CN102854320A - 一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，提供一种灵敏度高、特异性强、快速定量的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法。取壳聚糖溶液滴满玻碳电极表面，于45℃干燥3h；冷却至室温，浸于NaOH溶液中，用超纯水清洗掉NaOH溶液，浸于超纯水中；取出自然晾干后置于纳米金溶胶中；将纳米金电极置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中自组装；再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于单层纳米金修饰电极表面的中心，干燥后，用超纯水清洗；置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中自组装，超纯水冲洗后再置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中自组装，置于牛血清白蛋白溶液中温育，清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干。

Description

一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及生物免疫检测技术领域，特别是涉及一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法。
背景技术
食品与人类的生存和健康密切相关，保证食品的安全卫生、防止有毒有害物质通过食品对人体造成危害是至关重要的。腊样芽胞杆菌是一种食源性致病菌，要求在所有的食品中不得检出。
目前，腊样芽胞杆菌的测定方法主要是通过增菌培养，然后再通过平板计数等方法测定，或者通过试剂盒测定，不仅用时长、灵敏度低，而且只能实现半定量。为了判断食品是否安全，预防和控制食源性传染病的传播以及快速诊断出腊样芽胞杆菌的存在，研制出一种灵敏度高、特异性强、快速定量的检测方法是保障食品安全的重要手段。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、快速定量的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，包括下述步骤：
（1）将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45℃干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；
（2）干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为1mol/L的NaOH溶液中5min，用超纯水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；加入NaOH的目的是催化聚胶，所以聚胶后需要彻底去掉；
（3）取出自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；
（4）将步骤（3）得到的纳米金电极置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，即得单层纳米金修饰电极；
（5）再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，最后置于浓度为1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05%Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器。
所述玻碳电极预处理包括下述过程：将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V、扫描速度为100mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。
所述纳米金溶胶通过下述方法得到:
①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5%二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；
②根据Frens法取浓度为0.01g/100mL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
所述纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用0.1M K2CO3调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜。
所述硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备：将2.5mL质量体积百分比为2%的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10%的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇溶液200μL，最后加入体积百分比为2％的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。
所述纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体通过下述方法制备：蜡样芽孢杆菌单克隆抗体腹水，采用蛋白A进行亲和层析纯化；腹水效价为1∶102400，抗体亚型为I gG1，对苏云金芽孢杆菌1.1014、蕈状芽孢杆菌1.0856、巨大芽孢杆菌1.0151均无交叉反应。
所述王水由浓HC l与浓HNO3按照体积比为3∶1的比例配置而成。
利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在510～550nm波长范围内随胶体金颗粒大小而变化，据此可通过最大吸收峰处波长对所制备纳米金溶胶颗粒的大小进行粗略的表征；用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征。
所述2.0g/L辣根过氧化物酶液的制备方法为：将0.02g辣根过氧化物酶溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的方法以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶（HRP）复合物固定于上述电极，并吸附抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体构建了双层纳米金修饰的蜡样芽孢杆菌电化学免疫传感器，灵敏度高，特异性强，能够实现快速定量检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的方法可以用于食源性腊样芽胞杆菌检测。以下以用于乳源的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法为实施例进行说明。
实施例1
1、玻碳电极的预处理：
将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用1∶1的HNO3、无水乙醇、超纯水清洗。在1mo l/L H2SO4溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V，扫描速度为100mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。上述的稳定的循环伏安曲线满足下述要求：在实验室条件下预处理后的电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV以下，并尽可能的接近64mV，电极方能使用，最后置于氮气环境中干燥待用。
2、纳米金(Nano-Au)溶胶的制备:
（1）制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，所用王水由浓HC l与浓HNO3按照体积比为3∶1混合而成。取出后用大量自来水冲洗残留酸液，然后用蒸馏水浸泡24h。
（2）取出干燥后用含体积百分比为5%二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用。
（3）根据Frens法取0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，待其自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内(400-700nm)进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在510～550nm波长范围内随胶体金颗粒大小而变化，据此可通过最大吸收峰处波长对所制备纳米金溶胶颗粒的大小进行粗略的表征；结果应在518nm波长处有一很强的吸收峰，故可粗略确定纳米金平均粒径为15nm。用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征,所合成的纳米金形状规则，粒度均匀，平均粒径约为15nm，且没有聚集现象。
3、纯化的乳源蜡样芽孢杆菌单克隆抗体的制备：
乳源蜡样芽孢杆菌单克隆抗体腹水，采用蛋白A进行亲和层析纯化。腹水效价为1∶102400，抗体亚型为IgG1，对苏云金芽孢杆菌1.1014、蕈状芽孢杆菌1.0856、巨大芽孢杆菌1.0151均无交叉反应。
4、硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物的制备：
（1）将2g壳聚糖(Chit)溶于100mL体积百分比为2%的醋酸溶液中搅拌3h得到2%的壳聚糖溶液。
（2）将上述2.5mL质量体积百分比为2%的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10%的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇(Thi)溶液200μL，最后加入2%(v/v)的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极，且该共聚物溶液需现用现配。
5、纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备：
（1）将0.02g辣根过氧化物酶（HRP）溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，配置2.0g/L辣根过氧化物酶溶液。
（2）用0.1M K2CO3调节步骤2制备的纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL上述2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜，并利用分光光度计对此混合液在350～700nm范围内进行扫描，获得HRP/Nano-Au聚合物的吸收光谱，通过最大吸收波长对Nano-Au与HRP相互作用后所发生的变化情况进行表征；利用生物薄膜干涉技术分析Nano-Au对HRP的亲和力，亦即：紫外-可见吸收光谱常可用来表征蛋白质结构的变化及蛋白质与其他物质之间的相互作用，表明纳米金吸附固定HRP对HRP的结构没有影响，可以很好的保持HRP的生物活性。
6、乳源蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备:
(1)将0.5g壳聚糖溶于100mL体积分数为1%的醋酸溶液，得到质量体积百分比为0.5%壳聚糖溶液。
(2)取5μL上述质量体积百分比为0.5%的壳聚糖溶液滴于步骤1预处理后的玻碳电极表面，置于45℃烘箱中干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶，待其自然冷却至室温后浸于1mol/L NaOH溶液中5min催化聚胶，用超纯水清洗后并浸于超纯水中30min，使NaOH全部进入水中。
(3)取出自然晾干后置于步骤2制备的纳米金溶胶中24h，得到纳米金电极。然后将该电极置于步骤3所纯化的乳源蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装24h，即得单层纳米金修饰的电极。
（4）再取5μL步骤4中所制备的硫堇/壳聚糖(Thi/Chit)共聚物溶液滴加于单层纳米金修饰的电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于步骤5所制备的纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装24h，超纯水冲洗后再置于步骤3所纯化的乳源蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装24h，最后置于1g/100mL的牛血清白蛋白溶液（BSA）溶液中于37℃温育1h，以封闭非特异性位点，以含0.05%(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的乳源蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器，保存于4℃PBS缓冲液中。
将上述组装好的蜡样芽孢杆菌电化学免疫传感器在1×103cfu/mL蜡样芽孢杆菌的PBS稀释液中连续测定12次，结果相对标准偏差R.S.D为3.23%，证明该传感器的误差较小，定量效果较好。
将该传感器于0.01mo l/L pH值为7.4的PBS缓冲液上方4℃保存，间歇性使用，第20天电流响应信号为初始电流的93.56%，表明该传感器具有良好的稳定性。
取不同批次制备的免疫传感器5支，在相同条件下对同一浓度菌液(1×103cfu/mL)进行测定，结果响应电流的相对标准偏差R.S.D.=4.12%，说明该传感器重现性良好。
本发明以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-HRP复合物固定于上述电极并吸附抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体构建双层纳米金修饰的蜡样芽孢杆菌电化学免疫传感器。利用循环伏安法、交流阻抗法表征电极组装的各个阶段，利用计时电流法对蜡样芽孢杆菌进行测定，该传感器的响应电流与菌浓度在5×101～5×104cfu/mL范围内呈线性关系，相关系数为0.9966，检测限为10cfu/mL。
本发明结合电化学分析可实现在线检测，不受样品浊度、颜色的影响，所需设备仪器相对简单，无需对样品进行纯化、富集等预处理，可应用于蜡样芽胞杆菌的快速检测。
由于本发明所应用的是蜡样芽胞杆菌特异性蛋白的单克隆抗体，所以决定了其很强的特异性，和其他菌酶有交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45℃干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；
（2）干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为1mo l/L的NaOH溶液中5min，用超纯水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；
（3）取出自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；
（4）将步骤（3）得到的纳米金电极置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，即得单层纳米金修饰电极；
（5）再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，最后置于浓度为1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05%Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述玻碳电极预处理包括下述过程：将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V、扫描速度为100mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。
3.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金溶胶通过下述方法得到:
①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5%二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；
②根据Frens法取浓度为0.01g/100mL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HC l或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
4.根据权利要求1或3所述的乳源蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用0.1M K2CO3调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL 2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜。
5.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备：将2.5mL质量体积百分比为2%的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10%的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇溶液200μL，最后加入体积百分比为2%的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。
6.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体通过下述方法制备：蜡样芽孢杆菌单克隆抗体腹水，采用蛋白A进行亲和层析纯化；腹水效价为1∶102400，抗体亚型为IgG1，对苏云金芽孢杆菌1.1014、蕈状芽孢杆菌1.0856、巨大芽孢杆菌1.0151均无交叉反应。
7.根据权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述王水由浓HCl与浓HNO3按照体积比为3∶1的比例配置而成。
8.根据权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在510～550nm波长范围内随胶体金颗粒大小而变化，据此可通过最大吸收峰处波长对所制备纳米金溶胶颗粒的大小进行粗略的表征；用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征。
9.根据权利要求4所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述2.0g/L辣根过氧化物酶液的制备方法为：将0.02g辣根过氧化物酶溶于0.01M pH值为7.4的磷酸缓冲液中。
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