相互反应使得毛细管内表面覆盖一层氨基；用甲苯清洗、N2吹干，再通入2.5% 戊二醛（GA）水溶液，其中一端的醛基与毛细管内壁的氨基相互作用，另外一端的醛基用来结合包被抗体Ab1；
2、抗体Ab1的固定
向醛基活化的毛细管中通入40μg/mL降钙素原Ab1，两端封口，置于4℃冰箱过夜，0.1MpH 7.4 PBS溶液洗去未结合的Ab1；为了证明Ab1成功地固定到了毛细管内壁，我们采用紫外、红外和原子力显微镜对该步处理后的毛细管进行了详细表征，如图2所示；
3、消除非特异性吸附
通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽（GSSG）溶液至毛细管中，两端封口，室温放置2h，消除非特异性吸附；PBS清洗后，将其截为多根，每根长度为6cm，每个具有2厘米长的窗口；置于4℃冰箱，待用。
实施例2 降钙素原抗原标准曲线
1、优化过程及结果
标准曲线在最优条件下制作，条件优化过程为：考察了不同免疫反应孵育时间、Ab1浓度、B-Ab2浓度、链霉亲和素与生物素标记辣根过氧化酶的比例以及链霉亲和素的浓度对信号强度的影响，并选取最强信号对应的条件为最优条件，结果如图3所示。
2、标准曲线
1）用抗原稀释液配置将一系列不同浓度的降钙素原抗原标准物质，依次通入实施例1制备的传感器中，37℃免疫反应60min，PBST（含0.05% v/v Tween-20的PBS）洗去未结合的PCT；
2）将生物素标记的降钙素原抗体（B-Ab2）通入传感器中，37℃免疫反应60min，PBST洗去未结合的Ab2。
3）将链霉亲和素和生物素标记辣根过氧化酶形成的复合物溶液通入传感器中，37℃下孵育30min，PBST洗去未结合的复合物溶液；
4）将传感器插入毛细管支架中，并将传感器的一端浸入新制备的含有化学发光底物的溶液中（取鲁米诺和双氧水各10μL，即时混合），进行数据采集；
5）以化学发光强度为纵坐标，PCT浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。该抗原的最低检出限为2.5pg/mL，如图4所示。深色直线为没有进行信号放大的标准曲线；
本发明所提出的检测方法能够放大信号，提高检测灵敏度，在实际应用中，对于特定的目标物具有潜在的应用价值。
实施例3 干扰测定
用抗原稀释液配置浓度为1000 ng/mL的PCT溶液，将其作为溶剂配置一系列浓度为10μg/mL的干扰试剂（抗坏血酸，葡萄糖，亮氨酸，甘氨酸，谷氨酸，癌胚抗原，免疫球蛋白G），浓度比PCT：干扰试剂=1:10；按照上述方法测其化学发光强度，计算含不同干扰试剂与不含干扰试剂的化学发光强度比值，如图5所示，PCT检测的信号强度的抑制或增强在-7.0％ - +7.6％的范围内，说明在干扰试剂存在下不影响降钙素原的检测。
实施例3 实际样品检测
1、样品检测方法
1）将实际样品溶液通入实施例1制备的传感器中，37℃免疫反应60min，PBST冲洗。
2）将生物素标记的降钙素原抗体（B-Ab2）通入传感器中，37℃免疫反应60min，PBST洗去未结合的B-Ab2。
3）将链霉亲和素和生物素标记辣根过氧化酶形成的复合物溶液通入传感器中，37℃下孵育30min， PBST洗去未结合的复合物溶液。
4）将传感器插入毛细管支架中，并将传感器的一端浸入新制备的含有化学发光底物的溶液中（取鲁米诺和双氧水各10μL，即时混合），进行化学发光信号的数据采集。
5）测得的化学发光强度代入降钙素原抗原标准曲线，求出实际样品中降钙素原抗原浓度。
采用化学发光（CL）作为检测方法检测。免疫传感器中的实时化学发光输出通过CH326光子计数检测器（Beijing Hamamatsu Photon Techniques INC，Beijing）记录。使用CH297-01计数单元及其软件包（Beijing Hamamatsu Photon Technique INC，Beijing）进行数据采集。
2、实际样品单检测结果
取一份血清样品，加入不同已知浓度的PCT标样，计算加标回收率；结果列于下表1。
表1 加标回收率结果
用本发明所制备的传感器对15份已知浓度的实际血清样本进行检测；将化学发光强度代入标准曲线，所得结果与罗氏方法进行比较，如图6所示，说明该方法具有较高的准确性。
上述实施例所用的试剂、仪器设备来源：
1、降钙素原及其抗体：北京sino生物有限公司；
2、生物素化抗体、链霉亲和素、生物素标记酶：北京sino生物有限公司；
3、氧化型谷胱甘肽：西格玛奥德里奇；
4、氨丙基二乙氧基甲基硅烷、戊二醛：西格玛奥德里奇；
5、抗坏血酸，葡萄糖，甘氨酸，谷氨酸，白细胞介素6（IL-6）和C-反应蛋白（CRP）：西格玛奥德里奇；
6、SW2010 Wester Boltting ECL化学发光试剂盒：北京Solarbio科技有限公司；
7、临床血清样品：北京友谊医院。

Claims (9)

1.一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，它是由下述方法制备的：
1）毛细管预处理：依次用0.1M HCl、0.1M NaOH清洗毛细管，清洗时间分别为15~25min和55~65min，用水清洗、N2吹干，通入体积分数为0.5~1.5%氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液，用甲苯清洗、N2吹干，通入2~3% 戊二醛水溶液；
2）抗体Ab1的固定：向步骤1）预处理的毛细管中，通入38~45 µg/mL甲胎蛋白抗体Ab1，两端封口，置于4℃下过夜，用摩尔质量0.1M 、pH为7.4 的PBS溶液洗去未结合的甲胎蛋白抗体Ab1；
3）消除非特异性吸附：通入10mg/mL 氧化型谷胱甘肽溶液至毛细管中，两端封口，室温放置1.5~2.5h；将毛细管截为多根，每根毛细管长度为5~7cm。
2.根据权利要求1所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，其特征在于：步骤1）所述的毛细管预处理，通入体积分数为1%氨丙基二乙氧基甲基硅烷的甲苯溶液；通入2.5% 戊二醛水溶液。
3.根据权利要求2所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，其特征在于：步骤2）所述的抗体Ab1的固定，通入40µg/mL甲胎蛋白抗体Ab1。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器，其特征在于：步骤3）所述的每根毛细管长度为6cm，并设有2厘米长的窗口。
5.权利要求1所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器在检测降钙素原方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
1）将待测样品溶液通入权利要求1所述的一种新型信号放大-毛细管化学发光免疫传感器中，在36~37.5℃下免疫反应55~65min，PBST溶液冲洗；
2）将生物素标记的降钙素原抗体通入传感器中，在36~37.5℃下免疫反应55~65min，PBST溶液洗去未结合的B-Ab2；
3）将链霉亲和素和生物素标记辣根过氧化酶形成的复合物溶液通入传感器中，36~37.5℃下孵育30min， PBST溶液洗去未结合的复合物溶液；
4）将传感器插入毛细管支架中，并将传感器的一端浸入含有化学发光底物的溶液中，进行化学发光信号的数据采集；
5）测得的化学发光强度代入降钙素原抗原标准曲线，求出实际样品中降钙素原抗原浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的免疫反应，是在37℃下免疫反应60min。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的PBST溶液，是含有体积分数为0.05% Tween-20的PBS溶液。
9.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：步骤4）所述的含有化学发光底物的溶液，是取鲁米诺和双氧水各10μL，即时混合得到的溶液。
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