CN104330553A - 一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法 - Google Patents

一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法，一种无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法包括如下步骤：(1)将所述免疫传感器固定在免疫微反应器后，将带抗原样品以0.5ml/min的速度注入流通池，在线温育后形成免疫复合物；(2)用缓冲液PBST以1ml/min的速度冲洗免疫复合物，除去未反应的免疫试剂；(3)将化学发光底物溶液以0.5ml/min的速度通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。本发明以化学发光探针和无标记的抗体共固定于具有良好生物相容性的固相界面，制得该免疫传感器，结合流动注射，构建了一种廉价、快速、方便的无标记化学发光免疫分析方法。

Description

一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法。
背景技术
免疫分析技术是基于抗原-抗体间的特异性反应，具有高度专一性、高灵敏度、环境友好的现代分析技术，被认为是分析复杂样品体系的有效方法。流动注射作为一种最有用的分析技术之一，能够改善传统分析方法笨重、耗时和高劳动强度等缺点，并且样品消耗低，处理步骤较少，能够重复使用，重现性好，分析速度快，易于实现自动化，所以已经被广泛地应用于许多领域。本发明利用免疫分析技术结合流动注射，可自动化地对人血清中抗原和标志物等进行检测，以实现对某些疾病的早期诊断。
免疫分析可分为无标记(直接测定)和标记(间接测定)两种类型。相对标记免疫分析，无标记免疫分析技术能够直接测定生物样品，测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，样品消耗少，耗费时间短，操作简单等显著优势，适应直接、实时、原位、在线的痕量免疫分析，因此引起了人们极大的研究兴趣，成为生物传感领域发展的一个非常重要方向。目前的无标记型免疫分析主要分为光学免疫分析、压电免疫分析和电化学免疫分析。其中表面等离子共振免疫传感器、石英晶体微天平免疫传感器、电容免疫传感器及交流阻抗免疫传感器，文献中报道的较多。
目前，化学发光免疫分析技术在医学临床应用已成为研究热点，它同时具备了化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性，具有灵敏度高、特异性强、无放射性危害、适用面广、设备简单、线性范围宽等分析优点，日益受到人们的青睐，在生命分析、临床诊断、环境监测、食品安全、药物分析等领域得到了广泛应用，并有取代放射免疫分析和酶联免疫分析成为诊断市场上的主流趋势，而无标记化学发光免疫分析鲜有报道。因此，发展灵敏、快速、廉价和方便的新型无标记化学发光免疫分析方法，将具有非常重要的科学意义。
目前，缺乏一种廉价、快速、方便的一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种廉价、快速、方便的一种无标记化学发光免疫传感器及其免疫分析方法。
本发明的技术方案如下：本发明提供了一种无标记化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玻璃片在水虎鱼酸中浸泡10-12h，用蒸馏水充分清洗后，在氮气气氛中吹干，浸泡在1％的γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷GPTMS的甲苯溶液中进行硅烷化反应，室温下放置10-12h；
(2)硅烷化反应后，先后用甲苯和乙醇冲洗并在氮气气氛下吹干；
(3)将金纳米粒子溶液和2.0wt％壳聚糖溶液混合后超声至完全分散，然后与化学发光探针、抗体溶液相混合；取上述混合溶液，将其滴涂到环氧硅烷化的玻璃片表面，并在室温下反应0.5-1h，然后在4℃下放置10-12h；
(4)用缓冲液PBST冲洗三次，并在4℃下用封闭液封闭10-12h，制得免疫传感器。
进一步地，在步骤(1)中，所述玻璃片的长、宽、高分别为2.1cm、0.4cm、0.1cm；所述室温为25℃；所述H2SO4与H2O2的体积比为7:3。
进一步地，在步骤(3)中，化学发光探针为辣根过氧化物酶HRP；所述抗体溶液为人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液或甲胎蛋白AFP抗体溶液。
更进一步地，在步骤(3)中，所述辣根过氧化物酶HRP的浓度为5μg/ml，人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液浓度为40μg/ml。
进一步地，在步骤(4)中，所述封闭液为含1％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
本发明的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)将所述免疫传感器固定在免疫微反应器后，将带抗原样品以0.5ml/min的速度注入流通池，在线温育后形成免疫复合物；
(2)用缓冲液PBST以1ml/min的速度冲洗免疫复合物，除去未反应的免疫试剂；
(3)将化学发光底物溶液以0.5ml/min的速度通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。
进一步地，在步骤(1)中，所述免疫微反应器由带有进口和出口的聚四氟乙烯盖，所述聚四氟乙烯盖的长、宽、高分别为4.3cm、2.5cm、0.8cm；所述硅橡胶片的厚度为2.0mm和透明的塑胶玻璃片组成，制得的流通池的体积为80μl。
进一步地，在步骤(1)中，所述抗原样品为人类免疫球蛋白HIgG，所述人类免疫球蛋白HIgG测量的最佳温育时间为25min。
更进一步地，在步骤(2)中，缓冲液PBST为含0.05％Tween-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
进一步地，在步骤(3)中，所述化学发光信号的检测由光电倍增管处于同一高压条件下测得。
有益效果：本发明以化学发光探针和无标记的抗体共固定于具有良好生物相容性的固相界面，制得该免疫传感器，结合流动注射，构建了一种廉价、快速、方便的无标记化学发光免疫分析方法。本发明具有如下优点：
(1)本发明首先将带有羟基的玻璃片进行环氧硅烷化，再将化学发光探针和抗体利用具有良好生物相容性的金纳米粒子-壳聚糖复合膜固定于玻璃表面，将剩余活性位点封闭后即制得免疫传感器。检测时，免疫传感器固定在免疫微反应器中并通入抗原，在线温育形成免疫复合物，冲洗后通入化学发光底物，随后立即进行发光信号的采集，从而实现廉价，快速，方便地无标记检测。将流动注射与化学发光免疫分析结合起来，实现分析检测的简单化和自动化，有利于加快整体分析检测时间。
(2)本发明的无标记化学发光免疫分析方法，能够直接测定生物样品，测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，耗费时间短，操作简单等显著优势。
(3)本发明简化免疫分析过程，无需大量的优化过程，先后通入试样和化学发光底物可直接检测。开创性地提出了无标记化学发光免疫分析新思想，将引领化学发光免疫分析技术的革新，并对疾病诊断等领域的发展具有重要的意义。
(4)利用免疫微反应器，反应试剂和样品消耗少，操作简便，速度快。通入分析试样后，抗原抗体的特异性结合将在界面上形成免疫复合物，该复合物会阻碍化学发光底物向界面扩散的速度，从而引起化学发光强度的减弱；利用化学发光信号变化和抗原浓度的关系进行定量检测的分析方法。
(5)本发明方法所述的检测抗原的定量方法为标准曲线法，随着抗原浓度逐渐增加，更多的免疫复合物的形成使得化学发光强度随之减小，由此制得标准样品的线性曲线，而后进行实际样品的检测。
附图说明
图1为本发明免疫传感器的制作示意图；
图2为本发明免疫传感器的分析示意图；
图3为本发明的HIgG标准样品检测的线性曲线。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明提供了一种免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玻璃片在水虎鱼酸(H2SO4:H2O2＝7:3，V/V)中浸泡10-12h，用蒸馏水充分清洗后，在氮气气氛中吹干，浸泡在1％的γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷GPTMS的甲苯溶液中进行硅烷化反应，室温下放置10-12h；所述玻璃片为2.1cm×0.4cm×0.1cm；所述室温为25℃。
(2)硅烷化反应后，先后用甲苯和乙醇冲洗并在氮气气氛下吹干；
(3)将金纳米粒子溶液和2.0wt％壳聚糖溶液混合后超声至完全分散，然后与化学发光探针、抗体溶液相混合；取上述混合溶液，将其滴涂到环氧硅烷化的玻璃片表面，并在室温下反应0.5-1h，然后在4℃下放置10-12h；化学发光探针为辣根过氧化物酶HRP；所述抗体溶液为人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液。所述辣根过氧化物酶HRP的浓度为5μg/ml，人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液浓度为40μg/ml。
(4)用缓冲液PBST冲洗三次，并在4℃下用封闭液封闭10-12h，制得免疫传感器。所述封闭液为含1％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
本发明的方法制得的免疫传感器的无标记化学发光免疫分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述免疫传感器固定在免疫微反应器后，将带抗原样品以0.5ml/min的速度注入流通池，在线温育后形成免疫复合物；所述免疫微反应器由带有进口和出口的聚四氟乙烯盖(4.3cm×2.5cm×0.8cm)、硅橡胶片(2.0mm)和透明的塑胶玻璃片组成，制得的流通池的体积为80μl，所述流通池内设置有通孔，其长宽高为2.1cm×0.4cm×0.09cm。所述抗原样品为人类免疫球蛋白HIgG，所述人类免疫球蛋白HIgG测量的最佳温育时间为25min。
(2)用缓冲液PBST以1ml/min的速度冲洗免疫复合物，除去未反应的免疫试剂；缓冲液PBST为含0.05％Tween-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
(3)最后将化学发光底物溶液以0.5ml/min的速度通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管在500V高压下记录。
本发明以化学发光探针和无标记的抗体共固定于具有良好生物相容性的固相界面，制得该免疫传感器，结合流动注射，构建了一种廉价、快速、方便的无标记化学发光免疫分析方法。本发明具有如下优点：
(1)本发明首先将带有羟基的玻璃片进行环氧硅烷化，再将化学发光探针和抗体利用具有良好生物相容性的金纳米粒子-壳聚糖复合膜固定于玻璃表面，将剩余活性位点封闭后即制得免疫传感器。检测时，免疫传感器固定在免疫微反应器中并通入抗原，在线温育形成免疫复合物，冲洗后通入化学发光底物，随后立即进行发光信号的采集，从而实现廉价，快速，方便地无标记检测。将流动注射与化学发光免疫分析结合起来，实现分析检测的简单化和自动化，有利于加快整体分析检测时间。
(2)本发明的无标记化学发光免疫分析方法，能够直接测定生物样品，测定过程中无需预先对抗体或抗原进行标记，具有检测成本低，耗费时间短，操作简单等显著优势。
(3)本发明简化免疫分析过程，无需大量的优化过程，先后通入试样和化学发光底物可直接检测。开创性地提出了无标记化学发光免疫分析新思想，将引领化学发光免疫分析技术的革新，并对疾病诊断等领域的发展具有重要的意义。
(4)利用免疫微反应器，反应试剂和样品消耗少，操作简便，速度快。通入分析试样后，抗原抗体的特异性结合将在界面上形成免疫复合物，该复合物会阻碍化学发光底物向界面扩散的速度，从而引起化学发光强度的减弱；利用化学发光信号变化和抗原浓度的关系进行定量检测的分析方法。
(5)本发明方法所述的检测抗原的定量方法为标准曲线法，随着抗原浓度逐渐增加，更多的免疫复合物的形成使得化学发光强度随之减小，由此制得标准样品的线性曲线，而后进行实际样品的检测。
如图3所示，测定不同浓度的HIgG标准样品，制得HIgG标准样品的线性曲线。实验优化过程中，对温育时间进行优化的最佳温育时间选择为25min。制得标准曲线后，为考察该无标记化学发光免疫分析新方法的实际应用的可靠性，进行了实际样品加标回收实验如表1所示：
表1
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：如此测定不同浓度的AFP标准样品，制得AFP标准样品的线性曲线。所述化学发光探针为辣根过氧化物酶HRP；所述抗体溶液为甲胎蛋白AFP抗体溶液。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种无标记化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将玻璃片在水虎鱼酸中浸泡10-12h，用蒸馏水充分清洗后，在氮气气氛中吹干，浸泡在1％的γ-(2,3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷GPTMS的甲苯溶液中进行硅烷化反应，室温下放置10-12h；
(2)硅烷化反应后，先后用甲苯和乙醇冲洗并在氮气气氛下吹干；
(3)将金纳米粒子溶液和2.0wt％壳聚糖溶液混合后超声至完全分散，然后与化学发光探针、抗体溶液相混合；取上述混合溶液，将其滴涂到环氧硅烷化的玻璃片表面，并在室温下反应0.5-1h，然后在4℃下放置10-12h；
(4)用缓冲液PBST冲洗三次，并在4℃下用封闭液封闭10-12h，制得免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的无标记化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述玻璃片的长、宽、高分别为2.1cm、0.4cm、0.1cm；所述室温为25℃；所述H2SO4与H2O2的体积比为7:3。
3.根据权利要求1所述的无标记化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中，化学发光探针为辣根过氧化物酶HRP；所述抗体溶液为人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液或甲胎蛋白AFP抗体溶液。
4.根据权利要求3所述的无标记化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述辣根过氧化物酶HRP的浓度为5μg/ml，人类免疫球蛋白HIgG抗体溶液浓度为40μg/ml。
5.根据权利要求1所述的无标记化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于:在步骤(4)中，所述封闭液为含1％牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
6.利用权利要求1的方法制得的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述免疫传感器固定在免疫微反应器后，将带抗原样品以0.5ml/min的速度注入流通池，在线温育后形成免疫复合物；
(2)用缓冲液PBST以1ml/min的速度冲洗免疫复合物，除去未反应的免疫试剂；
(3)将化学发光底物溶液以0.5ml/min的速度通入免疫传感器，产生的化学发光信号由光电倍增管记录。
7.根据权利要求6所述的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述免疫微反应器由带有进口和出口的聚四氟乙烯盖，所述聚四氟乙烯盖的长、宽、高分别为4.3cm、2.5cm、0.8cm；所述硅橡胶片的厚度为2.0mm和透明的塑胶玻璃片组成，制得的流通池的体积为80μl。
8.根据权利要求6所述的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，其特征在于:在步骤(1)中，所述抗原样品为人类免疫球蛋白HIgG，所述人类免疫球蛋白HIgG测量的最佳温育时间为25min。
9.根据权利要求8所述的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，其特征在于:在步骤(2)中，缓冲液PBST为含0.05％Tween-20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
10.根据权利要求6所述的无标记化学发光免疫传感器的免疫分析方法，其特征在于:在步骤(3)中，所述化学发光信号的检测由光电倍增管处于同一高压条件下测得。
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